專利名稱：利用具有環(huán)氧基的星狀聚乙二醇衍生物制備水凝膠生物芯片的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種制備生物芯片的方法，更具體的是，涉及利用凝膠基質(zhì)制備生物芯片的方法。
背景技術(shù)：
人類基因組計(jì)劃的完成大大增加了對(duì)于能為遺傳疾病的診斷，治療和預(yù)防提供必需的大量遺傳信息的有效方法的需求。盡管DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和其自動(dòng)化得以發(fā)展，但用于核苷酸測序的Sanger方法仍然是繁重的，而且需要精細(xì)處理，耗費(fèi)大量的時(shí)間，精力和費(fèi)用。因此，已經(jīng)進(jìn)行了大量嘗試力圖發(fā)現(xiàn)能夠分析大量基因的新的核苷酸測序系統(tǒng)。
DNA芯片指的是小于1平方英寸的微矩陣，其通過將寡核苷酸探針固定在由硅，表面改性的玻璃，聚丙烯或活化的聚丙烯酰胺制成的固體表面上的幾百到幾十萬(hundreds of thousands of)個(gè)合適的位置上而形成，其中每個(gè)探針包括幾個(gè)到數(shù)百個(gè)核苷酸。在靶DNA片段與DNA芯片結(jié)合時(shí)，靶DNA片段與固定在DNA芯片上的寡核苷酸探針互補(bǔ)雜交。這種雜交可通過光學(xué)或放射化學(xué)方法進(jìn)行觀察和分析，以鑒定靶DNA的核苷酸序列。
DNA芯片的使用減小了DNA分析系統(tǒng)的大小，并且利用痕量樣品就可進(jìn)行遺傳分析。另外，靶DNA的多重序列可以同時(shí)進(jìn)行分析，由此可方便，快速而又低費(fèi)用地提供靶DNA的遺傳信息。DNA芯片可在短時(shí)間內(nèi)分析大量的遺傳信息和基因相關(guān)性。因此，預(yù)計(jì)DNA芯片可廣泛地應(yīng)用在，例如，遺傳疾病和癌癥的診斷，突變體和病原體的檢測，基因表達(dá)的分析，藥物的發(fā)現(xiàn)等。此外，基于遺傳重組技術(shù)，DNA芯片可用作微生物或污染物檢驗(yàn)器以發(fā)現(xiàn)解毒基因，并進(jìn)一步大規(guī)模地制備解毒藥。DNA芯片可導(dǎo)致大大改進(jìn)大多數(shù)的生物工業(yè)，包括藥用作物或低脂肪肉的生產(chǎn)。
DNA芯片根據(jù)固定在其上的探針類型可將其分為寡-芯片和cDNA芯片。根據(jù)制備方法可將DNA芯片分為石印(lithography chip)芯片，針型點(diǎn)樣(pin-type spotting)芯片，噴墨型點(diǎn)樣(pin-jet type spotting)芯片，將DNA與支持物電子地結(jié)合的電子定位(addressing)DNA芯片。
第一代DNA芯片是二維(2D)芯片，其中寡核苷酸附著于支持物成為單層，由于附著于支持物的探針點(diǎn)與點(diǎn)之間的差異，在相對(duì)地比較雜交程度時(shí)，會(huì)造成相當(dāng)大的錯(cuò)誤，并且其靈敏度低，因此需要昂貴的同焦點(diǎn)熒光顯微鏡以檢測雜交的DNA。而且，固體支持物的表面用有機(jī)溶劑和水溶液的混合物處理以誘導(dǎo)化學(xué)反應(yīng)。
美國專利5744305公開了使用光敏保護(hù)基團(tuán)通過光刻法制備的第一代DNA芯片的實(shí)例。在第一代DNA芯片中，各種聚合物諸如肽和寡核苷酸都排列在支持物上。
為了致力于改進(jìn)第一代DNA芯片的缺點(diǎn)，開發(fā)了下面的第二代DNA芯片。美國專利5736257和5847019公開了制備生物芯片的方法，其中支持物上的羥基(OH)用硅烷處理以在支持物上形成乙烯基分子層，并通過丙烯酰胺的聚合作用在該分子層上形成網(wǎng)絡(luò)層，利用光使其活化并形成圖案以將網(wǎng)絡(luò)層與生物材料結(jié)合。這些方法中，由于在乙烯基分子層上形成聚丙烯酰胺的3-D凝膠網(wǎng)絡(luò)，固定在其上的探針的量的差異減小，芯片的靈敏度得到改進(jìn)。然而，不利的是，費(fèi)用高且需要長的分析時(shí)間。
美國專利5552270，5741700和5770721公開了使用第二代DNA芯片的DNA序列分析方法，所述芯片包括寡核苷酸陣列基質(zhì)和固體支持物?；|(zhì)與固體支持物經(jīng)由凝膠層結(jié)合，形成一種相互以恒定距離間隔的方形點(diǎn)陣模式。在DNA芯片的制備中，在間距約30μm的兩玻璃板間應(yīng)用聚丙烯酰胺凝膠。移去大小為100×100×30μm3的一玻璃板，干燥剩下的覆蓋有凝膠的玻璃板，并通過使用機(jī)械工具或激光除去部分凝膠而行成斑點(diǎn)圖案。凝膠層的酰胺基團(tuán)經(jīng)化學(xué)反應(yīng)轉(zhuǎn)換成反應(yīng)性酰肼形式，那些在其5’-末端具有N-甲基尿苷的DNA探針轉(zhuǎn)換成二醛。通過寡核苷酸探針與反應(yīng)性凝膠的反應(yīng)將探針以三維形式固定在支持物上。
在較長的1-2天時(shí)間里通過多重加工制備DNA芯片，其中每一步加工后接一種徹底的清洗程序。因此，分析結(jié)果(yield)易受反應(yīng)條件的影響，凝膠表面不規(guī)則將吸收靶DNA將增加背景噪聲。
WO 00/65097和WO 00/2899公開了使用具有異氰酸(isocyanate)(NCO)基團(tuán)的水凝膠的3-D DNA芯片。水凝膠是親水性網(wǎng)絡(luò)聚合物，在脫水狀態(tài)為玻璃狀的，有水的情況下膨脹形成凝膠。根據(jù)該文獻(xiàn)，已知異氰酸根基團(tuán)參與水凝膠和探針間以及水凝膠自身聚合時(shí)的共價(jià)結(jié)合。具有異氰酸根基團(tuán)的水凝膠，例如具有異氰酸根基團(tuán)的聚環(huán)氧乙烷(polyethyleneoxide)或具有異氰酸根基團(tuán)的聚環(huán)氧乙烷和聚環(huán)氧丙烷的共聚物，和在5’-末端具有胺基(amine group)的探針在水溶液中混合，這些探針以三維形式固定在凝膠上，并與玻璃表面的胺基反應(yīng)以將探針附著在支持物上。
異氰酸根基團(tuán)水解太快不易控制。為防止異氰酸根基團(tuán)的水解，需要在低溫下制備DNA芯片。隨著那些既沒有與探針共價(jià)結(jié)合又沒有參與凝膠聚合的異氰酸根基團(tuán)被水解，聚合作用被加速，從而使粘稠度增加并使點(diǎn)樣針穩(wěn)固。并且，二氧化碳的產(chǎn)生使點(diǎn)樣大小難以控制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種易于制備的靈敏度改進(jìn)的水凝膠生物芯片。
本發(fā)明的另一目的是提供一種制備靈敏度改進(jìn)的生物芯片的方法。
本發(fā)明提供一種制備水凝膠生物芯片的方法，包括將在其末端具有環(huán)氧基團(tuán)的星狀聚乙二醇衍生物，親水的聚合交聯(lián)劑和探針在水溶液中混合以形成混合溶液；并將混合溶液應(yīng)用到支持物上以形成水凝膠，使探針固定到支持物上。
根據(jù)本發(fā)明制備水凝膠生物芯片的方法可包括形成由末端帶有環(huán)氧基團(tuán)的星狀聚乙二醇衍生物與親水的聚合交聯(lián)劑組成的基質(zhì)，將該基質(zhì)與探針反應(yīng)以形成基質(zhì)探針偶聯(lián)物。
根據(jù)本發(fā)明制備水凝膠生物芯片的方法如下詳述。
首先，將星狀聚乙二醇衍生物與過量的表氯醇和氫氧化鈉反應(yīng)使其末端具有環(huán)氧基團(tuán)。接著，使用低分子量，優(yōu)選具有親水羥基基團(tuán)，氨基基團(tuán)或硫醇基團(tuán)并且平均分子量約為60-100000的親水聚合物來作為交聯(lián)劑來形成基質(zhì)。那些在其末端具有親核基團(tuán)的探針與基質(zhì)共價(jià)結(jié)合以形成基質(zhì)-探針偶聯(lián)物?；|(zhì)的形成和基質(zhì)-探針偶聯(lián)物的形成是依次或同時(shí)進(jìn)行的。說明書中所用術(shù)語“探針”指的是所有特異地與靶物質(zhì)結(jié)合，并用于通過對(duì)探針和靶物質(zhì)間結(jié)合的分析測定靶物質(zhì)的特性的物質(zhì)。優(yōu)選的是，探針包括核酸，諸如脫氧核糖核酸(DNA)，核糖核酸(RNA)，和肽核酸(PNA)，蛋白質(zhì)或寡肽。本發(fā)明中所用的低分子量的親水性聚合物包括平均分子量例如為60-100000的聚乙二醇，聚亞乙基胺(polyethyleneamine)，聚環(huán)氧丙烷和多元醇。說明書中所用術(shù)語“星狀聚乙二醇”指的是具有3種或更多方向分支，由此具有星狀形式的PEG衍生物。因此，本發(fā)明星狀PEG衍生物可通過交聯(lián)劑交聯(lián)并行成三維聚合物基質(zhì)。
根據(jù)本發(fā)明，通過微點(diǎn)樣將基質(zhì)-探針偶聯(lián)物固定在固體支持物(優(yōu)選的是，對(duì)其表面進(jìn)行處理以暴露酰胺基團(tuán))上以形成本發(fā)明的水凝膠生物芯片。用于固體支持物的合適材料包括玻璃，石英，硅，塑料，聚丙烯，聚碳酸酯和活化的丙烯酰胺等。
根據(jù)本發(fā)明制備水凝膠生物芯片的方法包括制備在其末端具有環(huán)氧基團(tuán)的星狀聚乙二醇衍生物、親水的交聯(lián)劑、和探針的混合物溶液，以及將混合物溶液固定在支持物上。
固定在下述條件下進(jìn)行，例如溫度約40-70℃，濕度約60-30％，優(yōu)選的是40℃和60％，60℃和40％，或70℃和30％。通過固定而在支持物上形成的斑點(diǎn)圖案因交聯(lián)劑的類型和反應(yīng)條件諸如混合比例，溫度和濕度的不同而不同。在本發(fā)明特定的實(shí)施方案中，使用上述相同的聚乙二烯衍生物，親水聚合交聯(lián)劑，探針，和支持物。
本發(fā)明提供一種通過上述的制備水凝膠生物芯片的方法制備的水凝膠生物芯片。本發(fā)明水凝膠生物芯片包括固體支持物，與固體支持物共價(jià)結(jié)合的基質(zhì)，與該基質(zhì)共價(jià)結(jié)合的探針，其中所述基質(zhì)是末端具有環(huán)氧基團(tuán)的星狀聚乙二醇衍生物與親水交聯(lián)劑的反應(yīng)產(chǎn)物。
本發(fā)明還提供一種檢測探針和靶樣品間結(jié)合的分析方法，包括將包括待與探針結(jié)合的靶物質(zhì)的靶樣品應(yīng)用到由本發(fā)明方法制備的水凝膠生物芯片上，并檢測與所述探針特異性結(jié)合的靶物質(zhì)。優(yōu)選的是，用信號(hào)物質(zhì)例如熒光染料標(biāo)記探針以便易于檢測靶物質(zhì)。探針和靶物質(zhì)之間的結(jié)合可通過許多方法檢測，例如，熒光檢測方法，電化學(xué)檢測方法，質(zhì)量(mass)檢測方法，電荷檢測方法，或光學(xué)檢測方法，這些方法目前都得到廣泛應(yīng)用并根據(jù)標(biāo)記靶物質(zhì)的信號(hào)物質(zhì)的類型而分類。
附圖簡述

圖1是在肝細(xì)胞核因子-1α(HNF-1α)的全長野生型基因用作靶核苷酸時(shí)所顯示的雜交結(jié)果照片。
圖2是在雜合子突變體用作靶核苷酸時(shí)所顯示的雜交結(jié)果照片，該雜合子突變體是通過在HNF-1α基因的外顯子9的第5613位核苷酸后直接插入核苷酸A獲得的；和圖3是靶核苷酸與按照本發(fā)明實(shí)施例6制備的生物芯片雜交后，進(jìn)行的熒光掃描結(jié)果的照片。
具體實(shí)施例方式
結(jié)合下面的實(shí)施例更詳細(xì)的描述本發(fā)明。下述的實(shí)施例用于解釋的目的并不意欲限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1具有環(huán)氧基團(tuán)的星狀聚乙二醇的合成將7.5mL表氯醇和0.32g溴化四丁基銨加入到2mL NaOH溶液(50％重量)中并攪拌，緩慢地將1g季戊四醇乙氧基化物加入到上述混合物中，在室溫?cái)嚢?8小時(shí)。通過薄層層析鑒定反應(yīng)的完成。如果反應(yīng)尚未完成，將該混合物進(jìn)一步在60℃攪拌1小時(shí)。接著，向反應(yīng)產(chǎn)物添加30mL水進(jìn)行稀釋并用40mL二氯甲烷提取三次。用40mL飽和NaHCO3將有機(jī)溶劑層洗三次，加入無水MgSO4，低壓下除去有機(jī)溶劑。然后，將所得產(chǎn)物在真空中干燥兩天以除去表氯醇?xì)埢?。所得具有環(huán)氧基的星狀聚乙二醇(PEG)衍生物通過H-NMR和利用0.1N HBr/冰醋酸對(duì)環(huán)氧基團(tuán)進(jìn)行滴定來鑒定。
實(shí)施例2肼(diamine)交聯(lián)劑的合成將5g(9.2mmol)五(乙二醇)二甲苯磺酸酯溶于40ml DMF中，依次向該溶液中加入4.2g(64.1mmol)NaN3和0.5ml吡啶并在140℃攪拌18小時(shí)。低壓下除去溶劑后，攪拌所得產(chǎn)物并添加200ml水，用100ml二氯甲烷提取。用100mL鹽水將有機(jī)溶劑層洗三次，加入無水MgSO4，低壓下除去有機(jī)溶劑。然后，將所得產(chǎn)物進(jìn)行閃蒸塔層析(flash columnchromatography)(EA∶nHex＝1∶2)以分離二疊氮基中間產(chǎn)物。將該中間產(chǎn)物溶于30ml甲醇中，添加10％Pd-C(0.1當(dāng)量)，接著使用氫氣進(jìn)行18小時(shí)的還原反應(yīng)。催化劑利用硅藻土(Celite)墊(pad)除去，用乙醇洗該墊。將濾液和用于洗墊的乙醇混合，低壓下除去溶劑以得到肼交聯(lián)劑。
實(shí)施例3使用交聯(lián)劑制備凝膠基質(zhì)溶液(1)使用肼交聯(lián)劑制備凝膠基質(zhì)溶液100mg在實(shí)施例1中制備的具有環(huán)氧基的星狀PEG衍生物加4ml水一起攪拌。將在實(shí)施例2中合成的5.8mg肼交聯(lián)劑加入到上述混合物中，室溫?cái)嚢?8小時(shí)，4℃液態(tài)下儲(chǔ)存。
(2)使用PEG作為交聯(lián)劑制備凝膠基質(zhì)溶液將分子量為200，400，600，和1500的PEG分別溶于2N NaOH的水溶液中，并在冰浴中攪拌以獲得不同的PEG交聯(lián)劑溶液。
然后，將一部分在實(shí)施例1中制備的具有環(huán)氧基的星狀PEG衍生物溶于碳酸鹽緩沖液中(0.1M，pH9.1)。將所制得的PEG交聯(lián)溶液緩慢地添加入該溶液中，并在室溫中攪拌3小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后，用二氯甲烷提取反應(yīng)產(chǎn)物，低壓下除去有機(jī)溶劑并儲(chǔ)藏于4℃。
比較而言，在使用分子量為100000的PEG交聯(lián)溶液制備凝膠基質(zhì)溶液時(shí)，可得到固體反應(yīng)產(chǎn)物。凝膠滲透層析的結(jié)果顯示，鑒定出固體產(chǎn)物為具有5-6個(gè)環(huán)氧基團(tuán)的二聚物而不是基質(zhì)材料。因此證實(shí)，分子量低于100000的PEG可在本發(fā)明中用作交聯(lián)劑。
實(shí)施例4通過點(diǎn)樣凝膠基質(zhì)-DNA偶聯(lián)物溶液制備生物芯片將包括具有環(huán)氧基團(tuán)的星狀PEG的寡核苷酸探針，交聯(lián)劑和寡核苷酸以4∶1∶4的當(dāng)量比加入到實(shí)施例3中制備的凝膠基質(zhì)溶液中，37℃攪拌，放置14小時(shí)以得到基質(zhì)-DNA偶聯(lián)物的點(diǎn)樣溶液。
將點(diǎn)樣溶液點(diǎn)樣到玻璃支持物上，并于37℃濕室內(nèi)放置4小時(shí)，所述支持物表面已通過處理暴露出胺基。為防止靶核酸附著于玻璃表面的不需要的部分，實(shí)施進(jìn)一步的反應(yīng)，使玻璃支持物上未點(diǎn)樣位置的胺基帶負(fù)電荷(這是控制背景干擾(noise)的必要步驟)，將所得的生物芯片儲(chǔ)藏于干燥器中。
實(shí)施例5芯片檢驗(yàn)芯片性能檢驗(yàn)中，通過多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)獲得的全長野生型肝細(xì)胞核因子-1α(HNF-1α)基因和雜合子突變體用作靶核苷酸以與探針雜交，該突變體是在HNF-1α基因外顯子9的第5613位核苷酸之后(指向3’-末端)直接插入核苷酸A獲得的。在靶核苷酸的PCR中，將Cy3-dUTP加入到熒光標(biāo)記的靶核苷酸中。
下面的寡核苷酸(SEQ ID Nos.1-34)用作探針。
對(duì)于靶核苷酸與探針的雜交，將0.1％6SSPET(含0.1％Triton X-100的Saline Sodium Phosphate EDTA)中20nM的靶核苷酸溶液和基質(zhì)-DNA偶聯(lián)物固定在芯片上，并于37℃反應(yīng)16小時(shí)。室溫中，依次用0.05％6SSPET和0.05％3SSPET將芯片各洗5分鐘，室溫風(fēng)干5分鐘，用掃描儀(Exon CO.，GenePix4000B)掃描。
SEQ ID No.1tgaacttTggacttc-與HNF-1α基因啟動(dòng)子區(qū)互補(bǔ)的探針，其中探針序列中間的T與野生型啟動(dòng)子第432位的堿基配對(duì)，其側(cè)翼的探針序列與上述第432位堿基的側(cè)翼序列完好地匹配。
SEQ ID No.2tgaacttGggacttc-與在野生型啟動(dòng)子第432位堿基處包含點(diǎn)突變(A→C)的靶核苷酸互補(bǔ)的探針。
SEQ ID No.3gttttggGggggcag-與HNF-1α基因啟動(dòng)子區(qū)互補(bǔ)的探針，其中探針序列中間的G與野生型啟動(dòng)子第592位的堿基配對(duì)，其側(cè)翼的探針序列與上述第592位堿基的側(cè)翼序列完好地匹配。
SEQ ID No.4gttttggCggggcag-與在野生型啟動(dòng)子第592位堿基處包含點(diǎn)突變(C→G)的靶核苷酸互補(bǔ)的探針。
SEQ ID No.5tgcagctGgctcagt-與HNF-1α基因外顯子1區(qū)互補(bǔ)的探針，其中探針序列中間的G與野生型外顯子1的第733位堿基配對(duì)，其側(cè)翼的探針序列與外顯子1的第733位堿基的側(cè)翼序列完好地匹配。
SEQ ID No.6tgcagctAgctcagt-與在野生型外顯子1的第733位堿基處包含點(diǎn)突變(C→T)的靶核苷酸互補(bǔ)的探針。
SEQ ID No.7gcactggGtgagccg-與HNF-1α基因外顯子1區(qū)互補(bǔ)的探針，其中探針序列中間的G與野生型外顯子1的第806位堿基配對(duì)，其側(cè)翼的探針序列與外顯子1的第806位堿基的側(cè)翼序列完好地匹配。
SEQ ID No.8gcactggAtgagccg-與在野生型外顯子1的第806位堿基處包含點(diǎn)突變(C→T)的靶核苷酸互補(bǔ)的探針。
SEQ ID No.9caaggggGagtcctg-與HNF-1α基因外顯子1區(qū)互補(bǔ)的探針，其中探針序列中間的G與野生型外顯子1第856位堿基配對(duì)，其側(cè)翼的探針序列與外顯子1第856位堿基的側(cè)翼序列完好地匹配。
SEQ ID No.10caaggggAagtcctg-與在野生型外顯子1的第856位堿基處包含點(diǎn)突變(C→T)的靶核苷酸互補(bǔ)的探針。
SEQ ID No.11cggtcgaGgggagct-與HNF-1α基因外顯子1區(qū)互補(bǔ)的探針，其中探針序列中間的G與野生型外顯子1的第875位堿基配對(duì)，其側(cè)翼的探針序列與外顯子1的第875位堿基的側(cè)翼序列完好地匹配。
SEQ ID No.12ggcggtcGagctggc-與缺失野生型外顯子1第875-879位堿基的5個(gè)堿基的靶核苷酸互補(bǔ)的探針。
SEQ ID No.13accatctTcgccaca-與HNF-1α基因外顯子2區(qū)互補(bǔ)的探針，其中探針序列中間的T與野生型外顯子2的第1778位堿基配對(duì)，其側(cè)翼的探針序列與外顯子2的第1778位堿基的側(cè)翼序列完好地匹配。
SEQ ID No.14accatctCcgccaca-與在野生型外顯子2的第1778位堿基處包含點(diǎn)突變(A→G)的靶核苷酸互補(bǔ)的探針。
SEQ ID No.15cacaacaTcccacag-與HNF-1α基因外顯子2區(qū)互補(bǔ)的探針，其中探針序列中間的T與野生型外顯子2的第1812位堿基配對(duì)，其側(cè)翼的探針序列與外顯子2的第1812位堿基的側(cè)翼序列完好地匹配。
SEQ ID No.16cacaacaAcccacag-與在野生型外顯子2的第1812位堿基處包含點(diǎn)突變(A→T)的靶核苷酸互補(bǔ)的探針。
SEQ ID No.17gcgggccGccctgta-與HNF-1α基因外顯子2區(qū)互補(bǔ)的探針，其中探針序列中間的G與野生型外顯子2的第1910位堿基配對(duì)，其側(cè)翼的探針序列與外顯子2的第1910位堿基的側(cè)翼序列完好地匹配。
SEQ ID No.18gcgggccAccctgta-與在野生型外顯子2的第1910位堿基處包含點(diǎn)突變(C→T)的靶核苷酸互補(bǔ)的探針。
SEQ ID No.19acctctcGctgcttg-與HNF-1α基因外顯子2區(qū)互補(bǔ)的探針，其中探針序列中間的G與野生型外顯子2的第1940位堿基配對(duì)，其側(cè)翼的探針序列與外顯子2的第1940位堿基的側(cè)翼序列完好地匹配。
SEQ ID No.20acctctcActgcttg-與在野生型外顯子2的第1940位堿基處包含點(diǎn)突變(C→T)的靶核苷酸互補(bǔ)的探針。
SEQ ID No.21aaggggcGgaggaac-與HNF-1α基因外顯子3區(qū)互補(bǔ)的探針，其中探針序列中間的G與野生型外顯子3的第2659位堿基配對(duì)，其側(cè)翼的探針序列與外顯子3的第2659位堿基的側(cè)翼序列完好地匹配。
SEQ ID No.22aaggggcAgaggaac-與在野生型外顯子3的第2659位堿基處包含點(diǎn)突變(C→T)的靶核苷酸互補(bǔ)的探針。
SEQ ID No.23gaggaacCgtttcaa-與HNF-1α基因外顯子3區(qū)互補(bǔ)的探針，其中探針序列中間的C與野生型外顯子3的第2667位堿基配對(duì)，其側(cè)翼的探針序列與外顯子3的第2667位堿基的側(cè)翼序列完好地匹配。
SEQ ID No.24gaggaacTgtttcaa-與在野生型外顯子3的第2667位堿基處包含點(diǎn)突變(G→A)的靶核苷酸互補(bǔ)的探針。
SEQ ID No.25cacctccGtgacgag-與HNF-1α基因外顯子4區(qū)互補(bǔ)的探針，其中探針序列中間的G與野生型外顯子4的第3297位堿基配對(duì)，其側(cè)翼的探針序列與外顯子4的第3297位堿基的側(cè)翼序列完好地匹配。
SEQ ID No.26cacctccAtgacgag-與在野生型外顯子4的第3297位堿基處包含點(diǎn)突變(C→T)的靶核苷酸互補(bǔ)的探針。
SEQ ID No.27tagacacGcacctcc-與HNF-1α基因外顯子4區(qū)互補(bǔ)的探針，其中探針序列中間的G與野生型外顯子4的第3305位堿基配對(duì)，其側(cè)翼的探針序列與外顯子4的第3305位堿基的側(cè)翼序列完好地匹配。
SEQ ID No.28tagacacAcacctcc-與在野生型外顯子4的第3305位堿基處包含點(diǎn)突變(C→T)的靶核苷酸互補(bǔ)的探針。
SEQ ID No.29caaccggCgcaaaga-與HNF-1α基因外顯子4區(qū)互補(bǔ)的探針，其中探針序列中間的C與野生型外顯子4的第3332位堿基配對(duì)，其側(cè)翼的探針序列與外顯子4的第3332位堿基的側(cè)翼序列完好地匹配。
SEQ ID No.30caaccggTgcaaaga-與在野生型外顯子4的第3332位堿基處包含點(diǎn)突變(G→A)的靶核苷酸互補(bǔ)的探針。
SEQ ID No.31cctgagaTgccggcg-與HNF-1α基因外顯子9區(qū)互補(bǔ)的探針，其中探針序列中間的T與野生型外顯子9的第5613位堿基配對(duì)，其側(cè)翼的探針序列與外顯子9的第5613位堿基的側(cè)翼序列完好地匹配。
SEQ ID No.32cctgagaTtgccggc-與在野生型外顯子9的第5613位堿基之后直接插入堿基A所得的突變靶核苷酸互補(bǔ)的探針。
SEQ ID No.33tggcgctGagccggt-與HNF-1α基因外顯子9區(qū)互補(bǔ)的探針，其中探針序列中間的G與野生型外顯子9的第5688位堿基配對(duì)，其側(cè)翼的探針序列與外顯子9的第5688位堿基的側(cè)翼序列完好地匹配。
SEQ ID No.34tggcgctGagagccg-與在野生型外顯子9的第5688位堿基之后直接插入堿基T和C所得的突變的靶核苷酸互補(bǔ)的探針。
探針與靶核苷酸雜交反應(yīng)之后的掃描結(jié)果在圖1和圖2中顯示。圖1是用作靶核苷酸的全長野生型基因HNF-1α的結(jié)果。圖2是用作靶核苷酸的雜合子突變體的結(jié)果，該突變體是通過在HNF-1α基因外顯子9的第5613位堿基之后直接插入核苷酸A得到的。
在圖1和2中，對(duì)于各個(gè)相同探針在芯片上點(diǎn)6個(gè)斑點(diǎn)，最上面一排自左向右，將SEQ ID Nos.1，2，3和4探針固定為斑點(diǎn)。在下一排，SEQ IDNos.5，6，7和8探針以同樣的方式固定。剩余的直到SEQ ID No.34的探針以同樣的方式點(diǎn)在芯片上，這里，斑點(diǎn)的大小為170±5μm，斑點(diǎn)間隔調(diào)整為375μm。
在測定變異系數(shù)(CV)時(shí)，相同探針組中點(diǎn)與點(diǎn)之間的差異為8％，芯片與芯片之間的變異為10.6％。與常規(guī)具有25-30％的點(diǎn)對(duì)點(diǎn)變異系數(shù)的2D芯片相比，證實(shí)本發(fā)明應(yīng)用的3D固定技術(shù)可有效降低探針間的誤差。CV表示為偏離平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差百分比。
如圖1所示，與突變探針(即SEQ ID Nos.2，4，6，8，10，12，14，16，18，20，22，24，26，28，30，32和34)的固定斑點(diǎn)相比，野生型探針的固定斑點(diǎn)(即SEQ ID Nos.1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31和33)顯示強(qiáng)的熒光強(qiáng)度。因此，用作靶核苷酸的全長野生型基因HNF-1α與無突變體的野生型探針的堿基雜交。
如圖2所示，野生型探針(即SEQ ID Nos.1，3，5，7，9，11，13，15，17，19，21，23，25，27，29，31和33)的固定斑點(diǎn)觀察到的結(jié)果與圖1相似。然而，SEQ ID No.32探針(其是一突變探針)的固定的斑點(diǎn)，與圖1的結(jié)果不同，它顯示強(qiáng)的熒光強(qiáng)度?？扇菀椎罔b定在HNF-1α基因外顯子9區(qū)的第5613位核苷酸之后直接插入核苷酸A的插入突變。
實(shí)施例6利用在支持物上直接形成的基質(zhì)制備生物芯片根據(jù)本發(fā)明，基質(zhì)可直接在支持物上形成也可在與支持物分離的容器中制備。
在碳酸鹽緩沖液(0.25mM，pH9.5)中將寡核苷酸探針(5’-tgttctcttgtcttg-3’SEQ ID No.35)，實(shí)施例1中制備的具有環(huán)氧基的星狀聚乙二烯衍生物，和實(shí)施2中制備的肼交聯(lián)劑，以1∶8∶8的比例混合。調(diào)整寡核苷酸的濃度，使其不超過400μm。然后，將該混合溶液與等體積的DMSO混合，并通過點(diǎn)樣應(yīng)用到已經(jīng)過處理而暴露出酰胺基的玻璃表面。點(diǎn)樣后，將生物芯片放置于60℃溫度，40％濕度的烘箱中保溫1小時(shí)，接著用琥珀酸酐進(jìn)行后處理。后處理用以阻止玻璃表面未反應(yīng)的氨基，具有環(huán)氧基的星狀PEG衍生物的環(huán)氧基和探針的氨基的非特異性反應(yīng)。
在所得生物芯片上，進(jìn)行探針與靶核苷酸間的雜交反應(yīng)。掃描芯片表面的結(jié)果在圖3中顯示。這里，所用的寡核苷酸是與探針互補(bǔ)的人工寡核苷酸。圖3中，“C”針對(duì)的是該實(shí)施例中制備的生物芯片?！癇”針對(duì)的是實(shí)施例4中制備的生物芯片?！癆”為通過僅在玻璃支持物上點(diǎn)樣DNA溶液制備的生物芯片。如圖3所顯示的，生物芯片“C”顯示比生物芯片“B”的熒光強(qiáng)度大5-7倍，生物芯片“A”顯示比生物芯片“B”的熒光強(qiáng)度大2-3倍。
如上所述，根據(jù)本發(fā)明可制備具有下述結(jié)構(gòu)的3D生物芯片，其中該結(jié)構(gòu)自其表面向空間突出，芯片靈敏度大大增強(qiáng)。另外，本發(fā)明的生物芯片可以方便有效且低費(fèi)用地使用水溶液制備。
序列表序列表<110>三星電子株式會(huì)社(Samsung Electronics Co.，Ltd.)<120>利用具有環(huán)氧基的星狀聚乙二醇衍生物制備水凝膠生物芯片的方法<160>35<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>與HNF-1α基因啟動(dòng)子區(qū)互補(bǔ)的探針，其中中間的“t”堿基與野生型啟動(dòng)子第432位的堿基配對(duì)<400>1tgaactttgg acttc 15<210>2<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>與HNF-1α基因的啟動(dòng)子區(qū)互補(bǔ)的探針，所述啟動(dòng)子區(qū)中第432位的堿基帶有點(diǎn)突變(A-C)<400>2tgaacttggg acttc15<210>3<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>與HNF-1α基因啟動(dòng)子區(qū)互補(bǔ)的探針，其中中間的”g”堿基與野生型啟動(dòng)子第592位的堿基配對(duì)<400>3gttttggggg ggcag15<210>4<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>與HNF-1α基因的啟動(dòng)子區(qū)互補(bǔ)的探針，所述啟動(dòng)子區(qū)中第592位堿基有點(diǎn)突變(C-G)<400>4gttttggcgg ggcag 15<210>5<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>與HNF-1α基因外顯子1區(qū)互補(bǔ)的探針，其中中間“g”堿基與野生型外顯子1的第733位的堿基配對(duì)<400>5tgcagctggc tcagt 15<210>6<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>與其中第733位堿基點(diǎn)突變(C-T)的HNF-1α基因的外顯子1區(qū)互補(bǔ)的探針<400>6tgcagctagc tcagt15<210>7<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>與HNF-1α基因外顯子1區(qū)互補(bǔ)的探針，其中中間“g”堿基與野生型外顯子1的第806位堿基配對(duì)<400>7gcactgggtg agccg 15<210>8<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>與其中第806位堿基點(diǎn)突變(C-T)的HNF-1α基因的外顯子1區(qū)互補(bǔ)的探針<400>8gcactggatg agccg 15<210>9<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>與HNF-1α基因外顯子1區(qū)互補(bǔ)的探針，其中中間的“g”堿基與野生型外顯子1第856位堿基配對(duì)<400>9caagggggag tcctg 15<210>10<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>與其中第856位堿基點(diǎn)突變(C-T)的HNF-1α基因的外顯子1區(qū)互補(bǔ)的探針<400>10caaggggaag tcctg 15<210>11<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>與HNF-1α基因外顯子1區(qū)互補(bǔ)的探針，其中中間的“g”堿基與野生型外顯子1第875位堿基配對(duì)<400>11cggtcgaggg gagct 15<210>12<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>與其中第875-879位堿基缺失的HNF-1α基因的外顯子1區(qū)互補(bǔ)的探針<400>12ggcggtcgag ctggc 15<210>13<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>與HNF-α基因外顯子2區(qū)互補(bǔ)的探針，其中中間的“t”堿基與野生型外顯子2的第1778位堿基配對(duì)<400>13accatcttcg ccaca 15<210>14<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>與其中第1778位堿基具有點(diǎn)突變(A-G)的HNF-1α基因的外顯子2區(qū)互補(bǔ)的探針<400>14accatctccg ccaca 15<210>15<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>與HNF-1α基因的處顯子2區(qū)互補(bǔ)的探針，其中中間的“t”堿基與野生型外顯子2的第1812位堿基配對(duì)<400>15cacaacatcc cacag 15<210>16<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>與其中第1812位堿基具有點(diǎn)突變(A-T)的HNF-1α基因的外顯子2互補(bǔ)的探針<400>16cacaacaacc cacag 15<210>17<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>與HNF-1α基因互補(bǔ)的探針，其中中間的“g”堿基與野生型外顯子2第1910位堿基配對(duì)<400>17gcgggccgcc ctgta 15<210>18<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>與其中第1910位堿基具有點(diǎn)突變(C-T)的HNF-1α基因的外顯子2區(qū)互補(bǔ)的探針<400>18gcgggccacc ctgta 15<210>19<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>與HNF-1α基因的外顯子2區(qū)互補(bǔ)的探針，其中中間的“g”堿基與野生型外顯子2第1940位堿基配對(duì)<400>19acctctcgct gcttg 15<210>20<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>與其中第1940位堿基具有點(diǎn)突變(C-T)的HNF-1α基因的外顯子2區(qū)互補(bǔ)的探針<400>20acctctcact gcttg 15<210>21<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>與HNF-1α基因的處顯于3區(qū)互補(bǔ)的探針，其中中間的“g”堿基與野生型外顯子3的第2659位堿基配對(duì)<400>21aaggggcgga ggaac 15<210>22<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>與其中第2659位堿基具有點(diǎn)突變(C-T)的HNF-1α基因外顯子3區(qū)互補(bǔ)的探針<400>22aaggggcaga ggaac 15<210>23<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>與HNF-1α基因的外顯子3區(qū)互補(bǔ)的探針，其中中間的‘C’堿基與野生型外顯子3的第2667位堿基配對(duì)<400>23gaggaaccgt ttcaa 15<210>24<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>與其中第2667位堿基具有點(diǎn)突變(G-A)的HNF-1α基因的外顯子3區(qū)互補(bǔ)的探針<400>24gaggaactgt ttcaa 15<210>25<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>與HNF-1α基因外顯子4區(qū)互補(bǔ)的探針，其中中間的“g”堿基與野生型外顯子4的第3297位堿基配對(duì)<400>25cacctccgtg acgag 15<210>26<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>與其中第3297位堿基具有點(diǎn)突變(C-T)的HNF-1α基因的外顯子4區(qū)互補(bǔ)的探針<400>26cacct ccatg acgag 15<210>27<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>與HNF-1α基因外顯子4區(qū)互補(bǔ)的探針，其中中間的“g”堿基與野生型外顯子4的第3305位堿基配對(duì)<400>27tagacacgca cctcc 15<210>28<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>與其中第3305位堿基具有點(diǎn)突變(C-T)的HNF-10基因的外顯子4區(qū)互補(bǔ)的探針<400>28tagacacaca cctcc 15<210>29<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>與HNF-α基因外顯子4區(qū)互補(bǔ)的探針，其中中間的‘C’堿基與野生型外顯子4的第3332位堿基配對(duì)<400>29caaccggcgc aaaga 15<210>30<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>與其中第3332位堿基具有點(diǎn)突變(G-A)的HNF-1α基因的外顯子4區(qū)互補(bǔ)的探針<400>30caaccggtgc aaaga 15<210>31<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>與HNF-1α基因外顯子9區(qū)互補(bǔ)的探針，其中中間的“t”堿基與野生型外顯子9的5613位堿基配對(duì)<400>31cctgagatgc cggcg 15<210>32<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>與其中在外顯子9第5613位堿基后插入‘a(chǎn)’堿基的HNF-1α基因外顯子9區(qū)互補(bǔ)的探針<400>32cctgagattg ccggc 15<210>33<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>與HNF-1α基因的外顯子9區(qū)互補(bǔ)的探針，其中中間的‘g’堿基與野生型9的第5688位堿基配對(duì)<400>33tggcgctgag ccggt 15<210>34<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>與其中在外顯子9的第5688位堿基后插入‘tc’堿基的HNF-1α基因外顯子9區(qū)互補(bǔ)的探針<400>34tggcgctgag agccg 15<210>35<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的寡核苷酸探針<400>35tgttctcttg tcttg
權(quán)利要求
1.一種制備水凝膠生物芯片的方法，包括將在其末端具有環(huán)氧基團(tuán)的星狀聚乙二醇衍生物，親水的聚合交聯(lián)劑和探針在水溶液中混合以形成混合溶液；和將該混合溶液加到支持物上以形成水凝膠，使探針固定到支持物上。
2.權(quán)利要求1的方法，其中混合包括將在其末端具有環(huán)氧基團(tuán)的星狀聚乙二醇衍生物和親水的聚合交聯(lián)劑混合以形成基質(zhì)溶液；和將探針添加到基質(zhì)中以形成包含基質(zhì)溶液和探針溶液的混合溶液。
3.權(quán)利要求1的方法，其中在支持物上加混合溶液的步驟在溫度為約40-70℃且濕度約60-30％的條件下進(jìn)行。
4.權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的方法，其中親水聚合交聯(lián)劑的平均分子量約為60-100000，其是具有羥基，氨基或巰基的星狀聚乙二醇衍生物。
5.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法，其中探針是脫氧核糖核酸(DNA)，核糖核酸(RNA)，肽核酸(PNA)，蛋白質(zhì)或寡肽。
6.權(quán)利要求1或4中所述的方法，其中進(jìn)一步包括處理支持物表面以含有胺基基團(tuán)。
7.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法，其中形成支持物的材料選自玻璃，石英，硅，塑料，聚丙烯，聚碳酸酯和活化的丙烯酰胺。
8.權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法制備的水凝膠生物芯片。
9.一種檢測探針和靶物質(zhì)之間的結(jié)合的分析方法，包括將包含要結(jié)合探針的靶物質(zhì)的樣品加到權(quán)利要求1-4中任一項(xiàng)所述的方法制備的水凝膠生物芯片上；和檢測與探針特異結(jié)合的靶物質(zhì)。
10.權(quán)利要求9的分析方法，其中靶物質(zhì)是熒光標(biāo)記的生物分子。
全文摘要
本發(fā)明提供一種制備生物芯片的方法和由該方法制備的生物芯片。在制備生物芯片的方法中，在其末端具有環(huán)氧基團(tuán)的星狀聚乙二醇衍生物與低分子量的親水聚合物反應(yīng)以形成基質(zhì)，探針與該基質(zhì)共價(jià)結(jié)合并被固定在固體支持物上。所述生物芯片具有三維結(jié)構(gòu)，其自其表面向空間伸出，并改進(jìn)了芯片靈敏度。此外，所述生物芯片可以使用水溶液方便有效地制備，成本較低。
文檔編號(hào)G01N33/544GK1483083SQ02802541
公開日2004年3月17日 申請(qǐng)日期2002年8月30日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月1日
發(fā)明者楠 許, 許楠, 宋美貞, 樸鐘勉, 樸佳永 申請(qǐng)人:三星電子株式會(huì)社