專利名稱：靶核酸的檢測(cè)方法及核酸探針的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用了熒光能轉(zhuǎn)移的靶核酸的檢測(cè)方法及這一檢測(cè)方法中所用的核酸探針。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，遺傳基因的技術(shù)開(kāi)發(fā)工作開(kāi)展得轟轟烈烈。在醫(yī)療領(lǐng)域，通過(guò)解析與疾病有關(guān)的遺傳基因而可進(jìn)行分子級(jí)別的治療。伴隨著它的深入，根據(jù)遺傳基因的診斷結(jié)果而實(shí)現(xiàn)每一個(gè)患者的“個(gè)人化”醫(yī)療(tailor mademedicine)也正在實(shí)現(xiàn)。而且，在制藥領(lǐng)域，遺傳基因信息被用來(lái)解析生命分子(biomolecules)的機(jī)能、預(yù)測(cè)及確定相互作用等，而不斷地開(kāi)發(fā)出新型藥物。
對(duì)上述“個(gè)人化”醫(yī)療而言，疾病的標(biāo)記遺傳基因、成為患者體質(zhì)之標(biāo)志的遺傳基因的檢測(cè)技術(shù)是必須的。而且，所希望的遺傳基因的檢測(cè)技術(shù)是迅速地研究、開(kāi)發(fā)新藥所不可缺少的。還有，在農(nóng)業(yè)、食品行業(yè)，也有很多利用遺傳基因的檢測(cè)技術(shù)的例子，例如，檢查轉(zhuǎn)基因食品、確定肉類的產(chǎn)地等，都需要使用檢測(cè)技術(shù)。
到目前為止，在檢測(cè)所希望的遺傳基因或者搜索所希望的遺傳基因的時(shí)候，利用的是Southern印跡雜交法、Northern印跡雜交法及差異顯示(differential display)法等。最近，使用的是被稱為DNA微陣列的微小核酸檢測(cè)用傳感器。DNA微陣列這一技術(shù)，在利用核酸之間的雜交檢測(cè)靶核酸這一點(diǎn)上和上述現(xiàn)有技術(shù)是一樣的。而它卻可一次處理例如玻片那樣微小的基片上幾千種到幾十萬(wàn)種這樣龐大的核酸片段，所以在要調(diào)查大量遺傳基因的存在或者表達(dá)的情況下，利用DNA微陣列是很有效的。
現(xiàn)在市場(chǎng)上在銷售各種類型的DNA微陣列。利用這些DNA微陣列解析遺傳基因的方法大致如下。
首先，將要檢測(cè)的核酸或者是由與核酸片段互補(bǔ)的序列構(gòu)成的核酸探針固定到玻片等基片上。其次，讓該核酸探針與由熒光物質(zhì)等標(biāo)記的靶核酸雜交，之后再檢測(cè)出已雜交的靶核酸的信號(hào)。這樣就能將所希望的遺傳基因檢測(cè)出來(lái)，對(duì)它的表達(dá)模式進(jìn)行分析等。
然而，在使用DNA微陣列的方法中，如上所述，首先需要的是，將核酸探針高密度地固定到基片上這樣的高度技術(shù)。還有，因?yàn)樵诂F(xiàn)在的固定化技術(shù)中，固定在基片上的核酸探針的量的偏差很大，所以在查看遺傳基因的表達(dá)模式的時(shí)候，很難進(jìn)行定量解析。
而且，必須事先由使用者對(duì)包含靶核酸的樣品進(jìn)行標(biāo)記，而標(biāo)記又需要專用的藥劑。例如，現(xiàn)在最常用的標(biāo)記方法為，用標(biāo)記物質(zhì)Cy3或者Cy5來(lái)標(biāo)記靶核酸中的胸腺嘧啶的一部分。在這一方法下，標(biāo)記物質(zhì)的取入此例隨核酸的排列、長(zhǎng)度不同而不同，所以定量分析更加困難。
為解決上述問(wèn)題，有人提出了利用兩種物質(zhì)間的熒光能轉(zhuǎn)移這樣的方法。該熒光能轉(zhuǎn)移，在一種物質(zhì)為熒光物質(zhì)(施主熒光物質(zhì))，從該熒光物質(zhì)中發(fā)出的波長(zhǎng)與另一種物質(zhì)(受主物質(zhì))的吸收波長(zhǎng)重疊的情況下發(fā)生。換句話說(shuō)，因?yàn)槿魞烧呖康米銐蚪?，則即使用激活光來(lái)照射施主熒光物質(zhì)，從施主熒光物質(zhì)發(fā)出的熒光又被受主物質(zhì)吸收，所以結(jié)果是幾乎檢測(cè)不到從施主熒光物質(zhì)發(fā)出的熒光。這里，受主物質(zhì)為吸收由施主熒光物質(zhì)發(fā)出的熒光的物質(zhì)即可，還可為以施主熒光物質(zhì)的熒光作激活光的熒光物質(zhì)。在這種情況下，即使施主熒光物質(zhì)由于激活光的照射而發(fā)出熒光，該熒光也成為受主物質(zhì)的激活光，所以結(jié)果是幾乎檢測(cè)不到從施主熒光物質(zhì)發(fā)出的熒光，僅能檢測(cè)到受主物質(zhì)的熒光。
下述已提出的方法，即為這樣的利用了兩種物質(zhì)間的熒光能轉(zhuǎn)移的核酸檢測(cè)方法。
在特公平05-15439號(hào)公報(bào)中公開(kāi)了一種方法，在這一方法下，使用由與靶核酸互補(bǔ)的序列構(gòu)成且由形成熒光能轉(zhuǎn)移對(duì)的兩種物質(zhì)標(biāo)記的核酸探針。
在這一方法下，準(zhǔn)備具有與靶核酸的堿基序列中包含特定的限制性酶(限制性內(nèi)切核酸酶)的識(shí)別部位的序列互補(bǔ)的序列的核酸探針。該核酸探針由上述施主熒光物質(zhì)和受主物質(zhì)標(biāo)記，該施主熒光物質(zhì)和該受主物質(zhì)設(shè)在上述限制性酶的切斷位置的兩邊。將樣品和核酸探針混合后，即發(fā)生核酸的熱變性和再結(jié)合。
這樣以來(lái)，在樣品中含有靶核酸的情況下，靶核酸-核酸探針對(duì)被限制性酶切斷，施主熒光物質(zhì)和受主物質(zhì)就被分離開(kāi)。結(jié)果是，檢測(cè)出施主熒光物質(zhì)的熒光后，也就檢測(cè)出樣品中所含的靶核酸了。
因?yàn)榕c微陣列相比，在這一方法下能控制檢測(cè)核酸所用的核酸探針的量，所以可從所測(cè)得的熒光強(qiáng)度求出靶核酸的濃度。
然而，在這一方法下，必須這樣來(lái)設(shè)計(jì)核酸探針的序列，即保證在形成靶核酸和雙鏈的時(shí)候，一定形成某一限制性酶的識(shí)別部位。因此，核酸探針的設(shè)計(jì)就受到很大的限制，有時(shí)候，在某些靶核酸的序列下還不能采用該方法。
特開(kāi)平11-123083號(hào)公報(bào)所公開(kāi)的方法就試圖解決這一問(wèn)題。在這一方法下，也是使用由形成熒光能轉(zhuǎn)移對(duì)的兩種物質(zhì)標(biāo)記的核酸探針。
是這樣來(lái)設(shè)計(jì)在該方法下所使用的核酸探針的，即讓它具有和靶核酸的3’末端附近的序列互補(bǔ)的序列，且在與靶核酸雜交的時(shí)候5’末端突出。該5’一側(cè)的單鏈序列是這樣設(shè)計(jì)的，即在由于多聚酶伸長(zhǎng)反應(yīng)而形成互補(bǔ)鏈的情況下，形成任意的限制性酶的識(shí)別部位。而且，有可能形成那一限制性酶的識(shí)別部位的部分被布置在由施主熒光物質(zhì)修飾的堿基與由受主物質(zhì)修飾的堿基之間。
這樣以來(lái)，若在多聚酶伸長(zhǎng)反應(yīng)之后，用限制性酶處理樣品，則存在靶核酸時(shí)，就能觀測(cè)到施主熒光物質(zhì)的熒光。
另一方面，若樣品中不含靶核酸，核酸探針就還是維持原來(lái)的單鏈狀態(tài)，施主熒光物質(zhì)和受主物質(zhì)保持接近的樣子不變，所以就檢測(cè)不出熒光。
根據(jù)這一方法，因?yàn)榭蓪⒊蔀橄拗菩悦傅淖R(shí)別部位的序列自由地組合到核酸探針中，所以與特公平05-15439號(hào)公報(bào)中所公開(kāi)的方法相比，可使核酸探針的設(shè)計(jì)自由度增大。
然而，和特公平05-15439號(hào)公報(bào)中所公開(kāi)的方法相比，特開(kāi)平11-123083號(hào)公報(bào)中所公開(kāi)的方法中加上了多聚酶伸長(zhǎng)反應(yīng)的操作，所以檢測(cè)程序變得更復(fù)雜，檢測(cè)時(shí)間也變得更長(zhǎng)。除此之外，多聚酶等試劑也很貴，而造成檢查成本上升。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的，在于提供一種不管靶核酸的序列如何都適用，且容易進(jìn)行的靶核酸的檢測(cè)方法及該檢測(cè)方法下所使用的材料。
本發(fā)明的靶核酸的檢測(cè)方法，為一種檢測(cè)樣品溶液中的靶核酸的方法，包括以下幾個(gè)步驟，準(zhǔn)備核酸探針的步驟(a)，該核酸探針由施主熒光物質(zhì)及吸收所述施主熒光物質(zhì)的熒光并被布置成可以產(chǎn)生熒光能轉(zhuǎn)移的受主物質(zhì)標(biāo)記，具有與所述靶核酸的至少一部分互補(bǔ)的序列。將所述樣品溶液和所述核酸探針混合一下，在所述靶核酸和所述核酸探針雜交而能夠形成核酸探針-靶核酸復(fù)合體的條件下保持所述樣品溶液的步驟(b)。在所述步驟(b)后，讓和序列無(wú)關(guān)的核酸酶對(duì)所述樣品溶液起作用，而從所述樣品溶液的熒光強(qiáng)度的變化檢測(cè)出所述靶核酸的步驟(c)。
根據(jù)這一方法，在所述步驟(c)中，因?yàn)樽尯托蛄袩o(wú)關(guān)的核酸酶起作用了，所以核酸探針的設(shè)計(jì)自由度增大。還有，因沒(méi)有必要使用所多聚酶伸長(zhǎng)反應(yīng)了，所以能同時(shí)提高現(xiàn)有方法下未能提高的核酸探針的設(shè)計(jì)自由度和操作簡(jiǎn)便性。
所述和序列無(wú)關(guān)的核酸酶為雙鏈特異核酸外切酶，所以在步驟(b)中靶核酸存在于樣品溶液中的時(shí)候所形成的核酸探針-靶核酸復(fù)合體被有選擇地從雙鏈的末端部分消化掉。結(jié)果是，因由施主熒光物質(zhì)修飾的堿基游離，而使樣品溶液的熒光強(qiáng)度發(fā)生變化。因?yàn)樵谶@一方法下，單鏈核酸探針被切斷，所以不僅能夠定量地檢測(cè)出靶核酸，還能通過(guò)改進(jìn)核酸探針的修飾方法，而使檢測(cè)靈敏度等提高。
最好是，所述雙鏈特異核酸外切酶為核酸外切酶III或者是λ核酸外切酶。
構(gòu)成所述核酸探針的堿基中多個(gè)堿基由所述施主熒光物質(zhì)標(biāo)記以后，核酸探針-靶核酸復(fù)合體被消化時(shí)，在樣品溶液中游離的施主熒光物質(zhì)會(huì)更多，所以可提高靶核酸的檢測(cè)靈敏度。
所述和序列無(wú)關(guān)的核酸酶為單鏈特異核酸酶以后，該所述和序列無(wú)關(guān)的核酸酶就能消化包含雜交后以單鏈狀態(tài)殘留著的核酸探針的單鏈核酸。根據(jù)這一方法，不僅能夠定量地檢測(cè)出靶核酸，還能進(jìn)一步地提高核酸探針的設(shè)計(jì)自由度。
最好是，所述單鏈特異核酸酶，為從核酸外切酶VII、S1核酸酶及綠豆核酸酶、蛇毒核酸酶、脾臟磷酸二酯酶、核酸外切酶I、葡萄球菌核酸酶及鏈孢霉核酸酶中選出的一種。
在所述步驟(c)中，可利用所述施主熒光物質(zhì)發(fā)出的熒光強(qiáng)度的變化檢測(cè)靶核酸。
在所述步驟(c)中，也可利用所述受主物質(zhì)發(fā)出的熒光強(qiáng)度的變化檢測(cè)靶核酸。
在所述步驟(a)之后且所述步驟(b)之前，還包括這樣的步驟即在所述樣品溶液中含有靶核酸的情況下，以所述核酸探針為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)而擴(kuò)增所述靶核酸。這樣便可提高檢測(cè)靈敏度。
本發(fā)明的核酸探針，被用在使用和序列無(wú)關(guān)的核酸酶檢測(cè)靶核酸的檢測(cè)方法中，且在它單獨(dú)存在時(shí)由發(fā)出熒光的施主熒光物質(zhì)及吸收所述熒光的受主物質(zhì)標(biāo)記的核酸探針，它具有與所述靶核酸互補(bǔ)的堿基序列，多個(gè)堿基被所述施主熒光物質(zhì)修飾。從而可提高檢測(cè)靈敏度。
附圖的簡(jiǎn)單說(shuō)明

圖1(a)～圖1(c)為顯示本發(fā)明的第1個(gè)實(shí)施例所涉及的靶核酸的檢測(cè)方法的圖。
圖2(a)～圖2(c)為示意地顯示在本發(fā)明的靶核酸的檢測(cè)方法中所使用的核酸探針的圖。
圖3(a)～圖3(c)為顯示本發(fā)明的第2個(gè)實(shí)施例所涉及的靶核酸的檢測(cè)方法的圖。
圖4為顯示在第1個(gè)實(shí)施例所涉及的靶核酸的檢測(cè)方法中，樣品A～D的熒光強(qiáng)度在樣品D的熒光強(qiáng)度中所占的百分比。
圖5為顯示在第2個(gè)實(shí)施例所涉及的靶核酸的檢測(cè)方法中，樣品E～G的熒光強(qiáng)度在樣品E的熒光強(qiáng)度中所占的百分比。
具體實(shí)施例方式
-對(duì)檢測(cè)方法的探討-本案發(fā)明人討論了固定核酸探針的方法及檢測(cè)核酸時(shí)用熒光以外的物質(zhì)標(biāo)記的方法，這些都屬于不管靶核酸的序列如何也適用且很容易進(jìn)行的靶核酸的檢測(cè)方法。結(jié)果是，從能使用市場(chǎng)上銷售的試劑及操作的簡(jiǎn)單性等來(lái)看，采用了使用施主熒光物質(zhì)和受主物質(zhì)的檢測(cè)方法。
(第1個(gè)實(shí)施例)參考附圖，說(shuō)明本發(fā)明的第1個(gè)實(shí)施例所涉及的靶核酸的檢測(cè)方法。
圖1(a)～圖1(c)為顯示本發(fā)明的第1個(gè)實(shí)施例所涉及的靶核酸的檢測(cè)方法的圖。
首先，對(duì)本發(fā)明中所用的核酸探針進(jìn)行說(shuō)明。
如該圖所示，本方法中所用的核酸探針，為通常的單鏈DNA(脫氧核糖核酸)或者RNA(核糖核酸)，由形成熒光能轉(zhuǎn)移對(duì)的施主熒光物質(zhì)2和受主物質(zhì)3標(biāo)記。這樣的核酸探針1可由通常的化學(xué)合成法或者遺傳基因工學(xué)手法得到。也有使用市場(chǎng)上銷售的序列作核酸探針的時(shí)候。
該核酸探針1，具有與靶核酸序列中的任意部分互補(bǔ)的序列。
施主熒光物質(zhì)和受主物質(zhì)可為下述組合。異硫氰酸熒光素(FITCfluorescein isothiocynate)/四甲基異硫氰酸羅丹明(TRITCtetramethylrhodamine isothiocynate)、異硫氰酸熒光素(FITC)/德克薩斯紅(Texas red)、異硫氰酸熒光素(FITC)/N-羥基琥珀酰亞胺基1-芘丁基(PYBN-hydroxysuccinimidyl 1-pyrenebutylate)、異硫氰酸熒光素(FITC)/曙紅異硫氰酸(EITCeosin isothiocynate)、N-羥基琥珀酰亞胺基1-芘磺酸鹽(PYSN-hydroxysuccinimidyl1-pyrenesulfonate)/異硫氰酸熒光素、異硫氰酸熒光素/羅丹明(rhodamaine)X、異硫氰酸熒光素/四甲基羅丹明(TAMRAtetramethylrhodamin)、N-(4-氨基丁基1-乙基異氨基苯二酰一肼)(ABEIN-(4-aminobutyl-N-ethylisoluminol)/四甲基羅丹明、及BPTA-鋱/Cy3。但并不限于這些例子。換句話說(shuō)，只要滿足被激活的施主熒光物質(zhì)的熒光波長(zhǎng)與受主物質(zhì)的吸收波長(zhǎng)或者激活光波長(zhǎng)重疊這樣的條件，任意物質(zhì)的組合都是可以的。還有，施主熒光物質(zhì)的激活光、熒光或者是受主物質(zhì)為熒光物質(zhì)的情況下的熒光等，除可為可見(jiàn)光以外，還可為紅外線、紫外線等。例如，即使是發(fā)出Cy5(N，N修飾苯四甲基吲哚二碳染料Benztetrametyl-indodicarbocyanine)那樣的近紅外線的熒光的物質(zhì)，例如可將BHHCT-銪和ROX組合起來(lái)使用。
在本發(fā)明的實(shí)施例中，以FITC/TRITC之組合為例。另外，F(xiàn)ITC的激活光、熒光的波長(zhǎng)分別為490nm、520nm。TRITC的激活光、熒光的波長(zhǎng)分別為541nm、572nm。用這一行業(yè)所共知的方法將這些標(biāo)記用物質(zhì)引入到核酸探針中。
還有，核酸探針的標(biāo)記位置可以是任意的，但為了產(chǎn)生熒光能轉(zhuǎn)移，最好是使施主熒光物質(zhì)和受主物質(zhì)之間的間隔在24～26個(gè)堿基之內(nèi)。需提一下，如下所述，核酸探針中的標(biāo)記用物質(zhì)的對(duì)數(shù)對(duì)靶核酸的檢測(cè)靈敏度、檢測(cè)時(shí)間都有影響。
按上述設(shè)計(jì)的核酸探針在反應(yīng)液中溶解。這些核酸探針只要在它所需要的那一濃度下溶解即可，而不必象微陣列那樣將它固定到基片等固體層上。
其次，對(duì)使用了上述核酸探針的本實(shí)施例的靶核酸的檢測(cè)程序加以說(shuō)明。
首先，如圖1(a)所示，準(zhǔn)備包括由施主熒光物質(zhì)2及受主物質(zhì)3標(biāo)記的核酸探針1的溶液(以下稱其為“探針溶液”)。雖然未圖示，同時(shí)也準(zhǔn)備好樣品溶液。在該檢測(cè)方法中，可用從生物材料中提取的DNA、mRNA或者是從mRNA制成的cDNA等作樣品。因?yàn)镽NA不太穩(wěn)定，所以實(shí)際上最好是使用DNA或者cDNA。例如，在確定患者的遺傳基因類型的情況等下可用DNA作樣品，而在要查一查細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的DNA的情況下可用cDNA作樣品。
其次，如圖1(b)所示，在反應(yīng)槽4內(nèi)將探針溶液和樣品溶液混合起來(lái)，在適當(dāng)?shù)臈l件下進(jìn)行充分的雜交反應(yīng)。需提一下，在該圖中，為便于理解，示出的是樣品溶液中含有靶核酸5的情況。
在該操作中，在樣品溶液中所含的核酸為雙鏈的情況下，先通過(guò)加熱或者強(qiáng)堿讓它變性為單鏈狀態(tài)以后，再進(jìn)行雜交。樣品中的核酸的變性條件由同行業(yè)的人用已知的方法進(jìn)行。核酸探針和靶核酸的雜交，可利用由Sambrook等人發(fā)表的(1989)Molecular CloningA LaboratoryManual、第2版、第1～3卷、Cold Spring Harbor laboratory等實(shí)驗(yàn)書中所敘述的已知方法進(jìn)行。其中之一例為雜交在所謂的“嚴(yán)格度”條件下進(jìn)行。例如，讓反應(yīng)液的pH在7.0以上8.3以下，鈉離子的鹽濃度約在0.01M以上1.0M以下。當(dāng)核酸探針1有10～50個(gè)核苷酸，很短的情況下，至少在30℃下進(jìn)行雜交；而當(dāng)它超過(guò)50個(gè)核苷酸的時(shí)候，則至少在60℃下進(jìn)行雜交?！皣?yán)格度”條件還可通過(guò)添加甲醛那樣的不穩(wěn)定劑來(lái)得到，此時(shí)所采用的溫度可以較低。
通過(guò)本操作，在靶核酸5存在于樣品中的情況下，核酸探針1和靶核酸5的互補(bǔ)部分進(jìn)行雜交，而形成長(zhǎng)度的一部分或者全長(zhǎng)為雙鏈的核酸探針-靶核酸復(fù)合體6。在這之后用核酸外切酶進(jìn)行處理的時(shí)候，可將核酸探針1設(shè)計(jì)成它的3’末端在雜交時(shí)不突出3個(gè)以上的堿基，雜交到靶核酸5中任一部分。
其次，如圖1(c)所示，將對(duì)雙鏈核酸特異的核酸外切酶7加到反應(yīng)液中，將核酸探針-靶核酸復(fù)合體6切斷。這是本實(shí)施例的最大的特征。
因?yàn)楹怂嵬馇忻?從末端部分開(kāi)始依次將核酸中形成雙鏈的部分切斷，所以產(chǎn)生了由施主熒光物質(zhì)2標(biāo)記的核酸片段9和由受主物質(zhì)3標(biāo)記的核酸片段。這樣一來(lái)，施主熒光物質(zhì)2和受主物質(zhì)3間的距離就增大，熒光能也就不會(huì)從施主熒光物質(zhì)2轉(zhuǎn)移到受主物質(zhì)3了。因此，若在樣品溶液中含有靶核酸5的情況下，施主熒光物質(zhì)2的激活光給出以后，施主熒光物質(zhì)2的熒光強(qiáng)度就增大。
另一方面，在樣品溶液中不含靶核酸5的情況下，核酸探針1就成為單鏈游離的狀態(tài)，而不會(huì)由雙鏈特異核酸外切酶切斷。因此，也就看不到施主熒光物質(zhì)2的熒光強(qiáng)度有變化。
本操作中所使用的核酸外切酶之例，例如有核酸外切酶III、λ核酸外切酶等。核酸外切酶III，識(shí)別出DNA的雙鏈部分，并從3’末端朝著5’的方向?qū)NA切斷，而產(chǎn)生單核苷酸。此時(shí)，核酸外切酶III，分別在雙鏈DNA的平滑末端從一個(gè)鏈3’側(cè)開(kāi)始切斷DNA，在3個(gè)堿基以下的3’突出末端從突出的鏈3’末端切斷DNA，或者是在5’突出末端從突出的鏈的互補(bǔ)鏈3’末端切斷DNA。因此，在本操作中使用核酸外切酶III的情況下，只要在核酸探針-靶核酸復(fù)合體6，核酸探針1的3’末端堿基不突出4個(gè)以上，將核酸探針1設(shè)計(jì)成與靶核酸5的哪一個(gè)部分雜交都可以。
另外，λ核酸外切酶識(shí)別出雙鏈DNA，從5’末端朝著3’方向切斷DNA。需提一下，除此以外，只要是雙鏈特異核酸外切酶，就可被用到本其次，圖1(c)所示的核酸外切酶處理結(jié)束以后，一測(cè)施主熒光物質(zhì)2的熒光強(qiáng)度，就能檢測(cè)到樣品中有無(wú)靶核酸5。這里，因?yàn)橹灰獙⒎磻?yīng)液中的核酸探針1的濃度設(shè)在靶核酸5的濃度以上，靶核酸5的濃度和熒光強(qiáng)度就有一定的關(guān)系了，所以能做出檢量線(calibration)而定量地檢測(cè)靶核酸5。
還有，在受主物質(zhì)3也是熒光物質(zhì)的情況下，在進(jìn)行完圖1(c)所示的核酸外切酶處理后，受主物質(zhì)3的熒光強(qiáng)度下降。因此而可通過(guò)分析那一變化，定量地檢測(cè)出樣品中的靶核酸5。與觀測(cè)施主熒光物質(zhì)2的熒光的方法相比，在某些反應(yīng)條件下這一方法下的定量分析的精度會(huì)更好。
如上所述，根據(jù)本實(shí)施例的靶核酸的檢測(cè)方法，因?yàn)槟軌蚨康貦z測(cè)出樣品中的靶核酸，故可進(jìn)行各種各樣的要求定量性的檢查。例如，查看組織中的靶遺傳基因的表達(dá)量、確定對(duì)感染癥狀的檢查狀態(tài)等時(shí)，都可使用該檢測(cè)方法。
還有，與特開(kāi)平11-123083號(hào)公報(bào)中所公開(kāi)的現(xiàn)有例相比，在本實(shí)施例中的方法中，不需要進(jìn)行多聚酶伸長(zhǎng)反應(yīng)了，而且核酸探針的設(shè)計(jì)自由度也提高了，故不管是具有什么序列的靶核酸，都能在短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)出來(lái)。
需提一下，在本實(shí)施例的方法下，在想同時(shí)檢測(cè)出多個(gè)靶核酸的情況下，使用熒光波長(zhǎng)互異的施主熒光物質(zhì)-受主物質(zhì)對(duì)即可。換句話說(shuō)，通過(guò)用發(fā)出不同波長(zhǎng)的熒光的施主熒光物質(zhì)-受主物質(zhì)對(duì)來(lái)標(biāo)記不同的靶核酸，就能同時(shí)定量地檢測(cè)出多個(gè)靶核酸。只是因施主熒光物質(zhì)-受主物質(zhì)對(duì)是有限的，所以該方法在靶核酸的數(shù)量被限制在幾種的情況下用是很理想的。
還有，根據(jù)本實(shí)施例的方法，因?yàn)榭蛇M(jìn)行以核酸探針為引物PCR，事先將靶核酸擴(kuò)增，所以可根據(jù)需要提高檢測(cè)靈敏度。該P(yáng)CR，可用例如以已標(biāo)記的核酸探針作編碼鏈一側(cè)的引物，以與靶核酸的非編碼鏈互補(bǔ)的序列的DNA片段為下游側(cè)的引物這樣的眾人所知的方法來(lái)進(jìn)行。
還有，根據(jù)本實(shí)施例中的靶核酸的檢測(cè)方法，還可通過(guò)在核酸探針的標(biāo)記方法上下工夫(后述)而提高檢測(cè)靈敏度，縮短反應(yīng)時(shí)間，并能對(duì)具體情況進(jìn)行具體的處理。因此，與特開(kāi)平11-123083號(hào)公報(bào)中所公開(kāi)的方法及特公平05-15439號(hào)公報(bào)中所公開(kāi)的方法相比，該實(shí)施例能夠提高檢測(cè)靈敏度，縮短反應(yīng)時(shí)間。
-對(duì)核酸探針的標(biāo)記部位的探討-本案發(fā)明人，對(duì)在本實(shí)施例中的靶核酸的檢測(cè)方法下，核酸探針的標(biāo)記位置及標(biāo)記狀態(tài)影響檢測(cè)時(shí)間及檢測(cè)靈敏度的可能性問(wèn)題進(jìn)行了探討。
圖2(a)～圖2(c)為顯示用于標(biāo)記的施主熒光物質(zhì)及受主物質(zhì)的位置或者對(duì)數(shù)不同的核酸探針的圖。
因?yàn)殡p鏈特異核酸外切酶從末端部消化雙鏈狀態(tài)的DNA，所以一般認(rèn)為與識(shí)別核酸探針末端附近以外的堿基相比，識(shí)別核酸探針末端附近的堿基的時(shí)候能夠縮短檢測(cè)時(shí)間。
為確認(rèn)它，準(zhǔn)備了圖2(a)所示那樣的、由受主物質(zhì)3或者施主熒光物質(zhì)2標(biāo)記的核酸探針，和由施主熒光物質(zhì)2及受主物質(zhì)3標(biāo)記的核酸探針，進(jìn)行了本實(shí)施例的檢查方法。使用λ核酸外切酶作了核酸外切酶，酶反應(yīng)是在僅在5’→3’方向切斷DNA的條件下進(jìn)行的。結(jié)果得知，使用在5’末端附近布置受主物質(zhì)3或者施主熒光物質(zhì)2的核酸探針的時(shí)候，反應(yīng)時(shí)間由于核酸外切酶而縮短了。
還有，在使用在3’→5’方向上切斷DNA的核酸外切酶III作核酸外切酶的情況下，使用在3’末端附近布置受施主熒光物質(zhì)2及受主物質(zhì)3的核酸探針的時(shí)候，可使核酸外切酶的反應(yīng)時(shí)間最短。
很明顯，若根據(jù)所使用的核酸外切酶的特性來(lái)決定用施主熒光物質(zhì)2或者受主物質(zhì)3標(biāo)記5’末端附近的堿基或者3’末端附近的堿基，就能使靶核酸的檢測(cè)時(shí)間縮短。需提一下，只要施主熒光物質(zhì)2或者受主物質(zhì)3成對(duì)，用施主熒光物質(zhì)2、受主物質(zhì)3中的任一熒光物質(zhì)標(biāo)記末端部的堿基都可以。
其次，本案發(fā)明人，還探討了若用施主熒光物質(zhì)2標(biāo)記多個(gè)堿基，能否提高本實(shí)施例的檢測(cè)靈敏度的問(wèn)題。
為進(jìn)行探討，使用了圖2(c)所示的由多對(duì)施主熒光物質(zhì)2和受主物質(zhì)3標(biāo)記的核酸探針和僅由一對(duì)施主熒光物質(zhì)2和受主物質(zhì)3標(biāo)記的核酸探針，對(duì)靶核酸的檢測(cè)靈敏度進(jìn)行了比較。
結(jié)果是，使用由多對(duì)施主熒光物質(zhì)2和受主物質(zhì)3標(biāo)記的核酸探針時(shí)，能夠提高靶核酸的檢測(cè)靈敏度。這是因?yàn)樵谶@種情況下一個(gè)分子的核酸探針被分解以后，游離的施主熒光物質(zhì)增多的緣故。需提一下，最好是，交替著布置施主熒光物質(zhì)2和受主物質(zhì)3。只要能抑制來(lái)自處于未分解狀態(tài)的核酸探針的施主熒光物質(zhì)的熒光，便可采用和上述不一樣的布置。
如上所述，在本實(shí)施例的靶核酸的檢測(cè)方法中，使用由多對(duì)施主熒光物質(zhì)2和受主物質(zhì)3標(biāo)記的核酸探針以后，就能提高檢測(cè)靈敏度。與此相對(duì)，在使用核酸內(nèi)切酶的現(xiàn)有的檢測(cè)方法下，因?yàn)楹怂崽结?靶核酸復(fù)合體中只有一處被切斷，所以即使使用上述核酸探針也不能提高檢測(cè)靈敏度。
需提一下，圖2(a)～圖2(c)所示的核酸探針，可被用到本發(fā)明中所有的靶核酸的檢測(cè)方法中。
(第2個(gè)實(shí)施例)說(shuō)明使用對(duì)單鏈核酸特異且和序列無(wú)關(guān)的核酸酶，檢測(cè)本發(fā)明的第2個(gè)實(shí)施例所涉及的靶核酸的檢測(cè)方法。
和第1個(gè)實(shí)施例一樣，在本實(shí)施例的靶核酸的檢測(cè)方法中，也是使用用形成熒光能對(duì)的施主熒光物質(zhì)及受主物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記的核酸探針。而且，該核酸探針具有與靶核酸的一部分序列或者所有序列互補(bǔ)的序列。下面，說(shuō)明本實(shí)施例中的靶核酸的檢測(cè)程序。
圖3(a)～圖3(c)為顯示本發(fā)明的第2個(gè)實(shí)施例所涉及的靶核酸的檢測(cè)方法的圖。
首先，如圖3(a)所示，準(zhǔn)備含有核酸探針11的溶液(以下稱其為“探針溶液”)。雖然未圖示，同時(shí)也準(zhǔn)備好樣品溶液。不必將該核酸探針11固定到基片等上。
其次，如圖3(b)所示，在反應(yīng)槽4內(nèi)將探針溶液和樣品溶液混合起來(lái)，在適當(dāng)?shù)臈l件下進(jìn)行充分的雜交反應(yīng)。通過(guò)本操作，在靶核酸5存在于樣品中的情況下，核酸探針11和靶核酸5的互補(bǔ)部分進(jìn)行雜交，而形成長(zhǎng)度的一部分或者全長(zhǎng)為雙鏈的核酸探針-靶核酸復(fù)合體12。本操作的條件和第1個(gè)實(shí)施例中的條件一樣。
其次，如圖3(c)所示，將對(duì)單鏈核酸特異的核酸外切酶13加到反應(yīng)液中，僅將含有沒(méi)進(jìn)行雜交反應(yīng)的單鏈狀態(tài)的核酸探針11的單鏈核酸切斷。這里所用的核酸酶13既可為核酸內(nèi)切酶，又可為核酸外切酶。例如有S1核酸酶、綠豆核酸酶這些對(duì)單鏈核酸特異的核酸內(nèi)切酶、或者是核酸外切酶VII這樣的對(duì)單鏈核酸特異的核酸外切酶，且是從兩個(gè)方向切斷核酸。從成本、酶活性等方面來(lái)考慮的話，最好是使用這些酶，除此以外，只要是對(duì)單鏈核酸起作用、對(duì)雙鏈核酸卻不起作用的核酸酶都可用到這一方法中。例如，對(duì)單鏈特異的其他核酸酶有蛇毒核酸酶(3’→5’)、脾臟磷酸二酯酶(5’→3’)及核酸外切酶I(3’→5’)這些核酸外切酶，及葡萄球菌核酸酶及鏈孢霉核酸酶等這些核酸內(nèi)切酶等。只是因?yàn)檠貜?’到5’這樣的方向切斷核酸的核酸外切酶，也將核酸探針-靶核酸復(fù)合體6的3’側(cè)的突出末端切斷，故在使用這樣的3’→5’核酸外切酶的情況下，有必要設(shè)計(jì)成靶核酸5的標(biāo)記部位不突出的樣子。
在本操作中，用核酸酶13進(jìn)行處理以后，未雜交的核酸探針11就被切斷，由施主熒光物質(zhì)2標(biāo)記的熒光標(biāo)記核酸片段15、由受主物質(zhì)3標(biāo)記的受主標(biāo)記核酸片段14及核酸片段16便在溶液中游離。于是，因?yàn)槭┲鳠晒馕镔|(zhì)2和受主物質(zhì)3間的距離增大，而能觀測(cè)到施主熒光物質(zhì)2的熒光。
另一方面，核酸探針-靶核酸復(fù)合體12中雙鏈部分不被切斷。
正因?yàn)殡S著樣品中所含的靶核酸5濃度的增大，游離狀態(tài)的施主熒光物質(zhì)2濃度減少，所以便可通過(guò)測(cè)量施主熒光物質(zhì)2的熒光強(qiáng)度來(lái)定量地檢測(cè)出靶核酸5。例如，準(zhǔn)備樣品溶液和不加樣品的控制液并比較二者的熒光強(qiáng)度，就能知道有多少核酸探針對(duì)它和靶核酸間的雜交反應(yīng)做出了貢獻(xiàn)。這樣以來(lái)，就能間接地檢測(cè)出樣品中的靶核酸。這時(shí)，如果通過(guò)測(cè)量濃度已知的標(biāo)準(zhǔn)核酸溶液而事先做出靶核酸濃度和熒光強(qiáng)度的檢量線，那么就能知道樣品中所含的靶核酸的量。需提一下，在本實(shí)施例的方法中，若反應(yīng)液中的核酸探針11的濃度過(guò)分地大于靶核酸5的濃度，熒光強(qiáng)度的背景就會(huì)過(guò)高，所以有必要將核酸探針11的濃度調(diào)節(jié)在一個(gè)適當(dāng)?shù)闹瞪稀?br> 還有，在受主物質(zhì)3也是熒光物質(zhì)的情況下，測(cè)量受主物質(zhì)的熒光來(lái)代替測(cè)量施主熒光物質(zhì)的熒光，也能定量地檢測(cè)到靶核酸。
和微陣列相比，利用本發(fā)明中的靶核酸的檢測(cè)方法，能夠定量地檢測(cè)到靶核酸。而且，可選擇與靶核酸的任意部分互補(bǔ)的序列作核酸探針的序列，也不需要多聚酶伸長(zhǎng)反應(yīng)了，所以和利用熒光能轉(zhuǎn)移的現(xiàn)有方法相比，本實(shí)施例中的靶核酸的檢測(cè)方法，方便性更高，反應(yīng)時(shí)間更短。
另外，利用核酸探針的標(biāo)記方法可提高檢測(cè)靈敏度。
從以上特征來(lái)看，本實(shí)施例中的方法有很多用途，例如用于診斷各種遺傳基因、檢查疾病、確定動(dòng)植物等的品種等。
-第1個(gè)具體例-第1個(gè)具體例示出了第1個(gè)實(shí)施例中所述的檢測(cè)方法的一個(gè)具體例子。
在該具體例中，靶核酸使用的是由20個(gè)堿基構(gòu)成的單鏈寡核苷酸T1(序列號(hào)碼1)。核酸探針使用的是由與單鏈寡核苷酸T1互補(bǔ)的序列構(gòu)成，且5’末端由FITC修飾、從5’末端數(shù)起的第4個(gè)堿基的鳥(niǎo)嘌呤由TRITC修飾的修飾單鏈寡核苷酸P1(序列號(hào)碼2)。
T15’cggctagtacgcagcccgcg3’P15’(FITC)-cgcg-(TRITC)ggctgcgtactagccg3’首先，讓修飾單鏈寡核苷酸P1溶解在TE緩沖劑(10mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH7.2)中，且使其最終濃度達(dá)到500pmol/100μL，并向4個(gè)不同的玻璃制試管里分別注入100μL這樣的溶液。
接著，讓單鏈寡核苷酸T1溶解在所述溶液中。此時(shí)，做到單鏈寡核苷酸T1在這4個(gè)溶液中的每一個(gè)溶液中的濃度各不相同。具體而言，各個(gè)溶液中所含的單鏈寡核苷酸T1的最終濃度分別為1、10、50、100pmol/100μL，并規(guī)定這些溶液分別為樣品A、B、C及D。之后，在室溫下放置4個(gè)小時(shí)，進(jìn)行了雜交。
雜交后，向樣品A、B、C及D內(nèi)分別滴入10μL的100U/μL的核酸外切酶III液，讓它們?cè)?7℃的溫度下反應(yīng)30分鐘。
之后，在用波長(zhǎng)490nm的激活光分別去照射蠱有樣品A、B、C及D的玻璃制試管，測(cè)量520nm時(shí)的熒光強(qiáng)度并對(duì)二者進(jìn)行比較。結(jié)果示于圖4。
圖4示出了在本發(fā)明的第1具體例中，樣品A～D的熒光強(qiáng)度在樣品D的熒光強(qiáng)度中所占的百分比。這里，示出的是每一個(gè)樣品在520nm下的熒光強(qiáng)度值相對(duì)試樣D的熒光強(qiáng)度值的百分比。
如圖4所示，每一個(gè)樣品所發(fā)出的熒光強(qiáng)度為樣品A＜樣品B＜樣品C＜樣品D，所觀察到的熒光強(qiáng)度基本上與每一個(gè)試樣中的單鏈單鏈寡核苷酸T1的濃度成正比。
由該結(jié)果驗(yàn)證了以下事實(shí)，即本發(fā)明的第1個(gè)實(shí)施例所涉及的方法，在定量地檢測(cè)靶核酸或者是所希望的核酸片段時(shí)是非常有效的。
-第2個(gè)具體例-在本具體例中，也是和第1個(gè)具體例一樣，調(diào)整樣品A、B、C及D，進(jìn)行雜交后，再分別向樣品A、B、C及D中滴入10μL的100U/μL的λ核酸外切酶液，讓它們?cè)?7℃的溫度下反應(yīng)30分鐘。
之后，用波長(zhǎng)490nm的激活光分別去照射蠱有樣品A、B、C及D的玻璃制試管，并和520nm下的熒光強(qiáng)度進(jìn)行比較。結(jié)果和第1個(gè)具體例一樣，所觀測(cè)到的熒光強(qiáng)度基本上與每一個(gè)樣品中的單鏈寡核苷酸T1的濃度成正比。
-第3個(gè)具體例-本具體例示出了第2個(gè)實(shí)施例中所示的檢測(cè)方法的一個(gè)具體例。
在本實(shí)施例中，和第1個(gè)、第2個(gè)具體例一樣，用單鏈寡核苷酸T1作靶核酸；用修飾單鏈寡核苷酸P1作核酸探針。
首先，讓修飾單鏈寡核苷酸P 1溶解在TE緩沖劑(10mM Tris-HCl、1mM EDTA、pH7.2)中，且使其最終濃度達(dá)到500pmol/100μL，再分別向4個(gè)不同的玻璃制試管里注入100μL的這種溶液。
接著，讓單鏈寡核苷酸T1溶解在所述溶液中。此時(shí)，做到單鏈寡核苷酸T1在這4個(gè)溶液中的每一個(gè)溶液中的最終濃度各不相同。具體而言，使最終濃度分別為0、50、100、200pmol/100μL，并規(guī)定這些溶液分別為樣品E、F、G及H。之后，在室溫下放置4個(gè)小時(shí)，進(jìn)行了雜交。
雜交后，用S1核酸酶處理樣品E、F、G及H。換句話說(shuō)，向各個(gè)樣品中滴入10μL的100U/μL的S1核酸酶，讓它們?cè)?7℃的溫度下反應(yīng)30分鐘。
之后，用波長(zhǎng)490nm的激活光分別去照射樣品液E、F、G及H，測(cè)量520nm時(shí)的熒光強(qiáng)度。結(jié)果示于圖5。
圖5為顯示在本發(fā)明的第3個(gè)具體例中，樣品E～G的熒光強(qiáng)度在樣品E的熒光強(qiáng)度中所占的百分比的圖。
如該圖所示，沒(méi)加單鏈寡核苷酸T1的樣品E的熒光強(qiáng)度最大，隨著樣品中所含的單鏈寡核苷酸T1的濃度的增大，熒光強(qiáng)度下降。
從該結(jié)果驗(yàn)證了以下事實(shí)，即本發(fā)明的第2個(gè)實(shí)施例所涉及的方法，在定量地檢測(cè)靶核酸或者是所希望的核酸片段時(shí)是非常有效的。
-第4個(gè)具體例-在本具體例中，也是和第3個(gè)具體例一樣，調(diào)整樣品E、F、G及H，進(jìn)行雜交后，再分別向樣品E、F、G及H中滴入10μL的100U/μL的核酸外切酶VII液，讓它們?cè)?7℃的溫度下反應(yīng)30分鐘。
之后，用波長(zhǎng)490nm的激活光分別去照射盛有樣品E、F、G及H的玻璃制試管，并測(cè)量了520nm下的熒光強(qiáng)度。結(jié)果和第3個(gè)具體例一樣，隨著樣品內(nèi)所含的單鏈寡核苷酸T1的濃度的增大，熒光強(qiáng)度減小。
本發(fā)明的靶核酸的檢測(cè)方法，除了可作為從事生物學(xué)研究的基礎(chǔ)技術(shù)以外，還可被用到醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的遺傳基因診斷、疾病診斷上，及農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的動(dòng)植物品種的確定等上，用途很廣。
序列表<110>松下電器產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社夜久英信行政哲男杉原宏和<120>檢測(cè)靶核酸探針的方法<130>M02-TJ295<150>JP 01/329872<151>2001-10-26<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>靶序列<400>1cggctagtac gcagcccgcg20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>靶序列的互補(bǔ)堿基序列<400>2cgcgggctgc gtactagccg20
權(quán)利要求
1.一種靶核酸的檢測(cè)方法，它檢測(cè)樣品溶液中的靶核酸，其中包括準(zhǔn)備由施主熒光物質(zhì)及吸收所述施主熒光物質(zhì)的熒光并被布置成可以產(chǎn)生熒光能轉(zhuǎn)移的受主物質(zhì)標(biāo)記，具有與所述靶核酸的至少一部分互補(bǔ)的序列的核酸探針的步驟(a)，將所述樣品溶液和所述核酸探針混合一下，在所述靶核酸和所述核酸探針雜交而能夠形成核酸探針-靶核酸復(fù)合體的條件下保持所述樣品溶液的步驟(b)，及在所述步驟(b)后，讓和序列無(wú)關(guān)的核酸酶對(duì)所述樣品溶液起作用，而從所述樣品溶液的熒光強(qiáng)度的變化檢測(cè)出所述靶核酸的步驟(c)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶核酸的檢測(cè)方法，其中所述和序列無(wú)關(guān)的核酸酶為雙鏈特異核酸外切酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的靶核酸的檢測(cè)方法，其中所述雙鏈特異核酸外切酶為核酸外切酶III或者是λ核酸外切酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的靶核酸的檢測(cè)方法，其中構(gòu)成所述核酸探針的堿基中多個(gè)堿基由所述施主熒光物質(zhì)標(biāo)記。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶核酸的檢測(cè)方法，其中所述和序列無(wú)關(guān)的核酸酶為單鏈特異核酸酶。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的靶核酸的檢測(cè)方法，其中所述單鏈特異核酸酶，為從核酸外切酶VII、S1核酸酶及綠豆核酸酶、蛇毒核酸酶、脾臟磷酸二酯酶、核酸外切酶I、葡萄球菌核酸酶及鏈孢霉核酸酶中選出的一種。
7，根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶核酸的檢測(cè)方法，其中在所述步驟(c)中，利用所述施主熒光物質(zhì)發(fā)出的熒光強(qiáng)度的變化檢測(cè)靶核酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶核酸的檢測(cè)方法，其中在所述步驟(c)中，利用所述受主物質(zhì)發(fā)出的熒光強(qiáng)度的變化檢測(cè)靶核酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的靶核酸的檢測(cè)方法，其中在所述步驟(a)之后且所述步驟(b)之前，還包括在所述樣品溶液中含有靶核酸的情況下，以所述核酸探針為引物進(jìn)行PCR反應(yīng)而擴(kuò)增所述靶核酸的步驟。
10.一種核酸探針，被用在使用和序列無(wú)關(guān)的核酸酶檢測(cè)靶核酸的檢測(cè)方法中，且在它單獨(dú)存在時(shí)由發(fā)出熒光的施主熒光物質(zhì)及吸收所述熒光的受主物質(zhì)標(biāo)記的核酸探針，其中它具有與所述靶核酸互補(bǔ)的堿基序列，多個(gè)堿基由所述施主熒光物質(zhì)修飾。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種靶核酸的檢測(cè)方法，包括準(zhǔn)備被布置成能引起熒光能轉(zhuǎn)移的施主熒光物質(zhì)及受主物質(zhì)標(biāo)記，具有與靶核酸的至少一部分互補(bǔ)的序列的核酸探針的步驟；將樣品溶液和核酸探針混合一下，讓靶核酸和核酸探針進(jìn)行雜交的步驟；及在步驟(b)后，讓和序列無(wú)關(guān)的核酸酶對(duì)樣品溶液起作用，而從上述樣品溶液的熒光強(qiáng)度的變化檢測(cè)靶核酸的步驟。這樣以來(lái)，便能同時(shí)提高核酸探針的設(shè)計(jì)自由度和操作的簡(jiǎn)便性。
文檔編號(hào)G01N33/50GK1483076SQ02803370
公開(kāi)日2004年3月17日 申請(qǐng)日期2002年10月28日 優(yōu)先權(quán)日2001年10月26日
發(fā)明者夜久英信, 行政哲男, 杉原宏和, 和, 男 申請(qǐng)人:松下電器產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社