專利名稱：探測胞嘧啶甲基化模式的高靈敏度方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在DNA樣品中探測胞嘧啶甲基化的方法。
近幾年中在分子生物學(xué)中由于方法的發(fā)展而充分研究的觀察水平是基因本身，即這些基因至RNA的翻譯和由此產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。在個體發(fā)育過程中，哪些基因何時開啟及某些細胞和組織中某些基因激活和抑制如何得到控制，與基因或基因組甲基化的程度和特性相關(guān)。致病的狀態(tài)也是以單個基因或基因組的改變了的甲基化模式表達的。
5-甲基胞嘧啶是真核細胞DNA中最經(jīng)常進行共價修飾的堿基。例如，它在轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)中、在遺傳印記中和在腫瘤發(fā)生中起作用。5-甲基胞嘧啶作為遺傳信息成分的鑒定因而具有相當?shù)闹匾?。然?-甲基胞嘧啶位置不能通過測序來鑒定，這是因為5-甲基胞嘧啶與胞嘧啶具有相同的堿基配對性質(zhì)。此外，在PCR擴增的情況下，由5-甲基胞嘧啶攜帶的外遺傳信息完全喪失了。
其后研究DNA的5-甲基胞嘧啶最經(jīng)常應(yīng)用的相對新的方法是基于亞硫酸氫鹽與胞嘧啶的特定反應(yīng)的，胞嘧啶在隨后的堿水解之后轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?，尿嘧啶在堿基配對性質(zhì)上相應(yīng)于胸腺嘧啶。相反地，5-甲基胞嘧啶在這些條件下不被改變。因而使最初的DNA進行了如此轉(zhuǎn)變，使最初不能依靠其雜交性質(zhì)與胞嘧啶區(qū)分的甲基胞嘧啶現(xiàn)在可以作為單獨剩余的胞嘧啶而通過“標準的”分子生物學(xué)技術(shù)進行探測，例如通過擴增和雜交或測序。所有這些技術(shù)都基于堿基配對，就此堿基配對得到充分利用。涉及靈敏度的現(xiàn)有技術(shù)是通過一種方法定義的，該方法將所研究的DNA結(jié)合到瓊脂糖基質(zhì)上，借此防止了DNA的擴散和復(fù)性(亞硫酸氫鹽只能在單鏈DNA上反應(yīng))，且所有的沉淀和純化步驟都被快速的透析取代了(Olek A.，Oswald J.，Walter.J.，一種改良和提高的基于硫酸氫鹽的胞嘧啶甲基化分析方法(A modifiedand improved method for bisulphate based cytosinemethylation analysis)，Nucleic Acids Res.1996年12月15日；24(24)5064-6)。用該方法可研究單獨的細胞，這說明了該方法的潛力。然而至今僅研究了長度為約3000個堿基對的單獨區(qū)域，對細胞進行完全研究以進行數(shù)千的可能的甲基化分析是不可能的。然而該方法也不能可靠地分析來自微量樣品的非常小的片段，其盡管基質(zhì)的擴散保護，但還是損失了。
對探測5-甲基胞嘧啶的其它已知可能性的綜述可源自下面的綜述文章Rein T，DePamphilis ML，Zorbas H，鑒定DNA基因組中的5-甲基胞嘧啶和相關(guān)的修飾(Identifying 5-methylcytosineand related modifications in DNA genomes)，Nucleic AcidsRes.1998年5月15日；26(10)2255-64。
至今亞硫酸氫鹽技術(shù)僅應(yīng)用于研究中，僅有少數(shù)例外(例如，Zeschnigk M，Lich C，Buiting K，Drfler W，Horsthemke B，用于基于SNRPN座位的等位甲基化差異對Angelman和Prader-Willi綜合癥進行診斷的單管PCR檢驗(A single-tube PCR test forthe diagnosis of Angelman and Prader-Willi syndrome basedon allelic methylation differences at the SNRPN locus)，Eur J Hum Genet.1997年3月-4月；5(2)94-8)。然而，在亞硫酸氫鹽處理之后已知基因的短的特定片段總是得到擴增，并且由“引物延伸反應(yīng)”探測了或者經(jīng)完全測序的(Olek A，Walter J，H19甲基化印記的植入前個體發(fā)生(The preimplantation ontogeny ofthe H19 methylation imprint)，Nat.Genet.1997年11月；17(3)275-6)或者單獨的胞嘧啶位置(Gonzalgo ML，Jones PA，用甲基化敏感性單一核苷酸引物延伸(Ms-SNuPE)對特定位點上甲基化差異的快速定量(Rapid quantitation of methylationdifferences at specific sites using methylation-sensitivesingle nucleotide primer extension(Ms-SNuPE))，NucleicAcids Res.1997年6月15日；25(12)2529-31，WO專利9500669)或者酶的切割(Xiong Z，Laird PW，COBRA一種靈敏的定量DNA甲基化測定(a sensitive and quantitative DNAmethylation assay)，Nucleic Acids Res.1997年6月15日；25(12)2532-4)。此外還描述有依靠雜交進行的探測(Olek等人，WO 99/28498)。
基因組DNA中的5-甲基胞嘧啶測序之前，尿素改進了亞硫酸氫鹽處理的效率(Paulin R，Grigg GW，Davey MW，Piper AA，尿素改進了硫酸氫鹽介導(dǎo)的對基因組DNA中5-甲基胞嘧啶測序的效率(Urea improves efficiency of bisulphate-mediatedsequencing of 5’-methylcytosine in genomic DNA)，NucleicAcids Res.1998年11月1日；26(21)5009-10)。
其它有關(guān)用于在單個基因中探測甲基化的亞硫酸氫鹽技術(shù)的應(yīng)用的出版物為Grigg G，Clark S，基因組DNA中5-甲基胞嘧啶殘基的測序(Sequencing 5-methylcytosine residues in genomicDNA)，Bioassays.1994年6月；16(6)431-6，431；Zeschnigk M，Schmitz B，Dittrich B，Buiting K，HorsthemkeB，Drfler W，人類基因組中印記的區(qū)段由基因組測序方法確定的Prader-Willi/Angelman綜合癥區(qū)域中的不同的DNA甲基化模式(Imprinted segments in the human genomedifferent DNAmethylation patterns in the Prader-Willi/Angelman syndromeregion as determined by the genomic sequencing method)，Hum Mol Genet.1997年3月；6(3)387-95；Feil R，CharltonJ，Bird AP，Walter J，Reik W，單獨染色體的甲基化分析硫酸氫鹽基因組測序改進的規(guī)程(Methylation analysis onindividual chromosomesimproved protocol for bisulphategenomic sequencing)，Nucleic Acids Res.1994年2月25日；22(4)695-6；Martin V，Ribieras S，Song-Wang X，Rio MC，Dante R，基因組測序顯示pS2基因的5’區(qū)域中的和其在人乳腺癌細胞系中表達中的DNA甲基化不足之間相關(guān)(Genomic sequencingindicates a correlation between DNA hypomethylation in the5’region of the pS2 gene and in its expression in humanbreast cancer cell lines)，Gene.1995年5月19日；157(1-2)261-4；WO 97/46705，WO 95/15373和WO 45560。
另一個已知的方法是所謂的甲基化靈敏性PCR(Herman JG，Graff JR，Myohanen S，Nelkin BD，Baylin SB，(1996)，甲基化特異性PCRCpG島甲基化狀況的新PCR測定(Methylation-specific PCRa novel PCR assay for methylation status ofCpG islands)，Proc Natl Acad Sci USA.9月3日；93(18)9821-6)。該方法使用了引物，該引物或者僅與序列雜交，所述序列是由于對相關(guān)位置上未甲基化的DNA進行亞硫酸氫鹽處理而形成的，或者相反的引物，該引物僅與核酸結(jié)合，所述核酸通過亞硫酸氫鹽處理在相關(guān)位置上未甲基化的DNA而形成。利用這些引物，就可以產(chǎn)生擴增產(chǎn)物，其探測反過來提供了引物所結(jié)合的樣品中甲基化或非甲基化位置存在的線索。
一種更新近的方法也是依靠TaqMan PCR對胞嘧啶甲基化進行探測，該方法以甲基燈(methyl-light)聞名(WO 00/70090)。該方法可以直接在PCR過程中探測單獨的位置或數(shù)個位置的甲基化狀態(tài)，從而省去了隨后對產(chǎn)物的分析。
對寡聚體陣列產(chǎn)品的現(xiàn)有技術(shù)綜述可獲取自發(fā)表于1999年1月的自然基因?qū)W(Nature Genetics)上的特刊(Nature Genetics增刊(Supplement)，21卷，1999年1月)、在此處引用的文獻及美國專利5,994,065中的生產(chǎn)在減低的非特異性背景信號下用于目標分子如寡核苷酸的固體載體的方法。
多重熒光標記的探針被用于對固定的DNA陣列的掃描。特別適合于進行熒光標記的是在各個探針的5’-OH簡單地引入Cy3和Cy5染料。雜交的探針的熒光是依靠如聚焦顯微鏡進行探測的。除許多其它的之外，染料Cy3和Cy5是商業(yè)可購得的。
基質(zhì)輔助的激光解吸/電離質(zhì)譜分析(MALDI-TOF)是生物分子分析的非常有效力的發(fā)展(Karas M，Hillenkamp F，分子量超過10,000道爾頓的蛋白質(zhì)的激光解吸電離(Laser desorptionionization of proteins with molecular masses exceeding10,000 daltons)，Anal Chem.1988年10月15日；60(20)2299-301)。將一種分析物包埋入光吸收性基質(zhì)中。依靠短的激光脈沖使該基質(zhì)蒸發(fā)，且促使該分析物分子未片段化地遷移到氣相中。分析物的電離是通過與基質(zhì)分子的碰撞而實現(xiàn)的。施加的電壓將離子加速進入一個無場的飛行管。離子基于其不同的質(zhì)量而被加速到不同的程度。較小的離子比較大的離子更快地到達探測器。
MALDI-TOF光譜極其適合于對肽和蛋白質(zhì)的分析。對核酸的分析則有些困難(Gut，I.G.和Beck，S.(1995)，DNA和基質(zhì)輔助的激光解吸/電離質(zhì)譜分析(DNA and Matrix Assisted LaserDesorption Ionization Mass Spectrometry)，MolecularBiologyCurrent Innovations and Future Trends 1147-157)。對于核酸，靈敏度比肽大約低100倍，且隨著增大的片段而以過大的比例降低。對于具有多負電荷主鏈的核酸，通過基質(zhì)的電離過程基本是低效的。在MALDI-TOF光譜中，對基質(zhì)的選擇起非常重要的作用。對于肽的解吸，已發(fā)現(xiàn)了幾個非常有效力的基質(zhì)，所述基質(zhì)產(chǎn)生非常精細的結(jié)晶。同時雖然也發(fā)現(xiàn)了用于DNA的一些符合要求的基質(zhì)，卻借此未能減少靈敏度的差異。靈敏度的差異的減少可通過對DNA進行修飾而使之類似于肽的方法。硫代磷酸核酸可通過簡單的烷基化化學(xué)而轉(zhuǎn)變?yōu)殡姾芍行缘腄NA，所述核酸主鏈中通常的磷酸被硫代磷酸替代(Gut，I.G.和Beck，S.(1995)，選擇性DNA烷基化和由質(zhì)譜探測的程序(A procedure for selective DNA alkylationand detection by mass spectrometry)，Nucleic Acids Res.231367-1373)?！半姾蓸擞洝迸c該經(jīng)修飾的DNA的偶聯(lián)導(dǎo)致靈敏度的增加，增加量與其對肽的效用一樣?！半姾蓸擞洝钡牧硪粋€優(yōu)點是相對于雜質(zhì)分析穩(wěn)定性的增加，雜質(zhì)嚴重妨礙了對未修飾的底物的探測。
基因組DNA是通過標準方法從細胞、組織或其它檢驗樣品的DNA中獲得的。
所述標準的方法學(xué)可發(fā)現(xiàn)于參考文獻中，如Fritsch和Maniatis，分子克隆實驗室手冊(Molecular CloningALaboratory Manual)，1989。
因此，在現(xiàn)有技術(shù)中迄今已有許多甲基化分析的方法。然而，本發(fā)明將解決現(xiàn)有方法不能解決的問題，即，當其它不同來源的序列同源DNA片段也存在時以定向的方式擴增所研究的在體液或血清中的DNA。
所研究的DNA及在下面命名為背景DNA的其它存在的核酸通常是同樣擴增的，這是因為所用的引物不能區(qū)別所研究的DNA與背景DNA。然而，區(qū)別這些DNA的一種可能性是通過不同的甲基化模式。一種現(xiàn)有的方法是甲基化靈敏性PCR，簡稱MSP(Herman JG，GraffJR，Myohanen S，Nelkin BD，Baylin SB，(1996)甲基化特異性PCRCpG島甲基化狀況的新PCR測定(Methylation-specific PCRa novel PCR assay for methylation status of CpG islands)，Proc Natl Acad Sci USA.9月3日；93(18)9821-6)。該方法包含多個步驟。首先，進行了根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的亞硫酸氫鹽處理，再次導(dǎo)致所有胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏ざ谆陌奏A基(5-甲基胞嘧啶)保持不變的情況。在下一個步驟中，人們開始使用引物，該引物與用亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)變的甲基化DNA完全互補，但不與最初以非甲基化狀態(tài)存在的相應(yīng)DNA互補。當用這種引物進行PCR時，這導(dǎo)致最初甲基化的DNA專一地擴增的事實。同樣可能的是使用相反只擴增非甲基化DNA的引物。這樣，如果要分析的DNA及背景DNA存在時，所研究的DNA片段將選擇性地和專一地產(chǎn)生，只要它們與背景DNA鑒于CpG位置中的甲基化狀態(tài)有區(qū)別。目前現(xiàn)有技術(shù)從這樣一種所研究的DNA分子中反向推斷所研究的DNA的甲基化狀態(tài)或其是否存在，其再次原則上允許如對病人腫瘤病癥的診斷，因為已知的是，如腫瘤病人的血清DNA濃度部分地大幅度增加了。只有源自腫瘤的DNA除背景DNA之外應(yīng)被探測到。原則上，在其它體液中的DNA分析是類似的。
然而，此處描述的且認為是最近的現(xiàn)有技術(shù)的方法具有一些缺點。例如，它不可能從所研究的DNA的擴增片段的可探測性中推斷血清中存在的量。雖然最微量的這種DNA都可成功地獲得陽性結(jié)果，這在一方面是優(yōu)點，但如果人們希望判斷如腫瘤切除對血清DNA的影響時，它也可以以非常不適宜的方式起作用。然而，最大的缺點是有許多甲基化位置存在，其對于所研究的DNA和背景DNA僅在程度上有差別。明顯的是如果人們不希望冒著得到假陽性結(jié)果的風險，那么現(xiàn)有的MSP方法只能在如果人們知道背景DNA與所研究的DNA在目標CpG位置有明確的或達到100％的差別時才可實施。相反地，在腫瘤組織中典型地例如95％的腫瘤細胞中在特定位置上呈現(xiàn)甲基化狀態(tài)，而其中另外存在的背景DNA卻最多只有5％的甲基化狀態(tài)，這卻不可能用MSP方法得到能提供信息的結(jié)果，這是因為依靠PCR對模板DNA的量化原則上是不可能的或只能靠增加花費來實現(xiàn)。此外該發(fā)明是基于這樣的知識，即其經(jīng)常是DNA片段中的甲基化模式，這對于特定的細胞類型如腫瘤細胞是典型的。
同樣，現(xiàn)有技術(shù)包括由Epigenomics發(fā)展的方法，該方法在亞硫酸氫鹽處理后同樣地擴增所研究的DNA和背景DNA，然后通過雜交技術(shù)和可選擇地依靠小測序(mini-sequencing)或其它現(xiàn)有方法來鑒定包含于片段中先前CpG的位置。這具有獲得相對于所研究的甲基化位置的定量模式的優(yōu)點，即，成功地獲得了對多個位置的甲基化程度的確定，這例如使得能夠在實體瘤的情況下非常精確的分類。然而，該方法的缺點是它在背景DNA非常占優(yōu)勢的情況下不能提供精確的信息，這是因為該信息是完全如同所研究的DNA一樣擴增的，且兩者均在混合物中進行分析。對實體瘤的分析中不存在該問題，其中所研究的材料可以定向選擇，但是卻造成如對血清DNA的分析的困難。
本發(fā)明的目的目前是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點并將用于對體液和血清探測的兩種方法的優(yōu)點組合。
該目的是通過創(chuàng)造用于探測DNA樣品中胞嘧啶甲基化的方法而解決的，在該方法中進行了下面的步驟
將包含所研究的DNA和背景DNA的基因組DNA樣品以進行化學(xué)處理，從而使得所有非甲基化的胞嘧啶堿基都轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?，?-甲基胞嘧啶堿基保持不變；用至少2個引物寡核苷酸和一個聚合酶對經(jīng)化學(xué)處理的DNA樣品進行擴增，其中所研究的DNA相對于背景DNA是優(yōu)選被作為模板的，分析擴增產(chǎn)物，并從擴增產(chǎn)物的存在性和/或從對其它位置的分析中得出所研究的DNA中甲基化狀態(tài)的結(jié)論。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的是樣品從個體的血清或其它體液中獲得。
根據(jù)本發(fā)明進一步優(yōu)選的是樣品從細胞系、血液、痰、糞便、尿、血清、腦脊液、包埋于石蠟中的組織如來自眼、腸、腎、腦、心、前列腺、肺、乳房和肝的組織、組織載玻片和其所有可能的組合中獲得。
根據(jù)本發(fā)明尤其特別優(yōu)選的是化學(xué)處理是用亞硫酸氫鹽(＝Disulfit，Hydrogensulfit)進行的。還優(yōu)選的是在將DNA包埋于瓊脂糖中之后進行的化學(xué)處理。同樣且進一步優(yōu)選的是使DNA雙鏈體變性的試劑和/或自由基阱存在于化學(xué)處理中。
優(yōu)選擴增是在第二個步驟中至少一種額外的寡核苷酸存在下進行的，該寡核苷酸結(jié)合5’-CG-3’二核苷酸或5’-TG-3’二核苷酸或5’-CA-3’二核苷酸，其中該額外的寡核苷酸優(yōu)選地結(jié)合背景DNA并對其擴增產(chǎn)生不利影響。
特別優(yōu)選的是額外的寡核苷酸或PNA寡聚體在背景DNA上的結(jié)合位點與引物的結(jié)合位點重疊，且額外的寡核苷酸阻礙了至少一種引物寡核苷酸與背景DNA的結(jié)合。
再度特別優(yōu)選的是利用了至少兩個額外的寡核苷酸或PNA寡聚體，其中它們的結(jié)合位點再次分別與引物在背景DNA上的結(jié)合位點重疊，且額外的寡核苷酸和/或PNA寡聚體阻礙了這兩個引物寡核苷酸與背景DNA的結(jié)合。
此外特別言優(yōu)選的是額外的寡核苷酸和/或PNA寡聚體之一阻礙了正向引物的結(jié)合，而另一個阻礙了反向引物的結(jié)合。
特別優(yōu)選的是額外的寡核苷酸和/或PNA寡聚體至少以引物寡核苷酸濃度的5倍存在。
在本發(fā)明的另一個特別優(yōu)選的變體中，額外的寡核苷酸和/或PNA寡聚體結(jié)合背景DNA并因而阻礙了引物寡核苷酸在聚合酶反應(yīng)中的完全延伸。其中再度特別優(yōu)選的是所用的聚合酶不具有5’-3’外切核酸酶活性。另一個優(yōu)選的變體是額外的寡核苷酸存在5’末端的修飾，并因而不能被具有5’-3’外切核酸酶活性的聚合酶顯著地破壞。
此外，根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的是經(jīng)化學(xué)處理的DNA樣品在第二步驟中使用至少2個引物寡核苷酸和另一個與5’-CG-3’二核苷酸或5’-TG-3’二核苷酸或5’-CA-3’二核苷酸雜交的寡核苷酸，和至少一個與5’-CG-3’二核苷酸或5’-TG-3’二核苷酸或5’-CA-3’二核苷酸雜交的報道寡核苷酸以及一個聚合酶進行擴增；其中該額外的寡核苷酸優(yōu)選結(jié)合背景DNA并對其擴增產(chǎn)生不利影響，且其中該報道寡核苷酸優(yōu)選地結(jié)合所研究的DNA并指示其擴增。因而有利的是對于報道寡核苷酸附加地使用另一個用熒光染料進行標記的寡聚體，其直接在鄰近報道寡核苷酸處進行雜交，且該雜交借助熒光共振能量轉(zhuǎn)移進行探測。進一步有利的是進行TaqMan測定。同樣優(yōu)選的是進行LightCycler測定。
根據(jù)本發(fā)明進一步優(yōu)選的是除引物外所使用的寡核苷酸不能具備3’-OH功能。此外，優(yōu)選的是報道寡核苷酸帶有至少一個熒光標記。同樣優(yōu)選的是報道分子通過熒光的增加或減少顯示擴增。在此特別有利的是該熒光的增加和減少也直接用于分析，且所研究的DNA的甲基化狀態(tài)可從熒光信號來推斷。
根據(jù)本發(fā)明進一步優(yōu)選的是背景DNA以所研究的DNA濃度的100倍存在。進一步優(yōu)選的是背景DNA以所研究的DNA濃度的1000倍存在。
此外優(yōu)選的是該分析或者視情況進一步的分析可依靠與寡聚體陣列的雜交來進行，其中寡聚體可以是核酸或其雜交性質(zhì)上相似的分子如PNA。
根據(jù)本發(fā)明同樣有利的是寡聚體通過12-22個堿基長的區(qū)段與所研究的DNA雜交且它們包括CG、TG或CA二核苷酸。
優(yōu)選的是所研究的DNA中多于20個甲基化位置的甲基化狀態(tài)是在一個實驗中探測的。
進一步優(yōu)選的是所研究的DNA中多于60個甲基化位置的甲基化狀態(tài)是在一個實驗中探測的。
根據(jù)本發(fā)明同樣優(yōu)選的是該分析或者視情況的進一步分析是通過對擴增的所研究的DNA的長度測量來進行的，其中該長度測量的方法包含凝膠電泳、毛細管凝膠電泳、層析(如HPLC)、質(zhì)譜分析和其它適宜的方法。在此同樣有利的測序方法包括桑格方法、馬吉測序法和其它方法，如通過雜交的測序(SBH)。
一種根據(jù)本發(fā)明的方法同樣是優(yōu)選的，其中對每一個或一小組CpG位置的測序分別用一個單獨的引物寡核苷酸進行，且引物延伸僅構(gòu)成了一個或幾個堿基段，且從引物延伸的類型中推斷出所研究的DNA中相關(guān)位置的甲基化狀態(tài)。
進一步優(yōu)選的是從不同的經(jīng)研究的CpG位置的甲基化程度推斷病人的病癥或另一種醫(yī)學(xué)狀況的存在。
有利的是擴增產(chǎn)物本身是帶有可探測的標記的。進一步有利的是該標記為熒光標記或/和該標記為放射性核素或/和該標記為在質(zhì)譜儀中探測的可除去的質(zhì)量標記。
此外優(yōu)選的是在擴增中，引物之一是結(jié)合在固相上的。
根據(jù)本發(fā)明，擴增產(chǎn)物是全部在質(zhì)譜儀上探測的且由此通過其質(zhì)量明確地進行特征記錄。
本發(fā)明的另一個目的還有使用根據(jù)本發(fā)明的方法對病人或個體進行不利情形的診斷和/或預(yù)診，其中這些不利情形屬于至少一種下面的種類非期望的藥物作用；癌病癥；CNS功能失常、損傷或疾??；攻擊或行為障礙癥狀；腦損傷的臨床、心理學(xué)和社會結(jié)果；精神病障礙和個性病癥；癡呆和/或有關(guān)的癥狀；心血管疾病、功能失常和損傷；胃腸道的功能失常、損傷或疾??；呼吸系統(tǒng)的功能失常、損傷或疾?。皇軅?、炎癥、感染、免疫和/或康復(fù)；作為發(fā)育過程中畸形的身體功能失常、損傷或疾?。黄つw、肌肉、結(jié)締組織或骨骼的功能失常、損傷或疾病；內(nèi)分泌和代謝功能失常、損傷或疾??；頭痛或性功能失常。
在此根據(jù)本發(fā)明的方法用于區(qū)別細胞類型或組織或者用于研究細胞分化是有利的。
本發(fā)明的目的還有一種試劑盒，該試劑盒包括含有亞硫酸氫鹽的試劑、引物和其它用于產(chǎn)生擴增產(chǎn)物的無3’-OH功能的寡核苷酸，以及可選擇的實施根據(jù)本發(fā)明測定的說明書。
因而本發(fā)明描述了探測基因組DNA樣品的甲基化狀態(tài)的方法。與以前已知的方法相反，一組CpG位置的甲基化程度是在選擇的DNA片段亞組中確定的，如在血清中，從而在過量的與診斷不相關(guān)的背景DNA存在下該分析也是可能的。
在此優(yōu)選的方法包含幾個步驟，概述如下首先，從病人獲取血清和/或其它的體液，并且如果需要分離在其中存在的DNA。隨后，在第二個步驟中，進行化學(xué)處理，優(yōu)選的是用亞硫酸氫鹽(＝Hydrogensulfit，Disulfit)的，其中如所有非甲基化的胞嘧啶堿基轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?，但甲基化的胞嘧啶堿基(5-甲基胞嘧啶)則保持不變。在方法的第三個步驟中，開始進行擴增，其中優(yōu)選地擴增所研究的DNA而不是或者僅擴增較少量的背景DNA。在隨后的第四個步驟中，對擴增片段的甲基化特征進行分析，且多個先前的CpG位置的甲基化程度是在擴增產(chǎn)物中確定的。在該方法的第五個步驟中，病人的病癥或另一種醫(yī)學(xué)狀況的存在性是從研究的不同CpG位置的甲基化程度推斷的。
本發(fā)明的要素是兩類CpG位置對分析都起作用且具有相同的貢獻，這將在下面命名為“限定器(Qualifier)”位置和“分類器(Classifier)”位置。限定器位置在擴增中用作將所研究的DNA與背景DNA區(qū)分開來。這可在技術(shù)上在不同的途徑中進行，如在下面詳細給出的。然而，這些位置的性質(zhì)是在所研究的DNA中的甲基化程度與來自背景DNA的盡可能的不同，且這導(dǎo)致在擴增中對所研究的DNA的優(yōu)選。相反地，分類器位置用作從所研究的DNA產(chǎn)生的擴增產(chǎn)物中通過各自的甲基化程度提取對于診斷很重要的信息。如果進行例如寡聚體陣列上的分析，多達幾百個這樣的分類器位置可用于一個分析中，盡管這經(jīng)常不是必需的。然而，在這種情況下，不是特定擴增產(chǎn)物的形成而是在相同產(chǎn)物中CpG位置的分析對于研究結(jié)果是重要的。然而，在一些情況下，將從擴增產(chǎn)物的形成推導(dǎo)出的信息用于分析中卻是可能和有意義的；在這種情況下，幾個位置則同時是分類器和限定器。
該方法的第一步，即獲得樣品是優(yōu)選地通過獲得體液如痰或血清而進行的，但明顯的是該方法可用來自不同來源的許多類型的樣品來進行，此處列出這些樣品，但并不認為是其全部。
優(yōu)選地，本方法中所用的基因組DNA從DNA樣品中獲得，其中DNA的來源包括如細胞系、血液、痰、糞便、尿、血清、腦脊液、包埋于石蠟中的組織如來自眼、腸、腎、腦、心、前列腺、肺、乳房和肝的組織、組織載玻片和其所有可能的組合。
在一些情況下，為了避免由于過高的不純程度而導(dǎo)致的對亞硫酸氫鹽反應(yīng)和/或隨后的PCR的破壞，在亞硫酸氫鹽處理之前進行了DNA的純化和濃縮。然而，已知的是如源自組織的PCR可以在如蛋白酶K處理各無需進一步純化而進行，且按其意義也適用于亞硫酸氫鹽處理和隨后的PCR。
化學(xué)處理優(yōu)選通過用亞硫酸氫鹽的處理進行，再次優(yōu)選的是亞硫酸氫鈉(亞硫酸氫銨的適合程度次之)。該反應(yīng)或者是根據(jù)發(fā)表的變體方案進行的，在此DNA優(yōu)選地包埋在瓊脂糖中以使在處理中DNA保持單鏈狀態(tài)，然而或者根據(jù)一種新的變體方案，通過在自由基阱和變性劑存在下進行處理，優(yōu)選地為乙二醇二烴基醚或如二噁烷。在PCR反應(yīng)之前，在瓊脂糖的情況下通過洗滌除去試劑或者通過DNA純化方法除去(現(xiàn)有技術(shù)，沉淀或結(jié)合到固相、膜上)，或者簡單地通過在濃度區(qū)進行稀釋，該方法不會顯著影響PCR。
對于第三個步驟，現(xiàn)在基本的是選擇限定器位置和適當?shù)姆椒?，以允許所研究的DNA選擇性地擴增。位置的選擇是根據(jù)下面的前提進行的，即這些位置應(yīng)盡可能地鑒于其甲基化相互區(qū)別背景DNA和所研究的DNA。為此，分別確定所研究的腫瘤以及來自健康個體的背景DNA的相關(guān)基因區(qū)段的甲基化特點。這些在腫瘤DNA和背景DNA(如在血清中)具有最大差異的位置是作為限定器位置選擇的。這種位置對于大量基因是已知的，如對于GSTpi、對于HIC-1和MGMT(vonWronski MA，Harris LC，Tano K，Mitra S，Bigner DD，BrentTP，(1992)人橫紋肌肉瘤細胞系和異種移植中的胞嘧啶甲基化和O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶表達的抑制(Cytosine methylationand suppression of O6-methylguanine-DNA methyltransferaseexpression in human rhabdomyosarcoma cell lines andxenografts)，Oncol Res.；4(4-5)167-74；Esteller M，Toyota M，Sanchez-Cespedes M，Capella G，Peinado MA，Watkins DN，Issa JP，Sidransky D，Baylin SB，Herman JG，(2000)，通過啟動子超甲基化的DNA修復(fù)基因O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的失活與結(jié)腸腫瘤發(fā)生中K-ras中G到A的突變有關(guān)(Inactivation of the DNA repair gene O6-methylguanine-DNAmethyltransferase by promoter hypermethylation isassociated with G to A mutations in K-ras in colorectaltumorigenesis)，Cancer Res.5月1日；60(9)2368-71)?，F(xiàn)在有多種完全優(yōu)選的方法，依靠這些方法所研究的DNA可優(yōu)選地利用這些限定器位置進行擴增。
首先，可能的是用引物進行相應(yīng)于MSP的反應(yīng)，該引物完全與亞硫酸氫鹽處理后相應(yīng)于所研究的DNA的序列進行雜交，但不與進行類似處理的背景DNA進行雜交。換句話說，引物與在其中具有一個或多個限定器位置的DNA區(qū)段進行雜交，且只有當最初的DNA中的甲基化狀態(tài)相應(yīng)于對所研究的DNA進行特征記述的時，才可能發(fā)生顯著程度的擴增。這原則上是一個簡單的變體方案，但它具有限定器位置必須分別位于DNA片段的一端或兩端的缺點，即，分類器位置必須位于限定器位置之間(然而或者在只有一個限定器位置的情況下，限定器位置不應(yīng)該位于分類器位置的中間)。盡管根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的是進行這樣的MSP變體方案，但事實上它由此僅能用于比較少的情況中，這是因為限定器和分類器位置的分布僅在少數(shù)情況下是如此理想的。然而，由于原則上它是易于進行的，所以盡管如此將其列在此處作為優(yōu)選。
然而特別優(yōu)選的是一個變體方案，其中引物不與限定器位置重疊或與其雜交，而是PCR擴增由至少一種其它的寡核苷酸影響的，該寡核苷酸不發(fā)揮引物的功能，但在限定器位置結(jié)合。
這意味著原則上化學(xué)處理的DNA如在現(xiàn)有技術(shù)中是借助兩個引物擴增。在由兩個引物局限的DNA區(qū)段中具有一個或多個限定器位置?，F(xiàn)在與標準的PCR相反地，加入了額外的寡核苷酸，該寡核苷酸與在亞硫酸氫鹽處理之前或呈現(xiàn)甲基化或非甲基化的這些限定器位置選擇性地結(jié)合。如果所加入的寡核苷酸與限定器位置的結(jié)合比與背景DNA的結(jié)合較弱，那么所研究的DNA從而優(yōu)選地得到擴增。換句話說，加入的寡核苷酸選擇性地阻斷了背景DNA的擴增。
優(yōu)選這些加入的寡核苷酸含有至少一個CG、一個TG或者一個CA二核苷酸。它們必須額外具有不能被在PCR反應(yīng)中所用的聚合酶延伸的性質(zhì)。這優(yōu)選地是通過利用3’-脫氧寡核苷酸或然而利用在3’位置具有其它功能的寡核苷酸如3’-O-乙?；押塑账醽磉M行的。此外，必須防止這些寡核苷酸被聚合酶的分解。這優(yōu)選地用無核酸酶活性的聚合酶進行，或者優(yōu)選地用經(jīng)修飾的寡核苷酸進行，該寡核苷酸如在5’末端具有硫酯鍵(Thioatbrücken)并因而對分解有抗性。
另一個特別優(yōu)選的變體方案是PNA(肽核酸)寡聚體的使用，按其意義該PNA作為寡核苷酸在實驗中使用。PNA寡聚體即不能被聚合酶分解也不能被聚合酶延伸，從而理想地適合于此方法的變體方案。設(shè)計和合成PNA寡聚體的方法是現(xiàn)有技術(shù)。
如上所述，在這種方法中可以使用多個限定器位置和同樣多個分別對于在背景DNA中存在的甲基化狀態(tài)特定的寡核苷酸。
在所研究的DNA的選擇性擴增后，開始優(yōu)選的是根據(jù)本身已知的方法確定多個限定器位置的甲基化狀態(tài)。
然而明顯的是即使在這種情況下，PCR片段的形成即使在個別的情況下可具有足夠的信息值，同樣在MSP的情況下，只要限定器位置例如在背景DNA中實際上呈現(xiàn)達100％的非甲基化，而在所研究的DNA中呈現(xiàn)甲基化形式。如果人們開始在PCR中使用寡核苷酸，該寡核苷酸優(yōu)選經(jīng)亞硫酸氫鹽處理由非甲基化的背景DNA形成的序列結(jié)合。只要根本上存在至少微量的所研究的DNA，那么在PCR中只有一種產(chǎn)物形成。這在個別的情況中對于診斷已經(jīng)可以是足夠的了，且在此它涉及具有如MSP的相似性質(zhì)的方法。盡管這樣一種方法不是直接優(yōu)選的，但這樣一種方法迄今是未知的，并因此也被認為是本發(fā)明的一個主題。
優(yōu)選的是在PCR反應(yīng)中同時產(chǎn)生多個片段，即進行多重PCR。在其設(shè)計中必須注意不僅引物而且其它所用的寡核苷酸都必須不能相互互補，否則高度的多重性將在這種情況下比通常的情況更加困難。然而，經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的DNA具有優(yōu)點，基于兩個DNA鏈的不同G和C含量，正向引物從不能同樣發(fā)揮反向引物功能，這反過來促進了多重性并基本彌補了所述缺點。
在最簡單的情況下，再次開始探測形成的片段。對此考慮所有可能已知的分子生物學(xué)方法，如凝膠電泳、測序、液相層析或雜交，該探測在此不分析分類器寡核苷酸。這也可考慮用作對前序方法的質(zhì)量控制。如上所述，隨后對分類器位置的甲基化程度的分析卻是特別優(yōu)選的。
優(yōu)選擴增所研究的DNA的上述方法有利地與探測分類器寡核苷酸的技術(shù)的組合具有大量的可能性。
特別適合的探測技術(shù)是與寡聚體陣列的雜交，如引物延伸(小測序)反應(yīng)。與寡聚體陣列的雜交可不必進一步修改方案地使用最近的現(xiàn)有技術(shù)(Olek A，Olek S，Walter J；WO專利99 28498)。然而優(yōu)選的是使擴增產(chǎn)物與寡聚體陣列雜交，該寡聚體陣列包含一對固定于固相上的寡核苷酸，分別在亞硫酸氫鹽處理和擴增之前，其中之一每次最優(yōu)選地與含有最初非甲基化的CpG(分類器位置)的DNA區(qū)段進行雜交，而其中的另一個同樣最優(yōu)選地與最初含有甲基化CpG的相應(yīng)區(qū)段進行雜交。特別優(yōu)選的情況是將擴增產(chǎn)物進行熒光或放射性標記，或者用可除去的質(zhì)量標記進行標記，從而在雜交之后，結(jié)合到成對的兩個寡核苷酸上的片段可基于這些標記進行探測和定量。獲得的是強度比例，從該比例可例如在對用完全甲基化和非甲基化的DNA的實驗進行校正后，確定各個分類器位置的甲基化程度。大量的片段和分類器位置可同時在這種寡聚體陣列上進行探測(

圖1)。有意義的且優(yōu)選的是該陣列也含有探測限定器位置的寡聚體用于監(jiān)控實驗，這是因為可確定進入分析的所研究的DNA與背景DNA的比例。
引物延伸反應(yīng)也可在固定于固相上的寡核苷酸上進行。盡管不是完全必需的，這些引物的固定是優(yōu)選的，這是因為通常應(yīng)該研究多個擴增產(chǎn)物中許多的分類器位置，且該研究可以以顯著更簡單的方式在一個實驗中在固相并從而在寡聚體陣列上進行。特別優(yōu)選的是引物直接位于一個分類器位置旁，則該延伸只有一個核苷酸。特別優(yōu)選的是只將雙脫氧胸苷和雙脫氧胞苷作為核苷酸加入，且它們分別用一種不同的熒光染料進行標記，當然，其中也可考慮甚至優(yōu)選其它不同的標記，如質(zhì)量標記。在亞硫酸氫鹽處理和擴增之后，先前甲基化的CG呈現(xiàn)為CG，而以前非甲基化的CG現(xiàn)在呈現(xiàn)為TG。因而引物延伸反應(yīng)導(dǎo)致雙脫氧胞苷或者導(dǎo)致雙脫氧胸苷的插入。各個位置甲基化的程度可分別從對這兩個終止子探測的熒光標記的比例來推斷。如果不加入鳥嘌呤衍生物且由此在TG或CG序列的一個堿基向引物延伸就已經(jīng)終止，那么在這種情況下同樣可能和優(yōu)選的是用雙脫氧胞苷和雙脫氧胸苷進行引物延伸。此外同樣優(yōu)選的是類似地通過用雙脫氧-ATP和雙脫氧-GTP或其衍生物適當?shù)貐^(qū)別CA和CG而對相反鏈進行分析。
然而本方法的一個特別優(yōu)選的變體方案是在一個實驗中同時探測限定器位置和分類器位置，這將通過使用TaqMan或LightCycler技術(shù)變體方案來實現(xiàn)。在此相對于用于優(yōu)選擴增所研究的DNA的寡核苷酸，額外加入其它經(jīng)熒光標記的寡核苷酸，且熒光變化的測量是在PCR反應(yīng)過程中進行的。由于其主要被用于擴增所研究的DNA，對不同分類器CpG位置的甲基化狀態(tài)的信息也主要是直接從該熒光變化中獲得的。由于不同的寡核苷酸各自優(yōu)選地使用不同的熒光染料，所以在PCR過程中分別區(qū)分不同位置的熒光變化也是可能的。
該依賴于甲基化狀態(tài)的熒光變化可通過許多方法實現(xiàn)，此處將它們中的兩個以例子的方式進行描述。
首先，可以使用寡核苷酸探針，該探針或者特異性地與通過化學(xué)處理從非甲基化的DNA的相應(yīng)位置產(chǎn)生的序列結(jié)合，或者相應(yīng)地與通過化學(xué)處理從甲基化的DNA的相應(yīng)位置產(chǎn)生的序列結(jié)合。這些探針特別優(yōu)選帶有兩種熒光染料，即一種猝滅染料和一種熒光染料。兩者都是與相同的寡核苷酸探針連接的?，F(xiàn)在，如果PCR反應(yīng)以所研究的DNA作為模板來進行，那么這次PCR反應(yīng)將被熒光標記的寡聚體探針阻斷。然而，由于后者對聚合酶的核酸酶活性沒有抗性，所以在PCR反應(yīng)過程中，結(jié)合到模板DNA上的探針發(fā)生了分解，分解與探針和模板的結(jié)合效率相關(guān)，這是因為未結(jié)合的探針不被聚合酶分解。由于作為標記的猝滅染料和熒光染料各自分離的事實，通過標記染料的熒光增加，探針的分解是直接可見的。原則上，在此涉及所謂的TaqMan測定的變體方案。
依此所測量的是由所研究的DNA的PCR產(chǎn)物形成的，但僅僅當研究的分類器位置也呈現(xiàn)甲基化狀態(tài)的情況下，可以通過探針在經(jīng)化學(xué)處理的DNA上的雜交探測探針。因而含有探針的對照樣品是適當且優(yōu)選的，其中探針對應(yīng)地結(jié)合其它甲基化狀態(tài)中的分類器位置。
為了達到區(qū)別探針的能力并由此實現(xiàn)多重反應(yīng)，優(yōu)選具有不同發(fā)射波長的不同熒光染料與一個猝滅劑一起用于多個探針上。
即使在這樣一種測定的情況下，也使用了與限定器位置結(jié)合的寡核苷酸，其防止了背景DNA的顯著擴增。所研究的DNA的擴增也可以以這樣一種途徑進行分析，即相同的位置也是用上述的探針進行研究的，且從而擴增是用結(jié)合于限定器位置的探針進行探測的。在這種情況下，特別優(yōu)選的是不能被分解的寡核苷酸選擇性地結(jié)合到背景DNA上，而熒光標記的探針結(jié)合到所研究的DNA上。在本方法一個特別優(yōu)選的變體方案中，探針和不分解型的寡核苷酸除了優(yōu)選為一個核堿基(Nukleobasen)之外具有相同的序列，但在任何情況下都不超過兩個核堿基。
特別優(yōu)選的還有一個變體方案，其中將多個可甲基化的位置定義為限定器位置，且分別將至少一個優(yōu)選結(jié)合背景DNA的寡核苷酸及一個探針用于這些位置。由于在這種情況下背景DNA的擴增將被多個寡核苷酸抑制，所以該方法特別適用于當背景DNA相對于所研究的DNA過剩程度特別高的情況下。在許多情況下，在這些變體方案和對于多個限定器位置存在于一個片段中的情況下，對限定器位置的進一步的研究將成為多余的，這是因為用現(xiàn)有的設(shè)備不能同時探測任意多的不同染料(多數(shù)情況下為4-5種)。因而對于額外的分類器位置的研究優(yōu)選地用上述的其它探測技術(shù)的一種進行。
同樣優(yōu)選的是多個位置的甲基化程度可同時用一個探針進行研究。
如果需要對分類器甲基化程度進行更精確的定量，那么可優(yōu)選地使用兩個相互競爭的具有不同染料的探針，其中之一再次在所研究的DNA中非甲基化的位置的情況下結(jié)合，而另一個優(yōu)選地相反在甲基化位置的情況下結(jié)合。所研究的位置的甲基化程度可從兩種染料增加的熒光比例來推斷。
一個基本上不同的方法最近認為是LightCyclerTM技術(shù)，然而其中在PCR過程中也發(fā)生了熒光變化。利用了以下事實，即只有當兩個染料直接相互鄰近，即只間距1-5個核苷酸，熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)才能發(fā)生于兩個染料之間。只有在那時第二個染料才可被第一個染料的發(fā)射所激發(fā)且因而反過來發(fā)射另一個波長的可被探測到的光。
在上述甲基化分析的情況下，熒光標記的探針在相關(guān)的經(jīng)化學(xué)處理的DNA的一個分類器位置上雜交，且該探針的結(jié)合再次依賴于所研究的DNA是否在該位置上呈現(xiàn)甲基化或非甲基化的形式。具有另一種熒光染料的另一種探針直接在鄰近該探針處結(jié)合。如果另一個可甲基化的位置存在于各個序列區(qū)段，那么后一種結(jié)合再次依賴于甲基化而發(fā)生。在擴增過程中，DNA得到了擴增，只要具有對此所要的甲基化狀態(tài)，更多的熒光標記的探針就會在鄰近各個位置處結(jié)合，并且因而測量到增加的FRET。
在此方法中也同樣優(yōu)選使用多個不同熒光標記探針的多重反應(yīng)。
此處同樣可能和優(yōu)選對限定器位置進行測量。假定背景DNA在相關(guān)位置呈現(xiàn)非甲基化形式，且在化學(xué)處理和擴增之后在這些位置上產(chǎn)生了TG二核苷酸，同時相反地，甲基化的所研究的DNA產(chǎn)生了CG二核苷酸，熒光標記的探針將結(jié)合含有CG的序列，而未標記的競爭性寡聚體結(jié)合背景DNA相應(yīng)的TG序列。
在此重要的是非甲基化的寡核苷酸由于其與較短的探針寡核苷酸相比明顯較高的熔點而阻礙了擴增。在這點上，探針與化學(xué)處理的背景DNA結(jié)合的寡聚體在這種情況下不是只有少數(shù)幾個相同的堿基，它們基本是較長的(5-15個堿基)。同樣的，再次可能且優(yōu)選的是使用修飾的寡核苷酸和/或PNA。同樣在這種情況下，為了避免在PCR中的延伸，除位于其3’端的引物之外，所有探針和寡核苷酸都是被阻斷的。這可用如磷酸基團來進行。
這兩種方法在結(jié)果上的主要區(qū)別在于，在一種情況下測量了熒光的降低，而在另一種情況下測量了熒光的增加。在這兩種情況下，即可對限定器位置也可對分類器位置進行測量。
總之，一種探測DNA樣品中胞嘧啶甲基化的方法是特別優(yōu)選的，在其中進行了下面的步驟首先對含有所研究的DNA以及背景DNA的基因組DNA樣品以這樣一種途徑進行了化學(xué)處理，使得所有非甲基化的胞嘧啶堿基都轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?，?-甲基胞嘧啶堿基保持不變；然后將經(jīng)化學(xué)處理的DNA樣品用至少兩個引物寡核苷酸及一種聚合酶進行擴增，其中所研究的DNA作為模板比背景DNA更優(yōu)選，且在下一個步驟中，對擴增產(chǎn)物進行分析，且從擴增產(chǎn)物的存在性和/或從其它位置的分析中推斷所研究的DNA中的甲基化狀態(tài)。
在本方法特別優(yōu)選的變體方案中，樣品DNA是從個體的血清或其它體液中獲得的。同樣優(yōu)選的樣品是從細胞系、血液、痰、糞便、尿、血清、腦脊液、包埋于石蠟中的組織如來自眼、腸、腎、腦、心、前列腺、肺、乳房和肝的組織、組織載玻片和其所有可能的組合中獲得。
在本方法特別優(yōu)選的變體中，該化學(xué)處理是用亞硫酸氫鹽(＝Disulfit，Hydrogensulfit)。優(yōu)選的是在將DNA包埋于瓊脂糖中之后進行化學(xué)處理。同樣優(yōu)選的是在化學(xué)處理的情況中存在DNA雙鏈體變性的試劑和/或自由基阱。
在本方法特別優(yōu)選的變體中，擴增是在至少一種額外的寡核苷酸存在下的第二個步驟中進行的，該寡核苷酸結(jié)合5’-CG-3’二核苷酸或5’-TG-3’二核苷酸或5’-CA-3’二核苷酸，其中該額外的寡核苷酸優(yōu)選地結(jié)合背景DNA并對其擴增產(chǎn)生不利影響。
同樣特別優(yōu)選的是在第二步驟中經(jīng)化學(xué)處理的DNA樣品使用至少2個引物寡核苷酸和另一個與5’-CG-3’二核苷酸或5’-TG-3’二核苷酸或5’-CA-3’二核苷酸雜交的寡核苷酸，和至少一個與5’-CG-3’二核苷酸或5’-TG-3’二核苷酸或5’-CA-3’二核苷酸雜交的報道寡核苷酸連同一個聚合酶一起進行擴增的；其中該額外的寡核苷酸優(yōu)選結(jié)合背景DNA并對其擴增產(chǎn)生不利影響，且其中該報道寡核苷酸優(yōu)選地結(jié)合所研究的DNA并指示其擴增。
同樣優(yōu)選的是除報道寡核苷酸之外，使用了另一個用熒光染料進行標記的寡聚體，該寡聚體直接在鄰近報道寡核苷酸處進行雜交且該雜交可依靠熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)進行探測。
對該分析優(yōu)選進行TaqMan測定。同樣優(yōu)選的是進行LightCycler測定(如上所述)。
除引物之外所用的寡核苷酸特別優(yōu)選不具備3’-OH功能可用。此外報道寡核苷酸特別優(yōu)選地帶有至少一個熒光標記。
同樣特別優(yōu)選的是報道分子通過熒光的增加和減少顯示擴增，且該熒光的增加和減少也直接用于分析，且所研究的DNA的甲基化狀態(tài)可從熒光信號來推斷。
在本方法特別優(yōu)選的變體方案中，該分析或進一步的分析是依靠與寡聚體陣列的雜交來進行的，其中寡聚體可為核酸或在其雜交性質(zhì)上相似的分子，如PNA。優(yōu)選地，該寡聚體經(jīng)12-22個堿基長的區(qū)段與所研究的DNA進行雜交并包含CG、TG或CA二核苷酸。優(yōu)選用該方法在一個實驗中探測所研究的DNA中超過20個甲基化位置的甲基化狀態(tài)，更優(yōu)選的是超過60個的甲基化位置。
還有一種方法同樣是特別優(yōu)選的，其中進一步的分析是通過對經(jīng)擴增的所研究的DNA的長度測量來進行的，其中該長度測量的方法包括凝膠電泳、毛細管凝膠電泳、層析(如HPLC)、質(zhì)譜分析和其它適當?shù)姆椒ā?br> 還有一種方法同樣是特別優(yōu)選的，其中進一步的分析是通過測序進行的，其中用于測序的方法包括桑格方法、馬吉測序法和其它方法如通過雜交的測序(SBH)。再次優(yōu)選的是一種方法，其中對每一個或一小組CpG位置的測序(根據(jù)桑格)分別用一個單獨的引物寡核苷酸來進行的，且引物延伸僅構(gòu)成了一個或少數(shù)的堿基，且所研究的DNA中相關(guān)位置的甲基化狀態(tài)是從引物延伸的類型中推斷的。
在本方法特別優(yōu)選的變體方案中，病人疾病或其它醫(yī)學(xué)狀況的存在可從經(jīng)研究的不同CpG位置的甲基化程度來推斷。
特別優(yōu)選的是擴增產(chǎn)物本身帶有可探測的標記用于對其進行探測。這些標記優(yōu)選涉及熒光標記，放射性核素或在質(zhì)譜儀中探測的可除去的質(zhì)量標記。
此外，一種方法是優(yōu)選的，其中在擴增中引物之一是結(jié)合在固相上的。
該方法的一個變體方案同樣是優(yōu)選的，其中擴增產(chǎn)物是全部在質(zhì)譜儀上探測的且因而通過其質(zhì)量明確地進行特征記錄。
本發(fā)明的另一個目的是使用所描述的方法之一對病人或個體進行不利情形的診斷和/或預(yù)診，其中這些不利情形屬于至少一種下面的種類非期望的藥物相互作用；癌疾??；CNS功能失常、損傷或疾??；攻擊或行為障礙癥狀；腦損傷的臨床、心理學(xué)和社會結(jié)果；精神病障礙和個性病癥；癡呆和/或有關(guān)的癥狀；心血管疾病、功能失常和損傷；胃腸道的功能失常、損傷或疾??；呼吸系統(tǒng)的功能失常、損傷或疾?。皇軅?、炎癥、感染、免疫和/或康復(fù)；作為發(fā)育過程中畸形的身體功能失常、損傷或疾病；皮膚、肌肉、結(jié)締組織或骨骼的功能失常、損傷或疾??；內(nèi)分泌和代謝功能失常、損傷或疾??；頭痛或性功能失常。
此外，所描述的方法之一用于區(qū)別細胞類型或組織或者用于研究細胞分化是有利的。
本發(fā)明的目的還有一種試劑盒，該試劑盒包括含有亞硫酸氫鹽的試劑、引物和其它用于產(chǎn)生擴增產(chǎn)物的無3’-OH功能的寡核苷酸，以及可選擇的實施至少一種所描述的變體方案的說明書。
下面的實施例解釋了本發(fā)明實施例1在MDR-1基因中使用PNA阻斷探針(PCR箝位(clamping))的MDR1基因的甲基化靈敏性擴增。
a)利用PNA探針(PNA阻斷探針)的甲基化特異性PCR，該探針的結(jié)合位點不與引物的相重疊。
首先，PCR條件是對經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的DNA限定的，其中可識別PNA阻斷探針對PCR的等位基因特異性影響。在該第一個實驗中，PNA和引物間的結(jié)合位點不重疊。
首先，用引物TAAGTATGTTGAAGAAAGATTATTGTAG和TAAAAACTATCCCATAATAACTCCCAAC測試序列為AAAATGTGTT的11聚體PNA在PCR中的影響。PNA對PCR反應(yīng)的影響不能在具有55℃退火溫度的標準PCR條件下進行測量。用于MDR1-片段擴增的標準循環(huán)程序使用下面的程序步驟
步驟1T＝96℃ 20分鐘步驟2T＝96℃ 30秒鐘步驟3T＝56℃ 1.15分鐘步驟4T＝72℃ 2.00分鐘步驟2～4進行40個循環(huán)。
步驟5T＝72℃ 15分鐘步驟6冷卻至4℃并維持該溫度。
由此，為了獲得對擴增的等位基因特異性抑制，必須使引物長度、退火溫度和PNA樣品長度最適化。
為了使最適的引物和PNA退火成為可能，用較長的13聚體PNAAAAGACGTGTTAT測試較短的21聚體引物TAAGTATGTTGAAGAAAGATT和AATCCCCATAAACTTACCAAA。進一步的實驗是用18、19和20聚體引物進行的，這些引物與上述序列僅區(qū)別在3’端的堿基被省略的事實。21聚體引物是用退火溫度的梯度進行檢驗的。在一個平行的批次中，將13聚體的PNA AAAGACGTGTTAT或者適合于從非甲基化等位基因生產(chǎn)的序列的PNA AAAGATGTGTTAT以20-100pmol/μl的不同濃度加入。
在以70和100pmol/μl的濃度加入PNA時且在退火溫度49.4℃和46.7℃下觀察到了對PCR的明顯影響。該影響在用18聚體引物時最明顯。
至此開始研究的是較低的延伸溫度54℃在多大程度上影響了PNA的抑制影響。
為此目的分別將上述的13聚體PNA或兩個13聚體PNA一起以50和70pmol/μl的濃度加入到PCR批次中。與無PNA的正對照相比觀察到對PCR的明顯抑制(圖2，瓊脂糖凝膠電泳，所用的13聚體PNA探針的PNA濃度；注釋MDR 1-5 FM13聚體PNAAAAGACGTGTTAT；MDR 1-5 FU13聚體PNA AAAGATGTGTTAT)。該實驗使得檢驗中所用的DNA在相關(guān)位置上主要呈現(xiàn)非甲基化成為顯而易見的，這可通過亞硫酸氫鹽測序來證實。因此，在該實驗中可顯示PNA阻斷探針明顯的等位基因特異性，該特異性導(dǎo)致非甲基化片段優(yōu)選的擴增。
b)利用PNA探針(PNA阻斷探針)的甲基化特異性PCR，其結(jié)合位點與引物的相重疊(“引物排斥”)。
在上述實驗中，引物是如此選擇的，從而使PNA目標序列大約位于要擴增的區(qū)域的中心。如果引物和PNA序列相互鄰接或重疊，那么該排列則描述為更靈敏的。在PNA序列特異性結(jié)合的情況下，在這種排列下，即使微量的PNA濃度是也可觀察到PNA的作用。
在該實驗中選擇具有序列TTATGTGAATTTTGAAAG的引物，從而使得它與PNA序列重疊(引物排斥)。將13聚體PNA AAAGACGTGTTAT和PNA AAAGATGTGTTAT兩者以3種不同的濃度加入到反應(yīng)批次中。
在濃度為25pmol/μl時就觀察到了對PCR反應(yīng)的完全抑制。在前述的實驗中，對PCR的完全抑制只有在兩種PNA的加入下當濃度達到70pmol/μl時才能觀察到。
c)非甲基化DNA的相應(yīng)片斷的引物排斥為了探測序列特異性結(jié)合，在進一步的實驗中研究了PNA對鑒于甲基化狀態(tài)有明顯特征的模板的作用。用于本實驗的模板DNA相應(yīng)于經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的完全非甲基化的DNA。
這將用作PCR中的模板。為此使用了下面的程序步驟步驟1T＝96℃ 20分鐘步驟2T＝96℃ 30秒鐘步驟3T＝49℃ 1.15分鐘步驟4T＝54℃ 2.00分鐘步驟2～4進行36個循環(huán)。
步驟5T＝72℃ 15分鐘步驟6冷卻至4℃并維持該溫度。
將如上所述的13聚體[PNA]以3個不同的濃度加入到反應(yīng)批次中。在這種非甲基化模板的情況下，人們將預(yù)期適合于該模板的PNAMDR1-5-FU(3)將比MDR1-5-FM(3)具有明顯更強的影響。圖3(注釋參見圖2)顯示即使對于相當?shù)偷腜NA濃度事實上也是這樣的情況。
這些結(jié)果顯示通過特異性結(jié)合的PNA的甲基化特異性擴增使得對PCR反應(yīng)的抑制成為可能。在具有不與MDR-1互補的PNA的對照實驗中，可顯示這在正被討論的濃度下沒有對PCR形成顯著的影響。
實施例2GSTpi基因片段的甲基化靈敏性擴增。
GSTPi基因的特定CpG位置被鑒定為前列腺癌的腫瘤標記。經(jīng)選擇用于實驗的引物對GGAAAGAGGGAAAGGTTTT和TACTAAAAACTCTAAACCCCAT中的一個引物是這樣定位的，以使其精確地與PNA序列CCCCGAAAACGCG(或CCCTGAAAATGTG)鄰接。該PNA序列含有3個相關(guān)的CpG位置，其與那些用于MDR1片段的PNA有區(qū)別。GSTPi片段的所研究及相關(guān)CpG呈現(xiàn)“正常的”非甲基化的DNA，即不是源自腫瘤病人的DNA。對于反應(yīng)批次給出的具有序列CCCTGAAAATGTG PNA“GSTP-down”因而應(yīng)該對PCR反應(yīng)具有可識別的影響，而不是相應(yīng)的PNA“GSTP-up”CCCCGAAAACGCG。
將PNA“GSTP-down”以3個不同的濃度加入到實驗批次中。在退火溫度的梯度下進行了檢驗。
該實驗的結(jié)果在圖4中顯示。對PCR的最強的抑制可通過在退火溫度為55℃時PNA(GSTP-down)的加入來確定。與正對照(無PNA的加入)相比，可認識到PCR反應(yīng)將通過PNA以20[p]mol/μl的濃度加入而顯著地被抑制。
隨后，將PNA“GSTP-up”和“GSTP-down”對以最初樣品中非甲基化DNA和源自前列腺腫瘤組織的甲基化DNA作為模板的擴增的影響進行比較，以探測序列特異性(和因而最終的甲基化靈敏性)結(jié)合。
將非甲基化的DNA和前列腺DNA作為模板用于PCR中。將PNA“GSTP-up”或“GSTP-down”以3個不同的濃度加入到反應(yīng)批次中。
“GSTP-down”PNA的加入對下游甲基化的模板具有可見的影響當PNA以70pmol/μl的濃度加入時該PCR則被完全抑制。另一方面，在加入PNA“GSTP-up”的情況下，相反僅可發(fā)現(xiàn)PNA對PCR的弱的抑制影響。
在前列腺組織的檢驗DNA中加入“GSTP-up”PNA對PCR具有相當大的抑制影響(圖5)。PNA以20pmol/μl的濃度的加入就已經(jīng)明顯地抑制了PCR。在PNA以50pmol/μl的濃度加入時可確定對PCR的完全抑制。與此相反，在前列腺DNA中加入“GSTP-down”PNA具有明顯微小的影響。即使PNA以70pmol/μl的濃度加入也不能完全抑制PCR。
該實驗顯示，借助阻斷性寡聚體探針來選擇性地抑制經(jīng)限定位置的甲基化或非甲基化等位基因的擴增是可能的。在本發(fā)明的意義上，相關(guān)位置可充當限定器位置，即，將選擇性地抑制背景DNA的不想要的甲基化模板的擴增。
實施例3以GSTPi基因為例使用甲基化特異性抑制PCR的探針的不同可能性。
圖6顯示對于給定的模板序列在甲基化靈敏性擴增的意義上如何排列引物的幾種可能性。為了解釋，圖6a顯示在經(jīng)亞硫酸氫鹽處理之后的模板DNA1相應(yīng)于最初甲基化的樣品，且DNA2相應(yīng)于最初非甲基化的樣品。
圖6b顯示在等位基因特異性PCR或甲基化特異性PCR(MSP)的意義上引物之一的排列。在這種情況下，利用在所顯示的引物的使用下只有甲基化的DNA1的擴增可以發(fā)生。
圖6c和6d通過使用簡并位置(6c)或者圖6d中的通用堿基(此處為肌苷)顯示如何可以相應(yīng)地使用非甲基化特異性的引物。
圖7顯示對于給定的模板序列在甲基化靈敏性擴增的意義上如何排列引物和探針(“封阻劑”)的幾種可能性。在這些實施例中，所用的引物本身不是甲基化特異性的，而該甲基化特異性是單獨通過探針(“封阻劑”)來實現(xiàn)的。分別對DNA1和DNA2使用了特異性探針作為封阻劑。
在圖7a中引物和探針不重疊，但探針直接連接到引物的3’端了。所示的探針是在3’端進行了修飾的寡核苷酸，其在擴增中自身不能被延伸。類似地，也可使用PNA，但相應(yīng)于其熔解溫度，在本實施例中該PNA必須較短。在圖7b中使用了相同的引物，但此處的DNA探針與引物重疊(引物排斥)。
在圖7c和7d中，用于簡并位置的引物與甲基化特異性探針重疊。通用的堿基也可類似地用于引物中。
在圖8中類似地顯示了具有正向和反向引物的實施例，其中使用了探針，該探針不與任何一個引物重疊。
這些實施例闡明寡聚體探針如何可以用于甲基化特異性擴增的多種可能性，以抑制背景DNA相對于所分析的DNA的擴增。然而，本發(fā)明的范圍將不局限于作為實施例在此處所描述的實施方案。
實施例4非甲基化和甲基化DNA的制備和亞硫酸氫鹽處理用于甲基化DNA的制備，將人基因組DNA根據(jù)生產(chǎn)商的說明書用S-腺苷甲硫氨酸和CpG甲基化酶(SssI，New England Biolabs)進行處理。用于非甲基化DNA的制備，將基因片段ELK-1用來自人基因組DNA的引物GCTCTATGGTCTTGTCTAACCGTA(SEQ-ID1)和AGGTGGTGGTGGCGGTGG(SEQ-ID2)借助PCR進行擴增。將這樣制備的非甲基化和甲基化DNA以及人基因組DNA以這樣一種途徑用亞硫酸氫鹽(Bisulphit，Hydrogensulfit，Disulfit)進行處理，從而所有在堿基的5’位置未甲基化的胞嘧啶都被修飾從而產(chǎn)生了在堿基配對性質(zhì)上有差異的堿基，然而在5’位置甲基化的胞嘧啶則保持不變。如果將亞硫酸氫鹽在0.1摩爾～6摩爾的濃度范圍內(nèi)用于反應(yīng)中，則在非甲基化胞嘧啶堿基中發(fā)生加成。此外必須存在變性劑或溶劑及自由基阱。隨后的堿性水解導(dǎo)致非甲基化的胞嘧啶核堿基轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?。該轉(zhuǎn)變的DNA用作驗證甲基化胞嘧啶。
實施例5Cy5-標記的基因探針的制備由經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的DNA樣品開始，將來自ELK-1基因的啟動子區(qū)的長度為595bp的限定片段進行擴增。該擴增是用引物寡核苷酸ATGGTTTTGTTTAATYGTAGAGTTGTTT(SEQ-ID3)和TAAACCCRAAAAAAAAAAACCCAATAT(SEQ-ID4)進行的。通過使用以熒光染料Cy5標記的引物寡核苷酸，該片段直接在PCR過程中進行標記。將經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的(1)非甲基化DNA、(2)甲基化DNA或(3)人基因組DNA用作基質(zhì)DNA。然后在分開的雜交中研究這3種不同的DNA片段在特定CpG位置上的甲基化程度。
實施例6進行雜交并評估經(jīng)雜交的DNA“芯片”在實施例5中制備的基因探針在DNA芯片上進行雜交。已預(yù)先將寡核苷酸固定于芯片上。該寡核苷酸序列是源自在實施例2中所述的基因ELK-1的擴增片段，且具有CG二核苷酸包含與其直接鄰近的部分。寡核苷酸的長度總計14-22個核苷酸，且寡核苷酸中CG二核苷酸的位置是可變的。雜交之后，對DNA芯片進行掃描(參見圖1)，并用數(shù)字對雜交信號進行了評估(數(shù)據(jù)未顯示)。對寡核苷酸CTACTCAACGAAAACAAA(SEQ-ID5)和CTACTCAACAAAAACAAA(SEQ-ID6)的雜交結(jié)果在圖1中顯示。此處如果位于擴增產(chǎn)物的位置103的ELK-1片段的胞嘧啶是甲基化的，則CTACTCAACGAAAACAAA(SEQ-ID5)優(yōu)選地進行雜交，而如果該胞嘧啶是非甲基化的，則CTACTCAACAAAAACAAA(SEQ-ID6)優(yōu)選進行雜交。
圖1中顯示與啟動子片段雜交之后的DNA芯片。偽彩色圖像是如掃描后制作的那樣顯示的。相對與此處顯示的黑白圖相反，彩色圖像是用掃描儀制得的。不同顏色的強度代表雜交的程度，其中雜交的程度從紅色(這可在圖1中識別為淺色的點)減低到藍色(這可在圖1中識別為深色的點)。
實施例7模板DNA的制備和確立GSTp1 PCR將來自外周血的人DNA(Promega，Madison USA)作為模板DNA，該DNA是未處理的，用酶在體外進行甲基化，并進行了亞硫酸氫鹽處理。用于所有CG二核苷酸的甲基化，根據(jù)生產(chǎn)商的說明書，將150μl反應(yīng)體積中的6μg DNA與SssI(New England Biolabs，F(xiàn)rankfurt/Main)進行反應(yīng)。亞硫酸氫鹽處理是根據(jù)已公開的方法進行的(Olek A，Oswald J，Walter J，一種改良提高的基于硫酸氫鹽的胞嘧啶甲基化分析的方法(A modified and improved methodfor bisulphate based cytosine methylation analysis)，Nucleic Acids Res.1996年12月15日；24(24)5064-6)。
將153-bp長的GSTp1片段(序列Acc.Nr M24485.1中的位置1242-1393)用亞硫酸氫鹽-DNA特異性引物2cf GTTTT(CT)GTTATTAGTGAGT和2cr TCCTAAATCCCCTAAACC在25μl反應(yīng)體積中(1x反應(yīng)緩沖液，Qiagen；1 U HotstarTaq，Qiagen每種dNTP；200μM，每一種引物500nM，0.05-10ng經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的模板DNA)進行擴增，其PCR條件如下(95℃-15分鐘；46個循環(huán)96℃-045分鐘，52℃-045分鐘，72℃-020分鐘；72℃-10分鐘)(參見圖9和10)。通過對GSTp1片斷的測序可顯示來自外周血的人DNA對于這些片段沒有甲基化的CG二核苷酸，而在另一方面，經(jīng)SssI處理的DNA中，所有CG二核苷酸都呈現(xiàn)甲基化的形式(參見圖9)。對GSTp1片段的測序證實了其它的結(jié)果(參見如WO9955905)，即在GSTp1基因中，與經(jīng)發(fā)表的序列(Genbank Acc No.M24485.1)相比，存在額外的G核苷酸(在Genbank Acc No.M24485.1的位置1273和1274間；GSTp1 PCR片段的位置33，參見圖9)。至于PCR的效率，在CpG-甲基化和CpG-非甲基化的模板DNA之間無差異(參見圖10)。
實施例8甲基化GSTp1片段的選擇性擴增。
甲基化GSTp1片段選擇性擴增的實驗設(shè)計示意性地在圖11中顯示。GSTp1片段利用引物2cf GTTTT(CT)GTTATTAGTGAGT和2crTCCTAAATCCCCTAAACC在非甲基化模板DNA上的擴增是通過2個封阻劑寡核苷酸(B5+9FT6，GTGAGTATGTGTGGTTTGTGT-P；B15+17RT11，TAAACCCCCATCCCAAATCTCA-P，參見圖11)阻止的，所述封阻劑寡核苷酸序列相應(yīng)于非甲基化的經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的DNA。這些寡核苷酸在3’端用磷酸基團是經(jīng)修飾的以防止其在PCR過程中的延伸。該PCR是在25μl反應(yīng)體積中用如下循環(huán)程序(95℃-15分鐘；46個循環(huán)96℃-045分鐘，52℃-045分鐘，72℃-020分鐘；72℃-10分鐘)進行的。該PCR批次由如下組成1x反應(yīng)緩沖液(Qiagen，Hilden)；2 U HotstarTaq(Qiagen，Hilden)；每種dNTP200μM，每種引物500nM，每種封阻劑10μm(B5+9FT6，GTGAGTATGTGTGGTTTGTGT-P和B15+17RT11，TAAACCCCCATCCCAAATCTCA-P)，20ng-20pg經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的模板DNA。在這種PCR條件下，使可能完全抑制在25μg非甲基化模板DNA上GSTp1片段的擴增(參見圖12A，泳道8)。如果PCR是在無封阻劑寡核苷酸時進行的，那么GSTp1片段即得到了擴增(參見圖12，D泳道8)。相反地，GSTp1-PCR-產(chǎn)物可在具有或不具有封阻劑寡核苷酸的情形下在100pg甲基化模板DNA上以相同的PCR條件被探測到((參見圖12，C泳道7；F泳道7)。因而PCR的絕對靈敏度至少為100pg甲基化模板DNA。
為了研究PCR的相對靈敏度，制備了非甲基化和甲基化模板DNA的混合物，其中非甲基化的與甲基化的DNA的比例為1∶1至1∶1000。用于這種DNA混合物的制備，將來自外周血的DNA(Promega，Madison；USA)與經(jīng)SssI-處理的DNA相應(yīng)于要獲得的比例進行混合(參見實施例7)，并然后進行亞硫酸氫鹽處理。在這些模板DNA混合物上(25μg總DNA)具有或不具有封阻劑寡核苷酸進行的PCR的結(jié)果顯示于圖12A、B或圖12D、E中。它們顯示甲基化GSTp1基因的拷貝可在200個拷貝的非甲基化GSTp1基因的背景上重復(fù)探測(參見圖12，A泳道6；B泳道6)。1∶1000的相對靈敏度通過進一步使PCR條件最適化是可以達到的(參見圖12B，泳道7)。
對具有封阻劑(參見圖12，A泳道6)或不具有B封阻劑(參見圖12，D泳道6)的情形下，從DNA混合物中(非甲基化與甲基化DNA的比例為1∶200)擴增的PCR產(chǎn)物的序列分析顯示了預(yù)期的結(jié)果。在不具有封阻劑的PCR中產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物相應(yīng)于非甲基化的GSTp1基因，而相反地，在具有封阻劑寡核苷酸的PCR中產(chǎn)生的GSTp1基因片段具有甲基化的外遺傳狀態(tài)。
也成功地檢驗了不相應(yīng)于相應(yīng)的GSTp1核苷酸序列的其它3’修飾，如ddNTP或額外的核苷酸。
實施例9甲基化的GSTp1片段在LightCycler上的選擇性擴增。
LightCycler(Roche)是進行PCR并同時探測和分析PCR產(chǎn)物的儀器。該儀器是根據(jù)生產(chǎn)商的說明書進行操作的。對PCR的定量和定性分析是用LightCycler軟件3.5版進行的。
甲基化GSTp1基因片段的選擇性擴增是在10μl反應(yīng)體積中(1x反應(yīng)緩沖液(Qiagen，Hilden)；5 U HotstarTaq(Qiagen，Hilden)；每種dNTP250μM，每種引物625nM(2cf GTTTT(CT)GTTATTAGTGAGT；2cr TCCTAAATCCCCTAAACC)，4μM的封阻劑(B5+9FT16，GTGAGTATGTGTGGTTTGTGTT-P)，0.25μg/μl BSA(Sigma，Munich)，250nM錨定寡核苷酸(GSTp1-Fluo，TTTAGAGTTTTTAGTATGGGGTTAATT-Fluorescein；TibMolBiol，Berlin)，250nM雜交探針(GSTp1-Red705，Red705-GTATTAGGTTTGGGTTTTTGGT-P；TibMolBiol，Berlin)和/或GSTp1-Red650，Red650-TAGTATTAGGTTCGGGTTTTCGG-P，TibMolBiol，Berlin)，20ng-200pg模板DNA)進行的，使用如下循環(huán)程序95℃-15分鐘；46個循環(huán)變性96℃-4秒鐘，退火52℃-30秒鐘，延伸72℃-20秒鐘。探測是在每一個循環(huán)中通過基因特異性和甲基化特異性LightCycler探測探針在退火步驟中10秒鐘之后進行的。當甲基化特異性錨定探針GSTp1-Fluo及甲基化特異性探針GSTp1-Red705或GSTp1-Red650之一兩者與PCR片段進行雜交時，對GSTp1-PCR片段進行探測。
為了檢查探測探針的甲基化特異性，將各15 ng的經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的甲基化和非甲基化模板DNA在LightCycler中進行了擴增。為了進行探測，該PCR含有錨定探針GSTp1-Fluo和雜交探針GSTp1-Red705和GSTp1-Red650的等摩爾混合物。對于經(jīng)甲基化的GSTp1基因的探針GSTp1-Red650的熒光是在LightCycler的F2/F1探測通道中測量的，而相反地，對于非甲基化的GSTp1基因的探針GSTp1-Red705是在F3/F1通道中探測的(參見圖13)。該實驗顯示GSTp1-Red650特異性地探測甲基化的GSTp1基因，而非甲基化的版本不產(chǎn)生熒光信號(參見圖13A)。相反地，探針GSTp1-Red705探測非甲基化和甲基化的GSTp1基因，但對后者以顯著減少的效率進行探測(參見圖13B)。
甲基化GSTp1片段擴增的絕對和相對靈敏度是與實施例8類似地進行研究的。為了確定絕對靈敏度，在具有或不具有封阻劑寡核苷酸的情形下，在LightCycler中于不同甲基化量的經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的模板DNA上進行了GSTp1-PCR。除“錨定”探針之外，將雜交探針GSTp1-Red650用于探測。結(jié)果總結(jié)于圖14中。對“雜交點(crossing points)”的計算是用LightCycler軟件3.5版進行的，并顯示了PCR循環(huán)的數(shù)目，其中GSTp1 PCR產(chǎn)物可第一次以比負對照高的信號探測到。這意味著“雜交點”的值越低，GSTp1片段的擴增越有效。如果未顯示“雜交點”，則意味著不可探測到PCR產(chǎn)物。在所示的實驗中，即使在封阻劑存在時，GSTp1也可用75pg甲基化的亞硫酸氫鹽處理的模板DNA進行擴增(參見圖14)。
為了確定相對靈敏度，GSTp1的PCR是用具有或不具有封阻劑寡核苷酸的20ng模板DNA混合物進行的(參見實施例8)(圖15)。為了進行探測，該PCR含有“錨定”探針GSTp1-Fluo和雜交探針GSTp1-Red705和GSTp1-Red650的等摩爾混合物。對于甲基化的GSTp1基因的探針GSTp1-Red650的熒光是在LightCycler的F2/F1探測通道中測量的，而相反地，對于非甲基化的GSTp1基因的探針GSTp1-Red705是在F3/F1通道中探測的。
確定的“雜交點”顯示在具有封阻劑的寡核苷酸的PCR中，一拷貝的甲基化GSTp1基因可在500個拷貝的非甲基化GSTP1基因的背景中重復(fù)進行探測(參見圖15，“旋轉(zhuǎn)位置(rotor position)”17，F(xiàn)2/F1列)。這相應(yīng)于40pg甲基化模板DNA的絕對靈敏度。在無封阻劑寡核苷酸時，只可獲得1∶10的相對靈敏度(參見圖15，“旋轉(zhuǎn)位置(rotor position)”3，F(xiàn)2/F1列)。在相同的條件下，具有15ng非甲基化的經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的模板DNA的GSTp1基因的擴增是完全被抑制的(參見圖15，“旋轉(zhuǎn)位置(rotor position)”19和9，F(xiàn)3/F1列)。
實施例10甲基化GSTp1片段在TaqMan上的選擇性擴增TaqMan(Applied Biosystems，Weiterstadt)是進行PCR并同時探測和分析PCR產(chǎn)物的另一種儀器。該儀器是根據(jù)生產(chǎn)商的說明書進行操作的。對PCR的定量和定性分析是用TaqMan軟件進行的。
甲基化GSTp1基因片段的選擇性擴增是在20μl反應(yīng)體積中(1x反應(yīng)緩沖液(Applied Biosystems)；2 U Amplitaq Gold(Applied Biosystems)；3.5mM MgCl2，每種dNTP 400μM，每種引物500nM(2cft，GTTTT(CT)GTTATTAGTGAGTA；2crTCCTAAATCCCCTAAACC)，7.5μM封阻劑1(B5+9FT16，GTGAGTATGTGTGGTTTGTGT-P)，7.5μM封阻劑2(B15+17RT19，TAAACCCCCATCCCAAATCTC-P)，450nM TaqMan探針(Taq1，Blackhole-TAATTCGTAGTATTAGGTTCGGGTTTTCGGTAGGG-FAM；BiosearchTechnologies)，10ng模板DNA)進行的，使用如下循環(huán)程序(95℃-10分鐘；3個循環(huán)變性96℃-15秒鐘，退火60℃-60秒鐘；3個循環(huán)變性96℃-15秒鐘，退火58℃-30秒鐘，延伸60℃-30秒鐘；3個循環(huán)變性96℃-15秒鐘，退火55℃-30秒鐘，延伸60℃-30秒鐘；40個循環(huán)變性96℃-15s，退火52℃-30s，延伸60℃-40s)。探測是在每一個擴增循環(huán)中通過基因特異性TaqMan探針在延伸步驟之后進行的。
為了確定相對靈敏度，GSTp1的PCR是用具有或不具有封阻劑寡核苷酸的10ng模板DNA混合物進行的(參見實施例8)(圖16)。對“閾值循環(huán)”的計算是用TaqMan軟件進行的并給出了與LightCycler的“雜交點”的值可比較的PCR循環(huán)的數(shù)目，在該數(shù)目上GSTP1 PCR產(chǎn)物可第一次以比負對照高的信號探測到。這意味著“閾值循環(huán)”的值越低，GSTp1片段的擴增越有效。
確定的“閾值循環(huán)”的值顯示在具有封阻劑的寡核苷酸的PCR中，一拷貝的甲基化GSTp1基因可在200個拷貝的非甲基化GSTP1基因的背景中進行探測(參見圖16)。這相應(yīng)于50pg甲基化模板DNA的絕對靈敏度。在相同的條件下，具有10ng非甲基化的經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的模板DNA的GSTp1基因的擴增是完全被抑制的(參見圖16)。
附圖描述圖10GSTp1 PCR片段的瓊脂糖凝膠。PCR是用10ng、5ng、1ng、0.5ng和0.1ng的甲基化(A)和非甲基化(B)的經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的模板DNA進行的。
圖11具有引物和封阻劑寡核苷酸位置的GSTp1片段的序列。
圖12GSTp1 PCR片段的瓊脂糖凝膠。對甲基化GSTp1基因(A、B、D、E)擴增的相對靈敏度和甲基化GSTp1基因擴增的絕對靈敏度(C、F)進行了分析。GSTp1 PCR是在具有封阻劑寡核苷酸(A、B、C)和不具有封阻劑寡核苷酸(D、E、F)的情形下進行的。下面是用作模板DNA的20ng甲基化的經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的DNA(A1、B1、D1、E1、C1、F1、C2、F2)和20ng非甲基化的經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的DNA(A8、B8、D8、E8)；混合比例為1∶2(A2、B2、D2、E2)、1∶10(A3、B3、D3、E3)、1∶20(A4、B4、D4、E4)、1∶100(A5、B5、D5、E5)、1∶200(A6、B6、D6、E6)、1∶1000(A7、B7、D7、E7)的甲基化和非甲基化的經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的DNA；10ng(C3、F3)、2ng(C4、F4)、1ng(C5、F5)、0.2ng(C6、F6)、0.1ng(C7、F7)、0.02ng(C8、F8)甲基化的經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的DNA和無DNA(A9、D9)。
圖13探測探針的甲基化特異性的分析。該圖顯示在甲基化的經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的DNA(實線)和非甲基化的經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的DNA(虛線)的GSTp1 PCR中的熒光進程，該進程是用雜交探針GSTp1-Red650(A)或GSTp1-Red705(B)探測的。
圖14LightCycler上GSTp1 PCR的絕對靈敏度的確定。該GSTp1 PCR是在具有封阻劑核苷酸(“旋轉(zhuǎn)位置”9、10、11、12、13、14、15、16、18)和不具有封阻劑寡核苷酸(“旋轉(zhuǎn)位置”1、2、3、4、5、6、7、8、17)的情形下進行的。下面是用作模板DNA的甲基化的經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的DNA7.5ng(“旋轉(zhuǎn)位置”1、9)、3.7ng(“旋轉(zhuǎn)位置”2、10)、0.75ng(“旋轉(zhuǎn)位置”3、11)、0.37ng(“旋轉(zhuǎn)位置”4、12)、0.075ng(“旋轉(zhuǎn)位置”5、13)、0.037ng(“旋轉(zhuǎn)位置”6，14)、0.015ng(“旋轉(zhuǎn)位置”7、15)、0.0075ng(“旋轉(zhuǎn)位置”8、16)和無DNA(“旋轉(zhuǎn)位置”17、18)。
圖15甲基化GSTp1基因擴增的相對靈敏度的確定。該甲基化GSTp1基因的擴增是用LightCycler進行的。該探測是用雜交探針GSTp1-Red650(F2/F1，雜交點)和GSTp1-Red705(F3/F1，雜交點)進行的。該GSTp1 PCR是在具有封阻劑寡核苷酸(“旋轉(zhuǎn)位置”11、12、13、14、15、17、18、19、20)和不具有封阻劑寡核苷酸(“旋轉(zhuǎn)位置”1、2、3、4、5、7、8、9、10)的情形下進行的。下面是用作模板DNA的15ng甲基化的經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的DNA(“旋轉(zhuǎn)位置”1、11)和15ng非甲基化的經(jīng)亞硫酸氫鹽處理的DNA(“旋轉(zhuǎn)位置”10、20)，混合比例為1∶2(“旋轉(zhuǎn)位置”2、12)、1∶10(“旋轉(zhuǎn)位置”3、13)、1∶20(“旋轉(zhuǎn)位置”4、14)、1∶100(“旋轉(zhuǎn)位置”5、15)、1∶500(“旋轉(zhuǎn)位置”7、17)、1∶1000(“旋轉(zhuǎn)位置”8、18)的甲基化和非甲基化的亞硫酸氫鹽處理的DNA，和無DNA(“旋轉(zhuǎn)位置”10、20)。
圖16甲基化GSTp1基因擴增的相對靈敏度的確定。該甲基化GSTp1基因的擴增是用TaqMan進行的。
序列表<110>Epigenomics AG<120>探測胞嘧啶甲基化模式的高靈敏度方法<130>E01/1289/WO<160>17<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>24<212>DNA<213>人工<400>1gctctatggt cttgtctaac cgta24<210>2<211>18<212>DNA<213>人工<400>2aggtggtggt ggcggtgg 18<210>3<211>28<212>DNA<213>人工<400>3atggttttgt ttaatygtag agttgttt28<210>4<211>27<212>DNA<213>人工<400>4
taaacccraa aaaaaaaaac ccaatat 27<210>5<211>18<212>DNA<213>人工<400>5ctactcaacg aaaacaaa 18<210>6<211>18<212>DNA<213>人工<400>6ctactcaaca aaaacaaa 18<210>7<211>21<212>DNA<213>人工<400>7gttttctgtt attagtgagt a 21<210>8<211>35<212>DNA<213>人工<400>8taattcgtag tattaggttc gggttttcgg taggg35<210>9<211>20<212>DNA<213>人工<400>9
gttttctgtt attagtgagt 20<210>10<211>18<212>DNA<213>人工<400>10tcctaaatcc cctaaacc 18<210>11<211>21<212>DNA<213>人工<400>11gtgagtatgt gtggtttgtg t 21<210>12<211>22<212>DNA<213>人工<400>12taaaccccca tcccaaatct ca 22<210>13<211>21<212>DNA<213>人工<400>13taaaccccca tcccaaatct c 21<210>14<211>22<212>DNA<213>人工<400>14
gtgagtatgt gtggtttgtg tt 22<210>15<211>22<212>DNA<213>人工<400>15gtattaggtt tgggtttttg gt 22<210>16<211>23<212>DNA<213>人工<400>16tagtattagg ttcgggtttt cgg 23<210>17<211>27<212>DNA<213>人工<400>17tttagagttt ttagtatggg gttaatt 2權(quán)利要求
1.一種在DNA樣品中探測胞嘧啶甲基化的方法，其特征在于，進行了下面的步驟將包含所研究的DNA和背景DNA的基因組DNA樣品以這樣一種方式進行化學(xué)處理，從而使得所有非甲基化的胞嘧啶堿基都轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?，?-甲基胞嘧啶堿基保持不變；用至少2個引物寡核苷酸和一個聚合酶對經(jīng)化學(xué)處理的DNA樣品進行擴增，其中所研究的DNA相對于背景DNA是優(yōu)選被作為模板的，并且分析擴增產(chǎn)物，并從擴增產(chǎn)物的存在性和/或從對其它位置的分析中推斷所研究的DNA中的甲基化狀態(tài)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，樣品DNA是從個體的血清或其它體液中獲得的。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其特征在于，樣品是從細胞系、血液、痰、糞便、尿、血清、腦脊液、包埋于石蠟中的組織如來自眼、腸、腎、腦、心、前列腺、肺、乳房和肝的組織、組織載玻片和其所有可能的組合中獲得的。
4.根據(jù)前面權(quán)利要求中之一的方法，其特征在于，化學(xué)處理是用亞硫酸氫鹽進行的。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其特征在于，化學(xué)處理是在將DNA包埋于瓊脂糖中之后進行的。
6.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其特征在于，使DNA雙鏈體變性的試劑和/或自由基阱存在于化學(xué)處理中。
7.根據(jù)前面權(quán)利要求中之一的方法，其特征在于，擴增是在第二個步驟中至少一種額外的寡核苷酸或PNA寡聚體的存在下進行的，該寡核苷酸或PNA寡聚體結(jié)合5’-CG-3’二核苷酸或5’-TG-3’二核苷酸或5’-CA-3’二核苷酸，其中該額外的寡核苷酸或PNA寡聚體優(yōu)選地結(jié)合背景DNA并對其擴增產(chǎn)生不利影響。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其特征在于，該額外的寡核苷酸或PNA寡聚體的結(jié)合位點與引物在背景DNA上的結(jié)合位點重疊，且該額外的寡核苷酸阻礙了至少一種引物寡核苷酸與背景DNA的結(jié)合。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8的方法，其特征在于，使用至少兩個額外的寡核苷酸或PNA寡聚體，其中它們的結(jié)合位點再次分別與引物在背景DNA上的結(jié)合位點重疊，且所述額外的寡核苷酸和/或PNA寡聚體都阻礙了這兩個引物寡核苷酸與背景DNA的結(jié)合。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其特征在于，額外的寡核苷酸和/或PNA寡聚體之一阻礙了正向引物的結(jié)合，而另一個阻礙了反向引物的結(jié)合。
11.根據(jù)權(quán)利要求7～10中之一的方法，其特征在于，是額外的寡核苷酸和/或PNA寡聚體至少以相對于引物寡核苷酸5倍的濃度存在。
12.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其特征在于，額外的寡核苷酸和/或PNA寡聚體結(jié)合背景DNA并因而阻礙了引物寡核苷酸在聚合酶反應(yīng)中的完全延伸。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其特征在于，所用的聚合酶不具有5’-3’外切核酸酶活性。
14.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其特征在于，額外的寡核苷酸存在5’末端的修飾，并因而不能被具有5’-3’外切核酸酶活性的聚合酶顯著地破壞。
15.根據(jù)權(quán)利要求7～14中之一的方法，其特征在于，除引物之外使用的寡核苷酸不具備3’-OH功能。
16.根據(jù)前面權(quán)利要求之一的方法，其特征在于，在第二步驟中，經(jīng)化學(xué)處理的DNA樣品使用至少2個引物寡核苷酸和一個額外的與5’-CG-3’二核苷酸或5’-TG-3’二核苷酸或5’-CA-3’二核苷酸雜交的寡核苷酸或PNA寡聚體，和至少一個與5’-CG-3’二核苷酸或5’-TG-3’二核苷酸或5’-CA-3’二核苷酸雜交的報道寡核苷酸以及一個聚合酶進行擴增；其中該額外的寡核苷酸或PNA寡聚體優(yōu)選結(jié)合背景DNA并對其擴增產(chǎn)生不利影響，且其中該報道寡核苷酸優(yōu)選結(jié)合所研究的DNA并指示其擴增。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其特征在于，是對于報道寡核苷酸附加地使用另一個用熒光染料進行標記的寡聚體，該寡聚體直接在鄰近報道寡核苷酸處進行雜交，且該雜交借助熒光共振能量轉(zhuǎn)移進行探測。
18.根據(jù)權(quán)利要求16或17中之一的方法，其特征在于，進行TaqMan測定。
19.根據(jù)權(quán)利要求16或17中之一的方法，其特征在于，進行LightCycler測定。
20.根據(jù)權(quán)利要求16～19中之一的方法，其特征在于，報道寡核苷酸帶有至少一個熒光標記。
21.根據(jù)權(quán)利要求16～20中之一的方法，其特征在于，報道分子通過熒光的增加或減少以顯示擴增。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的方法，其特征在于，熒光的增加和減少也直接用于分析，且所研究的DNA的甲基化狀態(tài)從熒光信號來推斷。
23.根據(jù)前面權(quán)利要求之一的方，其特征在于，背景DNA以所研究的DNA濃度的100倍存在。
24.根據(jù)前面權(quán)利要求之一的方法，其特征在于，背景DNA以所研究的DNA濃度的1000倍存在。
25.根據(jù)前面權(quán)利要求之一的方法，其特征在于，該分析或者在根據(jù)權(quán)利要求6～11的方法情況下，進一步的分析是借助與寡聚體陣列的雜交來進行的，其中寡聚體可以是核酸或與其雜交性質(zhì)上相似的分子如PNA。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的方法，其特征在于，該寡聚體通過12-22個堿基長的區(qū)段與所研究的DNA雜交且它們包括CG、TG或CA二核苷酸。
27.根據(jù)權(quán)利要求25或26中之一的方法，其特征在于，所研究的DNA中多于20個甲基化位置的甲基化狀態(tài)是在一個實驗中探測的。
28.根據(jù)權(quán)利要求25或26中之一的方法，其特征在于，所研究的DNA中多于60個甲基化位置的甲基化狀態(tài)是在一個實驗中探測的。
29.根據(jù)權(quán)利要求1～24中之一的方法，其特征在于，該分析，或者在權(quán)利要求16～19的情況下，進一步的分析是通過對擴增的所研究的DNA的長度測量來進行的，其中長度測量的方法包括凝膠電泳、毛細管凝膠電泳、層析(如HPLC)、質(zhì)譜分析和其它適宜的方法。
30.根據(jù)權(quán)利要求1～24中之一的方法，其特征在于，該分析，或者在權(quán)利要求16～19的情況下，進一步的分析是通過測序進行的，其中測序方法包括桑格方法、馬吉測序法和其它方法，如通過雜交的測序(SBH)。
31.根據(jù)權(quán)利要求30的方法，其特征在于，對每一個或一小組CpG位置的測序分別用一個單獨的引物寡核苷酸進行，且引物延伸僅構(gòu)成了一個或幾個堿基段，且從引物延伸類型推斷所研究的DNA中相關(guān)位置的甲基化狀態(tài)。
32.根據(jù)前面權(quán)利要求之一的方法，其特征在于，從不同的經(jīng)研究的CpG位置的甲基化程度推斷病人的疾病或另一種醫(yī)學(xué)狀況的存在。
33.根據(jù)前面權(quán)利要求之一的方法，其特征在于，擴增產(chǎn)物本身帶有可探測的標記用于對其進行探測。
34.根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其特征在于，該標記為熒光標記。
35.根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其特征在于，該標記為放射性核素。
36.根據(jù)權(quán)利要求33的方法，其特征在于，該標記為在質(zhì)譜儀中探測的可除去的質(zhì)量標記。
37.根據(jù)前面權(quán)利要求之一的方法，其特征在于，在擴增反應(yīng)中引物之一是結(jié)合在固相上的。
38.根據(jù)權(quán)利要求1～33中之一的方法，其特征在于，擴增產(chǎn)物是全部在質(zhì)譜儀上探測并由此通過其質(zhì)量明確地進行特征記錄。
39.根據(jù)前面權(quán)利要求之一的方法的用途，用于對病人或個體進行不利情形的診斷和/或預(yù)診，其中這些不利情形屬于至少一種下面的種類非期望的藥物作用；癌病癥；CNS功能失常、損傷或疾??；攻擊或行為障礙癥狀；腦損傷的臨床、心理學(xué)和社會結(jié)果；精神病障礙和個性病癥；癡呆和/或有關(guān)的癥狀；心血管疾病、功能失常和損傷；胃腸道的功能失常、損傷或疾??；呼吸系統(tǒng)的功能失常、損傷或疾??；受傷、炎癥、感染、免疫和/或康復(fù)；作為發(fā)育過程中畸形的身體功能失常、損傷或疾?。黄つw、肌肉、結(jié)締組織或骨骼的功能失常、損傷或疾??；內(nèi)分泌和代謝功能失常、損傷或疾??；頭痛或性功能失常。
40.根據(jù)前面權(quán)利要求之一的方法的用途，用于區(qū)別細胞類型或組織或者用于研究細胞分化。
41.一種試劑盒，該試劑盒包括含有亞硫酸氫鹽的試劑、引物和其它用于產(chǎn)生擴增產(chǎn)物的無3’-OH功能的寡核苷酸，以及可選擇的實施根據(jù)權(quán)利要求1～38中之一的測定的說明書。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種在DNA樣品中探測胞嘧啶甲基化的方法，其中進行了下面的步驟將包含所研究的DNA和背景DNA的基因組DNA樣品以這樣一種方式進行化學(xué)處理，從而使得所有非甲基化的胞嘧啶堿基都轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?，?－甲基胞嘧啶堿基保持不變；用至少2個引物寡核苷酸和一個聚合酶對經(jīng)化學(xué)處理的DNA樣品進行擴增，其中所研究的DNA相對于背景DNA是優(yōu)選被作為模板的；并且分析擴增產(chǎn)物，并從擴增產(chǎn)物的存在性和/或從對其它的位置的分析中推斷所研究的DNA中的甲基化狀態(tài)。
文檔編號G01N27/447GK1539023SQ02805507
公開日2004年10月20日 申請日期2002年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2001年3月9日
發(fā)明者A·奧萊克, K·伯林, A 奧萊克 申請人:Epi基因組股份公司