專利名稱：癌癥病人的生物液體中存活素的檢測的制作方法
技術(shù)領域：
本發(fā)明涉及一種診斷癌癥的方法，它包括檢測病人生物液體中存活素(Survivn)的存在。特別地，本方法涉及膀胱癌的診斷方法，包括檢測病人尿樣中存活素的存在。另外，本發(fā)明涉及診斷癌癥的試劑盒，包括檢測病人生物體液的存活素的試劑和收集生物液體的容器。
背景技術(shù)：
癌指易于侵襲周圍組織并轉(zhuǎn)移至新的身體部位的惡性腫瘤。除非接受足夠的治療，癌在被努力切除后很可能復發(fā)并且導致病人死亡。導致癌癥的確切原因不知道，但是某些行為例如吸煙或暴露于致癌物質(zhì)與某些類型癌癥和腫瘤的發(fā)病率的相關(guān)性已經(jīng)被很多研究者證明。
癌從原發(fā)部位向遠端器官擴散，也就是，轉(zhuǎn)移，仍然是大多數(shù)癌癥病人的死亡的主要原因。盡管經(jīng)過數(shù)年的研究，參與該過程的遺傳機制在很大程度上還是不清楚。這樣的信息在具有不確定的疾病進程的癌癥的預后中顯得特別重要。因為用目前腫瘤分級技術(shù)不能總是準確評估癌癥預后，成功治療癌癥病人的最大的障礙之一還是缺乏可靠的預測性標記物。
膀胱癌膀胱癌是惡性腫瘤，通常起源于連接膀胱的泌尿道上皮細胞(移行上皮細胞)。膀胱的泌尿道上皮癌，即膀胱癌，是美國男性第四位最常見癌癥和女性第八位最常見癌癥，每年有超過54,000的新病例和11,200的死亡病例。超過80％的膀胱癌病人發(fā)生復發(fā)并且對長期緩解形成一個巨大的障礙，這種復發(fā)常常涉及肌肉侵襲和播散性疾病(Dawson等，ABC of UrologyUrological Malignancies-IIUrothelial Tumors.BMJ，1996，3121090-94)。
許多因素可以促進膀胱癌的發(fā)展。吸煙和職業(yè)性暴露于某類稱作芳香胺的有機化合物(β-萘胺，苯基苯胺，4-硝基聯(lián)苯，對二氨基聯(lián)苯)是已知的危險因素。一些研究表明大劑量人工合成的甜味糖精和移行上皮細胞膀胱癌有一定關(guān)系。其他研究已經(jīng)表明婦女為治療宮頸癌而接受放射性治療可以增加發(fā)生移行上皮細胞膀胱癌的危險性。另外，接受化療藥物，環(huán)磷酰胺(Cytoxan)的病人，已經(jīng)證實發(fā)生膀胱癌的危險性更大。
最常見的膀胱癌的臨床表現(xiàn)是血尿。通常，不管怎樣，膀胱癌的診斷都是延遲的，因為血尿是間斷性的或歸于其他原因，例如泌尿道感染或應用抗凝劑。移行上皮細胞所排泄的尿的細胞學檢查是常規(guī)用于診斷膀胱癌的方法。如果尿細胞學檢查呈陽性，那么泌尿道上皮的移行上皮細胞癌幾乎可以肯定是存在的。但是，高達一半的膀胱癌病人細胞學檢查移行上皮細胞可為陰性。因此，陰性的細胞學檢查結(jié)果不能除外膀胱癌的存在(Badalament等，Cancer，1987，59(12)2078；Cohen等，Urologic Clinics ofNorth America，1992，19(3)421)。
作為一個額外的診斷并發(fā)癥，由于移行上皮細胞排列于尿道起始于腎臟水平，包括腎盂，輸尿管，膀胱，和大部分尿道，一旦最初診斷膀胱癌就要對整個尿道進行移行上皮細胞癌的評價。通過靜脈腎盂造影(IVP)或逆行性腎盂造影，腎臟的腎盂和輸尿管是最好評價的。IVP方法包括靜脈注射對照物，然后可以在腎臟從血液中濾出進入尿液。在這個過程中普通X線照片顯示出尿道。典型的逆行性腎盂造影是用于對靜脈造影劑過敏或IVP成相可見度差的病人。逆行性腎盂造影在膀胱鏡檢查時進行。
膀胱鏡檢查，是指應用光學設備觀察膀胱內(nèi)部，是一項感覺不舒適的操作方法，適用于膀胱癌的明確診斷。逆行性腎盂造影檢查時，通過膀胱鏡將小塑料導管插入輸尿管，并且對照物注入輸尿管和腎臟。膀胱鏡檢查可以鑒別小的細微的異常改變，可以對其他診斷形式例如超聲，計算機X線斷層掃描或核磁共振成像檢查(MRI)的遺漏進行彌補。這樣，膀胱鏡檢查是最初評價必要的部分，同時不能被其他檢查所替代。現(xiàn)在，大多數(shù)膀胱鏡檢查都應用易變形柔軟的檢查鏡。與剛性的膀胱鏡對比，易變形柔軟的內(nèi)窺鏡更舒適并且允許醫(yī)生圍繞增大的前列腺的曲線進行觀察。
活組織檢查也可以用來診斷膀胱癌?；罱M織檢查是從器官，例如膀胱上采取一小塊活組織樣本，用顯微鏡檢查以確定或建立診斷，評價預后，或跟蹤疾病的進程。但是，活組織檢查是侵入性操作，并不是很令人滿意并且通常地是需要對病人實施麻醉。另外，與任何侵入性操作一樣，進行活組織檢查有導致感染的危險性。此外，完整的膀胱不能進行活檢來判斷是否存在膀胱癌。
膀胱癌分期膀胱癌分級依據(jù)其浸潤程度和與膀胱周圍組織的不同(分化)。由醫(yī)生診斷出膀胱癌后進行分期和分級。
有幾種不同的方法進行癌分期。針對膀胱癌應用的兩個最常用的分期系統(tǒng)為ABCD系統(tǒng)(Jewett-Strong-Marshall系統(tǒng))和TNM系統(tǒng)。ABCD系統(tǒng)較老，應用A-B-C-D分期對膀胱癌的階段或周期進行區(qū)分。本系統(tǒng)基本應用以下等級區(qū)分0，原位癌(癌局限于膀胱黏膜內(nèi)(內(nèi)層))；A，癌擴散穿過黏膜但是不超過黏膜下層；B，癌侵入肌層；C，癌侵入脂肪；D，癌擴散到局部淋巴結(jié)或遠端部位。每個字母都跟隨一個數(shù)字，例如A1，B2，等。TNM系統(tǒng)，膀胱用T表示，淋巴結(jié)用N表示，遠端擴散用M表示。每個字母跟隨一個描述數(shù)字，T2aN0M0。例如，Ta表示乳突狀無浸潤癌；Tis表示原位癌；T1表示癌侵入上皮下的結(jié)締組織。
膀胱癌通過擴展入臨近器官向體內(nèi)其他部位擴散，包括前列腺、子宮、陰道、輸尿管、和直腸。通過盆腔的淋巴結(jié)進行轉(zhuǎn)移，下一步癌擴散至肝臟，肺和骨組織。
膀胱癌分級膀胱癌分級是病理學家通過活組織檢查進行。癌的分級可以提供癌可能的生長速度或惡性程度的信息。高分級癌比低分級癌生長更快并且更容易擴散。目前的分級系統(tǒng)通常只有三個不同等級分化良好，中度分化，和分化不良(或I，II或III級)。一些病理學家用4段分級系統(tǒng)，I，II，III和IV。每個分級系統(tǒng)都可接受，病理學家將注明他們應用多少分段來進行癌癥分級如II/III或II/IV。分母或第二個數(shù)字表示他們應用的是哪個系統(tǒng)。分化良好的癌說明癌與正常膀胱組織更相近，所以通常生長和擴散不是很快。分化不良的癌說明癌與正常膀胱組織不相似，通常生長迅速并且更早地擴散至其他組織。中度分化癌處在中間水平。
分級，同樣重要，但對于治療決定的影響比分期小。在分期和分級明確后，在確定進一步治療的決定之前也應該考慮其他因素。
前列腺癌前列腺癌為生長在前列腺的惡性癌。它在所有年齡男性癌癥的最常見死亡原因中排第三位，并為75歲以上老年男性癌癥的最常見死亡原因。前列腺癌在小于40歲的男性中很少發(fā)現(xiàn)。
雖然病因不清楚，一些研究已經(jīng)證實前列腺癌與高脂肪飲食攝入和增加的睪丸激素水平的相關(guān)性。目前與良性前列腺增生(BPH)的關(guān)系還不清楚。
與膀胱癌一樣，依據(jù)從前列腺周圍組織分化的浸潤情況和程度對前列腺癌進行分類或分期。大多數(shù)前列腺癌應用A-B-C-D分期系統(tǒng)或TNM系統(tǒng)進行分期。對前列腺癌，A-B-C-D系統(tǒng)基本分類應用以下標準A癌不能觸知(能夠感覺到)，但是顯微鏡的活組織檢查可以檢測到；B可以在前列腺可觸知的癌；C癌擴展超過前列腺但沒有遠距離轉(zhuǎn)移；D癌擴展到局部淋巴結(jié)。另一方面，TNM系統(tǒng)，分別描述前列腺為(T)，淋巴結(jié)為(N)，和癌轉(zhuǎn)移跡象(遠距離擴散)為(M)。前列腺癌通過侵入精囊，膀胱和腹腔進行擴散。前列腺癌典型地轉(zhuǎn)移為淋巴結(jié)、骨、肺臟、肝臟、和腎臟。
目前，前列腺癌通常應用由Minnesota大學的病理學家命名的Gleason系統(tǒng)進行分級。該系統(tǒng)包括在前列腺尋找侵襲的不同模式然后給以1-5的兩個分值。所述兩個分值相加得出整個Gleason評分值，范圍為2-10。分值越高，癌的侵入性越強。例如，一個典型的Gleason分級的癌可以記為Gleason4+3＝7，或Gleason 2+2＝4。
存活素細胞凋亡(程序性細胞死亡)抑制劑的下調(diào)表達異常延長細胞生存力，有利于突變累積，并促進對治療的抗性，因此是癌變的因素(Reed，J.Clin.Oncol.，1999，172941-53)。最近確定的癌癥中細胞死亡/生存平衡中新的調(diào)節(jié)因子是存活素(Ambrosini等，Nat.Med.，1997，3917-21)，為細胞凋亡(IAP)基因家族的抑制劑的成員(Deveraux等，Genes Dev.，1999，13239-52)。
存活素為16.5kDa胞質(zhì)蛋白，包含唯一部分保守的BIR(桿狀病毒IAP重復片段)結(jié)構(gòu)域，以及一個高度荷電的羧基端卷曲螺旋區(qū)，而不是RING指狀結(jié)構(gòu)，其抑制當轉(zhuǎn)化成B細胞前體時通過生長因子(IL-3)的撤消誘導的細胞凋亡(Ambrosini等，Nat Med 1997，3917-921)。基于全部的序列保守性，羧基端RING指狀結(jié)構(gòu)的缺乏以及存在的唯一部分保守的BIR結(jié)構(gòu)域，存活素為IAP家族差別最大的成員，與NAIP具有高度相似性(神經(jīng)元細胞凋亡抑制蛋白；Roy等，Cell，1995，80167-178)。并且，與其他IAP蛋白不一樣，存活素在正常成人組織中檢測不到，但在通常的人類癌體中，卻成為第4高表達的轉(zhuǎn)錄本(Ambrosini等，Nat.Med.，1997，3917-21；Velculescu等，Nat.Genet.，1999，23387-88)，例如肺臟癌，結(jié)腸癌，乳腺癌，胰腺癌，以及前列腺癌，以及在約50％高分級非何杰金氏淋巴瘤。與在泌尿道上皮癌被提議的作用無調(diào)節(jié)細胞凋亡相一致的是(Gazzaniga等，Int.J.癌，1996，69100-04；Lara等，Int.J.Radiat.Oncol.Biol.Phys.，1999，431015-19)，存活素在78％的膀胱癌中被發(fā)現(xiàn)，但在正常的膀胱上皮中卻沒被發(fā)現(xiàn)，且其表達與加速復發(fā)相關(guān)(Swana等，N.Engl.J.Med.，1999，341452-53)。由于其在癌中過量表達，但在正常組織卻不過量表達(Ambrosini等，Nat.Med.，1997，3917-21；Velculescu等，Nat.Genet.，1999，23387-88)，以及其在多種惡性疾病中不利的預測/預后作用(Adida等，Lancet，1998，351882-83；Islam等，Oncogene，2000，19617-23；Tanaka等，Clin.癌Res.，2000，6127-34；Monzo等，J.Clin.Oncol.，1999，172100-04；Kawasaki等，Cancer Res.，1998，585071-74)，存活素可有用于作為癌癥的分子標志物。對膀胱癌而言，尤其如此(Stein等，J.Urol.，1998，160645-59；Ozen，Curr.Opin.Oncol.，1998，10273-78)，急需簡單和非侵襲性診斷方法，以監(jiān)測對治療的反應和簡單地跟蹤方法。盡管被當作是″金標準″(Brown，Urol.Clin.North Am.，2000，2725-37)，尿細胞學在膀胱癌檢測中具有低敏感度(30-40％)，且不能檢測表面上的，低分級損害。相應地，本申請的發(fā)明者考察體液存活素作為癌檢測的新分子標志物可能的適宜性，特別用來檢測尿存活素進行膀胱癌的診斷。
發(fā)明概述本發(fā)明提供一種診斷病人癌癥的方法，包括分析來自病人生物液體的樣本，判斷存活素存在或缺乏，其中樣本存活素的存在表明病人患有癌。在優(yōu)選的技術(shù)方案中，生物液體選自前列腺液，精液，全血，血清，尿，乳腺活組織檢查液體，胃腸液，以及陰道液，并且癌為新發(fā)或復發(fā)癌，選自肺癌，結(jié)腸癌，乳腺癌，胰腺癌，前列腺癌，膀胱癌，腎癌，泌尿生殖道癌，非何杰金氏淋巴瘤，以及成神經(jīng)細胞瘤。更優(yōu)選地，生物液體為尿或血清，并且癌為膀胱或前列腺癌。最優(yōu)選地，生物液體為尿，并且癌為膀胱癌。
一方面，本發(fā)明包括判斷癌癥分級的方法，方法是對病人生物液體中的存活素量進行定量，其中高水平的存活素表明所述癌癥為高分級的。此外，本發(fā)明包括該方法在確定癌癥分期中的應用，其中CIS期的癌癥與非侵襲性乳突狀癌期的癌癥相比，具有較高水平的存活素。
另一方面，本發(fā)明涉及監(jiān)測病人癌癥的方法，包括對病人生物液體中的存活素的量進行定量。此外，本發(fā)明包括對病人預后的判斷，方法是對病人生物液體中的存活素的量進行檢測或定量。在某些情況下，存活素的存在表明預后很差。存活素的定量包括測量樣本中存活素的相對水平。也包括對存活素存在或缺乏的檢測。
優(yōu)選地，存活素用與存活素結(jié)合或與編碼存活素的核酸雜交的試劑進行檢測。最優(yōu)選地，試劑選自結(jié)合存活素的抗體，存活素結(jié)合片段，以及與編碼存活素的核酸雜交的核酸，并且試劑用標記物標記。標記物為可為放射活性標記物，熒光標記物，酶，化學發(fā)光標記物，或比色標記物。
本發(fā)明一方面，用免疫分析檢測存活素。優(yōu)選地，免疫分析為酶聯(lián)免疫吸附分析或放射免疫分析，并且免疫分析包括免疫印跡，免疫擴散，免疫電泳，或免疫沉淀。更優(yōu)選地，存活素用斑點印跡檢測，最優(yōu)選地，用Bio-Dot方法以及Bio-Dot SF摸件。
本發(fā)明另一方面，存活素用核酸雜交檢測。在優(yōu)選的技術(shù)方案中，核酸雜交為RT-PCR或Northern印跡分析。核酸雜交中使用的試劑用放射活性標記物，熒光標記物，酶，化學發(fā)光標記物，或比色的標記物標記。
本發(fā)明也提供用于診斷，預后，或監(jiān)測病人癌的試劑盒，包括用于收集病人的生物液體的容器以及一種或多種檢測生物液體中存活素的存在的試劑。試劑盒中的試劑可用標記物進行標記。或者，試劑盒可包括其他的組分用來標記試劑。本發(fā)明也包括含有其他組分的試劑盒，所述其他組分用來診斷和監(jiān)測病人的癌癥，并對癌癥的預后進行判斷。在一種技術(shù)方案中，試劑盒的組分包裝在水性介質(zhì)中或為凍干的形式。


圖1顯示用Bio-Dot SF摸件進行存活素的尿檢測。
來自指示病人組的重組存活素(左列)，或尿樣以μg/ml漸增的濃度應用到狹縫印跡儀器上。膜與抗存活素抗體孵育，接著用HRP-偶聯(lián)的山羊抗兔IgG孵育。通過化學發(fā)光顯出條帶，用密度測定法進行定量。TCC，膀胱癌(組4)；TCC/R，消退(組5)；TCC/T，接受治療(組5)；RCC，腎細胞癌，PC，前列腺癌(組3)；PSA，有PSA升高但無前列腺癌診斷的病人(組2)；BPH，良性前列腺增生(組2)；Ctrl，健康志愿者(組1)。
圖2顯示尿存活素的Western印跡。對來自正常健康志愿者(正常)和患膀胱癌(TCC)的組4病人尿細胞進行電泳，轉(zhuǎn)移到尼龍膜上并用抗存活素抗體進行免疫印跡，然后進行化學發(fā)光處理。相對分子量標準顯示在左邊。
圖3顯示尿中存活素mRNA的RT-PCR擴增結(jié)果。從尿細胞中提取總RNA并用隨機引物進行反轉(zhuǎn)錄。擴增反應用存活素-特異巢式引物(279bp)或β-肌動蛋白-特異引物(309bp)進行。以(M)標出分子量標準(bp)。TCC，5例代表性的新發(fā)或復發(fā)膀胱癌病人(組4)的分析。
圖4顯示用Bio-Dot SF摸件進行存活素的血清檢測。
漸增濃度的重組存活素(μg/ml)(左和右列)，尿或血清樣品應用到狹縫印跡儀器上。膜與抗存活素抗體孵育，然后與HRP-偶聯(lián)的山羊抗兔IgG孵育。條帶通過化學發(fā)光顯色。″serum Bl CA″之前的數(shù)字指示血清來自患TCC的病人的血清。大多數(shù)這類樣本進行雙份印跡。8例膀胱癌病人的血清樣本中7例呈陽性。2份測試樣本中1份樣本(8-serum Bl CA)為陰性。來自病人2Bl CA的尿和血清為陽性。″Urine Hx TCC″指示來自先前診斷患有TCC的1例病人的尿。該病人已經(jīng)接受了切除術(shù)并正接受BCG治療。″3-serum PCA″表明來自前列腺癌病人的存活素陽性血清?！?-serum BPH″是來自良性前列腺增生病人的血清。該樣本的存活素陽性為測試的1/2倍。沒有其他方面關(guān)于該病人的信息?！錟rine TCC″指來自膀胱癌病人的尿?！錘eg con″為蛋白對照。″Blank″為只有TBS緩沖液。
發(fā)明詳述I.一般描述本發(fā)明基于開發(fā)安全、可靠、非侵襲性癌癥檢測特別是膀胱癌檢測的篩選方法的需要。所述疾病的單個預防/預后標志物的鑒定仍很困難(Stein等，J.Urol.，1998，160645-59)。用于診斷和篩選癌癥，特別是移行上皮細胞膀胱癌以及用于癌癥活性的監(jiān)測并對膀胱癌患者個體進行預后判斷的標志物的鑒定以及方法的開發(fā)，將對癌癥的治療有用。
本發(fā)明公開了一種簡單的，基于抗體或其他探針的檢測，其用于確定患癌病人的尿或其他體液中的細胞凋亡抑制劑存活素。
本發(fā)明部分基于下列發(fā)現(xiàn)在所有新診斷的或復發(fā)的膀胱癌病人(46/46)中發(fā)現(xiàn)尿存活素，但在正常志愿者中(0/17)，或在患其他泌尿道癌(0/30)的病人中卻沒有發(fā)現(xiàn)，只有4/30非腫瘤性泌尿生殖道疾病的病人發(fā)現(xiàn)有尿存活素。本發(fā)明也基于下列發(fā)現(xiàn)3例尿存活素檢測為陽性的血尿病人中，1例膀胱癌細胞學呈陽性，另1例在存活素檢測的6個月內(nèi)診斷出患膀胱癌。此外，本發(fā)明基于已經(jīng)進行膀胱癌治療并通過膀胱鏡檢查發(fā)現(xiàn)病情緩解的病人尿存活素檢測為陰性(32/35)。
本發(fā)明也部分基于膀胱癌和前列腺癌病人的血清中檢測到存活素的發(fā)現(xiàn)。
II.具體技術(shù)方案1.生物液體文中術(shù)語″病人生物液體″指來自活生物體的液體。該術(shù)語包含活生物體機體中可發(fā)現(xiàn)的″體液″。
本發(fā)明包括試劑在篩選生物液體以判斷存活素的存在中的用途。體外血清學評價取自病人的生物液體，從而可以進行癌癥的非侵襲性診斷。例如，人體液例如前列腺液、精液、全血、血清、尿、乳腺活組織檢查液、胃腸液、以及陰道液可從病人身上取樣，利用可以檢測存活素的試劑通過放射免疫分析或酶-聯(lián)免疫分析、競爭性結(jié)合酶-聯(lián)免疫分析、斑點印跡、Western印跡、Northern印跡、PCR、或本領域公知其他的分析方法分析存活素的存在。
在優(yōu)選的技術(shù)方案中，收集病人血清用來檢測存活素的存在以進行膀胱或前列腺癌的診斷。
更優(yōu)選地，收集病人尿樣本用來檢測存活素的存在以進行膀胱癌的診斷。待檢的尿樣本可在分析前盡早先收集好，并凍存以備處理。如果尿樣在分析前凍存，優(yōu)選地收集樣本并置于冰上。優(yōu)選在約2小時內(nèi)，離心冰凍的樣本使成團狀細胞碎片，然后過濾，濾液迅速在-20℃凍存，更優(yōu)選在-80℃凍存。在即將分析之前，凍存樣本應在37℃水浴中快速解凍。鮮尿樣本也應在收集后立即使用，最好離心，并過濾。更優(yōu)選地，將全尿放置在冰上直至其在-80℃凍存。在4℃解凍后，尿樣在4℃離心并分析其中的存活素。
2.檢測 存活素的試劑能用來檢測病人生物液體中的存活素的試劑是那些能與存活素或編碼存活素的核酸相互作用的試劑。所述試劑的實例包括，但不限于存活素抗體或其結(jié)合存活素的片段；存活素結(jié)合伴侶，例如p34cdc2-細胞周期蛋白B1激酶；以及與編碼存活素的核酸雜交的核酸。
存活素抗體本領域普通的技術(shù)人員已經(jīng)制備并使用了存活素抗體。Lu等(CancerRes.，1998，58(9)1808-12)報道了從重組產(chǎn)生的存活素/谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶融合蛋白制備小鼠單克隆存活素抗體，用于胃癌的免疫組織化學分析。Grossman等(J.Invest.Dermatol.，1999，1131076-81)公開了利用兔多克隆抗體來檢測人轉(zhuǎn)移性惡性黑色素瘤細胞株中的存活素。
使用本領域公知并描述的標準免疫學方法，利用存活素或存活素肽來產(chǎn)生抗體(Practical Immunology，Butt，編輯，Marchel Dekker，New York，1984)。簡言之，用分離的存活素或存活素肽(例如，利用重組DNA在宿主細胞進行中表達)在異種宿主中產(chǎn)生抗體。優(yōu)選的抗體為與存活素蛋白上的表位特異結(jié)合的抗體，優(yōu)選對所述表位結(jié)合親和力大于約105M-1，最優(yōu)選親和力大于約107M-1。例如，當需要抗人存活素蛋白的抗體時，合適的抗體產(chǎn)生宿主為小鼠，山羊，兔，豚鼠，或其他的用來產(chǎn)生抗體的哺乳動物。存活素蛋白或肽與能增加宿主體內(nèi)抗體產(chǎn)生的合適的佐劑組合，并注射到宿主體內(nèi)，例如，經(jīng)腹膜內(nèi)注射。可以使用任何合適刺激宿主的免疫應答的佐劑。目前優(yōu)選的佐劑為Freund氏完全佐劑(一種乳劑，包括滅活及干燥的微生物細胞，例如，購自Calbiochem Corp.，San Diego，或Gibco，GrandIsland，N.Y.)。當需要多次注射抗原時，后續(xù)的注射包括所述抗原與不完全佐劑(例如無細胞的乳劑)聯(lián)合使用。
在優(yōu)選的技術(shù)方案中，檢測生物液體中存活素的存在的公開的方法是用特異結(jié)合存活素的抗體進行的。用本領域公知的方法制備特異結(jié)合存活素的多克隆和單克隆抗體?？贵w包括按照Huse等方法制備的重組的多克隆或單克隆Fab片段。(Science，1989，2461275-1281；也參見Campbell，″Monoclonal Antibody Technology，The Production and Characterization ofRodent and Human Hybridomas″in Burdon等，編輯，Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology，1985 Volume 13，Elsevier SciencePublishers，Amsterdam)。
如上所述，制備多克隆和單克隆抗體的方法對本領域普通的技術(shù)人員而言是公知的。簡言之，多克隆抗體通過對宿主哺乳動物，例如兔，小鼠，大鼠，或山羊，注射存活素蛋白或存活素肽或片段而制備得到。從哺乳動物抽取血清并篩選以得到對所述肽或肽片段特異的多克隆抗體。
用來產(chǎn)生抗體的存活素蛋白，肽，或片段可從其天然來源分離、用重組方法、或用合成方法得到。
為了產(chǎn)生單克隆抗體，哺乳動物宿主用存活素蛋白或肽接種然后加強免疫。最后一次強化免疫幾天后，收集被接種的哺乳動物的脾。將從脾得到的細胞懸浮液與腫瘤細胞融合，所用方法按照Kohler和Milstein描述的方法(Nature，1975，256495-497)。為使其有用，肽片段必須包含足夠的氨基酸殘基以限定被檢的存活素分子的表位。
如果片段太短而不具有免疫原性，其可偶聯(lián)到載體分子上。一些合適的載體分子包括鑰孔血藍蛋白(keyhole limpet hemocyanin)以及牛血清白蛋白。偶聯(lián)可用本領域公知的方法進行。一種這樣的方法是將所述片段的半胱氨酸殘基與載體分子的半胱氨酸結(jié)合。肽片段可用本領域公知的方法合成。一些合適的方法描述在Stuart和Young的″Solid Phase PeptideSynthesis，″Second Edition，Pierce Chemical Company(1984)中。
抗體或片段的純化可用多種本領域技術(shù)人員熟悉的方法來完成，包括，用硫酸銨或硫酸鈉沉淀，然后對鹽水透析，離子交換色譜，親和力或免疫親和力色譜以及凝膠過濾，區(qū)帶電泳，等。(Goding in，Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice，2d ed.，pp.104-126，Orlando，F(xiàn)la.，Academic Press)。優(yōu)選使用純化的抗體或純化的具有至少一個存活素結(jié)合區(qū)部分的抗體片段，包括例如Fv，F(xiàn)(ab′)2，F(xiàn)ab片段(Harlow和Lane，1988，Antibody Cold SpringHarbor)來檢測癌癥病人液體中的存活素，優(yōu)選膀胱癌病人的尿液。
用于癌癥檢測和/或監(jiān)測的時候，純化的抗體可直接或通過連接臂共價連接到充當報告基團的化合物上，以檢測存活素的存在。多種不同類型的物質(zhì)可作為報告基團，包括但不限于酶，染料，放射活性金屬和非金屬同位素，發(fā)熒光(fluorogenic)化合物，熒光化合物，等。本發(fā)明用于檢測，監(jiān)測的抗體(或其片段)的抗體偶聯(lián)物的制備方法描述在美國專利4,671,958；4,741,900以及4,867,973中。
本發(fā)明一方面中，優(yōu)選的結(jié)合表位可從已知的存活素基因序列及其編碼的核酸序列鑒定出來，并用來產(chǎn)生高親和力的存活素抗體。而且，存活素上結(jié)合表位的確定可用來設計和構(gòu)建優(yōu)選的抗體。例如，編碼存活素上優(yōu)選的表位的DNA可以重組的方式表達并可用來選擇與所述表位選擇性結(jié)合的抗體。選擇的抗體然后在足以容許抗體與存活素上特異結(jié)合表位進行特異結(jié)合的條件下，曝露于所述樣本，然后檢測所形成的復合物的量。人們已經(jīng)充分了解特定的抗體方法學并在文獻中進行了充分的描述。它們的制備的更詳細描述可參見，例如，Practical Immunology，Butt，W.R.，編輯，Marcel Dekker，New York，1984。
本發(fā)明也包括存活素抗體的檢測。存活素為癌癥特異性標志物。因此，病人生物液體中存活素抗體的檢測也能導致癌癥診斷。
存活素結(jié)合伴侶結(jié)合存活素的其他分子也可用來檢測生物液體中存活素的存在。存活素結(jié)合伴侶的實例，除了存活素抗體外，包括但不限于p34cdc2-細胞周期蛋白B1激酶和caspase-9。
核酸與編碼存活素的核酸雜交的核酸，包括天然存在的核酸，寡核苷酸，反義寡核苷酸，以及合成的寡核苷酸，可用來作為檢測癌癥病人生物液體中存活素存在的試劑，所述生物液體優(yōu)選為膀胱癌病人的尿液。Ambrosini等(Nat Med，1997，3917-921)公開了存活素基因的克隆。用作本發(fā)明試劑的核酸和寡核苷酸包括但不限于相應于Ambrosini等分離的存活素基因的那些核酸(Nat Med，1997，3917-921)。本發(fā)明包括利用相應于存活素編碼序列以及其互補序列的核酸序列，以及編碼序列進一步上游或下游方向的存活素轉(zhuǎn)錄序列(例如，包含在，或延伸到，5′和3′非翻譯區(qū)的序列)的互補序列，來作為癌癥病人生物液體中存活素表達的檢測試劑，優(yōu)選生物液體為膀胱癌癥病人的尿液。
檢測生物液體中存活素存在的優(yōu)選寡核苷酸是與至少部分編碼存活素的cDNA序列互補的那些寡核苷酸。所述互補序列為本領域也公知″反義″序列。所述寡核苷酸可為寡核糖核苷酸或寡脫氧核糖核苷酸。此外，寡核苷酸可為天然寡聚物，由生物學上重要的核苷酸組成，即，A(腺嘌呤)，dA(脫氧腺嘌呤)，G(鳥嘌呤)，dG(脫氧鳥嘌呤)，C(胞嘧啶)，dC(脫氧胞嘧啶)，T(胸腺嘧啶)和U(尿嘧啶)，或修飾的寡核苷酸，例如，甲基或硫原子取代核苷酸間的磷酸二酯鍵中磷酸酯氧原子。此外，所述核苷酸自身，和/或其核糖部分可被修飾。
寡核苷酸可用文獻上充分描述的任何已知的化學的寡核苷酸合成方法進行化學合成。例如，寡核苷酸可用任何商品化的，自動核酸合成儀制備得到。或者，寡核苷酸可用標準重組DNA技術(shù)制備，例如，誘導非編碼鏈的轉(zhuǎn)錄。編碼存活素的DNA序列可倒轉(zhuǎn)在重組DNA體系中，例如，按照反方向插入合適的啟動子的下游，這樣可轉(zhuǎn)錄出非編碼鏈。
盡管任何長度的寡核苷酸可用來與編碼存活素的核酸雜交，通常優(yōu)選在8-100個核苷酸范圍內(nèi)的寡核苷酸。用于尿樣本中存活素的檢測的最優(yōu)選寡核苷酸為15-50個核苷酸范圍內(nèi)的寡核苷酸。
選來與存活素核酸雜交的寡核苷酸，無論是化學合成的或通過重組DNA技術(shù)得到的，都隨后用標準技術(shù)分離和純化，并優(yōu)選地用標準標記方法進行標記物(例如，用35S或32p)。
本發(fā)明也包括利用聚合酶(PCR)中的寡核苷酸對來檢測生物液體存活素的表達。寡核苷酸對由存活素引物和反向存活素引物組成。優(yōu)選的寡核苷酸對為SEQ ID NO1和SEQ ID NO2。更優(yōu)選地，寡核苷酸對為SEQ IDNO3和SEQ ID NO4。
3.檢測方法蛋白結(jié)合分析本領域普通技術(shù)人員應該認識到，本發(fā)明包括特異地確定和定量癌癥病人生物液體中存活素蛋白的任何方法。目前優(yōu)選的對樣本中存活素蛋白進行檢測的方法是通過能與標志物蛋白特異性地相互作用的結(jié)合蛋白進行的。優(yōu)選地，可使用標記的抗體，其結(jié)合部分，或其他存活素結(jié)合伴侶?？贵w可為單克隆或多克隆來源，或可為生物合成方法制備的。存活素結(jié)合伴侶也可為天然存在的分子或合成產(chǎn)生的分子。復合的存活素蛋白的量，例如，與結(jié)合蛋白結(jié)合了的存活素蛋白的量，用本領域描述的標準蛋白檢測方法測定。免疫分析設計，理論以及方案的詳細綜述可在本領域的眾多文本中見到，包括Practical Immunology，Butt，編輯，Marcel Dekker，NEWYork，1984。
存在多種用標記抗體檢測蛋白的分析方法。在1步分析法中，存活素分子，如果存在，被固定并與標記抗體孵育。標記抗體結(jié)合到固定的靶分子上。洗滌除去未結(jié)合的分子后，分析樣本判斷標記物的存在。
在2步分析法中，固定的存活素分子與未標記的抗體孵育。存活素-未標記抗體復合物，如果存在，然后結(jié)合到對未標記抗體特異的第二種標記抗體上。洗滌樣本并分析標記物的存在。
用來標記抗體的標志物的選擇隨應用而變。但是，本領域普通的技術(shù)人員很易作出標志物的選擇。所述標記抗體可用于免疫分析以及組織學應用以檢測癌癥的存在。標記抗體可為多克隆或單克隆的。在優(yōu)選的技術(shù)方案中，抗體為多克隆兔抗體。
抗體可用放射活性原子，酶，發(fā)色或熒光成分，或比色的標記物進行標記。對用來標記的標記物的選擇也取決于期望的檢測限的要求。酶分析(ELISA)通常允許檢測酶-標記的復合物與酶底物相互作用而形成的有色產(chǎn)物。放射活性原子的一些實例包括32P，125I，3H，以及14P。酶的一些實例包括辣根過氧化物酶，堿性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，以及葡萄糖-6-磷酸酯脫氫酶。發(fā)色成分的一些實例包括熒光素和羅丹明?？捎帽绢I域公知的方法將所述抗體偶聯(lián)到所述標記物上。例如，酶和發(fā)色分子可用偶聯(lián)試劑，例如二醛類，碳二亞胺類，二馬來酰亞胺類等偶聯(lián)到抗體上?；蛘?，偶聯(lián)可通過配體-受體對發(fā)生。一些合適的配體-受體對包括，例如，生物素-親和素或-鏈親和素，以及抗體-抗原。
迄今為止公知的最靈敏的標記物為化學發(fā)光標記物，其中標記物與反應物相互作用而發(fā)光。有用的標記物包括化學發(fā)光分子，例如吖啶鎓(acridium)酯類或化學發(fā)光酶，其中反應物為酶底物。當，例如，吖啶鎓酯類與堿性過氧化物溶液反應的時候，就發(fā)出強光，檢測限比其他標記物的檢測限增加100-10,000倍。并且，反應很迅速?；瘜W發(fā)光和免疫分析的詳細綜述可在Weeks等(Methods in Enzymology，1983，133366-387)，Kawaguichi等(Stabilized Phenyl Acridinium Esters For ChemiluminescentImmunoassay--Bioluminescence and Chemiluminescence，Proceedings of 9thInternational Symposium 1996，Edited by Hastings，Kricka and Stanley，JohnWiley & Sons，1997，pp.480-484)，以及美國專利5,468,646中找到。流體分析的其他考慮包括使用微量滴定孔或柱免疫分析。柱分析特別有利，其中使用快速反應標記物，例如化學發(fā)光標記物。標記的復合物可洗脫到柱后檢測器中，后者也包含反應物或酶底物，從而使后續(xù)形成的產(chǎn)物可以立即得到檢測。
一方面，本發(fā)明包括使用夾心技術(shù)檢測檢測血清和其他生物液體中的存活素蛋白。如PCT公開文本W(wǎng)O93/09437(1993年5月13日發(fā)表)中所述，該技術(shù)需要2中能與感興趣的蛋白結(jié)合的抗體例如，1種被固定到固相載體上；另一種游離在溶液中，但是用一些容易檢測的化合物標記?？捎糜诘诙N抗體的化學標記物實例包括但不限于放射同位素，熒光化合物，以及酶或當暴露于反應物或酶底物的時候，產(chǎn)生有色的或電化學活性的產(chǎn)物的其他分子。當包含存活素蛋白的樣本置于這種體系中的時候，存活素蛋白與被固定的抗體和標記抗體都發(fā)生結(jié)合。結(jié)果是在支持物表面上形成″夾心″免疫復合物。洗去未結(jié)合的樣本成分和過量的標記抗體，并測量復合到在支持物表面上的蛋白上的標記抗體量，從而進行復合蛋白的檢測。夾心免疫分析是高度特異的并且非常敏感，條件是使用具有優(yōu)良檢測限的標記物。
本發(fā)明也包括同時篩選許多生物液體樣本?？捎脧V泛使用并易自動化的常規(guī)96-孔微量滴定方式實現(xiàn)這一目的。也存在數(shù)種進行96孔板顏色分析的商品化分光儀(″讀板器″)。
優(yōu)選地，體液樣本中存活素的存在用放射免疫分析或酶-聯(lián)免疫分析，競爭性結(jié)合酶-聯(lián)免疫分析，斑點印跡，Western印跡，色譜，優(yōu)選高效液相色譜(HPLC)，或本領域公知的其他分析方法進行檢測。
斑點印跡是本領域普通的技術(shù)人員用抗體作為探針檢測期望的蛋白的常規(guī)操作(Promega Protocols and Applications Guide，Second Edition，1991，Page 263，Promega Corporation)。利用斑點印跡儀器將樣本轉(zhuǎn)移到膜上。標記探針與膜溫育，并檢測蛋白的存在。
Western印跡分析是本領域普通的技術(shù)人員公知的方法(Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，1989，Vol.3，Chapter 18，Cold SpringHarbor Laboratory)。在Western印跡中，樣本用SDS-PAGE分離。凝膠轉(zhuǎn)移到膜上。膜與標記抗體進行孵育以檢測期望的蛋白。
上述分析涉及例如但不限于下列步驟免疫印跡，免疫擴散，免疫電泳，或免疫沉淀。
優(yōu)選地，存活素用斑點印跡或Western印跡檢測。更優(yōu)選地，利用Bio-Dot方法和Bio-Dot SF摸件進行癌癥病人生物液體中的存活素斑點印跡檢測。
核酸檢測病人生物液體樣本中存活素的存在也可用核酸雜交確定，例如但不限于Northern印跡分析，斑點印跡，Southern印跡分析，熒光原位雜交(FISH)，以及PCR。色譜，優(yōu)選HPLC，以及其他的已知的分析也可用來確定樣本中存活素信使RNA水平。
存活素DNA令人信服地可在研究的生物液體的脫落或釋放的存活素-陽性癌細胞中發(fā)現(xiàn)。
一方面，本發(fā)明包括利用核酸作為試劑，來檢測病人生物液體中的存活素，其中核酸進行了標記。核酸試劑可用放射活性標記物，熒光標記物，酶，化學發(fā)光標記物，比色的標記物或其他標記物或上述討論的標記物或本領域公知的標記物進行標記。
另一方面，本發(fā)明包括利用Northern印跡分析來檢測體液樣本中存活素mRNA的存在。分析的第一步涉及用凝膠電泳分離包含存活素核酸的樣品。被分離的核酸然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或其他濾膜上。隨后，標記的寡核苷酸在合適的雜交條件下暴露于濾膜，例如在42℃的50％甲酰胺，5XSSPE，2XDenhardt溶液，0.1％SDS中，如Molecular CloningA LaboratoryManual，Maniatis等(1982，CSH Laboratory)中所述。本領域公知的其他方法包括溶液雜交，斑點和狹縫RNA雜交，以及基于探針的微陣列。用本領域公知的標準方法測量雜交片段的放射活性可對病人生物液體中存在的存活素核酸量進行定量。
斑點印跡涉及將包含研究的核酸的樣本轉(zhuǎn)移到膜上。核酸可在轉(zhuǎn)移到膜之前或之后進行變性。膜與標記探針孵育。斑點印跡對本領域普通的技術(shù)人員而言是公知的方法，并在U.S.4,582,789和4,617,261中進行了更充分的公開，其公開這里引入作為參考。
聚合酶鏈式反應(PCR)利用聚合引物和試劑來擴增核酸樣本中一種或多種特異核酸序列，然后檢測擴增的序列。其中一種引物的延伸產(chǎn)物當與另一種雜交時，就成為用于產(chǎn)生所需特異性核酸序列的摸板，反之亦然，重復該方法，直到產(chǎn)生需要量的序列。本領域普通的技術(shù)人員檢測期望的序列的存在(U.S.4,683,195)，通常使用聚合酶鏈式反應。
本領域普通的技術(shù)人員通常進行用來檢測期望序列的PCR的一種具體實例是反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR；Saiki等，Science，1985，2301350；Scharf等，Science，1986，2331076)。RT-PCR涉及從生物液體中分離總RNA，在能識別需要的核酸序列的引物存在的條件下，使該RNA變性，利用引物通過反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生RNA的cDNA拷貝，利用特異性的引物通過PCR擴增cDNA，并通過電泳或本領域普通的技術(shù)人員知道的其他方法檢測擴增的cDNA。
在優(yōu)選的技術(shù)方案中，檢測癌癥病人生物液體，優(yōu)選膀胱癌病人的尿中存活素核酸的方法包括，Northern印跡分析，斑點印跡，Southern印跡分析，F(xiàn)ISH，以及PCR。更優(yōu)選地，檢測方法為RT-PCR時，使用下列兩對引物SEQ ID NO1和2以及SEQ ID NO3和4。
4.診斷癌癥的試劑盒一方面，本發(fā)明包括試劑盒，其包括診斷癌癥的必需元件。優(yōu)選地，試劑盒包括用來收集來自病人的生物液體的容器以及用來檢測液體中存活素的存在或其編碼核酸的試劑。試劑盒的組成可包裝在水性介質(zhì)中或以凍干形式存在。
可以制備用于診斷或監(jiān)測癌癥的試劑盒，所述試劑盒包含一種或多種檢測存活素蛋白的試劑，例如但不限于存活素抗體，其片段，或存活素結(jié)合伴侶。試劑可以與用以收集來自病人生物液體的容器包裝在一起。當試劑盒中使用以偶聯(lián)物的形式存在的抗體或結(jié)合伴侶的時候，所述偶聯(lián)物連接有標記物，例如放射活性金屬離子或半分子，所述偶聯(lián)物的成分可以為充分偶聯(lián)形式，或以中間體形式或以分開的半分子存在，由試劑盒使用者進行偶聯(lián)。
也可以制備包含一種或多種檢測存活素核酸的試劑的試劑盒，存活素核酸例如但不限于全長存活素核酸，存活素寡核苷酸，以及存活素引物對。試劑可與收集來自病人生物液體的容器包裝在一起。核酸可以標記形式或待標記形式存在。
試劑盒的其他組成可包括但不限于，收集生物液體的用具(means)，對試劑進行標記的用具，固定生物液體中存活素或存活素核酸的膜，將生物液體轉(zhuǎn)移到膜上的用具，使試劑與病人生物液體中的存活素結(jié)合的用具，第二種抗體，從病人生物液體分離總RNA的用具，進行凝膠電泳的用具，從分離的總RNA產(chǎn)生cDNA的方法，進行雜交分析的用具，以及進行PCR的用具，等。
5.本發(fā)明分析以及試劑盒的應用本發(fā)明所述的分析或方法以及試劑盒有用于診斷，預后，以及監(jiān)測病人的癌癥。本發(fā)明一方面，病人生物液體存活素的存在表明病人患有癌癥。所述癌癥可為新發(fā)癌或復發(fā)癌。文中術(shù)語″復發(fā)癌″指治療后復發(fā)的癌癥(復發(fā)的)。文中術(shù)語″新發(fā)癌″指新發(fā)展的癌癥。
存活素可在表達以及分泌，釋放，或于體液中發(fā)現(xiàn)存活素的任何癌癥的生物液體中檢測到。存活素在肺臟，結(jié)腸，胰腺，乳腺，前列腺癌(Ambrosini等，Nat.Med.，1997，3917-21)，膀胱(Swana等，N.Engl.J.Med.，1999，341452-53)，以及非何杰金氏淋巴瘤中表達。存活素在成神經(jīng)細胞瘤，乳腺癌，肺癌膀胱癌以及結(jié)腸直腸癌中的表達與不利的疾病狀況相關(guān)并縮短生存期(Adida等，Lancet，1998，351882-83；Islam等，Oncogene，2000，19617-23；Tanaka等，Clin.Cancer Res.，2000，6127-34；Monzo等，J.Clin.Oncol.，1999，172100-04；Kawasaki等，Cancer Res.，1998，585071-74；Swana等，N.Engl.J.Med.，1999，341452-53)。
存活素在腫瘤的進程中由脫落的癌細胞釋放到細胞外環(huán)境中。相應地，來自病人的任何生物液體可用來分析存活素的存在。優(yōu)選地，可以收集來自病人的體液例如前列腺液、精液、全血、血清、尿、乳腺活組織檢查液、胃腸液、以及陰道液并篩選存活素的存在。
在優(yōu)選的技術(shù)方案中，本發(fā)明的方法和試劑盒通過檢測病人生物液體中的存活素，可用來診斷泌尿生殖道癌，包括膀胱癌，前列腺癌，以及腎癌。更優(yōu)選地，本發(fā)明的方法和試劑盒通過檢測病人尿樣本中存活素的存在，可用來診斷膀胱癌。病人尿樣本中的存活素的存在表明病人患有膀胱癌。
另一方面，本發(fā)明的方法和試劑盒可用來定量病人生物液體中的存活素的量。病人生物液體中的存活素量可用于癌癥分級。病人生物液體中的高水平的存活素可能表明所述癌有高的分級?；蛘?，本發(fā)明的方法和試劑盒可用來確定病人癌癥分期。CIS期的癌與非侵襲性乳突狀癌時期的癌癥相比，具有較高水平的存活素。
文中術(shù)語″乳突狀癌″指惡性腫瘤，特征在于形成了許多，不規(guī)則的，纖維性基質(zhì)指狀突起，并且表層為腫瘤上皮細胞所覆蓋。
文中術(shù)語″癌原位(CIS)″與上皮內(nèi)癌同義。當該術(shù)語用來表示膀胱癌時，指膀胱內(nèi)層(移行上皮細胞)內(nèi)的扁平癌。
此外，對病人生物液體中存活素的定量可用來監(jiān)測病人體內(nèi)癌癥進程并判斷癌癥病人的預后。例如，測量一段時間的存活素量可以提供有關(guān)癌癥生長速度的信息。
尿中存活素可用來作為監(jiān)測病人的快速及便宜方法。尿中存活素的檢測結(jié)合一整套尿標志物，可以提高早期復發(fā)檢測的敏感度和特異性。
可以預期，當病人的生物液體檢測出存活素陽性后，需要利用更具侵入性及更昂貴的方法，例如膀胱鏡進行檢測。
按照前述一般性的討論，下面提供的特定實施例只是說明性的，并不用來限制本發(fā)明的發(fā)明范圍。其他一般性的和具體的情況對本領域普通的技術(shù)人員而言是顯而易見的。
實施例材料與方法尿樣在Yale-New Haven Hospital的泌尿門診以及New England HealthCare Systems，West Haven，康涅狄格分部退役軍人管理局收集到158份尿樣。從分類成5個不同組的個體中獲得隨機的干凈尿樣或直接通過導管得到的尿樣。組1，正常健康志愿者，平均年齡47.6±20.8歲，未用藥(n＝17)。組2，病人，平均年齡60.0±18.1歲，診斷患有非惡性尿道疾病或血尿(n＝30)。組3，病人，平均年齡71.5±9.9歲，診斷患有泌尿生殖癌，膀胱癌除外(n＝30)。組4，病人，平均年齡69.7±8.7歲，診斷患有新發(fā)或復發(fā)膀胱癌(n＝46)。組5，平均年齡76.1±8.9歲的正在接受治療或已經(jīng)接受治療的膀胱癌的病人，并且在收集尿的當天細胞學鏡檢為陰性(n＝35)。
組5中的治療措施包括膀胱內(nèi)卡介內(nèi)(BCG)，噻替哌，經(jīng)尿道切除術(shù)，部分膀胱切除術(shù)以及輻照。組4包括那些收集尿后接受類似的治療措施和/或搶救性膀胱切除術(shù)或完全膀胱切除術(shù)的病人。
統(tǒng)計分析尿存活素和病人診斷之間的關(guān)系用Chi平方檢驗進行分析。用Yale-New Haven Hospital的分級分類系統(tǒng)，通過非參數(shù)統(tǒng)計分析來進行加權(quán)尿存活素評分值的比較。
實施例1用Bio-Dot SF模件檢測尿中存活素用提供48-孔狹槽形式的模件中的微孔過濾裝置將尿樣過濾到硝酸纖維素膜上。使用多克隆抗體分析該印跡中存活素的存在。方案如下收集尿并保存-80℃直至分析。在分析的當天，尿樣在20,000xg離心20分鐘。同時Bio-Dot微孔過濾裝置裝配上0.2μm硝酸纖維素膜(BioRadLaboratories，Hercules，CA)，并用20mM Tris-緩沖鹽(pH7.5)潤濕。然后，尿樣上清液(300μl)與作為標準的漸增濃度的大腸(桿)菌表達型重組存活素(Li等，Nature，1998，396580-84)(0.001-1.0llg/ml)溶解在300μl的TBS中，并過濾到膜上。過濾后，干燥膜，在5％Blotto和0.01％疊氮鈉的PBS(pH7.4)中4℃封閉12小時。用PBS-Tween20(0.25％)清洗后，膜與2μg/ml的兔抗存活素抗體22℃孵育(Grossman等，J.Invest.Dermatol.，1999，1131076-81.)3小時，用PBS-Tween清洗，與1∶1000稀釋的辣根過氧化物酶-偶聯(lián)驢抗兔IgG(Amersham Biotech，Piscataway NJ)22℃孵育1小時。PBS×2清洗10分鐘，PBS-Tween×2清洗5分鐘，再PBS×2清洗5分鐘，第一抗體的結(jié)合可以用增強化學發(fā)光(Amersham)和放射自顯影檢測。條帶用密度測定法進行定量，根據(jù)抗體隨重組存活素的濃度遞增的反應性計算存活素加權(quán)評分，如下0＝未檢測到；1＝0.001-0.25μg/ml；2＝0.25-1μg/ml；3＝＞1μg/ml。每份尿樣在兩種不同的場合下至少分析兩次，得到可以比較的結(jié)果。
實施例2Western印跡尿樣(100ml)在1,200xg 22℃離心10分鐘，細胞沉淀用TBS洗兩次，在蛋白酶抑制劑存在的條件下4℃在0.5％TritonX-100中溶解30分鐘。樣本用SDS凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)移到尼龍膜(Millipore，Corp.)上，并進一步用1μg/l抗存活素的抗體(Grossman等，J.Invest.Dermatol.，1999，1131076-81)孵育，然后用辣根過氧化物酶(HRP)-偶聯(lián)的山羊抗兔IgG孵育，然后檢測化學發(fā)光。
實施例3RT-PCR從15例新發(fā)或復發(fā)泌尿道上皮癌病人，2例已經(jīng)治療的膀胱癌病人，1例前列腺癌病人，1例非腫惡性尿道疾病病人和1例健康志愿者中獲取50ml干凈尿樣。用Trizol試劑(Life Technologies，Inc.，Gaithersburg，MD，USA)從尿沉淀中分離出總RNA。1-5μg總RNA用1μl的Superscript反轉(zhuǎn)錄酶(Gibco BRL，Life Technologies，Inc.，Gaithersburg，MD，USA)以隨機引發(fā)的方式在43℃溫育1h合成單鏈cDNA。70℃加熱15分鐘后，用存活素引物進行第一次擴增5′-CTGCCTGGCAGCCCTTTCTCAA-3′(正向；SEQ IDNO1)以及5′AATAAACCCTGGAAGTGGTGCA-3′(反向；SEQ ID NO2)，94℃變性15秒，53℃退火15秒，72℃延伸1分鐘，進行20個循環(huán)，然后72℃溫育5分鐘。463個堿基對(bp)的存活素cDNA片段然后用嵌套存活素引物進行第二輪擴增5′-CCGCATCTCTACATTCAAGAAC-3′(正向；SEQID NO3)和5′CTTGGCTCTTTCTCTGTCC-3′(反向；SEQ ID NO4)，94℃變性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸45秒，進行30個循環(huán)，然后72℃溫育5分鐘。擴增的279bp的存活素cDNA用2.0％瓊脂糖凝膠進行分離并用溴乙錠染色而顯現(xiàn)。對照反應用β-肌動蛋白特異性引物進行擴增5′-AGCGGGAAATCGTGCGTG-3′(正向；SEQ ID NO5)以及5′CAGGGTACATGGTGGTGCC-3′(反向；SEQ ID NO6)，得到309bp的片段。
結(jié)果用Bio-Dot檢測法檢測尿中存活素的代表性實驗見圖1。用Bio-Dot方法對本研究中收集的158份樣本中的138份進行了尿存活素的測定(表1)。另外對20份尿樣用RT-PCR分析存活素表達，以獨立地評價Bio-Dot方法的特異性。在下列研究對象中未檢測出存活素正常志愿者的尿(0/16)，或良性前列腺增生病人(0/6)，間質(zhì)性膀胱炎病人(0/2)，腎結(jié)石病人(0/3)，尿道感染病人(0/6)，或患其他的非惡性尿道疾病的病人(0/6)(表1)。在5例隱發(fā)性血尿病人(加權(quán)存活素評分，2)中3例檢測出尿存活素，他們都有尿潴留和經(jīng)尿道前列腺切除術(shù)后排尿困難的病史，膀胱鏡檢查發(fā)現(xiàn)有小梁的不規(guī)則的增厚膀胱。1例有升高的PSA水平但無前列腺癌診斷的病人，尿存活素為陽性(表1)。該病人膀胱鏡檢查也發(fā)現(xiàn)有小梁的不規(guī)則的增厚膀胱。在患下列疾病的病人的尿樣中未檢測出存活素前列腺癌(0/19)，腎癌(0/8)，陰道癌(0/1)，或?qū)m頸癌(0/1)(表1)。與此形成鮮明對照的是，在所有的新發(fā)或復發(fā)膀胱癌病人中檢測到尿存活素(31/31)(表1)。用Bio-Dot SF分析了尿存活素的組4中31例病人進行了組織病理學分級(I級-IV級)，包括13例病人為II級，7例病人為III級，5例病人為IV級的腫瘤。在5例病人中發(fā)現(xiàn)原位癌(CIS)合并乳突狀和侵入性癌，在1例病人中發(fā)現(xiàn)原位癌合并高分級的輸尿管的泌尿道上皮癌。
表1.用Bio-Dot SF模件檢測138例尿樣本中的存活素的結(jié)果尿樣本 (n) 存活素-陰性存活素-陽性組1(對照健康志愿者)16 16 0組2(非腫瘤性尿道疾病) 29血尿 52 3UTI66 0BPH66 0上升PSA10 1間質(zhì)性膀胱炎 22 0腎結(jié)石 33 0其他 66 0組3(除膀胱癌外的泌尿生殖癌)29前列腺癌腎癌 19 19 0陰道癌 88 0宮頸癌 11 0組4(新發(fā)或復發(fā)膀胱癌) 11 0組5(經(jīng)治療的膀胱癌 ) 31§ 0 3133 303UTI，尿道感染；BPH，良性前列腺增生；PSA，前列腺特異抗原。包括乳突狀壞死病人(n＝1)，前列腺炎病人(n＝2)，膀胱輸尿管反流病人(n＝1)，以及肌酐水平不斷升高的腎移植病人(n＝2)?！彀?例患輸尿管泌尿道上皮癌的病人。 膀胱鏡檢查正常。所述病人中的2人接受了膀胱癌的經(jīng)尿道切除術(shù)治療，1人接受電灼療法。1例病人尿細胞學檢查為膀胱癌陽性。
用Bio-Dot SF分析，組5中33個病人中的30個沒有檢測出尿存活素(表1)。所述30個病人中的5人接受了BCG并且已經(jīng)完成了3-5療程，其他的25人為治療后膀胱鏡檢查陰性的狀態(tài)。組5中最初診斷有GII非侵襲性膀胱癌的3個病人，進行被動膀胱鏡檢查后，尿存活素檢測呈陽性。3例病人中1人尿細胞學檢查為膀胱癌陽性。3個病人中的2人接受了經(jīng)尿道切除膀胱癌的治療，并且1人接受電灼療法治療。
對加權(quán)存活素評分標準化后，患CIS的病人的存活素評分(2.5....0.5，n＝6)比II級膀胱癌病人(1.3....0.6，n＝13)高得多。加權(quán)存活素評分與多個膀胱癌病例的組織病理學或分級之間的關(guān)聯(lián)度分別見表2和3。
表2.加權(quán)尿存活素評分和膀胱癌組織病理學之間的相關(guān)性組織病理學 所測病例平均存活素評分ND 3 1.7±1.2非侵襲性乳突狀癌 4 1±0未侵入逼尿肌 12 1.6±0.8侵入肌肉 6 1.7±0.8CIS 6 2.5±0.5表3.加權(quán)尿存活素評分與膀胱癌分級之間的相關(guān)性分級 檢測病例平均存活素評分分級II 13 1.3±0.6分級III 7 1.5±0.8分級IV 5 2±1分級IV 1 3*加權(quán)存活素評分用重組存活素濃度遞增的標準曲線計算出來如下0，未檢測出；1，0.001-0.25μg/ml；2，0.25-1μg/ml；以及3，＞1μg/ml。*6個CIS病人中的1人患輸尿管泌尿道上皮癌(分級IV；存活素評分，3)。組織病理學分析用對乳突狀移行上皮細胞腫瘤進行分類的Broader氏細胞學分級體系(分級I-IV)進行。ND，未測定。CIS，原位癌。與分級II或非侵襲性乳突狀癌相比，差異顯著(p＜0.02)。
通過Western印跡，16.5kDa的存活素單帶在膀胱癌病人的尿細胞團中檢測出，在來自健康志愿者的尿細胞團中卻未檢測出(圖2)。
為了獨立地評價用Bio-Dot方法得到的結(jié)果，另外15個新發(fā)或復發(fā)膀胱癌病人用RT-PCR分析尿存活素。從所有15例新發(fā)膀胱癌病人(15/15)的尿細胞團中擴增出279bp的存活素cDNA(圖3，數(shù)據(jù)未顯示)。與此相反，從另外5例個體的尿細胞團中沒有檢測出存活素cDNA，這5例中1例患尿道感染，2例為已經(jīng)治療的膀胱癌并且膀胱鏡檢查為陰性，1例患前列腺癌，1例來自正常志愿者(圖3)。在對照實驗中，從對照和膀胱癌病人尿中都擴增出309bp的β-肌動蛋白cDNA片段(圖3)。用RT-PCR分析的膀胱癌的組織病理學病例包括5個II級癌癥病人，1個III級癌癥病人，6個IV級癌癥病人和3個CIS病人。所述實驗表明在腫瘤進程中，脫落的癌細胞被動地將存活素釋放到細胞外環(huán)境，即尿中。
在這里檢查的病人中，尿存活素檢測對新發(fā)或復發(fā)膀胱癌病人的敏感度為100％，并且其對其他腫瘤性和非腫瘤性泌尿生殖疾病的特異性為95％(p＜0.02)。由于其高特異性，尿存活素檢測可用來作為細胞學和/或其他診斷性標志物的補充(Ramakumar等，J.Urol.，1999，161388-94；Lokeshwar等，J.Urol.，2000，163348-56)，以更好監(jiān)測膀胱癌癥病人并識別出早期復發(fā)或再發(fā)(de novo)癌癥。利用目前商業(yè)供應的抗存活素單個抗體的1步檢測法進行尿存活素檢測的其他可能優(yōu)勢包括其簡單性，適于作為對點服務(point-of-service)，以及其廉價。
實施例4病人血清中存活素的檢測從膀胱癌和前列腺癌的病人中收集血樣。分離血清并通過實施例1中描述的斑點印跡方法檢測存活素的存在。檢測膀胱癌和前列腺癌病人血清中的存活素。將遞增濃度的重組存活素g(μg/ml)(左和右列)，尿或血清樣本加載到狹槽-印跡裝置中。膜與抗存活素抗體、隨后與HRP-偶聯(lián)山羊抗兔IgG孵育。條帶用化學發(fā)光顯色。
癌癥病人血清中存活素的檢測表明，存活素可用作其他癌癥檢測的標志物。血清中存活素的存在的檢測可用于癌癥復發(fā)的篩選和檢測。
應該理解前述討論和實施例只是為了提供某種優(yōu)選的技術(shù)方案的詳細描述。下列事實對本領域的普通技術(shù)人員而言是顯而易見的可以進行多種不偏離本發(fā)明精神和范圍的修改。在本專利申請中出現(xiàn)的所有的期刊文章，其他參考文獻，專利，以及專利申請全部引入作為參考。
權(quán)利要求
1.一種診斷病人的癌癥的方法，包括分析來自病人的生物液體樣本中的存活素存在或缺乏，其中樣本中存活素的存在表明病人患有癌癥。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中生物液體為尿或血清。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中癌癥為任何侵襲泌尿生殖道的癌癥。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中泌尿生殖道癌為膀胱癌或前列腺癌。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中膀胱癌或前列腺癌分級為CIS。
6.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中膀胱癌或前列腺癌為任何等級或階段。
7.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中存活素用選自下列的試劑檢測結(jié)合存活素的抗體，存活素結(jié)合伴侶，或與編碼存活素的核酸雜交的核酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中試劑用標記物進行標記。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中標記物為放射活性標記物、熒光標記物、酶、或化學發(fā)光標記物。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中存活素用免疫分析進行檢測。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中免疫分析為酶聯(lián)免疫吸附分析或放射免疫分析。
12.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中免疫分析包括免疫印跡、免疫擴散、免疫電泳、或免疫沉淀。
13.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中存活素用斑點印跡檢測。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中斑點印跡包括使用Bio-Dot SF模件。
15.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中存活素用核酸雜交方法檢測。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中核酸雜交為RT-PCR或Northern印跡分析。
17.一種診斷，預后，或監(jiān)測癌的試劑盒，包括用于收集來自病人的生物液體的容器以及檢測生物液體中存活素存在的試劑。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的試劑盒，其中試劑選自結(jié)合存活素的抗體，存活素結(jié)合伴侶，以及與編碼存活素的核酸雜交的核酸。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的試劑盒，其中試劑用標記物進行標記。
20.根據(jù)權(quán)利要求18的試劑盒，其中標記物為放射性標記、熒光標記、酶、或化學發(fā)光標記。
21.根據(jù)權(quán)利要求17的試劑盒，其中試劑包裝在水性介質(zhì)中或以凍干形式存在。
22.根據(jù)權(quán)利要求17的試劑盒，進一步包括分析存活素存在的用具。
23.根據(jù)權(quán)利要求17的試劑盒，其中癌為膀胱癌或前列腺癌。
24.根據(jù)權(quán)利要求17的試劑盒，其中生物液體為尿或血清。
25.一種確定病人的癌癥等級的方法，包括對來自病人生物液體的樣本中的存活素進行定量，并將該樣本中存活素的量與對照樣本中存活素的量進行比較以確定癌癥的等級。
26.一種確定病人的癌癥階段的方法，包括對來自病人生物液體的樣本中的存活素進行定量，并將該樣本中存活素的量與對照樣本中存活素的量進行比較以確定癌癥的階段。
27.一種監(jiān)測病人癌癥的方法，包括對來自病人生物液體的樣本中的存活素進行定量以確定癌癥的等級。
28.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中生物液體選自前列腺液、精液、全血、血清、尿、乳腺的活組織檢查液體、胃腸液、或陰道液。
29.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中癌為任何表達存活素的癌。
30.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中癌選自成神經(jīng)細胞瘤、乳腺癌、肺癌、膀胱癌、結(jié)腸直腸癌、胰腺癌、泌尿生殖道癌、前列腺癌、腎癌、或膀胱癌。
31.根據(jù)權(quán)利要求的方法1，其中癌為新發(fā)癌或復發(fā)癌。
全文摘要
本發(fā)明包括診斷癌癥的一種方法，該方法包括檢測病人的生物液體中存活素的存在。本發(fā)明也提供試劑盒，其包括一種或更多的檢測存活素多肽或存活素核酸的試劑和一個收集用于檢測的生物液體的容器。
文檔編號G01N33/53GK1636139SQ02806510
公開日2005年7月6日 申請日期2002年1月11日 優(yōu)先權(quán)日2001年1月12日
發(fā)明者達里奧·C·阿爾蒂里, 羅伯特·B·韋斯, 香農(nóng)·D·史密斯, 馬西婭·A·惠勒, 珍妮特·普萊西亞 申請人:耶魯大學