專利名稱：血紅蛋白測定的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及糖化血紅蛋白測定方法及其相關(guān)方法的改進(jìn)。
溶于體液中的蛋白不斷發(fā)生糖化過程。葡萄糖與蛋白通過非酶促反應(yīng)形成糖蛋白，且多數(shù)情況下，形成糖蛋白的水平與體液中葡萄糖濃度是成比例的。對于最初不是合成為糖蛋白的那些蛋白而言，以糖化形式出現(xiàn)的蛋白部分因此是生物體中該蛋白的生命周期以及暴露于該蛋白的葡萄糖濃度的函數(shù)。
血液，血漿或尿液中葡萄糖濃度的測定只能得到取樣時的葡萄糖濃度，與此不同的是，糖基化蛋白的量可以指示較長時間段內(nèi)生物體對葡萄糖濃度的控制。
紅細(xì)胞平均壽命大約120天，其包含大量的血紅蛋白。因此，糖基化紅細(xì)胞血紅蛋白級分是一種控制糖尿病患者病情的很好的測定方法，也是患者在采血前幾周血液中葡萄糖濃度的函數(shù)。
US-A-5242842(Axis)提到一種測定糖基化血紅蛋白的方法，它利用了被報告分子標(biāo)記的硼酸偶聯(lián)物，如N-(9-羥基-3-異吩噁唑酮-4-羰基)哌啶-4-羧酸-N-羥基琥珀酰亞胺酯(RESOS)或異硫氰酸熒光素(FITC)與氨基苯硼酸的偶聯(lián)物。該試劑中的B(OH)3-陰離子與糖基化血紅蛋白的順二醇基團(tuán)結(jié)合，從而使糖基化血紅蛋白帶上報告分子標(biāo)記(如RESOS或FITC)。
在US-A-5631364(Axis)中描述了一組特別有效的帶有報告分子-標(biāo)記的硼酸偶聯(lián)物，包括二甲苯-苯胺-苯基硼酸偶聯(lián)物，它在本文中被稱為XC-DAPOL-CPBA。發(fā)色團(tuán)標(biāo)記物使該偶聯(lián)物的最大吸收值在616nm處(即藍(lán)色)，樣品中糖基化血紅蛋白級分可以利用在616nm和415nm的吸收值來測定，其中415nm為血紅蛋白的最大吸收值。
利用了該系統(tǒng)的糖化(即糖基化)血紅蛋白診斷分析已有商品，是Axis-Shield Plc的NycoCardHbAlc檢驗。在該檢驗的操作中，將弱堿性試劑水溶液與血樣混合，并且將該混合物加載至多孔膜上，洗膜后測定此膜(即捕獲在此膜上的血紅蛋白)的光反射。所述試劑溶液包括表面活性劑(用于裂解紅細(xì)胞和釋放血紅蛋白)，XC-DAPOL-CPBA(用于結(jié)合糖化血紅蛋白)，以及鋅離子(用于沉淀血紅蛋白)。經(jīng)沉淀的糖化和非糖化血紅蛋白截留在膜上，而其它糖化蛋白和過量的硼酸偶聯(lián)物經(jīng)清洗步驟從膜上洗去。
但該測定的結(jié)果隨所述試劑的保存時間不同而不同，如果試劑保存了6個月或更長時間，測定結(jié)果將不可信。由于臨床實驗室可能具有不同時間的試劑盒，因此需要提高基于硼酸偶聯(lián)物的糖化血紅蛋白測定的重復(fù)準(zhǔn)確性。
我們發(fā)現(xiàn)，使硼酸偶聯(lián)物和鋅在試劑盒中作為不同的試劑分別存在，可以改進(jìn)這類測定的可信度。因此本發(fā)明的一方面提供了用于糖化血紅蛋白測定的試劑盒，所述試劑盒包括能保留沉淀的血紅蛋白的多孔膜；第一試劑，包括鋅離子水溶液或包括水可溶性鋅化合物；第二試劑，包括發(fā)色團(tuán)-硼酸偶聯(lián)物；和任選包括水性洗滌試劑；其中至少第一試劑和第二試劑之一還包括能裂解紅細(xì)胞的表面活性劑，其中所述第二試劑為液體時呈酸性。
本發(fā)明試劑盒中第二試劑可以是溶液或干燥或不含溶劑的物質(zhì)。此試劑優(yōu)選包括所述表面活性劑的至少部分。試劑為液體時，溶劑可以是水或水溶性有機(jī)溶劑，即醇，醚，酮，酰胺，亞砜等，或上述兩種或更多種的混合。溶劑的優(yōu)選實例是水，甲醇，DMSO和甲酰胺。試劑優(yōu)選包括酸(如，檸檬酸)且優(yōu)選為液體時pH低于6，更優(yōu)選低于5。如果試劑是干燥的或不合溶劑的，特別優(yōu)選通過使以水，甲醇，或水和甲醇(優(yōu)選最多占甲醇體積的70％，如至少20％，例如30％-70％)為溶劑的溶液干燥而制備。尤其優(yōu)選以水作為溶劑。意外發(fā)現(xiàn)，通過例如蒸發(fā)而使這樣的包含硼酸偶聯(lián)物和表面活性劑的溶液干燥，將留下一種油性殘留物，其比單獨的偶聯(lián)物或表面活性劑更快地溶于水。此外，使用甲醇/水體系時發(fā)現(xiàn)，所得殘留物比單獨用甲醇的情況更均勻地對表面進(jìn)行包被。僅用水作為溶劑時結(jié)果更好。應(yīng)注意，長久以來認(rèn)為將表面活性劑溶液干燥一般產(chǎn)生成團(tuán)，粥樣殘留物，這種產(chǎn)生均勻，快速水可分散的殘留物的能力是十分驚奇的。
制備干燥或無溶劑的第二試劑時，添加不干擾血紅蛋白測定的水溶性大分子，如白蛋白(例如牛血清白蛋白)等蛋白特別有利，因為發(fā)現(xiàn)干殘留物更均勻，特別是經(jīng)過長期保存后。將大分子包含在內(nèi)還對液體形式的第二試劑有利，其可以降低偶聯(lián)物沉淀的發(fā)生率。此外還發(fā)現(xiàn)，將它包括在第一試劑或第二試劑或兩者中，都可縮短第一試劑和第二試劑混合均勻所需的時間。結(jié)論是，優(yōu)選第一試劑和/或第二試劑包含這種大分子化合物，尤其是濃度最高為1％w/v，特別是0.025％-0.3％w/v，更特別是0.05％-0.1％w/v的BSA。
硼酸偶聯(lián)物可以是，例如US-A-5242842，US-A-5631364和US-A-5739318中描述的任一種發(fā)色團(tuán)-硼酸偶聯(lián)物，但優(yōu)選XC-DAPOL-CPBA。
試劑中所用表面活性劑可以是任意具有裂解紅細(xì)胞能力的表面活性劑。即去氧膽酸鹽，Triton和Tween；但優(yōu)選Triton等非離子表面活性劑，尤其Triton X-100。
第一試劑是堿性水溶液或可溶于水或是用于產(chǎn)生堿性水溶液的水性堿。第二種情況中，所述試劑可以是只需加水就可重建的經(jīng)干燥的水性溶液。
第一試劑優(yōu)選也包括表面活性劑，也可包括其他可選組分，例如無機(jī)鹽(如氯化鈉或氯化鎂和疊氮化鈉)，甘氨酸和緩沖化合物。更優(yōu)選引入鋅作為無機(jī)鹽，如氯化鋅。優(yōu)選以水為基本溶劑，也可以有其他水性溶劑。試劑的pH值為堿性，優(yōu)選為弱堿性，如7.1到8.5，更優(yōu)選8.0到8.2，特別是大約8.1。該pH值應(yīng)使第一試劑和第二試劑混合成混合物時為堿性。
第一試劑優(yōu)選包含5-30mM，特別是7-20mM的鋅和0.05-0.22w/v的表面活性劑，并優(yōu)選緩沖到pH7.8-8.2。
第二試劑為水性液體時優(yōu)選包含0.15-0.75mg/g，特別是0.20-0.50mg/g的偶聯(lián)物，和0.05％-0.25％w/v，特別是0.1％-0.2％w/v的表面活性劑，5％-20％v/v，特別是10％-15％v/v的水溶性有機(jī)溶劑(如甲酰胺或DMSO)，第二試劑為干燥形式時優(yōu)選從水溶液而形成，該水溶液包含0.1-0.5mg/ml，特別是0.1-0.4mg/ml，更特別是0.15-0.3mg/ml的偶聯(lián)物，0.1％-0.5％w/v，特別是0.25-0.4％w/v的表面活性劑，0.2-0.6mM，特別是0.4-0.55mM的酸(如檸檬酸)，最高70％v/v，優(yōu)選0或最高(如從1％v/v)至50％v/v的甲醇，和優(yōu)選0.025-0.3％w/v，特別是0.05-0.1％的BSA。
洗滌試劑適宜為水溶性緩沖液，如Hepes。一種特別適宜的洗滌試劑包括50mM嗎啉，200mM NaCl，0.5％w/v Triton-X-100，0.1％w/v的甘油，0.05％w/vNaN3，pH9.1。
用于本發(fā)明試劑盒的膜可以是任意具有適合的孔徑大小的膜；但適宜是玻璃纖維或硼硅酸鹽濾膜或纖維質(zhì)膜，如孔徑大小0.5-1.5μm，特別是0.8-1.0μm。最好是將吸收層(如纖維質(zhì)層或聚醚砜層)放在膜上遠(yuǎn)離加樣面的表面上，這樣就能使樣品和試劑經(jīng)毛細(xì)管作用通過膜。
本發(fā)明的試劑盒中，第一試劑和第二試劑(其中第二試劑是液體)優(yōu)選放在由易碎的膜分離成的兩室容器中。這可以是，例如將易碎的(即玻璃)容器放于柔韌性容器的內(nèi)部。打破脆弱的膜分隔物(如玻璃瓶壁)可使兩種試劑在與血樣接觸之前混合。當(dāng)?shù)诙噭┦歉稍镂镔|(zhì)時，優(yōu)選將其包被在試劑盒的基座和/或容器壁或阻擋器上。這樣可使第一試劑充入第二試劑的容器中，以便將偶聯(lián)物帶入測定液中，或者將已用干燥的第二試劑包被的阻擋器放在裝有液態(tài)第一試劑的玻璃瓶(即預(yù)裝瓶)的瓶頸處。第二試劑若為液體，可相應(yīng)用于將干燥的第一試劑帶入測定所用的溶液中。
試劑盒中提供的試劑容器應(yīng)該最好是戴帽的，以防止液體流失或濕氣侵入。
另一方面，本發(fā)明也提供了測定血樣的糖化血紅蛋白的方法，所述方法包括使血樣與具有溶解紅細(xì)胞功能的表面活性劑，發(fā)色團(tuán)-硼酸偶聯(lián)物和鋅離子水溶液接觸，對樣品進(jìn)行溫育，使經(jīng)過溫育的樣品通過能截留沉淀的血紅蛋白的多孔膜，洗膜以除去不與偶聯(lián)物結(jié)合的血紅蛋白，用血紅蛋白和偶聯(lián)物各自的吸收波長測定從膜上反射出的光，比較所測定的反射光的強(qiáng)度，以便指示血樣中糖化血紅蛋白所占比例(如定量，半定量，或定性指示)，其特征在于，所述偶聯(lián)物和鋅離子是通過混合包含鋅離子堿性水溶液的第一試劑和包含發(fā)色團(tuán)-硼酸偶聯(lián)物的第二試劑而接觸，其中所述至少第一和第二試劑之一還包括具有溶解紅細(xì)胞能力的表面活性劑，其中所述第二試劑為液體時呈酸性。
明顯的本發(fā)明的試劑盒可用于本發(fā)明測定方法。
如上所述，表面活性劑和偶聯(lián)物的組合比單獨的表面活性劑或偶聯(lián)物更易溶于水。因此，本發(fā)明的另一方面提供一種水溶性物質(zhì)，它通過干燥一種不飽和環(huán)狀有機(jī)酸(如分子量500-1500道爾頓，例如硼酸偶聯(lián)物)溶液(如水性溶液，鏈烷醇或水-鏈烷醇溶液)和一種表面活性劑(如非離子表面活性劑，特別是Triton)而制備。這樣的溶液當(dāng)然還包括溶質(zhì)，其在所述物質(zhì)與水接觸時可類似地釋放。
本發(fā)明將在如下的非限定性實施例中進(jìn)一步描述。
實施例2，5，6中的第二試劑和實施例3中的溶液前體的干燥條件如下可以使用真空干燥爐或帶可編程真空控制器的冷凍-干燥器。應(yīng)將儀器設(shè)定在接近7-10mbar的壓力中，保持40-65分鐘。根據(jù)要干燥的試管的數(shù)量(液體量)和冷凍-干燥器的種類，進(jìn)行不同設(shè)置。設(shè)置不同便于在塑料壁上產(chǎn)生干燥物質(zhì)的平整膜。
對于Heraeus真空干燥爐(VT6025)使用以下設(shè)置(400-500只試管)溫度30℃用于獲得P2的時間5分鐘P2100mBar用于保持P2的時間5分鐘用于獲得P3的時間5分鐘P350mBar用于保持P3的時間5分鐘用于獲得P4的時間5分鐘P420mBar用于保持P4的時間5分鐘用于獲得P5的時間5分鐘P57mBar用于保持P5的時間5分鐘實施例1兩溶液測定第一試劑第一試劑包括200mM Hepes緩沖液50mM甘氨酸18mMZnCl230mMMgCl2400mM NaCl0.15％ w/v Triton X-100
0.05％ w/v NaN3pH 8.12該試劑通過使1ml 1M Hepes，0.25ml 1M甘氨酸，2ml H2O，0.09ml 1MZnCl2，0.15ml 1M MgCl2，0.4ml 5M NaCl，0.075ml 10％Triton X-100和0.025ml 10％NaN3混合而制備。將pH值調(diào)到8.12，加水至5ml。
第一試劑也可選擇如下制備24.6mg氯化鋅溶于2.5ml水中。233.8mg氯化鈉，61mg六水氯化鎂，0.05ml 10％疊氮化鈉和0.1ml 10％Triton X-100都溶于2.5ml水中。然后兩種溶液混合。將476.6mg HEPES和37.6mg甘氨酸溶于1.5ml水和0.4ml 5M氫氧化鈉中。然后向該HEPES溶液中加入鋅和Triton X-100溶液，將pH值調(diào)到8.1，將體積調(diào)至10ml。
第二試劑第二試劑包括12.4％v/v甲酰胺0.32mg/mLXC-DAPOL-CPBA0.15％w/vTriton X-100該試劑通過混合0.11ml甲酰胺，0.52ml XC-DAPOL-CPBA(3.15g/L在甲酰胺中)并加水至5ml來制備?？梢杂肈MSO代替甲酰胺。
測定步驟100μL的第一試劑和100μL的第二試劑混合。將混合物加入5μL血液，并溫育2分鐘。然后將25μL等份試樣放在玻璃纖維濾膜上。加入25μL pH9.1的洗滌液(實施例4)，從NycoCard閱讀器中讀出632nm和476nm處的結(jié)果。
實施例2溶液和經(jīng)干燥的偶聯(lián)物的測定第一試劑第一試劑包括100mMHepes25mM 甘氨酸9mM ZnCl215mM MgCl2
200mM NaCl0.1％ w/v Triton X-1000.05％ w/v NaN3pH值 8.12該試劑通過混合1ml 1M Hepes，0.25ml 1M甘氨酸，2ml H2O，0.09ml 1MZnCl2，0.15ml 1M MgCl2，0.4ml 5M NaCl，0.1ml 10％Triton X-100和0.05ml10％NaN3制備。pH值調(diào)到8.12，加水至5ml。
第一試劑也可以如下制備將12.3mg氯化鋅溶于2.5ml水中。116.9mg氯化鈉，30.5mg六水氯化鎂，0.05ml 10％疊氮化鈉和0.1ml 10％Triton X-100都溶于2.5ml水中。然后兩種溶液混合。將238.3mg HEPES和18.8mg甘氨酸溶于1.5ml水和0.2ml 5M氫氧化鈉中。然后將該HEPES溶液再加入鋅和Triton X-100溶液，調(diào)pH值到8.1，體積至10ml。
第二試劑(A)溶液前體溶液前體包括64.1％v/v 甲醇0.23mg/mL XC-DAPOL-CPBA0.336％w/v Triton X-1000.48mM 檸檬酸該溶液前體通過將XC-DAPOL-CPBA溶于0.36mg/mL的甲醇中來制備。2ml該溶液與105μL 10％Triton X-100，1ml水和15μl 0.1M檸檬酸混合。
(B)第二試劑蒸發(fā)150μL溶液前體溶液前體可選擇包括20％v/v 甲醇0.3-0.5mg/mL XC-DAPOL-CPBA0.34％w/v BAS0.336％w/vTriton X-1000.4-0.6mM 檸檬酸pH值到4.1該溶液前體通過將XC-DAPOL-CPBA溶于2.5mg/mL的甲醇中來制備。2ml該溶液與4.8ml 0.7％Triton X-100混合，加入2ml 0.5％w/v的BAS，再加0.1M的檸檬酸(約50-60μl)調(diào)pH值到4.1。加水至10ml。調(diào)整XC-DAPOL-CPBA的用量以便使620nm的光密度(OD)為32.5。
125μL的該溶液前體經(jīng)真空干燥產(chǎn)生第二試劑。
測定步驟200μL第一試劑與第二試劑混合，然后與5μl血液混合，此后的測定步驟同實施例1。
實施例3干燥緩沖液和液體偶聯(lián)物的測定(A)溶液前體第一試劑包括50mM 甘氨酰胺氫氯化物10mM ZnCl220mM MgCl2200mMNaCl0.1％ w/vTriton X-1000.05％ w/v NaN3pH值 8.1213.6mg ZnCl2溶于2.5ml水中。116.9mg NaCl，40.6mg MgCl2×6H2O，0.05ml 10％w/v NaN3和0.1ml 10％w/v Triton X-100溶于2.5ml水中，然后混合兩種溶液。將55.2mg甘氨酰胺溶于1.5ml水和0.4ml 5M的NaOH中，該溶液再加入鋅溶液。調(diào)pH值到8.1，體積至10ml。
(B)第一試劑將200μL的溶液前體真空干燥。
第二試劑包含BSA的溶液如實施例2所述，作為液體形式的溶液前體。
測定步驟200μL第一試劑與該第二試劑混合，然后與5ml血液混合，此后的測定步驟同實施例1。
實施例4
洗滌溶液洗滌溶液包括50mM 嗎啉200mM NaCl0.5％ w/v Triton X-1000.1％ w/v 甘油0.05％ w/vNaN3該溶液通過混合各成分來制備，調(diào)pH值到9.1，加水到達(dá)所要濃度。
實施例5溶液和經(jīng)干燥的偶聯(lián)物的測定用于測定的物質(zhì)的制備同實施例2，但溶液前體的制備不同，要將硼酸偶聯(lián)物溶于0.5mM的NaOH中達(dá)到濃度為0.25mg/ml。這需要攪拌10-30分鐘。然后將2ml該溶液與0.05ml 10％Triton X-100混合后再攪拌10分鐘。加0.01ml 0.1M的檸檬酸使pH值降到約4.5。測定如實施例2所述。
實施例6溶液和經(jīng)干燥的偶聯(lián)物的測定用于測定的物質(zhì)的制備同實施例2，但溶液前體的制備不同，要將硼酸溶于10mM的NaOH中達(dá)到濃度為0.25mg/ml。2ml該溶液與4.8ml 0.7％Triton X-100混合。加入2ml 0.5％w/v的BAS，再用0.1M的檸檬酸(50-60μl)調(diào)pH值到4.1。加水至10ml。調(diào)整偶聯(lián)物的用量使620nm的光密度為32.5。測定如實施例2所述。
權(quán)利要求
1.用于測定糖化血紅蛋白的試劑盒，所述試劑盒包括能保留沉淀的血紅蛋白的多孔膜；第一試劑，包括鋅離子水溶液或包括水可溶性鋅化合物；第二試劑，包括發(fā)色團(tuán)-硼酸偶聯(lián)物；和任選包括水性洗滌試劑；其中至少第一試劑和第二試劑之一還包括能裂解紅細(xì)胞的表面活性劑，其中所述第二試劑為液體時呈酸性。
2.權(quán)利要求1的試劑盒，其中所述第一試劑包括鋅離子堿性水溶液。
3.權(quán)利要求1或2的試劑盒，其中所述第二試劑包括表面活性劑。
4.權(quán)利要求1到3之一的試劑盒，其中所述第二試劑是經(jīng)干燥的物質(zhì)。
5.權(quán)利要求1到4之一的試劑盒，其中所述第一試劑包括表面活性劑。
6.權(quán)利要求1到5之一的試劑盒，其中至少所述第一試劑和第二試劑之一包括白蛋白。
7.權(quán)利要求1到6之一的試劑盒，其中所述第一試劑和第二試劑中，一種以液體形式置于容器中，另一種以干燥形式包被在應(yīng)用于所述容器上的阻擋器表面。
8.測定血樣中糖化血紅蛋白的方法，所述方法包括使血樣與具有溶解紅細(xì)胞功能的表面活性劑，發(fā)色團(tuán)-硼酸偶聯(lián)物和鋅離子水溶液接觸，對樣品進(jìn)行溫育，使經(jīng)過溫育的樣品通過能截留沉淀的血紅蛋白的多孔膜，洗膜以除去不與偶聯(lián)物結(jié)合的血紅蛋白，用血紅蛋白和偶聯(lián)物各自的吸收波長測定從膜上反射出的光，比較所測定的反射光的強(qiáng)度，以便指示血樣中糖化血紅蛋白所占比例，其特征在于，所述偶聯(lián)物和鋅離子是通過混合包含鋅離子堿性水溶液的第一試劑和包含發(fā)色團(tuán)-硼酸偶聯(lián)物的第二試劑而接觸，其中所述至少第一和第二試劑之一還包括具有溶解紅細(xì)胞能力的表面活性劑，其中所述第二試劑為液體時呈酸性。
9.一種水溶性物質(zhì)，其通過干燥一種不飽和環(huán)狀有機(jī)酸(例如分子量500-1500道爾頓，如硼酸偶聯(lián)物)和一種表面活性劑而得到。
全文摘要
本發(fā)明提供一種測定糖化血紅蛋白的試劑盒，所述試劑盒包括能保留沉淀的血紅蛋白的多孔膜；第一試劑，包括鋅離子水溶液或包括水可溶性鋅化合物；第二試劑，包括發(fā)色團(tuán)－硼酸偶聯(lián)物；和任選包括水性洗滌試劑；其中至少第一試劑和第二試劑之一還包括有溶解紅細(xì)胞能力的表面活性劑，其中所述第二試劑為液體時呈酸性。
文檔編號G01N33/483GK1531654SQ02808765
公開日2004年9月22日 申請日期2002年4月10日 優(yōu)先權(quán)日2001年4月24日
發(fā)明者喬斯泰恩·霍爾特倫德, 克斯廷·伯恩斯特羅姆, 埃倫·德沃斯基, 利斯·科尼利厄森, 伯恩斯特羅姆, 喬斯泰恩 霍爾特倫德, 德沃斯基, 科尼利厄森 申請人:阿克西斯-希爾德公司