專利名稱：免疫反應(yīng)測定方法以及方法中使用的免疫反應(yīng)測定用試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及可以對作為樣品中被測定物質(zhì)的抗原或抗體進(jìn)行測定的免疫反應(yīng)測定方法以及方法中使用的免疫反應(yīng)測定用試劑盒。
背景技術(shù)：
在醫(yī)療領(lǐng)域中，為了研究各種各樣疾病的診斷以及病狀的經(jīng)過，廣泛地進(jìn)行對存在于人體液的各種疾病中特征的蛋白質(zhì)含量的測定。在這些蛋白質(zhì)含量的測定中，主要廣泛利用用特異識別靶蛋白作為抗原的抗體的反應(yīng)(抗原抗體反應(yīng))的免疫反應(yīng)測定方法。現(xiàn)在，在免疫反應(yīng)測定方法中開發(fā)了利用各種各樣原理的測定方法。
其中，有公知的對利用抗原抗體反應(yīng)生成抗原抗體復(fù)合物的凝集物(以下稱之為凝集復(fù)合物)進(jìn)行檢測的免疫散射測濁法(以下略稱為散射測濁法)、免疫比濁法(以下略稱為比濁法)以及玻片凝集法等測定方法。這些測定方法由于是在溶液中抗原和抗體都以同樣分散的狀態(tài)下進(jìn)行的方法，所以統(tǒng)稱為「均一體系的免疫反應(yīng)測定方法」。
在抗原抗體反應(yīng)中，由于凝集復(fù)合物的生成在反應(yīng)體系中出現(xiàn)渾濁。凝集復(fù)合物生成在反應(yīng)體系中出現(xiàn)的渾濁的程度與抗原的量和抗體的量有關(guān)。根據(jù)這一現(xiàn)象，散射測濁法和比濁法是對上述反應(yīng)體系產(chǎn)生的渾濁程度進(jìn)行光學(xué)上測定，由其測定值算出抗原的量或抗體的量的方法。
散射測濁法是根據(jù)反應(yīng)體系中散射的光量，而比濁法是根據(jù)反應(yīng)體系中因散射而減少的通過光量測定反應(yīng)體系出現(xiàn)的渾濁程度的。一般來說，無論是散射測濁法還是比濁法都可以在同樣反應(yīng)體系中進(jìn)行測定。就是說散射測濁法或比濁法任一方能夠測定的反應(yīng)體系，另一方也可以進(jìn)行測定。玻片凝集法是通過將由于凝集復(fù)合物生成而出現(xiàn)渾濁的反應(yīng)體系中的溶液採集到載玻片上等，通過目視等判定反應(yīng)體系中產(chǎn)生的渾濁程度的方法。對于玻片凝集法可以使用與散射測濁法、比濁法同樣的反應(yīng)體系。
在上述以往的均一體系的免疫反應(yīng)測定方法中，為了促進(jìn)抗原抗體反應(yīng)，對微量成分進(jìn)行高靈敏度地測定，嘗試使用各種各樣的添加劑。作為人們熟知的例子，例如使聚乙二醇、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮以及聚氯乙稀等水溶性高分子混在反應(yīng)體系中，通過促進(jìn)由于抗原抗體反應(yīng)引起的凝集復(fù)合物的形成，縮短反應(yīng)時(shí)間，使測定值提高，從而提高測定靈敏度。已知即使上述水溶性高分子中的聚乙二醇在比較低濃度下，也可以使反應(yīng)時(shí)間縮短，使測定值提高的效果很好。特別是在反應(yīng)體系中添加終濃度為2～6重量％的平均分子量為6,000的聚乙二醇(PEG)的方法正被廣泛采用。尤其是在反應(yīng)體系中添加終濃度為4重量％的平均分子量為6,000的聚乙二醇(PEG)的方法除了凝集復(fù)合物外沒有非特異渾濁，上述效果更好。
水溶性高分子促進(jìn)抗原抗體反應(yīng)的效果，一般存在越是水溶性高分子的分子量大且水溶性高分子濃度高則效果越大的傾向(參照AutomatedImmunoanalysis Part 1，Ritchie編，第67-112頁(1978))。
考慮抗原抗體反應(yīng)的測定時(shí)，依賴于抗原抗體反應(yīng)程度(即抗原的濃度)的信號強(qiáng)度(即測定值)越高，越能維持良好的S/N比，可以進(jìn)行穩(wěn)定的測定。然而，為了要進(jìn)一步促進(jìn)抗原抗體反應(yīng)，得到上述效果，象以往那樣將更高濃度的水溶性高分子或高分子量的水溶性高分子添加到反應(yīng)體系中時(shí)，溶解了水溶性高分子的反應(yīng)體系中的溶液粘性增大。由于這一原因，存在著測定操作上的處理變得困難的不好狀況。因此，有時(shí)不能得到高的信號強(qiáng)度(即測定值)，很難進(jìn)行穩(wěn)定的測定。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明鑒于上述情況，目的在于提供可以容易使測定值提高、獲得高的測定靈敏度的免疫反應(yīng)測定方法以及該方法中使用的免疫反應(yīng)測定用試劑盒。
本發(fā)明的免疫測定方法是測定樣品中被測定物質(zhì)含量的免疫反應(yīng)測定方法，包含構(gòu)建含有上述樣品、與上述被測定物質(zhì)特異結(jié)合的特異結(jié)合物質(zhì)以及苯二甲酸或苯二甲酸鹽的反應(yīng)體系的工序A；對上述反應(yīng)體系的光學(xué)特性進(jìn)行測定的工序B，在上述工序A中，上述反應(yīng)體系的pH設(shè)定為低于7，而上述被測定物質(zhì)和上述特異結(jié)合物質(zhì)的組合是抗原與抗體的組合。
利用本發(fā)明的免疫反應(yīng)測定方法可以使反應(yīng)體系的光學(xué)特性的測定值提高。另外由于本發(fā)明中使用的苯二甲酸或苯二甲酸鹽是低分子物質(zhì)，因此不會使反應(yīng)體系的粘性增大，其測定操作上的處理也變得容易。
上述光學(xué)特性可以是散射光強(qiáng)度或光透射量。
在上述工序A中，上述反應(yīng)體系還可以含有緩沖劑。
在上述工序A中，上述反應(yīng)體系的pH最好設(shè)定在4.5～5.5范圍內(nèi)。
在上述工序A中，上述反應(yīng)體系中的苯二甲酸或苯二甲酸鹽的濃度最好在0.2M以下。
上述苯二甲酸鹽最好是苯二甲酸氫鉀。
反應(yīng)體系可以含有2～6重量％的聚乙二醇。
上述被測定物質(zhì)是在其內(nèi)部具有保持金屬離子的結(jié)構(gòu)的抗原，而上述特異結(jié)合物質(zhì)是與沒有保持上述金屬離子的上述抗原特異結(jié)合的抗體。
上述被測定物質(zhì)可以是人C反應(yīng)性蛋白質(zhì)。
上述被測定物質(zhì)是在其內(nèi)部具有保持金屬離子的結(jié)構(gòu)的抗原，而上述特異結(jié)合物質(zhì)是多克隆抗體，在上述工序A中上述反應(yīng)體系還可以含有上述金屬離子。
上述被測定物質(zhì)可以是人C反應(yīng)性蛋白質(zhì)。
上述被測定物質(zhì)是抗原，而上述特異結(jié)合物質(zhì)是能夠與上述抗原的多個(gè)部位結(jié)合的單克隆抗體。
上述被測定物質(zhì)可以是人C反應(yīng)性蛋白質(zhì)。
本發(fā)明免疫反應(yīng)測定用試劑盒是用于測定樣品中被測定物質(zhì)含量的免疫反應(yīng)測定用試劑盒，含有與上述被測定物質(zhì)特異結(jié)合的特異結(jié)合物質(zhì)；苯二甲酸或苯二甲酸鹽；在構(gòu)建含有上述樣品、上述特異結(jié)合物質(zhì)以及上述苯二甲酸或苯二甲酸鹽的反應(yīng)體系時(shí)用于將上述反應(yīng)體系的pH設(shè)定在7以下的緩沖劑；上述被測定物質(zhì)和上述特異結(jié)合物質(zhì)的組合是抗原與抗體的組合。
利用本發(fā)明的免疫反應(yīng)測定用試劑盒可以使反應(yīng)體系的光學(xué)特性的測定值提高。另外由于本發(fā)明中使用的苯二甲酸或苯二甲酸鹽是低分子物質(zhì)，不會使反應(yīng)體系的粘性增大，其測定操作上的處理也變得容易。
上述緩沖劑最好是將上述反應(yīng)體系的pH設(shè)定在4.5～5.5范圍內(nèi)。
上述反應(yīng)體系中的上述苯二甲酸或苯二甲酸鹽的濃度最好調(diào)整到0.2M以下。
上述苯二甲酸鹽最好是苯二甲酸氫鉀。
還含有聚乙二醇，而且上述反應(yīng)體系中的上述聚乙二醇的濃度可以調(diào)節(jié)到2～6重量％的范圍內(nèi)。
上述被測定物質(zhì)是在其內(nèi)部具有保持金屬離子的結(jié)構(gòu)的抗原，而上述特異結(jié)合物質(zhì)是與沒有保持金屬離子的上述抗原特異結(jié)合的抗體。
上述抗體可以是抗人C反應(yīng)性蛋白質(zhì)抗體。
還含有供給金屬離子的金屬化合物，上述被測定物質(zhì)是在其內(nèi)部具有保持金屬離子的結(jié)構(gòu)的抗原，上述抗原在其內(nèi)部具有保持金屬離子的結(jié)構(gòu)，而上述特異結(jié)合物質(zhì)可以是多克隆抗體。
上述抗體可以是抗人C反應(yīng)性蛋白質(zhì)抗體。
上述被測定物質(zhì)是抗原，而上述特異結(jié)合物質(zhì)可以是能夠與上述抗原的多個(gè)部位結(jié)合的單克隆抗體。
上述單克隆抗體可以是抗人C反應(yīng)性蛋白質(zhì)抗體。
可以將上述特異物質(zhì)和上述苯二甲酸或上述苯二甲酸鹽混合。


圖1是表示本發(fā)明一實(shí)施方式的免疫反應(yīng)測定方法的各工序的工藝流程圖。
圖2是對本發(fā)明人對本發(fā)明的反應(yīng)機(jī)制的推測進(jìn)行說明的模式圖。
圖3(a)和(b)是表示均一體系免疫反應(yīng)測定方法的反應(yīng)體系中抗原和抗體的反應(yīng)方式的模式圖。
圖4是表示就本發(fā)明的一實(shí)施例中使用含有苯二甲酸氫鉀的免疫反應(yīng)測定用試劑盒的免疫測定方法和比較例，利用散射測濁法進(jìn)行人白蛋白測定的結(jié)果的曲線圖。
圖5是表示就本發(fā)明的一實(shí)施例中使用含有苯二甲酸的免疫反應(yīng)測定用試劑盒的免疫測定方法和比較例，利用散射測濁法進(jìn)行人白蛋白測定的結(jié)果的曲線圖。
圖6是表示就本發(fā)明的其他實(shí)施例中使用含有苯二甲酸氫鉀的免疫反應(yīng)測定用試劑盒的免疫測定方法，利用散射測濁法研究在人白蛋白測定中對pH依賴性的結(jié)果的曲線圖。
圖7是表示就本發(fā)明的另外其他實(shí)施例中使用含有苯二甲酸氫鉀的免疫反應(yīng)測定用試劑盒的免疫測定方法，利用散射測濁法研究在人白蛋白測定中對苯二甲酸氫鉀濃度依賴性的結(jié)果的曲線圖。
圖8是表示就本發(fā)明的另外的其他實(shí)施例中使用含有苯二甲酸和其它緩沖劑的免疫反應(yīng)測定用試劑盒的免疫測定方法和比較例，利用散射測濁法測定人白蛋白的結(jié)果的曲線圖。
圖9是表示就本發(fā)明的另外的其他實(shí)施例中使用含有山羊抗人CRP多克隆抗體和苯二甲酸的免疫反應(yīng)測定用試劑盒的免疫測定方法和比較例，利用散射測濁法測定人CRP的結(jié)果的曲線圖。
圖10是表示就本發(fā)明的另外的其他實(shí)施例中使用含有小鼠抗人CRP單克隆抗體和苯二甲酸氫鉀的免疫反應(yīng)測定用試劑盒的免疫測定方法和比較例，利用散射測濁法測定人CRP的結(jié)果的曲線圖。
具體實(shí)施例方式
象上述那樣在對樣品中被測定物質(zhì)含量進(jìn)行測定的免疫反應(yīng)測定方法中，由被測定物質(zhì)引起抗原抗體反應(yīng)，并且由反應(yīng)后的反應(yīng)體系的光學(xué)特性的測定值可以算出被測定物質(zhì)的量。
本發(fā)明人等在進(jìn)行上述測定時(shí)發(fā)現(xiàn)可以獲得高的測定值(即，測定靈敏度高)的免疫反應(yīng)測定方法以及免疫反應(yīng)測定用試劑盒。另外還發(fā)現(xiàn)了利用本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的該免疫反應(yīng)測定方法以及免疫反應(yīng)測定用試劑盒可以緩和在抗原過剩區(qū)產(chǎn)生的區(qū)帶現(xiàn)象(Zone Phenomenon)。
以下參照圖1對本發(fā)明的實(shí)施方式進(jìn)行說明。圖1是表示本實(shí)施方式的免疫反應(yīng)測定方法的各工序的工藝流程圖。在本說明書中，用語「測定值」只要沒有特別記載的話，與信號強(qiáng)度意思相同。
首先，在圖1所示的工序St1中，構(gòu)建含有要對被測定物質(zhì)的含量進(jìn)行測定的樣品、與被測定物質(zhì)特異結(jié)合的特異結(jié)合物質(zhì)以及苯二甲酸或苯二甲酸鹽的反應(yīng)體系。此時(shí)上述反應(yīng)體系的pH設(shè)定為低于7。而被測定物質(zhì)是抗原時(shí)，特異結(jié)合物質(zhì)是抗體，被測定物質(zhì)是抗體時(shí)，特異結(jié)合物質(zhì)是抗原。
依照這樣的工序，當(dāng)樣品中含有被測定物質(zhì)時(shí)，通過被測定物質(zhì)和特異結(jié)合物質(zhì)的抗原抗體反應(yīng)會生成凝集復(fù)合物。當(dāng)樣品中不含有被測定物質(zhì)時(shí)，就不會通過被測定物質(zhì)和特異結(jié)合物質(zhì)的抗原抗體反應(yīng)生成凝集復(fù)合物。
在圖1所示的工序St2中，對反應(yīng)體系的光學(xué)特性進(jìn)行測定。此時(shí)，當(dāng)在上述工序St1中生成凝集復(fù)合物時(shí)，上述反應(yīng)體系出現(xiàn)渾濁、散射光強(qiáng)度以及光透過量等都發(fā)生變化。因此通過測定散射光強(qiáng)度以及光透過量等可以估計(jì)反應(yīng)體系的渾濁程度。在此最好是將從上述反應(yīng)體系中除去特異結(jié)合物質(zhì)后的反應(yīng)體系作為基準(zhǔn)，對上述反應(yīng)體系的光學(xué)變化量、即散射光或光透過量進(jìn)行測定。另外也可以將從反應(yīng)體系中除去樣品后的反應(yīng)體系作為基準(zhǔn)。
通過實(shí)施上述工序，可以使因抗原抗體反應(yīng)生成的凝集復(fù)合物引起的反應(yīng)體系的光學(xué)特性的測定值提高。因此利用本實(shí)施方式的免疫反應(yīng)測定方法可以高靈敏度地測定被測定物質(zhì)的量。獲得這樣效果的理由現(xiàn)階段還不清楚，但本發(fā)明人推測存在下述理由。參照圖2對該推測進(jìn)行說明。
認(rèn)為苯二甲酸或苯二甲酸鹽無論哪一個(gè)在水溶液中都是以苯二甲酸或苯二甲酸離子形式存在的。認(rèn)為苯二甲酸或苯二甲酸離子無論哪一個(gè)都有極性，具有在水溶液中容易吸附水分子的性質(zhì)。因此通過在上述反應(yīng)體系中添加苯二甲酸或苯二甲酸鹽，水分子聚集在苯二甲酸或苯二甲酸離子的周圍。因此就象圖2所示的那樣，存在于抗體分子周圍的水分子顯著減少，抗體分子的局部存在比率增大。由此認(rèn)為抗原和抗體之間的沖突增加，促進(jìn)了抗原抗體反應(yīng)。其結(jié)果也促進(jìn)了凝集復(fù)合物的形成，提高了反應(yīng)體系的光學(xué)特性的測定值。
如上所述，利用以往的添加水溶性高分子的方法，為了使測定值提高，并維持良好的S/N比，進(jìn)行穩(wěn)定的測定，需要添加高濃度或高分子量的水溶性高分子。因此，存在著使溶液的粘性增大，其分析操作上的處理變得困難的不好狀態(tài)。然而在本實(shí)施方式中由于使用的苯二甲酸或苯二甲酸鹽是低分子物質(zhì)，不會使溶液的粘性增大，其測定操作的處理也變得容易。
另外利用本實(shí)施方式的免疫反應(yīng)測定方法，可以緩和抗原過量存在時(shí)產(chǎn)生的區(qū)帶現(xiàn)象(Zone Phenomenon)。以下參照圖3進(jìn)行說明。圖3(a)和(b)是表示均一體系的免疫反應(yīng)測定方法的反應(yīng)體系中抗原和抗體的反應(yīng)方式的模式圖。
一般來說，人們知道如果利用均一體系的免疫反應(yīng)測定方法，會發(fā)生稱之為區(qū)帶現(xiàn)象的現(xiàn)象。如圖3(a)所示，如果利用通常均一體系的免疫反應(yīng)測定方法，會生成抗原與抗體交替結(jié)合形成的巨大的分子鏈的凝集復(fù)合物。所謂區(qū)帶現(xiàn)象就象圖3(b)所示那樣，相對于抗體，抗原存在的量比抗原和抗體形成最大量的凝集復(fù)合物的當(dāng)量區(qū)還過剩時(shí)，凝集復(fù)合物變得難于形成的現(xiàn)象。多價(jià)抗體和2價(jià)以上抗原之間的結(jié)合反應(yīng)，Heidelberger等人的格子學(xué)說是有名的，F(xiàn)undamental Immunology，William E.Paul編(1984)(邦譯基礎(chǔ)免疫學(xué)，多田富雄監(jiān)譯，第714-716頁(1987))文獻(xiàn)中有詳細(xì)記載。
在不發(fā)生區(qū)帶現(xiàn)象的抗體和抗原的濃度范圍中，如圖(a)所示那樣，會生成抗原與抗體交替結(jié)合形成的巨大的分子鏈的凝集復(fù)合物。此時(shí)如果抗體濃度一定，該凝集復(fù)合物的量和大小依賴于抗原濃度而增加。因此，通過將該凝集復(fù)合物的量和大小作為光學(xué)的變化量進(jìn)行測定，可以定量測定抗原濃度。另外，凝集復(fù)合物由于抗體和抗原的濃度關(guān)系，作為溶液中的渾濁或凝集物即使用肉眼也可以充分確認(rèn)，因此通過目視也可以進(jìn)行定性判定。
然而，在實(shí)際的均一體系的免疫反應(yīng)測定方法中，往往使用抗體測定抗原濃度。在比抗原濃度低的情況高時(shí)，測定值往往具有重要的意義。可是當(dāng)抗原濃度與抗體相比過剩時(shí)，就象圖3(b)所示那樣，抗體的結(jié)合部位被抗原飽和的抗體量增加，凝集復(fù)合物產(chǎn)生變得困難。因此，在抗原低濃度情況與抗原過剩情況之間對抗原抗體反應(yīng)的結(jié)果進(jìn)行區(qū)別變得困難。因此擔(dān)心不能進(jìn)行依賴于抗原濃度的正確定量以及判定，或者說，要進(jìn)行依賴于抗原濃度的正確定量以及判定會產(chǎn)生所謂的測定濃度受到限制的不良狀況。這樣一來，由于抗原過量存在產(chǎn)生的區(qū)帶現(xiàn)象往往是均一體系的免疫反應(yīng)測定方法中不良狀況的一個(gè)原因。
然而，利用本實(shí)施方式的免疫反應(yīng)測定方法，可以緩和抗原過量存在時(shí)產(chǎn)生的區(qū)帶現(xiàn)象。如上所述，這是由于通過在上述反應(yīng)體系中添加苯二甲酸或苯二甲酸鹽，促進(jìn)凝集復(fù)合物形成的緣故。
另外利用本實(shí)施方式的免疫反應(yīng)測定方法，由于可以緩和區(qū)帶現(xiàn)象，所以可以減少被測定物質(zhì)在高濃度下的測定值的下降。由此可以擴(kuò)展能夠正確測定被測定物質(zhì)的含量的測定濃度范圍。
以下就各個(gè)工序進(jìn)行詳細(xì)的說明。
在工序St1中，如上所述，構(gòu)建含有被測定物質(zhì)、與被測定物質(zhì)特異結(jié)合的特異結(jié)合物質(zhì)以及苯二甲酸或苯二甲酸鹽的反應(yīng)體系。此時(shí)反應(yīng)體系中可以同時(shí)含有苯二甲酸和苯二甲酸鹽。當(dāng)然，反應(yīng)體系中無論含有苯二甲酸或苯二甲酸鹽哪一種都可以。
另外在工序St1中，通過反應(yīng)體系中含有的苯二甲酸或苯二甲酸鹽賦予緩沖能力，最好將反應(yīng)體系的pH設(shè)定為低于7。這樣一來，由于反應(yīng)體系的pH設(shè)定為低于7，因此不添加其他緩沖劑，也可以有效地發(fā)揮上述的提高測定值的效果以及緩和區(qū)帶現(xiàn)象的效果。為了通過苯二甲酸或苯二甲酸鹽賦予反應(yīng)體系緩沖能力，苯二甲酸或苯二甲酸鹽的濃度最好在0.01M以上。
在本實(shí)施方式的免疫反應(yīng)測定方法中，工序St1中反應(yīng)體系的pH優(yōu)選為4.5～5.5范圍，更優(yōu)選4.5～5.3范圍，特別優(yōu)選在4.5～5.0范圍。在上述pH范圍內(nèi)，上述的測定值提高效果變好，另外區(qū)帶現(xiàn)象的緩和效果也變好。特別是反應(yīng)體系的pH調(diào)整在4.5是最理想的。
在本實(shí)施方式的免疫反應(yīng)測定方法中，工序St1中反應(yīng)體系的苯二甲酸或苯二甲酸鹽濃度最好是在0.2M以下。這樣一來，上述的測定值提高效果變得更好，另外區(qū)帶現(xiàn)象的緩和效果也變得更好。為了進(jìn)一步提高這些效果，反應(yīng)體系的苯二甲酸或苯二甲酸鹽濃度在0.1M以下比較好，特別是為了使上述效果顯著提高，最好是將反應(yīng)體系的苯二甲酸或苯二甲酸鹽濃度大致調(diào)整在0.1M。
另外在工序St1中，反應(yīng)體系可以進(jìn)一步添加別的緩沖劑。本實(shí)施方式的免疫反應(yīng)測定方法中可以使用的緩沖劑是該領(lǐng)域中眾所周知的緩沖劑。例如，可以舉出由磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉構(gòu)成的磷酸系緩沖劑、乙酸鈉、二甲胂酸鈉、2-(N-嗎啉代)乙磺酸、琥珀酸等。添加緩沖劑時(shí)，反應(yīng)體系應(yīng)當(dāng)含有的緩沖劑的量可以根據(jù)使用的緩沖劑的種類、含有被測定物質(zhì)的樣品(檢體)的量、以及針對反應(yīng)體系中作為被測定物質(zhì)的抗原或抗體的抗體或抗原的供給方法等適當(dāng)調(diào)整。
作為本實(shí)施方式的免疫反應(yīng)測定方法中使用的苯二甲酸或苯二甲酸鹽，可以舉出苯二甲酸、苯二甲酸酐、苯二甲酸氫鉀、苯二甲酸鉀、苯二甲酸二鈉、苯二甲酸銨、苯二甲酸銅(II)等。這些試劑都有銷售，容易獲得。這些試劑可以單獨(dú)或搭配起來用。其中作為本實(shí)施方式的免疫反應(yīng)測定方法以及免疫反應(yīng)測定用試劑盒中使用的苯二甲酸鹽，從對水的溶解性高、而且溶解時(shí)的水溶液的pH在4.0附近的觀點(diǎn)出發(fā)，優(yōu)選苯二甲酸氫鉀。
而苯二甲酸存在著o-苯二甲酸、m-苯二甲酸以及p-苯二甲酸(對苯二甲酸)異構(gòu)體。在本實(shí)施方式中，可以使用o-苯二甲酸、m-苯二甲酸以及p-苯二甲酸的混合物。單獨(dú)使用對水溶解性高的o-苯二甲酸最好。使用苯二甲酸鹽情況也與苯二甲酸情況一樣，可以使用o-苯二甲酸、m-苯二甲酸以及p-苯二甲酸的鹽的混合物。單獨(dú)使用對水溶解性高的o-苯二甲酸鹽最好。
另外在本實(shí)施方式的免疫反應(yīng)測定方法中，根據(jù)其用途等在獲得上述效果的范圍內(nèi)可以添加該領(lǐng)域中眾所周知的其他任意成分。例如在適用于散射測濁法、比濁法、玻片凝集法等均一體系的免疫反應(yīng)測定法的場合，可以向本發(fā)明的免疫反應(yīng)測定方法的反應(yīng)體系中添加聚乙二醇(PEG)。從非特異凝集少、測定靈敏度高的觀點(diǎn)出發(fā)，在本實(shí)施方式中相對于上述的反應(yīng)體系，優(yōu)選聚乙二醇含量為2～6重量％濃度，更優(yōu)選4重量％濃度。
另外為了減少由于抗原或抗體自身凝集引起的非特異渾濁，可以向本實(shí)施方式的反應(yīng)體系中加入Tween 20、辛基糖苷、十二烷基硫酸鈉(SDS)、蔗糖單月桂酸鹽、CHAPS等表面活性劑。其含量從減少抗原抗體反應(yīng)阻礙的觀點(diǎn)出發(fā)，在本實(shí)施方式中，相對于反應(yīng)體系優(yōu)選在0.3％(w/v)以下，更優(yōu)選0.1％(w/v)以下。
在本實(shí)施方式的免疫反應(yīng)測定方法的工序St2中，適用于測定反應(yīng)體系的光學(xué)特性的測定方法沒有特別限定。特別是使用會引起區(qū)帶現(xiàn)象的散射測濁法、比濁法、玻片凝集法等均一體系的免疫測定方法，預(yù)料可以獲得更好效果。另外適用于通過自動(dòng)測定儀器進(jìn)行測定已經(jīng)普及的散射測濁法或比濁法的場合，由于可以削減或簡化在區(qū)帶現(xiàn)象判定中需要的工序，所以特別理想。
在本實(shí)施方式的免疫反應(yīng)測定方法中，抗原-抗體復(fù)合物優(yōu)選是凝集復(fù)合物。另外在工序B中，優(yōu)選是通過對起因于凝集復(fù)合物的光學(xué)上的變化量進(jìn)行測定可以對上述凝集復(fù)合物進(jìn)行檢測，更優(yōu)選光學(xué)上的變化量為散射光強(qiáng)度或光透過量的變化量。
本實(shí)施方式的免疫反應(yīng)測定方法，其代表性的作法可以通過以下方式進(jìn)行。將苯二甲酸或苯二甲酸鹽加入到含有緩沖劑的緩沖液中，最終使反應(yīng)體系的pH保持在酸性，pH保持在4.5～5.5比較好，pH保持在4.5更好。此時(shí)加入的苯二甲酸或苯二甲酸鹽的濃度，使抗原抗體反應(yīng)時(shí)的濃度變?yōu)?.2M以下，優(yōu)選0.1M以下，特別優(yōu)選0.1M的濃度。苯二甲酸或苯二甲酸鹽也可以充當(dāng)緩沖劑。通過依次向上述緩沖液中添加要測定的被測定物質(zhì)的含量的樣品(檢體)和含有特異結(jié)合物質(zhì)的溶液并進(jìn)行混合構(gòu)建反應(yīng)體系，以樣品作為基準(zhǔn)測定反應(yīng)體系的光學(xué)上的變化量。
而添加苯二甲酸或苯二甲酸鹽的方法、為了將反應(yīng)體系保持在酸性而添加緩沖劑的方法、以及調(diào)整反應(yīng)體系的pH的方法并不限定于上述作法。例如為了滿足上述必要的條件，首先可以在含有特異結(jié)合物質(zhì)的溶液中混合苯二甲酸或苯二甲酸鹽，然后再混合緩沖劑。
以下就本實(shí)施方式的免疫反應(yīng)測定方法中使用的免疫反應(yīng)測定用試劑盒進(jìn)行說明。
本實(shí)施方式的免疫反應(yīng)測定用試劑盒制備成含有與被測定物質(zhì)特異結(jié)合的特異結(jié)合物質(zhì)；苯二甲酸或苯二甲酸鹽；用于將含有被測定物質(zhì)、特異結(jié)合物質(zhì)以及苯二甲酸或苯二甲酸鹽的反應(yīng)體系的pH設(shè)定在7以下的緩沖劑。被測定物質(zhì)和上述特異結(jié)合物質(zhì)的組合是抗原和抗體的組合。
通過將本實(shí)施方式的免疫反應(yīng)測定用試劑盒添加到要對被測定物質(zhì)的含量進(jìn)行測定的樣品中，在圖1所示的工序St1中可以構(gòu)建含有要對被測定物質(zhì)的含量進(jìn)行測定的樣品、與被測定物質(zhì)特異結(jié)合的特異結(jié)合物質(zhì)和苯二甲酸或苯二甲酸鹽的反應(yīng)體系。當(dāng)樣品中含有被測定物質(zhì)時(shí)，通過被測定物質(zhì)和特異結(jié)合物質(zhì)之間的抗原抗體反應(yīng)會生成凝集復(fù)合物。當(dāng)樣品中不含有被測定物質(zhì)時(shí)，就不會通過被測定物質(zhì)和特異結(jié)合物質(zhì)之間的抗原抗體反應(yīng)生成凝集復(fù)合物。
因此通過使用本實(shí)施方式的免疫反應(yīng)測定用試劑盒實(shí)施圖1所示的各個(gè)工序，可以使由于抗原抗體反應(yīng)生成的凝集復(fù)合物引起的反應(yīng)體系的光學(xué)特性的測定值提高。就是說，通過使用本實(shí)施方式的免疫反應(yīng)測定用試劑盒可以以高測定靈敏度測定被測定物質(zhì)的量。另外由于本發(fā)明中使用的苯二甲酸或苯二甲酸鹽是低分子物質(zhì)，不會使反應(yīng)體系的粘性增大，其測定操作上的處理變得容易。
另外，存在的抗原與抗體相比過量時(shí)產(chǎn)生的區(qū)帶現(xiàn)象也可以緩和。由于區(qū)帶現(xiàn)象被緩和，在被測定物質(zhì)的高濃度下的測定值的下降被減少。因此可以使能夠正確測定被測定物質(zhì)的含量的測定濃度范圍擴(kuò)展。
這里的本實(shí)施方式的免疫反應(yīng)測定用試劑盒可以既含有苯二甲酸的同時(shí)也可以含有苯二甲酸鹽。而苯二甲酸或苯二甲酸鹽可以賦予反應(yīng)體系緩沖能力，上述工序St1的反應(yīng)體系的pH優(yōu)選調(diào)節(jié)為低于7。即，優(yōu)選苯二甲酸或苯二甲酸鹽也起著緩沖劑的作用。
另外，本實(shí)施方式的免疫反應(yīng)測定用試劑盒也可以含有別的緩沖劑。這樣的緩沖劑可以是該領(lǐng)域中眾所周知的緩沖劑。例如可以舉出由磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉構(gòu)成的磷酸系緩沖劑、乙酸鈉、二甲胂酸鈉、2-(N-嗎啉代)乙磺酸、琥珀酸等。此時(shí)緩沖劑的量可以根據(jù)使用的緩沖劑的種類、含有被測定對象物的樣品(檢體)的量、以及針對反應(yīng)體系中作為被測定物質(zhì)的抗原或抗體的抗體或抗原的供給方法等適當(dāng)調(diào)整。
另外本實(shí)施方式的免疫反應(yīng)測定用試劑盒，在工序ST1中反應(yīng)體系的pH調(diào)整在4.5～5.5范圍比較好，調(diào)整在4.5～5.3范圍更好，最好是調(diào)整在4.5～5.0范圍。在上述pH范圍內(nèi)，上述的測定值提高效果變好，另外區(qū)帶現(xiàn)象的緩和效果也變好。特別是反應(yīng)體系的pH大致調(diào)整在4.5是最理想的。
本實(shí)施方式的免疫反應(yīng)測定用試劑盒，在工序St1的反應(yīng)體系中的苯二甲酸或苯二甲酸鹽濃度最好調(diào)整是在0.2M以下。這樣一來，上述的測定值提高效果變得更好，另外區(qū)帶現(xiàn)象的緩和效果也變得更好。為了進(jìn)一步提高這些效果，反應(yīng)體系的苯二甲酸或苯二甲酸鹽濃度調(diào)整在0.1M以下更好，特別是為了使上述效果顯著提高，將反應(yīng)體系的苯二甲酸或苯二甲酸鹽濃度最好調(diào)整在0.1M。
作為本實(shí)施方式的免疫反應(yīng)測定用試劑盒中含有的苯二甲酸或苯二甲酸鹽，可以舉出苯二甲酸、苯二甲酸酐、苯二甲酸氫鉀、苯二甲酸鉀、苯二甲酸二鈉、苯二甲酸銨、苯二甲酸銅(II)等。這些試劑都有銷售，容易獲得。這些試劑可以單獨(dú)或搭配起來用。其中作為本實(shí)施方式的免疫反應(yīng)測定方法以及免疫反應(yīng)測定用試劑盒中使用的苯二甲酸鹽，從對水的溶解性高、且溶解時(shí)的水溶液的pH在4.0附近的觀點(diǎn)出發(fā)，特別優(yōu)選苯二甲酸氫鉀。
而苯二甲酸存在著o-苯二甲酸、m-苯二甲酸以及p-苯二甲酸(對苯二甲酸)異構(gòu)體。在本實(shí)施方式中，可以使用o-苯二甲酸、m-苯二甲酸以及p-苯二甲酸的混合物。單獨(dú)使用對水溶解性高的o-苯二甲酸最好。而使用苯二甲酸鹽情況也與苯二甲酸情況一樣，可以使用o-苯二甲酸、m-苯二甲酸以及p-苯二甲酸的鹽的混合物。單獨(dú)使用對水溶解性高的o-苯二甲酸的鹽最好。
另外在本實(shí)施方式的免疫反應(yīng)測定用試劑盒中，根據(jù)其用途等在獲得上述效果的范圍內(nèi)可以添加該領(lǐng)域中眾所周知的其他任意成分。例如在適用于散射測濁法、比濁法、玻片凝集法等均一體系的免疫反應(yīng)測定法的場合，可以向本實(shí)施方式的免疫反應(yīng)測定用試劑盒中添加聚乙二醇(PEG)。添加的量從非特異凝集少、測定靈敏度高的觀點(diǎn)出發(fā)，在本實(shí)施方式中，上述的反應(yīng)體系中聚乙二醇含量終濃度為2～6重量％濃度的量比較好，為4重量％濃度更好。
另外為了降低由于抗原或抗體自身凝集引起的非特異渾濁，可以向本實(shí)施方式的免疫反應(yīng)測定用試劑盒中加入Tween 20、辛基糖苷、十二烷基硫酸鈉(SDS)、蔗糖單月桂酸鹽、CHAPS等表面活性劑。而在本實(shí)施方式的免疫反應(yīng)測定用試劑盒中其含量從減少抗原抗體反應(yīng)阻礙觀點(diǎn)出發(fā)，在反應(yīng)體系的0.3％(w/v)以下比較好，0.1％(w/v)以下更好。
適用于本實(shí)施方式的免疫反應(yīng)測定測定用試劑盒的測定體系沒有特別限定。特別是使用可以引起區(qū)帶現(xiàn)象的散射測濁法、比濁法、玻片凝集法等均一體系的免疫測定方法，預(yù)料可以獲得更好效果。另外適用于通過自動(dòng)測定儀器進(jìn)行測定已經(jīng)普及的散射測濁法或比濁法的場合，由于可以削減或簡化在區(qū)帶現(xiàn)象的判定中需要的工序，所以特別理想。
本實(shí)施方式的免疫反應(yīng)測定用試劑盒代表性制作方式如下。
象下面那樣分別制備含有與被測定物質(zhì)(這里指的是抗原)特異結(jié)合的特異結(jié)合物質(zhì)(這里指的是抗體)的溶液以及含有苯二甲酸或苯二甲酸鹽的溶液。
含有苯二甲酸或苯二甲酸鹽的溶液使用緩沖劑制備，使反應(yīng)體系的pH保持為低于7。將溶液的pH調(diào)整在4.5～5.5比較好，調(diào)整在4.5～5.3更好，而調(diào)整到4.5～5.0特別好。反應(yīng)體系的pH調(diào)整到4.5最好。而為了使苯二甲酸或苯二甲酸鹽的濃度在反應(yīng)體系中的濃度在0.2M以下、0.1M以下比較好、最好大致在0.1M的濃度，調(diào)整苯二甲酸或苯二甲酸鹽以及緩沖劑的量，通過將他們?nèi)芙庥诩兯衼碇苽浜斜蕉姿峄虮蕉姿猁}的溶液。
只要滿足上述必要條件，也可以將緩沖劑、苯二甲酸或苯二甲酸鹽一個(gè)一個(gè)地分別溶解于溶液中來制備。另外只要是滿足上述pH范圍，即使不添加緩沖劑，苯二甲酸或苯二甲酸鹽兼任緩沖劑的溶液也可以。
含有特異結(jié)合物質(zhì)的溶液與上述含有苯二甲酸或苯二甲酸鹽的溶液混合時(shí)，只要是反應(yīng)體系滿足上述必要條件，可以是任意組成。
另外，也可以將特異結(jié)合物質(zhì)與上述苯二甲酸或上述苯二甲酸鹽預(yù)先混合。此時(shí)為了滿足上述所示的必要條件，可以用制備的含有苯二甲酸或苯二甲酸鹽的溶液通過對含有特異結(jié)合物質(zhì)的溶液進(jìn)行透析或凝膠過濾，對低分子成分進(jìn)行置換。
作為本實(shí)施方式的免疫反應(yīng)測定方法以及免疫反應(yīng)測定用試劑盒的被測定物質(zhì)的抗原或抗體沒有特別限定，一般來說只要是利用抗原抗體反應(yīng)可以測定的物質(zhì)無論什么樣物質(zhì)都可以。例如蛋白質(zhì)、核酸、脂類、細(xì)菌、病毒以及半抗原等。其中由于蛋白質(zhì)是利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行臨床檢查中的主要測定對象，所以被測定物質(zhì)是蛋白質(zhì)時(shí)，本實(shí)施方式的免疫反應(yīng)測定方法以及免疫反應(yīng)測定用試劑盒非常適用。作為蛋白質(zhì)例如可以是LH(促黃體素)、FSH(促卵胞素)、hCG(人絨毛膜促性激素)等激素，以及各種免疫球蛋白類和亞類、補(bǔ)體成分、各種傳染病的標(biāo)志物、CRP、白蛋白、類風(fēng)濕因子、血型抗原等。其中作為被測定物質(zhì)要測定人白蛋白和人C反應(yīng)性蛋白質(zhì)(以下略稱為人CRP)時(shí)，利用本實(shí)施方式的免疫反應(yīng)測定方法以及免疫反應(yīng)測定用試劑盒特別合適。
苯二甲酸或上述苯二甲酸鹽具有螯合作用，具有有效爭奪存在于反應(yīng)體系中的Ca2+或Fe3+等二價(jià)和三價(jià)金屬離子的性質(zhì)。因此當(dāng)抗原的內(nèi)部含有保持金屬離子的結(jié)構(gòu)時(shí)，與抗原特異結(jié)合的抗體優(yōu)選也能特異結(jié)合脫去金屬離子狀態(tài)下的抗原。這樣一來，抗原即使由于金屬離子脫離引起的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化的物質(zhì)，也可以進(jìn)行測定。
另外，當(dāng)抗原的內(nèi)部含有保持金屬離子的結(jié)構(gòu)，由于金屬離子的脫離引起抗原的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化時(shí)，將與抗原保持的金屬離子相同的金屬離子添加到反應(yīng)體系中，使得上述金屬離子存在于反應(yīng)體系中也可以。通過這樣操作，反應(yīng)體系內(nèi)由于金屬離子脫離引起的抗原的分子結(jié)構(gòu)變化被抑制，抗體可與抗原結(jié)合，可以進(jìn)行測定。
此時(shí)添加的金屬離子的量可以根據(jù)使用的苯二甲酸或苯二甲酸鹽的螯合能力、其濃度、抗原具有的金屬離子的保持能力等進(jìn)行設(shè)定。
作為具有可保持金屬離子的分子結(jié)構(gòu)的抗原如CRP。CRP不會由于有無Ca2+而發(fā)生結(jié)構(gòu)變化。因此，例如在本實(shí)施方式的免疫反應(yīng)測定方法以及免疫反應(yīng)測定用試劑盒中使用的抗原是CRP，作為抗體使用含有與未帶有Ca2+的人CRP不結(jié)合的抗體的山羊抗人CRP多克隆抗體，以及作為苯二甲酸或苯二甲酸鹽使用苯二甲酸時(shí)，對于0.02M苯二甲酸，向反應(yīng)體系中添加0.02M的Ca2+比較好。
另外當(dāng)抗原是對至少一種抗體具有多個(gè)結(jié)合部位的物質(zhì)時(shí)，抗體是與抗原多個(gè)結(jié)合部位結(jié)合的單克隆抗體比較好。單克隆抗體可以通過雜交瘤細(xì)胞株產(chǎn)生。雜交瘤細(xì)胞株是從通過對產(chǎn)生抗體的B細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞(myeloma細(xì)胞)進(jìn)行細(xì)胞融合得到的具有產(chǎn)生抗體能力和很強(qiáng)的增殖能力的融合細(xì)胞團(tuán)中分離出的唯一的細(xì)胞，通過使其增殖確立的。因此產(chǎn)生的抗體的性狀都相同。另外雜交瘤細(xì)胞株增殖能力強(qiáng)，由于可冷凍保存，只要進(jìn)行適當(dāng)管理，可以無限期地使用，將雜交瘤細(xì)胞株在培養(yǎng)液或腹腔中進(jìn)行培養(yǎng)，通過純化可以不斷地得到性狀永遠(yuǎn)相同的抗體。
另外，多克隆抗體是通過將抗原注入到動(dòng)物體，使血液中大量出現(xiàn)與抗原結(jié)合的抗體，採集全部血液或一部分，通過純化得到。因此其性質(zhì)與動(dòng)物的個(gè)體差異、生育環(huán)境、狀態(tài)等有關(guān)。因此連續(xù)得到同一性狀的抗體很困難。
就是說，通過使用單克隆抗體，經(jīng)常使用性狀相同的抗體成為可能，可以穩(wěn)定供給作為試劑的抗體。其結(jié)果可以預(yù)料能夠使利用本實(shí)施方式的免疫反應(yīng)測定方法以及免疫反應(yīng)測定用試劑盒進(jìn)行的免疫反應(yīng)測定結(jié)果穩(wěn)定。
本實(shí)施方式的免疫反應(yīng)測定方法以及免疫反應(yīng)測定用試劑盒中使用的抗體沒有特別限定，只要是與抗原特異結(jié)合的，可以是IgG、IgM、IgE、IgA、IgD中的任一類抗體。其中IgG抗體最好。這是由于IgG抗體具有難于產(chǎn)生非特異反應(yīng)的性質(zhì)，另外由于銷售的產(chǎn)品比較多、容易買到的緣故。另外抗體來自動(dòng)物的種類也沒有特別限定，但由于來自兔、山羊、小鼠的抗體比較容易獲得，使用的例子也比較多，所以比較好。
實(shí)施例以下對本發(fā)明的實(shí)施例進(jìn)行說明，但本發(fā)明并不限定于這些實(shí)施例。
(實(shí)施例1)以下給出了人白蛋白作為被測定物質(zhì)時(shí)的免疫反應(yīng)測定用試劑盒的構(gòu)成方法。在本實(shí)施例中對由可在基于玻片凝集法、比濁法以及散射測濁法測定中使用的抗體溶液以及含有苯二甲酸或苯二甲酸鹽的緩沖液構(gòu)成的免疫反應(yīng)測定用試劑盒的制作方法進(jìn)行敘述。
在制備以下所示的緩沖液等時(shí)，使用了用Milli-Q SP TOC(Millipore制作)過濾的純水。另外以下沒有特別記載的鹽、緩沖劑等試劑都是和光純藥工業(yè)制造的產(chǎn)品，使用的聚乙二醇6,000，trans-烏頭酸是1級試劑，其他試劑都是特級試劑。
首先制備抗體溶液。兔抗人白蛋白(和光純藥工業(yè)制造)多克隆抗體從，是從免疫人白蛋白的兔採集的抗血清中使用蛋白A柱層析進(jìn)行純化。填充在柱中的蛋白A固定化凝膠使用Amersham Pharmacia生產(chǎn)的膠。純化使用的平衡緩沖液的組成為1.5M甘氨酸、3.0M NaCl、pH8.9，洗脫緩沖液組成為0.1M檸檬酸、pH4.0。
向下述那樣進(jìn)行純化。使容量為填充到柱子的凝膠容量的5倍的平衡緩沖液流過柱子，對柱子進(jìn)行平衡后，用平衡緩沖液將柱子全結(jié)合容量的10～20％的含有抗體的抗血清稀釋2倍后流過柱子，使血清中抗體結(jié)合到蛋白A上。然后使平衡緩沖液流過柱子使沒有吸附在蛋白A的血清成分從柱子上洗出，直洗至沒有這些成分。然后使洗脫緩沖液流過柱子，將結(jié)合于蛋白A上的抗體洗脫出來。將洗脫下來的抗體級分裝入分級分子量1萬的透析袋中，用組成為約100倍容量的0.05M 3-(嗎啉代)丙磺酸(Dojin生產(chǎn)，以下略稱為MOPS)、0.15M NaCl、0.04重量％NaN3、pH7.4的緩沖液透析數(shù)次，置換緩沖液成分。然后通過測定280nm的吸光度推定抗體濃度，使用與透析用緩沖液相同的緩沖液將抗體濃度調(diào)到3.0mg/ml，將該溶液作為抗體溶液。而抗體濃度并沒有特別限定。制作的抗體溶液可以保存在室溫下，但要防止抗體變性，最好是保存在低溫下，保存在4℃下更好。
含有苯二甲酸或苯二甲酸鹽的緩沖液的制備方法如下。而作為苯二甲酸或苯二甲酸鹽使用苯二甲酸以及苯二甲酸氫鉀，各自構(gòu)成由各個(gè)物質(zhì)組成的緩沖液。
使用苯二甲酸氫鉀的緩沖液的構(gòu)成方法如下。按照最終濃度計(jì)量，苯二甲酸氫鉀為0.05M、聚乙二醇6,000為4重量％，將他們?nèi)芙庥诩s90％制備目的體積的純水中。然后添加NaOH水溶液，將pH調(diào)整到4.5，用純水將體積調(diào)整到制備目的體積。制備的緩沖液保存在室溫下。
使用苯二甲酸的緩沖液的構(gòu)成方法如下。按照最終濃度計(jì)量，苯二甲酸為0.03M、聚乙二醇6,000為4重量％，將他們?nèi)芙庥诩s90％制備目的體積的純水中。然后添加NaOH水溶液，將pH調(diào)整到4.5，用純水將體積調(diào)整到制備目的體積。制備的緩沖液保存在室溫下。
通過使至少有一種象上述那樣構(gòu)成的含有苯二甲酸或苯二甲酸鹽的緩沖液與抗體溶液搭配，可以構(gòu)成免疫測定用試劑盒。
(實(shí)施例2)以下給出了以人CRP為被測定物質(zhì)時(shí)的免疫測定用試劑盒的構(gòu)成方法。由于CRP具有由具有同一結(jié)構(gòu)的5個(gè)亞基構(gòu)成的結(jié)構(gòu)，所以是相對于一種抗體具有多個(gè)結(jié)合部位的物質(zhì)。因此，即使使用一種抗CRP的單克隆抗體也可以制作均一系統(tǒng)的免疫反應(yīng)測定中使用的免疫測定用試劑盒。單克隆抗體的種類在2種以上也可以。
因此在本實(shí)施例中，制作由各自使用多克隆抗體溶液和單克隆抗體溶液的2種抗體溶液和含有苯二甲酸或苯二甲酸鹽的緩沖液構(gòu)成的免疫反應(yīng)測定用試劑盒。
首先給出多克隆抗體溶液的制備方法。
使用蛋白G柱層析從免疫過人CRP的山羊採集的抗血清中純化山羊抗人CRP多克隆抗體。填充在柱中的蛋白G固定化凝膠使用AmershamPharmacia生產(chǎn)的凝膠。純化使用的平衡緩沖液的組成為0.02MNa2HPO4-NaH2PO4、pH7.0，洗脫緩沖液組成為0.1M甘氨酸、pH2.7。有關(guān)利用柱層析的純化方法、通過透析置換緩沖液的方法與實(shí)施例1使用的方法一樣。然后通過測定280nm的吸光度推定抗體濃度，使用與透析用緩沖液相同的緩沖液將抗體濃度調(diào)到1.0mg/ml，將該溶液作為多克隆抗體溶液。
人CRP由于是否帶有Ca2+會發(fā)生結(jié)構(gòu)變化。因此構(gòu)成免疫反應(yīng)測定用試劑盒的抗體溶液中含有對未帶有Ca2+的人CRP不結(jié)合的抗體時(shí)，由于苯二甲酸或苯二甲酸鹽的螯合作用，未帶有Ca2+的人CRP增加，出現(xiàn)抗原抗體反應(yīng)的反應(yīng)率低下的可能性是存在的。最近，對多克隆抗體溶液進(jìn)行了制備，但在多克隆抗體溶液中含有對未帶有Ca2+的人CRP不結(jié)合的抗體。所以在以下所示的含有苯二甲酸或苯二甲酸鹽的緩沖液的制備中為了保持人CRP的結(jié)構(gòu)，在緩沖液中添加了Ca2+。
具體來說，含有苯二甲酸或苯二甲酸鹽的緩沖液的制備如下。而作為苯二甲酸或苯二甲酸鹽在本實(shí)施例中使用苯二甲酸。
按照最終濃度計(jì)量，苯二甲酸為0.02M、CaCl2為0.02M、聚乙二醇6,000為4重量％，將他們?nèi)芙庥诩s90％制備目的體積的純水中。然后添加NaOH水溶液，將pH調(diào)整到4.5，用純水將體積調(diào)整到制備目的體積。將得到的緩沖液保存在室溫下。
以下給出單克隆抗體溶液的制備方法。
作為單克隆抗體使用即使通過向反應(yīng)體系添加螯合劑(例如0.02M的苯二甲酸或乙二胺四乙酸等)也沒有喪失對人CRP的結(jié)合能力、即與沒帶有Ca2+的人CRP也能特異結(jié)合的抗體。具體來說，可以象如下所述那樣制備單克隆抗體溶液。
本實(shí)施例中使用的小鼠抗人CRP單克隆抗體按照下述操作可以得到。首先將產(chǎn)生小鼠抗人CRP單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞(工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所受托編號FERM BP-6620號)注入小鼠腹腔內(nèi)，通過使其增殖得到腹水。通過使用與實(shí)施例1同樣的柱層析法從得到的腹水中進(jìn)行純化，得到小鼠抗人CRP單克隆抗體樣品。
具體來說，腹水可以象下述那樣得到。為了產(chǎn)生腹水，使用進(jìn)行了retire的雌性BALB/c小鼠。向小鼠腹腔內(nèi)注入0.5～1ml的降植烷，約7天后注入下述細(xì)胞懸浮液0.5～1ml后，依次從有腹水產(chǎn)生的小鼠採集腹水。這里向腹腔內(nèi)注入的雜交瘤細(xì)胞懸浮液是通過使用RPMI1640培養(yǎng)基(SIGMA生產(chǎn))中混合了5～15體積％的胎牛血清的培養(yǎng)基的培養(yǎng)使雜交瘤細(xì)胞增殖，增殖的細(xì)胞用RPMI1640培養(yǎng)基經(jīng)離心清洗，再懸浮于RPMI1640培養(yǎng)基(使其濃度為1×106～107cells/ml)得到的。
接下來將利用柱層析完成純化的小鼠抗人CRP單克隆抗體樣品裝入分級分子量1萬的透析袋中用約100倍容量的含有0.04重量％NaN3的PBS緩沖液(8g/L NaCl、0.2g/L KCl、1.15g/L Na2HPO4·12H2O、0.2g/L KH2PO4、pH7.4)透析數(shù)次，置換緩沖液成分。然后通過測定280nm的吸光度推定抗體濃度，使用與透析用緩沖液相同的緩沖液將抗體濃度調(diào)到1.0mg/ml，將該溶液作為單克隆抗體溶液。
含有苯二甲酸或苯二甲酸鹽的緩沖液的制備如下。在苯二甲酸或苯二甲酸鹽中使用苯二甲酸氫鉀構(gòu)成緩沖液。而在本實(shí)施例的單克隆抗體溶液因?yàn)椴皇苡捎谌薈RP中有無Ca2+引起的結(jié)構(gòu)變化的影響，所以緩沖液中沒有添加Ca2+。
含有苯二甲酸或苯二甲酸鹽的緩沖液的構(gòu)成方法如下。按照最終濃度計(jì)量，苯二甲酸氫鉀為0.05M、聚乙二醇6,000為4重量％，將他們?nèi)芙庥诩s90％制備目的體積的純水中。然后向得到的溶液中添加NaOH水溶液，將pH調(diào)整到4.5，用純水將體積調(diào)整到制備目的體積。將得到的緩沖液保存在室溫下。
上述那樣制備的各個(gè)抗體溶液的濃度并沒有限定于這些濃度。制作的抗體溶液可以保存在室溫下，但要防止抗體變性，最好是保存在低溫下，保存在4℃下更好。
通過將上述那樣構(gòu)成的含有苯二甲酸或苯二甲酸鹽的緩沖液與抗體溶液組合可以構(gòu)成免疫測定用試劑盒。
在實(shí)施例1和2構(gòu)成的試劑的使用方法，為構(gòu)建反應(yīng)體系可以將含有抗原的樣品(檢材)、抗體溶液、含有苯二甲酸或苯二甲酸鹽的緩沖液混合之后使用?；旌戏椒梢允褂萌我夥椒??；旌系谋嚷士梢愿鶕?jù)需要的抗原濃度的測定范圍決定。在通過混合構(gòu)建的反應(yīng)體系中會發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，生成凝集復(fù)合物。通過測定散射光強(qiáng)度的變化量可以估計(jì)由于凝集復(fù)合物引起的渾濁程度，根據(jù)該結(jié)果可以知道檢測樣品中的抗原濃度。
由于混合，緩沖劑、苯二甲酸或苯二甲酸鹽、聚乙二醇6,000等添加劑的濃度與初期濃度相比變稀了，但稀釋后的濃度與初期濃度的差在大致10％左右，所以得到的結(jié)果與由初期濃度預(yù)料的測定結(jié)果沒有太大差別，沒有受到多大的影響。而為了避免由于稀釋引起的濃度變化，混合時(shí)試劑中的各個(gè)物質(zhì)的濃度都按照目的濃度添加就可以制備抗體溶液和含有苯二甲酸或苯二甲酸鹽的緩沖液。
另外雖然在實(shí)施例1和2中沒有給出，但可以將抗體固定于膠乳、金膠體、磁微粒子等微粒子載體上，還可以對抗體進(jìn)行酶、色素、熒光物質(zhì)、發(fā)光物質(zhì)等標(biāo)記。
抗體溶液制備中使用的緩沖劑以及抗體溶液的pH并不限定于上述組成和pH。例如，在構(gòu)成一液系的試劑時(shí)，可以使抗體溶液含有苯二甲酸或苯二甲酸鹽。因此為了將反應(yīng)體系的pH維持在低于7，可以用含有苯二甲酸或苯二甲酸鹽的酸性緩沖液進(jìn)行透析。
在實(shí)施例1和2中pH調(diào)節(jié)使用了NaOH，也可以使KOH、LiOH、NH4OH、Ca(OH)2、Mg(OH)2等氫氧化物。
實(shí)施例1和2在制備含有苯二甲酸或苯二甲酸鹽的緩沖液時(shí)使用了苯二甲酸氫鉀和苯二甲酸，也可以使用其他苯二甲酸或苯二甲酸鹽，例如苯二甲酸酐、或苯二甲酸鉀、苯二甲酸鈉、苯二甲酸銨、苯二甲酸銅(II)等中的任一種。也可以將他們搭配起來用，此時(shí)pH的調(diào)節(jié)，如果溶解于純水時(shí)的pH處于比調(diào)節(jié)目的pH高的堿性區(qū)時(shí)，使用HCl等，如果處于比調(diào)整目的pH低的酸性區(qū)時(shí)，使用上述的氫氧化物等。另外也可以對上述列舉的苯二甲酸或苯二甲酸鹽的混合比進(jìn)行調(diào)整。
另外，在實(shí)施例1和2中給出了含有苯二甲酸或苯二甲酸鹽的緩沖液的主要緩沖能力是由苯二甲酸或苯二甲酸鹽賦予時(shí)的制備方法。然而，添加到緩沖液中的苯二甲酸或苯二甲酸鹽的濃度并沒有特別限定。另外含有苯二甲酸或苯二甲酸鹽的緩沖液的主要緩沖能力也可以由其他緩沖劑賦予，也可以使苯二甲酸或苯二甲酸鹽與其他的緩沖劑協(xié)調(diào)賦予緩沖能力。
(實(shí)施例3)在本實(shí)施例中對在基于本發(fā)明的含有苯二甲酸或苯二甲酸鹽的酸性反應(yīng)體系中的抗原測定的效果與在免疫反應(yīng)測定方法中一般使用的中性反應(yīng)體系的抗原測定進(jìn)行了對比。對比是通過散射測濁法測定人白蛋白進(jìn)行的。用于構(gòu)成含有苯二甲酸或苯二甲酸鹽的酸性反應(yīng)體系的試劑使用實(shí)施例1中構(gòu)成的試劑。
以下將實(shí)施例1中制作的使用苯二甲酸氫鉀的緩沖液稱之為苯二甲酸氫鉀緩沖液，而使用苯二甲酸的緩沖液稱之為苯二甲酸緩沖液。
而作為比較例在用于構(gòu)成中性反應(yīng)體系的緩沖液的構(gòu)成中使用MOPS，準(zhǔn)備0.05M MOPS、4重量％聚乙二醇6,000、pH7.4組成的緩沖液和0.03M MOPS、4重量％聚乙二醇6,000、pH7.4組成的緩沖液。以下，分別稱之為0.05M MOPS緩沖液和0.03M MOPS緩沖液。各個(gè)緩沖液都保存在室溫下。
使用用作抗原的人白蛋白(和光純藥工業(yè)制造)和0.05M MOPS、0.04重量％NaN3、pH7.4組成的緩沖液，制作人白蛋白濃度分別為0、5、10、20、30、50、70、100、200、300、500mg/dl的白蛋白溶液。人白蛋白溶液在使用之前保存在4℃下。
測定時(shí)使用分光熒光光度計(jì)(島津制作所制造，型號RF-5300PC)。分光熒光光度計(jì)的樣品室中配置與恒溫水槽(TAITEC制作，商品名COOLNIT BATH EL-15)連接的恒溫池架(島津制作所制作，型號206-15440)，使溫度保持在25℃的水在恒溫水槽內(nèi)循環(huán)，測定時(shí)要將石英杯內(nèi)的溫度保持一定。分光熒光光度計(jì)的測定條件設(shè)定為激發(fā)、熒光波長都是670nm，熒光、激發(fā)兩者帶幅都為3nm，靈敏度設(shè)定在高靈敏度。
測定如下。向2.87ml的各個(gè)緩沖液中添加0.1ml的實(shí)施例1制備的抗體溶液后，攪拌混合，然后再向各個(gè)混合液中分別加入各個(gè)濃度的人白蛋白溶液0.03ml，攪拌混合。反應(yīng)體系中的兔抗人白蛋白多克隆抗體約為0.10mg/ml、人白蛋白濃度為測定時(shí)使用的人白蛋白溶液濃度乘以0.01后的濃度。將他們移到熒光分析用的石英杯中，設(shè)置在分光熒光光度計(jì)上，將T型熱電偶(從RSコンポ-ネンツ獲得，型號219-4696)浸漬到石英杯內(nèi)，在混合白蛋白后2分鐘開始的時(shí)間過程測定中，每隔0.04秒測定一次，測定300秒。測定中的石英杯內(nèi)的溫度通過將T型熱電偶與數(shù)字多級監(jiān)測器(ァドバンテスト制造，型號TR2114)連接進(jìn)行監(jiān)測。為了排除石英杯的污染對測定的影響，在各反應(yīng)的測定前將純水加入杯內(nèi)，用測定的值進(jìn)行修正。求出通過測定得到的200～300秒之間的各個(gè)測定值的平均值，把這些值作為對應(yīng)于各個(gè)濃度的人白蛋白溶液的測定值。為了了解各個(gè)緩沖液、抗體溶液、各個(gè)濃度的人白蛋白溶液由于混合對反應(yīng)體系的pH的影響，測定結(jié)束后用pH計(jì)對反應(yīng)體系的混合液的pH進(jìn)行測定。
以下敘述測定結(jié)果。由各個(gè)測定中使用的各個(gè)緩沖液、抗體溶液、各濃度的人白蛋白溶液構(gòu)成的反應(yīng)體系的混合液的pH大致與緩沖液的pH相同。而通過熱電偶測定得到的各個(gè)測定中的杯內(nèi)溫度保持在25.5±1℃。
圖4中的曲線表示對于由0.05M苯二甲酸氫鉀緩沖液構(gòu)成的反應(yīng)體系和由0.05MMOPS緩沖液構(gòu)成的反應(yīng)體系分別加入直至500mg/dl的各個(gè)人白蛋白溶液之后進(jìn)行測定的結(jié)果?？v軸表示散射光強(qiáng)度，橫軸表示測定中使用的人白蛋白溶液的濃度。散射光強(qiáng)度越大，反應(yīng)體系的渾濁程度(濁度)越高，表明由于抗原抗體反應(yīng)形成很多凝集復(fù)合物。而曲線中的各個(gè)值是由就各個(gè)緩沖液得到的各個(gè)濃度的人白蛋白溶液的測定值減去人白蛋白濃度為0mg/dl時(shí)的測定值得到的結(jié)果。
就象圖4所示那樣，與使用0.05MMOPS緩沖液進(jìn)行測定時(shí)相比，很顯然使用0.05M苯二甲酸氫鉀緩沖液測定時(shí)給出了高的測定值。而使用0.05MMOPS緩沖液時(shí)，在50mg/dl附近出現(xiàn)測定值峰值，隨著人白蛋白濃度變高由于區(qū)帶現(xiàn)象使測定值大大減少。然而，使用0.05M苯二甲酸氫鉀緩沖液時(shí)，在70～100mg/dl附近具有測定值的峰，即使人白蛋白濃度增高，由于區(qū)帶現(xiàn)象引起的測定值的減少也被抑制了。
圖5中的曲線表示對于使用0.03M苯二甲酸緩沖液的反應(yīng)體系和使用0.03MMOPS緩沖液的反應(yīng)體系分別加入直至500mg/dl的各個(gè)人白蛋白溶液之后進(jìn)行測定的結(jié)果。縱軸表示散射光強(qiáng)度，橫軸表示測定中使用的人白蛋白溶液的濃度。曲線中的各個(gè)值是由就各個(gè)緩沖液得到的各個(gè)濃度的人白蛋白溶液的測定值減去人白蛋白濃度為0mg/dl時(shí)的測定值得到的結(jié)果。
就象圖5所示那樣，與使用0.03MMOPS緩沖液進(jìn)行測定時(shí)相比，很顯然使用0.03M苯二甲酸緩沖液測定時(shí)給出了高的測定值。而使用0.03MMOPS緩沖液時(shí)，在50mg/dl附近出現(xiàn)測定值峰值，隨著人白蛋白濃度變高由于區(qū)帶現(xiàn)象使測定值大大減少。而使用0.03M苯二甲酸緩沖液時(shí)，在70～100mg/dl附近具有測定值的峰，即使人白蛋白濃度增高，由于區(qū)帶現(xiàn)象引起的測定值的減少也被抑制了。
就象以上結(jié)果表明的那樣，能夠確認(rèn)利用本發(fā)明的免疫反應(yīng)測定方法和免疫反應(yīng)測定用試劑盒比使用以往的免疫反應(yīng)測定方法和免疫反應(yīng)測定用試劑盒可以得到高的測定值。另外也可以確認(rèn)與使用以往的免疫反應(yīng)測定方法和免疫反應(yīng)測定用試劑盒相比可以使區(qū)帶現(xiàn)象緩和。
在臨床檢查中，作為糖尿病性腎病的早期診斷標(biāo)志，排泄到尿中的微量的人白蛋白成為測定對象，將0.1～20mg/dl范圍作為定量范圍的免疫反應(yīng)測定方法和免疫反應(yīng)測定用試劑盒很多(參照新·糖尿病性腎病預(yù)防發(fā)病和防止發(fā)展繁田幸雄、海津嘉藏編輯，第131頁(1992))。若通過源于散射測濁法的以往的測定方法和該方法中使用的試劑盒，為了緩和區(qū)帶現(xiàn)象，需要利用均一體系的免疫反應(yīng)是平衡反應(yīng)，通過增加作為反應(yīng)體系被構(gòu)建的中性緩沖液中的抗體濃度，或者通過中性緩沖液的稀釋等使抗原濃度降低來解決。
而如果使用本發(fā)明的免疫反應(yīng)測定方法和免疫反應(yīng)測定用試劑盒，抗體濃度低，而且在抗原濃度高時(shí)區(qū)帶現(xiàn)象也可以緩和。為此，例如將本實(shí)施例的測定結(jié)果作為基礎(chǔ)，通過設(shè)計(jì)將20mg/dl以上的測定值作為陽性值的判定區(qū)，在由0.05M苯二甲酸氫鉀緩沖液或0.03M苯二甲酸緩沖液構(gòu)成的反應(yīng)體系中將直至500mg/dl的很寬的范圍作為測定范圍是有可能的。然而，在比較例的中性緩沖液體系中其測定界限在120～130mg/dl左右。
就象以上所示那樣，利用本發(fā)明的免疫反應(yīng)測定方法和免疫反應(yīng)測定用試劑盒與以往的中性緩沖液體系中的測定相比，可以不考慮區(qū)帶現(xiàn)象的影響而測定更寬濃度范圍的人白蛋白。
(實(shí)施例4)以下給出了通過散射測濁法對使用苯二甲酸氫鉀作為苯二甲酸或苯二甲酸鹽的本發(fā)明的免疫反應(yīng)測定方法和免疫反應(yīng)測定用試劑盒測得的測定值對pH的依賴關(guān)系進(jìn)行研究的內(nèi)容。作為被測定物質(zhì)使用人白蛋白。人白蛋白溶液的制備用與實(shí)施例3同樣的方法進(jìn)行，準(zhǔn)備濃度分別為0、5、10、20、30、50、70、100、200、300、500mg/dl的白蛋白溶液。使用的抗體溶液與實(shí)施例1相同。
作為構(gòu)建用于研究測定值對pH依賴性的反應(yīng)體系的緩沖液，制備將含有0.05M苯二甲酸氫鉀以及4重量％聚乙二醇6,000的溶液的pH分別調(diào)整到4.0、4.5、5.0、5.5、6.0的0.05M苯二甲酸氫鉀緩沖液。
作為比較例，使用含有0.05M MOPS、4重量％聚乙二醇6,000的溶液的pH調(diào)整到7.4的0.05M MOPS緩沖液。儀器和測定法與實(shí)施例3相同。
就結(jié)果進(jìn)行敘述。由各個(gè)測定中使用的各個(gè)緩沖液、抗體溶液、各濃度的人白蛋白溶液構(gòu)成的反應(yīng)體系的混合液的pH與緩沖液的pH相同。另外測定中石英杯內(nèi)的溫度保持在25.5±1℃。
得到的結(jié)果如圖6所示。圖6中的曲線表示對于使用由各pH的0.05M苯二甲酸氫鉀緩沖液構(gòu)成的反應(yīng)體系分別加入直至500mg/dl的各個(gè)人白蛋白溶液之后進(jìn)行測定的結(jié)果?？v軸表示散射光強(qiáng)度，橫軸表示測定中使用的人白蛋白溶液的濃度。曲線中的各個(gè)值是由就各個(gè)緩沖液得到的各個(gè)濃度的人白蛋白溶液的測定值減去人白蛋白濃度為0mg/dl時(shí)的測定值得到的結(jié)果。曲線的評估與圖4一樣。
用pH4.5～5.5的0.05M苯二甲酸氫鉀緩沖液構(gòu)成反應(yīng)體系并進(jìn)行測定時(shí)，與作為比較例的用0.05M MOPS緩沖液構(gòu)成的反應(yīng)體系并測定的結(jié)果相比，測定值提高，另外可以看到隨著抗原濃度增高產(chǎn)生的區(qū)帶現(xiàn)象被緩和的效果。該效果在用pH4.5的0.05M苯二甲酸氫鉀緩沖液構(gòu)成反應(yīng)體系時(shí)最大。另外從圖6的結(jié)果可以認(rèn)為，若由pH4.5～5.3、優(yōu)選pH4.5～5.0的0.05M苯二甲酸氫鉀緩沖液構(gòu)成反應(yīng)體系時(shí)，測定值的提高和區(qū)帶現(xiàn)象的緩和效果是非常穩(wěn)定的。
在用pH為6.0的0.05M苯二甲酸氫鉀緩沖液構(gòu)成的反應(yīng)體系時(shí)，測定值低于用0.05M MOPS緩沖液構(gòu)成的反應(yīng)體系測定的值。而測定值曲線表現(xiàn)出與用0.05M MOPS緩沖液構(gòu)成的反應(yīng)體系同樣的形狀，看不到對隨著抗原濃度變成高濃度而出現(xiàn)的區(qū)帶現(xiàn)象有緩和的效果。
在用pH為4.0的0.05M苯二甲酸氫鉀緩沖液構(gòu)成的反應(yīng)體系中，將直至100mg/dl的人白蛋白加入反應(yīng)體系后測定的值低于用0.05M MOPS緩沖液構(gòu)成的反應(yīng)體系測定的值。然而將200mg/dl以上的人白蛋白加入反應(yīng)體系后測定的值高于用0.05M MOPS緩沖液構(gòu)成的反應(yīng)體系測定的值?？吹綄﹄S著抗原濃度變成高濃度而出現(xiàn)的區(qū)帶現(xiàn)象有緩和的效果。
以上結(jié)果表明，在使用苯二甲酸或苯二甲酸鹽的免疫反應(yīng)測定法中反應(yīng)體系的pH一般設(shè)定在pH4.5～5.5范圍、設(shè)定在pH4.5～5.3范圍更好，最好是設(shè)定在pH4.5～5.0范圍。另外知道將反應(yīng)體系的pH設(shè)定在4.5可以得到最大的效果。
同樣，在使用苯二甲酸或苯二甲酸鹽的免疫反應(yīng)測定用試劑盒中，反應(yīng)體系的pH象設(shè)定的那樣調(diào)整在pH4.5～5.5范圍、調(diào)整在pH4.5～5.3范圍更好，最好是調(diào)整在pH4.5～5.0范圍。另外可知將反應(yīng)體系的pH象設(shè)定的那樣調(diào)整在4.5可以得到最大的效果。
(實(shí)施例5)以下給出了通過散射測濁法對使用苯二甲酸氫鉀作為苯二甲酸或苯二甲酸鹽的本發(fā)明的免疫反應(yīng)測定方法和免疫反應(yīng)測定用試劑盒測得的測定值對苯二甲酸或苯二甲酸鹽依賴性進(jìn)行研究的內(nèi)容。作為被測定物質(zhì)使用人白蛋白。人白蛋白溶液的制備用與實(shí)施例3同樣的方法進(jìn)行，準(zhǔn)備濃度分別為0、5、10、20、30、50、70、100、200、300、500mg/dl的白蛋白溶液。使用的抗體溶液與實(shí)施例1相同。
作為構(gòu)建用于研究測定值對苯二甲酸或苯二甲酸鹽依賴性的反應(yīng)體系的緩沖液，準(zhǔn)備分別含有苯二甲酸氫鉀濃度為0.01、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3M以及4重量％聚乙二醇6,000的pH為4.5的各個(gè)苯二甲酸氫鉀緩沖液。
作為比較例，使用含有0.05M MOPS、4重量％聚乙二醇6,000以及pH調(diào)整到7.4的0.05M MOPS緩沖液。儀器和測定法與實(shí)施例3相同。
以下敘述測定的結(jié)果。由各個(gè)測定中使用的各個(gè)緩沖液、抗體溶液、各濃度的人白蛋白溶液構(gòu)成的反應(yīng)體系的混合液的pH在使用0.01M苯二甲酸氫鉀緩沖液時(shí)為4.7，在使用0.025M苯二甲酸氫鉀緩沖液時(shí)為4.6，在使用其他濃度的苯二甲酸氫鉀緩沖液時(shí)為4.5。另外測定中石英杯內(nèi)的溫度保存在25.5±1℃。
得到的結(jié)果如圖7所示。圖7中的曲線表示對于使用由pH大致為4.5的各個(gè)濃度的苯二甲酸氫鉀緩沖液構(gòu)成的反應(yīng)體系分別加入直至500mg/dl的各個(gè)人白蛋白溶液之后進(jìn)行測定的結(jié)果。縱軸表示散射光強(qiáng)度，橫軸表示測定中使用的人白蛋白溶液的濃度。曲線中的各個(gè)值是由就各個(gè)緩沖液得到的各個(gè)濃度人白蛋白溶液的測定值減去人白蛋白濃度為0mg/dl時(shí)的測定值得到的結(jié)果。曲線的評估與圖4一樣。
用苯二甲酸氫鉀的濃度在0.2M以下的苯二甲酸氫鉀緩沖液構(gòu)成反應(yīng)體系進(jìn)行測定時(shí)，與作為比較例的0.05M MOPS緩沖液構(gòu)成的反應(yīng)體系測定的結(jié)果相比測定值提高了，能夠確認(rèn)測定值提高的效果。另外也可以看到隨著抗原濃度增高產(chǎn)生的區(qū)帶現(xiàn)象被緩和的效果。緩和區(qū)帶現(xiàn)象的效果在用0.1M以下濃度的苯二甲酸氫鉀緩沖液構(gòu)成反應(yīng)體系時(shí)特別高。用0.1M以下濃度的苯二甲酸氫鉀緩沖液構(gòu)成反應(yīng)體系測定值提高效果沒有太大差別，但緩和區(qū)帶現(xiàn)象的效果在用0.1M濃度的苯二甲酸氫鉀緩沖液構(gòu)成反應(yīng)體系中最大。
在用0.3M苯二甲酸氫鉀緩沖液構(gòu)成的反應(yīng)體系時(shí)，人白蛋白濃度直至100mg/dl的測定值都低于用0.05M MOPS緩沖液構(gòu)成的反應(yīng)體系測定的值。而人白蛋白濃度為200mg/dl以上的測定值高于比較例，可以看到對隨著人白蛋白濃度變成高濃度而出現(xiàn)的區(qū)帶現(xiàn)象有緩和的效果。
由以上結(jié)果可知，在使用苯二甲酸或苯二甲酸鹽的免疫反應(yīng)測定法中，為了獲得比一般中性緩沖液高的效果，反應(yīng)體系的苯二甲酸氫鉀濃度調(diào)整在0.2M以下合適。特別是苯二甲酸氫鉀濃度調(diào)整在0.1M以下更好，苯二甲酸氫鉀濃度調(diào)整在0.1M最好。
同樣，如果使用用苯二甲酸或苯二甲酸鹽構(gòu)成的免疫反應(yīng)測定用試劑盒，可知反應(yīng)體系的苯二甲酸氫鉀濃度調(diào)整在0.2M以下比較好。特別是苯二甲酸氫鉀濃度調(diào)整在0.1M以下更好，苯二甲酸氫鉀濃度調(diào)整為0.1M最好。
(實(shí)施例6)以下給出了通過散射測濁法對將苯二甲酸或苯二甲酸鹽與其他緩沖劑混合之后使用時(shí)利用本發(fā)明的免疫反應(yīng)測定方法和免疫反應(yīng)測定用試劑盒測得的測定值進(jìn)行研究的內(nèi)容。
作為被測定物質(zhì)使用人白蛋白。人白蛋白溶液的制備用與實(shí)施例3同樣的方法進(jìn)行，準(zhǔn)備濃度分別為0、5、10、20、30、50、70、100、200、300、500mg/dl的白蛋白溶液。使用的抗體溶液與實(shí)施例1相同。
作為苯二甲酸或苯二甲酸鹽使用苯二甲酸。與苯二甲酸共存的緩沖劑中使用琥珀酸，制備由0.1M琥珀酸、0.02M苯二甲酸、4重量％聚乙二醇6,000組成的pH為4.5琥珀酸苯二甲酸混合緩沖液。另外作為沒有苯二甲酸或苯二甲酸鹽時(shí)的比較例，使用配制的0.12M琥珀酸、4重量％聚乙二醇6,000組成的pH為4.5琥珀酸緩沖液。
以下敘述測定的結(jié)果。由各個(gè)測定中使用的各個(gè)緩沖液、抗體溶液、各濃度的人白蛋白溶液構(gòu)成的反應(yīng)體系的混合液的pH與緩沖液的pH大致相同。另外測定中石英杯內(nèi)的溫度保持在25.5±1℃。
得到的結(jié)果如圖8所示。圖8中的曲線表示對于使用上述由琥珀酸苯二甲酸混合緩沖液以及琥珀酸緩沖液分別構(gòu)成的反應(yīng)體系分別加入直至500mg/dl的各個(gè)人白蛋白溶液之后進(jìn)行測定的結(jié)果?？v軸表示散射光強(qiáng)度，橫軸表示測定中使用的人白蛋白溶液的濃度。曲線中的各個(gè)值是由就各個(gè)緩沖液得到的各個(gè)濃度人白蛋白溶液的測定值減去人白蛋白濃度為0mg/dl時(shí)的測定值得到的結(jié)果。曲線的評估與圖4一樣。
結(jié)果表明，使用琥珀酸苯二甲酸混合緩沖液時(shí)，與作為比較例使用的琥珀酸緩沖液相比，測定值提高了，可以確認(rèn)有效果。另外也可以看到隨著抗原濃度增高產(chǎn)生的區(qū)帶現(xiàn)象被緩和的效果。
由以上結(jié)果可知，在本發(fā)明的免疫反應(yīng)測定方法以及免疫反應(yīng)測定用試劑盒中，即使將苯二甲酸或苯二甲酸鹽與其他緩沖劑一起使用，也可以確認(rèn)起到了測定值提高效果以及緩和區(qū)帶現(xiàn)象的效果。
(實(shí)施例7)以下給出了使用實(shí)施例2制作的山羊抗人CRP多克隆抗體溶液對本發(fā)明的人CRP測定的效果與在以往免疫反應(yīng)測定方法中一般使用的中性反應(yīng)體系中的人CRP測定進(jìn)行對比的結(jié)果。
測定中使用的各濃度的人CRP溶液的配制如下將純化的人CRP(Chemicon International生產(chǎn)，Lot No.21042246)用組成為0.05M MOPS、0.04重量％NaN3的pH為7.4緩沖液稀釋后配制。制備人CRP溶液的濃度分別為0、10、20、30、50、70、100、200mg/dl的溶液。
作為抗體溶液使用實(shí)施例2制作的山羊抗人CRP多克隆抗體溶液。
作為含有苯二甲酸或苯二甲酸鹽的緩沖液使用實(shí)施例2制作的苯二甲酸緩沖液(0.02M苯二甲酸、0.02McaCl2、4重量％聚乙二醇6,000，pH4.5)。
另外作為不含苯二甲酸或苯二甲酸鹽的緩沖液的比較例使用含有0.05M MOPS以及4重量％聚乙二醇6,000的溶液并且將pH調(diào)整到7.4的0.05M MOPS緩沖液。
測定裝置使用自己制作的裝置，其構(gòu)成如下。光源做成270Hz調(diào)制的波長680nm的輸出功率15mW半導(dǎo)體激光頭(キコ-技研制，型號MLXS-D-12-680-35)，檢測器做成可見紅外精密測光用硅光電二極管(濱松フオトニクス制造，型號S2387-66R)。杯子是將厚0.1cm的光學(xué)玻璃板粘接，做成容量約200μl的正四角柱形。各配置位于離開光源0.5cm的地方，使其一面與光源成垂直地配置杯子，檢測器在與光源成90°角度方向，離開杯子5.5cm的地方配置，為了使雜散光不入射到檢測器，在檢測器和杯子之間設(shè)置遮光筒。依賴于檢測器檢測的光量的電流信號經(jīng)過電流電壓變換電路(106V/A)和運(yùn)算放大器構(gòu)成的發(fā)大電路放大100倍的電壓信號后，通過同步放大器(ェヌェフ回路設(shè)計(jì)ブロツク制造，型號5610B)進(jìn)行位相敏感檢波，輸入到GPIB控制的計(jì)算機(jī)中。
就各個(gè)緩沖液，對各濃度人CRP的測定如下。反應(yīng)體系的混合比為緩沖液178μl、人CRP溶液9μl、抗體溶液7μl。反應(yīng)體系中的山羊抗人CRP多克隆抗體的最終濃度約為0.036mg/ml、人CRP的最終濃度為測定中使用的人CRP溶液的濃度乘以0.046得到的濃度。
首先向杯內(nèi)按照上述容量加入緩沖液和人CRP溶液，攪拌混合。然后按照上述容量加入抗體溶液，進(jìn)行攪拌混合，使抗原抗體反應(yīng)發(fā)生。散射光的測定從加入抗體溶液前10秒開始，每0.5秒測定一次，連續(xù)測定300秒。測定值是作為電壓值得到的。杯子的污染對測定的影響可以用通過在各反應(yīng)前向杯內(nèi)加入純水測定的值進(jìn)行修正除去。求得到的于200～300秒之間的平均值，該值作為于各濃度人CRP溶液的測定值。另外在可以由加入抗體溶液之前10秒的測定值判斷出由于抗原產(chǎn)生自身凝集的情況，從上述求出的各濃度的人CRP溶液的測定值中減去這些平均值。測定在室溫(約20℃)下進(jìn)行。
以下給出了測定結(jié)果。圖9中的曲線表示就各個(gè)緩沖液加入直至100mg/dl的各人CRP溶液后測定的結(jié)果。縱軸表示測定的電壓值，橫軸表示測定中使用的人CRP溶液的濃度。測定電壓值越高，入射到檢測器的散射光越多，反應(yīng)體系的濁度高，即表明由于抗原抗體反應(yīng)形成許多凝集復(fù)合物。另外曲線中的各個(gè)值是從得到的各濃度的人CRP溶液的測定值減去人CRP濃度為0mg/dl的測定值得到的結(jié)果。
就象圖9所示那樣，與作為比較例使用MOPS緩沖液進(jìn)行測定時(shí)相比，可以確認(rèn)使用實(shí)施例2制作的由山羊抗人CRP多克隆抗體溶液以及含有0.02M CaCl2和苯二甲酸的緩沖液構(gòu)成的試劑進(jìn)行測定時(shí)得到的值，在各濃度的人CRP溶液的測定中都表現(xiàn)出高的測定值。
(實(shí)施例8)以下給出了使用實(shí)施例2制作的小鼠抗人CRP單克隆抗體溶液對本發(fā)明的人CRP測定的效果與在以往免疫反應(yīng)測定方法中一般使用的中性反應(yīng)體系中的人CRP測定進(jìn)行對比的結(jié)果。
測定中使用的各濃度人CRP溶液的制備使用與實(shí)施例7同樣的方法。制備人CRP溶液的濃度分別為0、10、20、30、50、70、100mg/dl的溶液。
作為抗體溶液使用實(shí)施例2制作的小鼠抗人CRP單克隆抗體溶液。
作為含有苯二甲酸或苯二甲酸鹽的緩沖液使用實(shí)施例2制作的苯二甲酸氫鉀緩沖液(0.05M苯二甲酸氫鉀、4重量％聚乙二醇6,000，pH4.5)。
另外作為不含苯二甲酸或苯二甲酸鹽的緩沖液的比較例使用含有0.05M MOPS以及4重量％聚乙二醇6,000的并且將pH調(diào)整到7.4的0.05MMOPS緩沖液。
測定中使用與實(shí)施例7所述同樣構(gòu)成的裝置和測定條件。另外有關(guān)測定方法以及測定數(shù)據(jù)的處理方法等也都與實(shí)施例7所述的方法同樣。因此反應(yīng)體系中的小鼠抗人CRP單克隆抗體的最終濃度約為0.036mg/ml，人CRP的最終濃度為測定中使用的人CRP溶液的濃度乘以0.046得到的濃度。
以下給出了測定結(jié)果。圖10中的曲線表示就在苯二甲酸或苯二甲酸鹽中使用苯二甲酸氫鉀的以實(shí)施例2構(gòu)成的0.05M苯二甲酸氫鉀緩沖液和作為比較例的0.05M MOPS緩沖液，加入直至100mg/dl的各個(gè)人CRP溶液后測定的結(jié)果?？v軸表示測定的電壓值，橫軸表示測定中使用的人CRP溶液的濃度。另外曲線中的各個(gè)值是從得到的各濃度的人CRP溶液的測定值減去人CRP濃度為0mg/dl的測定值得到的結(jié)果。曲線的評估與圖9一樣。
就象圖10所示那樣，在對比較例使用的0.05MOPS緩沖液進(jìn)行人CRP測定時(shí)，就10mg/dl的人CRP溶液的測定來說，在與0mg/dl的人CRP溶液的測定值之間沒有得到充分的測定值差，實(shí)質(zhì)上不能測定人CRP的濃度差。另一方面，用0.05M苯二甲酸氫鉀緩沖液進(jìn)行測定時(shí)，在各個(gè)濃度的人CRP溶液測定中都明顯表現(xiàn)出很高的測定值，即使在10mg/dl的人CRP溶液的測定中，在與0mg/dl的人CRP溶液的測定值之間也可以得到充分的測定值差。就是說，對人CRP的濃度差進(jìn)行測定成為可能。
就象以上實(shí)施例7和8所示那樣，可以確認(rèn)本發(fā)明的免疫反應(yīng)測定方法以及方法中使用的免疫反應(yīng)測定用試劑盒，即使對人CRP測定也具有測定值提高的效果。
就象以上說明的那樣，利用本發(fā)明的免疫反應(yīng)測定方法以及免疫反應(yīng)測定用試劑盒，通過使免疫反應(yīng)的反應(yīng)體系中存在苯二甲酸或苯二甲酸鹽，將反應(yīng)體系的pH設(shè)定酸性，可以提高通過抗原抗體結(jié)合引起的免疫反應(yīng)的測定值，而且通過上述操作可以緩和在抗原過剩范圍中產(chǎn)生的區(qū)帶現(xiàn)象。
在以往的添加水溶性高分子的方法中，為了使測定值提高，維持良好的S/N比，進(jìn)行穩(wěn)定的測定，需要添加更高濃度水溶性高分子或高分子量的水溶性高分子。因此，使溶液的粘性增大，存在著其分析操作上的處理變得困難的不好狀況。然而在本發(fā)明中由于使用的苯二甲酸或苯二甲酸鹽是低分子物質(zhì)，不會使溶液的粘性增大，其分析操作的處理也變得容易。
另外，利用本發(fā)明的免疫反應(yīng)測定方法以及免疫反應(yīng)測定用試劑盒，由于區(qū)帶現(xiàn)象被緩和，在被測定物質(zhì)的高濃度下的測定值的急劇下降被減輕。因此可以使能夠正確測定被測定物質(zhì)的含量的測定濃度范圍擴(kuò)展。
就象以上說明的那樣，通過本發(fā)明可以提供很容易使測定值提高的免疫反應(yīng)測定方法以及方法中使用的免疫反應(yīng)測定用試劑盒。還可以提供使在抗原過剩范圍內(nèi)產(chǎn)生的區(qū)帶現(xiàn)象緩和的免疫反應(yīng)測定方法以及方法中使用的免疫反應(yīng)測定用試劑盒。
權(quán)利要求
1.一種免疫反應(yīng)測定方法，對樣品中的被測定物質(zhì)含量進(jìn)行測定，其特征在于包含構(gòu)建含有上述樣品、與上述被測定物質(zhì)特異結(jié)合的特異結(jié)合物質(zhì)以及苯二甲酸或苯二甲酸鹽的反應(yīng)體系的工序A；對上述反應(yīng)體系的光學(xué)特性進(jìn)行測定的工序B；在上述工序A中上述反應(yīng)體系的pH設(shè)定為低于7，上述被測定物質(zhì)和上述特異結(jié)合物質(zhì)的組合是抗原與抗體的組合。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫反應(yīng)測定方法，其特征在于上述光學(xué)特性是散射光強(qiáng)度或光透過量。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的免疫反應(yīng)測定方法，其特征在于上述工序A中，上述反應(yīng)體系還含有緩沖劑。
4.根據(jù)權(quán)利要求1～3中任一項(xiàng)所述的免疫反應(yīng)測定方法，其特征在于上述工序A中，上述反應(yīng)體系的pH被設(shè)定在4.5～5.5范圍內(nèi)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1～4中任一項(xiàng)所述的免疫反應(yīng)測定方法，其特征在于在上述工序A中，上述反應(yīng)體系中的苯二甲酸或苯二甲酸鹽的濃度在0.2M以下。
6.根據(jù)權(quán)利要求1～5中任一項(xiàng)所述的免疫反應(yīng)測定方法，其特征在于上述苯二甲酸鹽是苯二甲酸氫鉀。
7.根據(jù)權(quán)利要求1～6中任一項(xiàng)所述的免疫反應(yīng)測定方法，其特征在于反應(yīng)體系含有2～6重量％的聚乙二醇。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫反應(yīng)測定方法，其特征在于上述被測定物質(zhì)是在其內(nèi)部具有保持金屬離子的結(jié)構(gòu)的抗原，上述特異結(jié)合物質(zhì)是與沒有保持上述金屬離子的上述抗原特異結(jié)合的抗體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的免疫反應(yīng)測定方法，其特征在于上述被測定物質(zhì)是人C反應(yīng)性蛋白質(zhì)。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫反應(yīng)測定方法，其特征在于上述被測定物質(zhì)是在其內(nèi)部具有保持金屬離子的結(jié)構(gòu)的抗原，上述特異結(jié)合物質(zhì)是多克隆抗體，在上述工序A中，上述反應(yīng)體系還含有上述金屬離子。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的免疫反應(yīng)測定方法，其特征在于上述被測定物質(zhì)是人C反應(yīng)性蛋白質(zhì)。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的免疫反應(yīng)測定方法，其特征在于上述被測定物質(zhì)是抗原，上述特異結(jié)合物質(zhì)是能夠與上述抗原的多個(gè)部位結(jié)合的單克隆抗體。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述免疫反應(yīng)測定方法，其特征在于上述被測定物質(zhì)是人C反應(yīng)性蛋白質(zhì)。
14.一種免疫反應(yīng)測定用試劑盒，用于對樣品中被測定物質(zhì)含量進(jìn)行測定，其特征在于，含有與上述被測定物質(zhì)特異結(jié)合的特異結(jié)合物質(zhì)；苯二甲酸或苯二甲酸鹽；在構(gòu)建含有上述樣品、上述特異結(jié)合物質(zhì)以及苯二甲酸或苯二甲酸鹽的反應(yīng)體系時(shí)用于將上述反應(yīng)體系的pH設(shè)定為低于7的緩沖劑；上述被測定物質(zhì)和上述特異結(jié)合物質(zhì)的組合是抗原與抗體的組合。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的免疫反應(yīng)測定用試劑盒，其特征在于上述緩沖劑將上述反應(yīng)體系的pH設(shè)定在4.5～5.5范圍內(nèi)。
16.根據(jù)權(quán)利要求14或15所述的免疫反應(yīng)測定用試劑盒，其特征在于上述反應(yīng)體系中的上述苯二甲酸或苯二甲酸鹽的濃度被調(diào)整在0.2M以下。
17.根據(jù)權(quán)利要求14～16中任一項(xiàng)所述的免疫反應(yīng)測定用試劑盒，其特征在于，上述苯二甲酸鹽是苯二甲酸氫鉀。
18.根據(jù)權(quán)利要求14～17中任一項(xiàng)所述的免疫反應(yīng)測定用試劑盒，其特征在于，還含有聚乙二醇，而且上述反應(yīng)體系中的上述聚乙二醇的濃度被調(diào)整到2～6重量％的范圍內(nèi)。
19.根據(jù)權(quán)利要求14所述的免疫反應(yīng)測定用試劑盒，其特征在于上述被測定物質(zhì)是在其內(nèi)部具有保持金屬離子的結(jié)構(gòu)的抗原，上述特異結(jié)合物質(zhì)是與沒有保持上述金屬離子的上述抗原特異結(jié)合的抗體。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的免疫反應(yīng)測定用試劑盒，其特征在于上述抗體是抗人C反應(yīng)性蛋白質(zhì)抗體。
21.根據(jù)權(quán)利要求14所述的免疫反應(yīng)測定用試劑盒，其特征在于還含有供給金屬離子的金屬化合物，上述被測定物質(zhì)是在其內(nèi)部具有保持金屬離子的結(jié)構(gòu)的抗原，上述抗原在其內(nèi)部具有保持上述金屬離子的結(jié)構(gòu)，上述特異結(jié)合物質(zhì)是多克隆抗體。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的免疫反應(yīng)測定用試劑盒，其特征在于上述抗體是抗人C反應(yīng)性蛋白質(zhì)抗體。
23.根據(jù)權(quán)利要求14所述的免疫反應(yīng)測定用試劑盒，其特征在于上述被測定物質(zhì)是抗原，上述特異結(jié)合物質(zhì)是能夠與上述抗原的多個(gè)部位結(jié)合的單克隆抗體。
24.根據(jù)權(quán)利要求23所述的免疫反應(yīng)測定用試劑盒，其特征在于上述單克隆抗體是抗人C反應(yīng)性蛋白質(zhì)抗體。
25.根據(jù)權(quán)利要求14所述的免疫反應(yīng)測定用試劑盒，其特征在于上述特異物質(zhì)與上述苯二甲酸或上述苯二甲酸鹽被混合。
全文摘要
一種免疫反應(yīng)測定方法，首先通過圖1所示的工序St1構(gòu)建含有要對被測定物質(zhì)含量進(jìn)行測定的樣品、與被測定物質(zhì)特異結(jié)合的特異結(jié)合物質(zhì)以及苯二甲酸或苯二甲酸鹽的反應(yīng)體系。此時(shí)上述反應(yīng)體系的pH設(shè)定為低于7。而在被測定物質(zhì)是抗原時(shí)特異結(jié)合物質(zhì)是抗體，而被測定物質(zhì)是抗體時(shí)特異結(jié)合物質(zhì)是抗原。然后通過圖1所示工序St2測定反應(yīng)體系的光學(xué)特性。此時(shí)在上述工序St1中生成凝集復(fù)合物時(shí)，上述反應(yīng)體系出現(xiàn)渾濁，散射光強(qiáng)度以及光透過量等都發(fā)生變化。因此通過測定散射光強(qiáng)度以及光透過量等可以估計(jì)反應(yīng)體系的渾濁程度。
文檔編號G01N33/536GK1507564SQ0280970
公開日2004年6月23日 申請日期2002年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月27日
發(fā)明者龜井明仁, 權(quán)丈紀(jì)子, 河村達(dá)朗, 平井真人, 人, 子, 朗 申請人:松下電器產(chǎn)業(yè)株式會社