專利名稱：人嗜中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂卡林及有關(guān)蛋白的突變蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及制備人嗜中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂卡林(lipocalin)(hNGAL)、大鼠α2-微球蛋白相關(guān)蛋白(A2m)或小鼠24p3/子宮卡林(uterocalin)(24p3)的突變蛋白的方法，其中此突變蛋白對(duì)給定靶標(biāo)有可檢測(cè)的親合力，并涉及可通過(guò)本方法獲得的這三個(gè)蛋白的突變蛋白。本發(fā)明也涉及編碼這些突變蛋白的核酸、含有本發(fā)明突變蛋白的藥物組合物及人嗜中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂卡林、大鼠α2-微球蛋白相關(guān)蛋白(A2m)和小鼠24p3/子宮卡林(24p3)的突變蛋白的各種用途。
背景技術(shù)：
脂卡林(Pervaiz和Brew，F(xiàn)ASEB J.1(1987)，209-214)是一個(gè)由常常為單體的分泌型小蛋白組成的家族，這些蛋白已經(jīng)從各種生物體中分離出來(lái)，其生理學(xué)作用在于存放或運(yùn)輸不同靶物質(zhì)，例如類黃醇或信息素，及參與更復(fù)雜的生物學(xué)功能例如味覺(jué)和嗅覺(jué)或前列腺素合成(綜述，例如，F(xiàn)lower，Biochem.J.318(1996)，1-14)。脂卡林成員之間有相對(duì)小的相互序列相似性，作為蛋白結(jié)構(gòu)家族，它們的關(guān)系首先通過(guò)x射線結(jié)構(gòu)分析闡明(Sawyer等，Nature 327(1987)，659)。
脂卡林的典型靶標(biāo)是低分子量的親脂物質(zhì)例如retinoid、脂肪酸、膽固醇、前列腺素、膽綠素、信息素、tastant、及添味劑(Flower，Biochem.J.318(1996)，1-14；也參見Kjeldsen，Biochimica et BiophysicaActa，1482(2000)，272-283)。對(duì)于視黃醇結(jié)合蛋白(Rbp)及β-乳球蛋白，脂卡林的一個(gè)典型靶標(biāo)是維生素A(Papiz等，Nature 324(1986)，383-385)。
抗體，例如免疫球蛋白，是蛋白通過(guò)非共價(jià)相互作用選擇性結(jié)合靶標(biāo)的經(jīng)典例子。這些蛋白作為試劑在生物技術(shù)、藥學(xué)、生物分析及普通生物和生命科學(xué)領(lǐng)域扮演關(guān)鍵角色。盡管很多倍地需要與配體/靶標(biāo)識(shí)別、結(jié)合或分離相關(guān)聯(lián)的結(jié)合蛋白，但目前幾乎僅有免疫球蛋白被用于這些目的。有明確的配體結(jié)合特征的其他蛋白，例如凝集素的應(yīng)用仍然限于特定情況。
近來(lái)，脂卡林家族成員已經(jīng)在關(guān)于有確定配體結(jié)合特征的蛋白的研究中成為研究對(duì)象。德國(guó)Offenlegungsschrift DE 19742706和國(guó)際專利公開WO 99/16873記載了anticalin_類；對(duì)給定配體有特異結(jié)合特征的類似于抗體的多肽(也參見Beste等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96(1999)1898-1903)。起始自脂卡林家族多肽通過(guò)在如下四個(gè)片段中進(jìn)行突變可以獲得Anticalin_，這四個(gè)片段與后膽色素結(jié)合蛋白(Bbp)中含有氨基酸位置28到45、58到69、86到99、114到129的線性多肽序列的序列位置相對(duì)應(yīng)。
另外，德國(guó)專利DE 19926068，WO 00/75308及Schlehuber等J.Mol.Biol.(2000)，1105-1120描述了后膽色素結(jié)合蛋白的突變蛋白例如特異結(jié)合地高辛配基的突變蛋白DigA和DigA16。
盡管anticalin_技術(shù)大體上已經(jīng)建立且可能在如上述的地高辛配基結(jié)合Bbp突變蛋白方面產(chǎn)生有前途的實(shí)踐應(yīng)用，但仍需要其它的改進(jìn)和實(shí)踐應(yīng)用?？紤]到在生命科學(xué)領(lǐng)域中配體或靶標(biāo)結(jié)合蛋白的各種潛在用途，純粹出于實(shí)踐應(yīng)用中有更多的選擇的原因，亦需要基于可選擇的脂卡林支架制備anticalin_。
因此，本發(fā)明的目的是提供對(duì)給定靶標(biāo)有結(jié)合親合力的可選擇脂卡林的突變蛋白。

發(fā)明內(nèi)容
上述目的通過(guò)具有本申請(qǐng)獨(dú)立權(quán)利要求的技術(shù)特征的方法和突變蛋白而解決。
此方法是用于制備選自下組中的蛋白的突變蛋白的方法人嗜中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂卡林(hNGAL)，大鼠α2-微球蛋白相關(guān)蛋白(A2m)及小鼠24p3/子宮卡林(24p3)，所述突變蛋白對(duì)給定靶標(biāo)有可檢測(cè)的親合力，所述方法包括步驟(a)對(duì)蛋白在與hNGAL的序列位置33-54、66-83、94-106、123-136相對(duì)應(yīng)的一個(gè)或多個(gè)序列位置進(jìn)行誘變，產(chǎn)生蛋白的一個(gè)或多個(gè)突變蛋白。
此方法優(yōu)選地還包括步驟(b)，即，通過(guò)篩選從所獲一個(gè)或多個(gè)突變蛋白中富集對(duì)給定靶標(biāo)有結(jié)合親合力的至少一個(gè)突變蛋白，和/或分離所述至少一個(gè)突變蛋白。優(yōu)選地，誘變導(dǎo)致產(chǎn)生蛋白的多個(gè)突變蛋白，即，兩個(gè)或多個(gè)突變蛋白。
這意味著本發(fā)明基于以下發(fā)現(xiàn)人嗜中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂卡林(hNGAL)及其大鼠(A2m)和小鼠(24p3)來(lái)源的同源蛋白為制備對(duì)給定的目的靶標(biāo)有結(jié)合活性的蛋白提供了合適支架。hNGAL已經(jīng)鑒定為脂卡林家族的成員且其三維結(jié)構(gòu)已經(jīng)由NMR(Coles等，J.Mol.Biol.289(1999)，139-157)和x射線晶體學(xué)(Goetz等，Biochemistry，39(2000)，1935-1941)解析，但直到今天無(wú)論其生理功能或其自然靶標(biāo)仍沒(méi)有被清楚地鑒定(Kjeldsen等，上面提到的引文)。因此，本發(fā)明第一次為hNGAL以及其同源A2m和24p3提供了可能的實(shí)踐用途。
蛋白A2m和24p3中根據(jù)本發(fā)明方法進(jìn)行誘變的氨基酸位置由hNGAL、A2m和24p3的氨基酸序列比對(duì)來(lái)確定。在與hNGAL有相同的氨基酸殘基數(shù)目(178)的蛋白A2m中，用于誘變的序列位置與hNGAL中選擇的位置，即hNGAL的序列位置33-54、66-83、94-106、123-136相同。對(duì)于24p3，相應(yīng)的序列位置是序列位置33-54、66-85、96-108、125-138。因此，進(jìn)行誘變的氨基酸位置分散于如下四個(gè)序列片段之中，這四個(gè)片段對(duì)應(yīng)于hNGAL、A2m和24p3三維結(jié)構(gòu)中的四個(gè)環(huán)。
用于誘變的上述片段(環(huán))的數(shù)目可以變化。為了產(chǎn)生對(duì)給定靶標(biāo)有可檢測(cè)親合力的突變蛋白，并不一定需要同時(shí)，例如在協(xié)同誘變中突變所有這四個(gè)環(huán)，也可以只進(jìn)行兩個(gè)或三個(gè)環(huán)的突變。
在根據(jù)本發(fā)明方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，各個(gè)蛋白，即hNGAL、A2m或24p3分別在與hNGAL序列位置40-50、70-79、101-103、125-132相對(duì)應(yīng)的一個(gè)或多個(gè)序列位置進(jìn)行誘變。例如，如果選擇hNGAL用于制備突變蛋白，則對(duì)hNGAL在選自序列位置40-50、70-79、101-103和125-132的一個(gè)或多個(gè)序列位置處進(jìn)行誘變。
在此方法的一個(gè)更優(yōu)選實(shí)施方案中，各個(gè)蛋白在與hNGAL序列位置40、42、44、46、47、49、50、70、72、73、77、79、101、102、103、125、127、128、130、132相對(duì)應(yīng)的一個(gè)或多個(gè)序列位置進(jìn)行誘變。
在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，在hNGAL或A2m的序列位置40、42、44、46、47、49、50、70、72、73、77、79、101、102、103、125、127、128、130和132或24p3的相應(yīng)序列位置中至少有10個(gè)，更優(yōu)選有至少15個(gè)被誘變。在最優(yōu)選實(shí)施方案中，所有這20個(gè)序列位置均被隨機(jī)化，其中優(yōu)選在這些位置允許所有20種天然氨基酸整合入多肽序列。
這意味著本發(fā)明基于以下發(fā)現(xiàn)對(duì)給定靶標(biāo)有可檢測(cè)親合力的hNGAL或其同源A2m和24p3的突變蛋白可以通過(guò)誘變，優(yōu)選隨機(jī)誘變總共20個(gè)氨基酸殘基，即hNGAL的序列位置40、42、44、46、47、49、50、70、72、73、77、79、101、102、103、125、127、128、130和132而獲得。由于幾個(gè)原因本發(fā)現(xiàn)是特別令人驚喜的。
正如指出的，在根據(jù)本發(fā)明方法的此優(yōu)選實(shí)施方案中，一組總共20個(gè)氨基酸被隨機(jī)化，即被誘變；而在WO 98/16873中總共只有16個(gè)氨基酸被突變。當(dāng)將隨機(jī)NNS或NNK密碼子誘變用于這20個(gè)氨基酸位置的完全隨機(jī)化時(shí)(即，在這所選的20個(gè)位置的每個(gè)位置處都允許20種天然氨基酸的每一個(gè)出現(xiàn))，存在3220種可能的密碼子組合。如果16個(gè)氨基酸位置用于隨機(jī)化，存在3216種可能的密碼子組合。因此，將進(jìn)行隨機(jī)誘變的氨基酸的數(shù)目增加4個(gè)(從16到20)，可以導(dǎo)致組合復(fù)雜性增加324≈106。然而，由于實(shí)驗(yàn)限制，在基于DNA的相應(yīng)文庫(kù)中可以實(shí)際上實(shí)現(xiàn)的突變體的數(shù)目不能任意地增加，并且根據(jù)本領(lǐng)域現(xiàn)狀該數(shù)目通常限定在約1×109-1×1010(Fitzgerald，Drug Discov.Today 5(2000)，253-258)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，使用了含有僅僅約1×107個(gè)序列變體(突變蛋白)的組合DNA文庫(kù)。
考慮到組合序列空間中小的可獲取部分將進(jìn)一步縮小約106倍，令人驚喜的是完全有可能從含有僅1×107個(gè)序列變體的組合文庫(kù)中分離出(a)不但可折疊成可溶性蛋白而且(b)甚至有新的配體/靶標(biāo)特異性的hNGAL(或A2m或24p3)突變蛋白。
在這個(gè)方面，應(yīng)當(dāng)注意的是此處采用的方法與WO 99/16873中的教導(dǎo)是不同的。根據(jù)此文獻(xiàn)，在單個(gè)實(shí)驗(yàn)中突變的氨基酸位置總數(shù)保持盡可能的低應(yīng)當(dāng)是有用的，這樣誘變獲得的變體集合，即文庫(kù)才可能就整體或至少其中有代表性的選擇部分而言實(shí)現(xiàn)盡可能的完整。
最后應(yīng)當(dāng)注意的是，令人驚喜的是本發(fā)明方法還能成功地用于制備對(duì)蛋白表位有特異結(jié)合活性的突變蛋白(參見例如實(shí)施例5、15)。
本發(fā)明也涉及對(duì)給定靶標(biāo)有可檢測(cè)親合力的人嗜中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂卡林、大鼠α2-微球蛋白相關(guān)蛋白(A2m)或小鼠24p3/子宮卡林(24p3)的突變蛋白；此突變蛋白可以通過(guò)相應(yīng)蛋白在與hNGAL序列位置33-54、66-83、94-106、123-136相對(duì)應(yīng)的序列位置上的誘變獲得。優(yōu)選可以通過(guò)對(duì)相應(yīng)蛋白在與hNGAL序列位置40-50、70-79、101-103、125-132相對(duì)應(yīng)的位置進(jìn)行誘變而獲得的突變蛋白。
優(yōu)選地，此突變蛋白在所選20個(gè)序列位置的5-10個(gè)，更優(yōu)選8-12個(gè)或者最優(yōu)選10-18個(gè)或10-20個(gè)序列位置處帶有氨基酸替換。
在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，突變蛋白具有SEQ ID NO12的氨基酸序列。此突變蛋白也稱作TlpcA。
本發(fā)明突變蛋白能與所需的靶標(biāo)結(jié)合且有可檢測(cè)的親合力，即，具有優(yōu)選至少105M-1的親合常數(shù)。比這個(gè)低的親合力用常規(guī)方法例如ELISA通常不再是可測(cè)量的，因此對(duì)于實(shí)踐應(yīng)用而言重要性次之。特別優(yōu)選的是能結(jié)合所需的靶標(biāo)且有至少106M-1親合力(相應(yīng)于1μM復(fù)合物的解離常數(shù))的突變蛋白。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以用多種方法測(cè)量突變蛋白與所需的靶標(biāo)的結(jié)合親合力，例如通過(guò)熒光滴定、通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性ELISA或通過(guò)表面等離子體共振技術(shù)測(cè)量。
突變蛋白結(jié)合的靶標(biāo)(配體)可以是任何化學(xué)部分，例如，也可以被免疫球蛋白識(shí)別和結(jié)合的化學(xué)部分。因此，靶標(biāo)可以是游離或綴合形式的化學(xué)化合物，它可以顯示以下化合物的特征半抗原、激素例如類固醇激素或任何生物聚合物或其片段，例如肽、蛋白或蛋白結(jié)構(gòu)域、肽、寡脫氧核苷酸、核酸、寡糖和多糖或者另外的大分子或其綴合物。本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方案中，靶標(biāo)是蛋白。
本發(fā)明突變蛋白在突變片段，即對(duì)于hNGAL而言氨基酸位置33-54、66-83、94-106、123-136的區(qū)域之外可以具有hNGAL、A2m或24p3的天然氨基酸序列。另一方面，此處公開的突變蛋白也可以在進(jìn)行誘變的位置外含有氨基酸突變(與野生型蛋白相比而言)，只要這些突變不影響突變蛋白的結(jié)合活性及折疊即可。這包括可以將例如，氨基酸殘基的突變、替換、缺失、插入及N-和/或C-端的添加引入hNGAL、A2m或24p3的天然氨基酸序列中。
對(duì)所選蛋白的氨基酸序列(無(wú)論在所選的結(jié)合區(qū)域之內(nèi)或之外)的此類修飾包括定點(diǎn)誘變各單個(gè)氨基酸位置，例如為了簡(jiǎn)化突變后的脂卡林基因或其部分的亞克隆，可以并入某些限制性酶的切割位點(diǎn)。例如，可以向hNGAL基因引入Glu28到His和/或Thr145到Ala的突變，以便通過(guò)兩個(gè)新BstXI限制位點(diǎn)簡(jiǎn)化突變基因片段在這些位置的克隆。而且，可以在四個(gè)肽環(huán)之內(nèi)或之外引入突變，以改善所選作為支架的蛋白的突變蛋白的某些特征，例如其折疊穩(wěn)定性或折疊效率或其對(duì)蛋白酶的抗性。
例如，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，hNGAL的Cys87替換成Ser或Ala，由此可以防止其與其他蛋白例如明膠酶B的共價(jià)交聯(lián)(這可能在體內(nèi)應(yīng)用突變蛋白時(shí)發(fā)生)并且可以穩(wěn)定其單體結(jié)構(gòu)。相似地，作為誘變和篩選本發(fā)明突變蛋白的結(jié)果而可能出現(xiàn)的Cys殘基對(duì)于結(jié)合給定的靶標(biāo)并不總是至關(guān)重要的，故也可以由Ser或Ala替換以防止共價(jià)鍵形成或巰基氧化。
在hNGAL的一個(gè)優(yōu)選突變蛋白中，Cys87被替換和/或突變蛋白與hNGAL相比帶有氨基酸替換Glu(28)→His和Thr(145)→Ala中的一個(gè)或兩個(gè)。在這方面，應(yīng)當(dāng)注意的是本發(fā)明也涉及有天然氨基酸序列的(重組)hNGAL，其中只有Cys87由任何其他合適的氨基酸替換。用此處描述的用于制備本發(fā)明其他突變蛋白的方法可以制備此hNGAL多肽(參見實(shí)施例4)，例如通過(guò)使用pHNGAL7載體來(lái)制備。
本發(fā)明的方法優(yōu)選包括(在步驟(b)中)(i)提供作為給定靶標(biāo)的化合物，它選自顯示出免疫半抗原、肽、蛋白或其他大分子的特征的游離或綴合形式的化學(xué)化合物，(ii)使所述靶標(biāo)與多個(gè)突變蛋白接觸以允許所述靶標(biāo)與對(duì)所述靶標(biāo)有結(jié)合親合力的突變蛋白之間形成復(fù)合物，(iii)去除沒(méi)有或基本上沒(méi)有結(jié)合親合力的突變蛋白。
沒(méi)有或基本沒(méi)有結(jié)合親合力是指在所用條件下，在靶標(biāo)與跟靶標(biāo)接觸的多個(gè)突變蛋白之間沒(méi)有形成復(fù)合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚，復(fù)合物形成依賴于許多因素例如結(jié)合伙伴的濃度、作為競(jìng)爭(zhēng)者的化合物的濃度、緩沖液的離子強(qiáng)度等等。篩選和富集通常在允許分離和富集對(duì)靶標(biāo)有至少105M-1親合常數(shù)的突變蛋白的條件下進(jìn)行。然而，洗滌和洗脫步驟可以在不同嚴(yán)緊性下進(jìn)行。例如，如果要分離有至少106M-1親合常數(shù)的突變蛋白，可以在增加的嚴(yán)緊性下，即更嚴(yán)緊的條件下進(jìn)行洗滌和洗脫。也可以就動(dòng)力學(xué)特征進(jìn)行選擇。例如，篩選可以在有利于靶標(biāo)和突變蛋白形成復(fù)合物的條件下進(jìn)行，其中所述突變蛋白顯示出與靶標(biāo)(受體)的解離緩慢，或者換句話說(shuō)具有低Koff率。
此處所用術(shù)語(yǔ)“多個(gè)”指存有至少兩個(gè)在其氨基酸序列上能彼此區(qū)別開的突變蛋白。由誘變產(chǎn)生的突變蛋白的上限通常由實(shí)驗(yàn)條件限制，通常在107到1012之間。
術(shù)語(yǔ)“誘變”如此處所用指選擇實(shí)驗(yàn)條件以便在hNGAL、A2m或24p3的序列位置處自然存在的氨基酸可以被在相應(yīng)這些天然多肽序列的此特定位置處不存在的至少一個(gè)氨基酸所替換。術(shù)語(yǔ)“誘變”也包括(附加地)，通過(guò)缺失或插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸改變序列片段的長(zhǎng)度。因此，本發(fā)明的范圍包括例如，在所選序列位置處一個(gè)氨基酸由一連串三個(gè)隨機(jī)突變所替代，從而導(dǎo)致與野生型蛋白(相應(yīng)片段)的長(zhǎng)度相比有兩個(gè)氨基酸殘基的插入。術(shù)語(yǔ)“隨機(jī)誘變”是指在某個(gè)序列位置不出現(xiàn)既定的單個(gè)氨基酸(突變)而是在誘變中可以以某一概率使至少兩個(gè)氨基酸整入所選序列位置。
此實(shí)驗(yàn)條件，例如可以通過(guò)在結(jié)構(gòu)基因中，例如，對(duì)于hNGAL在那些待被突變的位置處摻入具有簡(jiǎn)并堿基組成的密碼子得到。例如，使用密碼子NNK或NNS允許在誘變中整入所有20種氨基酸加琥珀終止密碼子，而密碼子VVS將可能整入的氨基酸數(shù)目限定到14，因?yàn)樗懦税被酑ys、Ile、Leu、Met、Phe、Trp、Tyr、Val在多肽序列的所選位置的整入；使用密碼子NMS使得例如，在所選序列位置處可能的氨基酸數(shù)目被限定到11，因?yàn)樗懦税被酇rg、Cys、Gly、Ile、Leu、Met、Phe、Trp、Val在所選序列位置處的整入。在本發(fā)明方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，進(jìn)行隨機(jī)誘變，其中至少4個(gè)，優(yōu)選6個(gè)，更優(yōu)選8到12個(gè)或者8到15個(gè)氨基酸被允許整入hNGAL、A2m或24p3的一個(gè)所選序列位置。在特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，對(duì)至少一個(gè)序列位置進(jìn)行完全隨機(jī)化，即在誘變中所有20種氨基酸都被允許整入此位置。通過(guò)上面可以清楚，在各個(gè)蛋白例如hNGAL的某個(gè)序列位置自然出現(xiàn)的氨基酸也可以在該位置被誘變后于突變蛋白中出現(xiàn)。
在本發(fā)明方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，靶標(biāo)是蛋白。蛋白可以以游離形式或綴合形式或以融合蛋白形式提供用于選擇突變蛋白。
在本發(fā)明方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，使用編碼選自hNGAL、A2m和24p3的單個(gè)蛋白的多個(gè)突變蛋白的核酸。此核酸由誘變產(chǎn)生，并且在3’末端與編碼M13絲狀噬菌體家族的外殼蛋白pIII或其片段的基因可操作地融合，以便選出結(jié)合給定靶標(biāo)的至少一個(gè)突變蛋白。
可以通過(guò)使用PCR獲得由誘變產(chǎn)生的核酸。在本發(fā)明方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，制備編碼相應(yīng)蛋白的突變片段的核酸包括以下兩個(gè)步驟。首先，用PCR產(chǎn)生兩個(gè)核酸片段，每個(gè)各編碼突變蛋白的一部分，并使這些片段部分地重疊。這些片段與兩個(gè)側(cè)翼引物在第二擴(kuò)增步驟中一起使用以獲得含有完整突變結(jié)構(gòu)基因的核酸(見圖2及實(shí)施例1，其中闡述了這兩個(gè)步驟)。由于重疊，在此反應(yīng)中可以擴(kuò)增全長(zhǎng)PCR產(chǎn)物，而不必添加任何額外的核酸。在兩個(gè)獨(dú)立的擴(kuò)增反應(yīng)中用一對(duì)或多對(duì)適宜引物可以得到上述的兩個(gè)片段(也參見圖2和實(shí)施例1，其中顯示這兩個(gè)片段在PCR反應(yīng)A和B中產(chǎn)生)。
對(duì)于某些應(yīng)用，使用標(biāo)記形式的本發(fā)明的hNGAL、A2m或24p3的突變蛋白是有用的。因此，本發(fā)明也涉及此處用作支架的這三個(gè)蛋白的突變蛋白，它與選自下組的標(biāo)記物綴合酶標(biāo)記物、放射性標(biāo)記物、熒光標(biāo)記物、顯色標(biāo)記物、發(fā)光標(biāo)記物、半抗原、生物素、地高辛配基、金屬配合物(metal complex)、金屬及膠體金。突變蛋白也可以與有機(jī)分子綴合。在本申請(qǐng)中使用的術(shù)語(yǔ)“有機(jī)分子”優(yōu)選指含有至少兩個(gè)碳原子但不超過(guò)7個(gè)可旋轉(zhuǎn)碳鍵且分子量在100-2000道爾頓之間，優(yōu)選1000道爾頓的有機(jī)分子和包括一個(gè)或兩個(gè)金屬原子的分子。
通常，可以用任何合適的化學(xué)物質(zhì)或酶標(biāo)記突變蛋白，這些化學(xué)物質(zhì)或酶可以在化學(xué)、酶學(xué)或物理反應(yīng)中直接或間接產(chǎn)生能用于檢測(cè)的可檢測(cè)化合物或信號(hào)。物理反應(yīng)的一個(gè)例子是通過(guò)輻射激發(fā)后發(fā)射熒光或者通過(guò)放射性標(biāo)記物發(fā)射X射線；堿性磷酸酶、辣根過(guò)氧化物酶或β-半乳糖苷酶是酶標(biāo)記物的例子，它們能催化形成隨后可以被檢測(cè)的顯色(有顏色)化合物。通常用于抗體的所有標(biāo)記物，除了那些專有地與免疫球蛋白Fc段中的糖部分一起使用的標(biāo)記物外，也可以用于與本發(fā)明突變蛋白綴合?？梢杂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法制備這些綴合物。
對(duì)此處公開的突變蛋白的實(shí)踐應(yīng)用而言特別有利的一項(xiàng)可選方案是以融合蛋白的形式使用突變蛋白。在此融合蛋白的優(yōu)選實(shí)施方案中，酶、蛋白或蛋白結(jié)構(gòu)域、肽，例如信號(hào)序列和/或親合標(biāo)簽等肽可操作地與突變蛋白的氨基端或羧基端融合。
融合伙伴能適當(dāng)?shù)刭x予突變蛋白新特征，例如酶活性或?qū)ζ渌肿永绲鞍?、大分子或低分子量靶?biāo)的親合力。例如，可以與催化顯色或熒光反應(yīng)的酶(例如堿性磷酸酶、辣根過(guò)氧化物酶、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶)或具有釋放細(xì)胞毒性劑的作用的酶融合。在實(shí)踐中可能有利的融合伙伴的另外例子是結(jié)合結(jié)構(gòu)域例如蛋白質(zhì)G的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域、蛋白質(zhì)A、抗體片段、寡聚化結(jié)構(gòu)域、毒素或本發(fā)明突變蛋白或者anticalin_，它們可以具有不同或相同的靶標(biāo)特異性。后者的具體例子是含有本發(fā)明hNGAL突變蛋白和在德國(guó)專利DE19926068中公開的地高辛配基結(jié)合突變蛋白DigA16的融合蛋白?？捎糜谟H合層析純化和/或用于檢測(cè)(例如使用Strep-tag_對(duì)鏈霉抗生物素蛋白的特異親合力)的親合標(biāo)簽例如Strep-Tag_或Strep-tag_II(Schmidt等J.Mol.Biol.255(1996)，753-766)或寡聚組氨酸標(biāo)簽(例如His6-tag)或蛋白例如谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶是優(yōu)選的融合伙伴的另外例子。有顯色或熒光性質(zhì)的蛋白例如綠色熒光蛋白(GFP)也是合適的融合伙伴。
如此處所用，術(shù)語(yǔ)“融合蛋白”也包括裝有信號(hào)序列的本發(fā)明突變蛋白，例如hNGAL的突變蛋白。位于本發(fā)明多肽N-端的信號(hào)序列可以適宜地在生物合成過(guò)程中指導(dǎo)多肽到達(dá)特定的細(xì)胞區(qū)室，例如進(jìn)入大腸桿菌的周質(zhì)或真核細(xì)胞的腔或者進(jìn)入細(xì)胞周圍的介質(zhì)中。在此過(guò)程中，信號(hào)序列由信號(hào)肽酶切割。也可以使用其他引導(dǎo)序列或信號(hào)序列，但它必須位于多肽的N端并且允許多肽定位于特定細(xì)胞區(qū)室。用于分泌入大腸桿菌周質(zhì)的優(yōu)選信號(hào)序列是OmpA信號(hào)序列。大量的另外的信號(hào)序列是本領(lǐng)域已知的。
本發(fā)明也涉及含有編碼本發(fā)明突變蛋白或其融合蛋白的序列的核酸分子。在優(yōu)選實(shí)施方案中，核酸分子含有編碼突變蛋白SEQ ID NO.12的核苷酸序列。
由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性允許某些密碼子可以被規(guī)定相同氨基酸并因此導(dǎo)致相同蛋白的其他密碼子替換，故本發(fā)明不限于特定的核酸分子，而是包括含有編碼具有本發(fā)明氨基酸序列的突變蛋白的核苷酸序列的所有核酸分子。
含有編碼本文公開的hNGAL、A2m或24p3之任一個(gè)的突變蛋白的核苷酸序列的核酸分子可以與調(diào)節(jié)序列可操作地連接以允許核酸分子在宿主細(xì)胞(體內(nèi))表達(dá)或在無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)(體外)中轉(zhuǎn)錄和翻譯。
如果一個(gè)核酸分子例如DNA包括含有轉(zhuǎn)錄和翻譯信息的核苷酸序列，并且這些序列與編碼多肽的核苷酸序列“可操作的連接”，則該核酸分子被認(rèn)為“能表達(dá)核酸分子或表達(dá)核苷酸編碼序列”或者能“允許核苷酸序列表達(dá)”?？刹僮鬟B接是指調(diào)節(jié)DNA序列與待表達(dá)的DNA序列以允許基因表達(dá)的方式相連?；虮磉_(dá)所需的調(diào)節(jié)區(qū)和元件的精確性質(zhì)可能因生物體而異，但通常應(yīng)包括啟動(dòng)子區(qū)，例如在原核生物中，包括啟動(dòng)子調(diào)節(jié)序列——該序列可以包括在細(xì)胞內(nèi)有功能的轉(zhuǎn)錄區(qū)和在細(xì)胞內(nèi)有功能的轉(zhuǎn)錄終止區(qū)。用于轉(zhuǎn)錄或翻譯的元件有啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、前導(dǎo)序列、轉(zhuǎn)錄起始位置和轉(zhuǎn)錄終止位置、多腺苷酸化信號(hào)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)例如Shine-Dalgarno序列等等。這些調(diào)節(jié)序列和/或本發(fā)明突變蛋白可以是載體的一部分。因此，本發(fā)明也涉及含有編碼如本文公開的hNGAL、A2m或24p3的突變蛋白的核酸序列的載體。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明也涉及制備本發(fā)明突變蛋白或其融合蛋白的方法。在此方法中起始自編碼突變蛋白的核酸通過(guò)基因工程方法在細(xì)菌或真核宿主生物體內(nèi)制備突變蛋白或融合蛋白，并從此宿主生物體或其培養(yǎng)物中分離該蛋白。為此，通常首先用包含編碼例如本發(fā)明NGAL突變蛋白的核酸分子的載體轉(zhuǎn)化適宜的宿主細(xì)胞。然后在允許此多肽生物合成的條件下培養(yǎng)此宿主細(xì)胞——它可以是任何原核或真核宿主細(xì)胞。然后通常從細(xì)胞或從培養(yǎng)基中回收多肽。由于人嗜中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂卡林、A2m和24p3均含有一個(gè)結(jié)構(gòu)二硫鍵，故優(yōu)選通過(guò)合適的信號(hào)序列指導(dǎo)多肽進(jìn)入具有氧化巰基/二硫化物氧化還原環(huán)境的細(xì)胞區(qū)室。此氧化環(huán)境存在于細(xì)菌例如大腸桿菌的周質(zhì)中或真核細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中，并通常有助于二硫鍵的正確形成。然而，也可以在宿主細(xì)胞，優(yōu)選大腸桿菌的胞質(zhì)中生產(chǎn)本發(fā)明多肽。在這種情況下，多肽可以，例如，以包函體的形式生產(chǎn)，之后體外復(fù)性。另一個(gè)選擇是使用在胞質(zhì)中有氧化環(huán)境并因此允許在胞質(zhì)中產(chǎn)生天然蛋白的特異突變菌株。
從以上公開可見，可以在多種應(yīng)用中使用本發(fā)明突變蛋白或其融合蛋白或其綴合物。通常，本文公開的突變蛋白可以用于所有使用抗體的用途中，除了特別依賴于Fc段糖基化的那些用途。
突變蛋白的優(yōu)選用途是用本發(fā)明突變蛋白或其融合蛋白檢測(cè)靶標(biāo)，它包括的步驟是在合適條件下使突變蛋白與懷疑含有給定靶標(biāo)的樣品接觸，由此允許突變蛋白與給定靶標(biāo)之間形成復(fù)合物，并通過(guò)合適的信號(hào)確定形成復(fù)合物的突變蛋白。此信號(hào)可以由標(biāo)記物，例如上述熒光或顯色標(biāo)記物引起。此信號(hào)也可以由物理特性的改變引起，而此改變是結(jié)合引起的，即由復(fù)合物形成本身引起。此特性的一個(gè)例子是表面等離子體共振，在結(jié)合伙伴的結(jié)合過(guò)程中共振值改變，其中一個(gè)結(jié)合伙伴固定于表面例如金箔上。
如上面提到的，與抗體或其片段類似，本文公開的突變蛋白及其衍生物能用于許多領(lǐng)域。突變蛋白優(yōu)選用于結(jié)合固相，以使突變蛋白的靶標(biāo)或此靶標(biāo)的綴合物或融合蛋白能被固定或分離。本發(fā)明突變蛋白更優(yōu)選的用法是標(biāo)記上酶、抗體或放射性物質(zhì)或有生化活性或確定的結(jié)合特性的其他基團(tuán)，以使突變蛋白的靶標(biāo)或此靶標(biāo)的綴合物或融合蛋白能被檢測(cè)或接觸。通過(guò)成熟的生物分析方法例如ELISA或Western印跡，應(yīng)用顯微鏡或免疫傳感術(shù)，本發(fā)明突變蛋白可以例如用于檢測(cè)化學(xué)結(jié)構(gòu)。此處，檢測(cè)信號(hào)可以通過(guò)合適的突變蛋白綴合物或融合蛋白直接產(chǎn)生，或者通過(guò)用針對(duì)突變蛋白的抗體或者例如通過(guò)使用親合標(biāo)簽檢測(cè)結(jié)合的突變蛋白間接產(chǎn)生。
在醫(yī)學(xué)中也存在hNGAL、A2m或24p3的突變蛋白的多種可能應(yīng)用。除了用于診斷外，還可以制備結(jié)合例如組織或腫瘤特異性細(xì)胞表面分子的本發(fā)明突變多肽。此突變蛋白可以，例如以綴合物或融合蛋白形式用于“腫瘤成像”或直接用于癌癥治療。
本文所述突變蛋白的另一個(gè)相關(guān)的優(yōu)選用途是靶標(biāo)確認(rèn)，也就是檢查經(jīng)推測(cè)參與疾病或紊亂發(fā)展的多肽是否真正地以某種方式引起疾病或紊亂。確認(rèn)蛋白為藥理學(xué)藥物靶標(biāo)的這個(gè)用法利用了本發(fā)明突變蛋白特異識(shí)別蛋白天然構(gòu)象的表面區(qū)域的能力，也就是本文公開的突變蛋白結(jié)合天然表位的能力。在這方面，值得注意的是，不論是由K_hler和Milstein(Nature256(1975)，495-497)的經(jīng)典免疫方法制備的抗體還是由組合技術(shù)例如噬菌體展示制備的抗體，這種結(jié)合天然表位的能力僅僅在有限數(shù)量的重組抗體中有過(guò)報(bào)道。使用突變蛋白確認(rèn)藥物靶標(biāo)不僅包括檢測(cè)蛋白靶標(biāo)，也包括檢測(cè)存在形式為蛋白結(jié)構(gòu)域、肽、核酸分子、有機(jī)分子或金屬配合物的靶標(biāo)。
在另一方面，本發(fā)明涉及含有本發(fā)明的人嗜中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂卡林、大鼠α2-微球蛋白相關(guān)蛋白(A2m)或小鼠24p3/子宮卡林(24p3)的突變蛋白或其融合蛋白及藥學(xué)可接受載體的藥物組合物。
有藥物價(jià)值的突變蛋白，例如hNGAL突變蛋白，可以是，例如結(jié)合腫瘤特異性細(xì)胞表面的突變蛋白。也可以是結(jié)合特定藥物并起到使藥物“持續(xù)釋放”或者使藥物在患者體內(nèi)長(zhǎng)時(shí)間存留的作用的突變蛋白。此突變蛋白可以以任何對(duì)于蛋白質(zhì)藥物有效的治療路徑給藥，例如通過(guò)腸胃外的、鼻內(nèi)的、直腸的、口腔的方式給藥或通過(guò)噴霧或氣霧劑吸入呼吸道?？梢砸詣┝繂挝恢苿┬问浇o藥，此制劑含有所需的傳統(tǒng)無(wú)毒藥學(xué)可接受載體、輔藥和賦形劑。術(shù)語(yǔ)“腸胃外”包括諸如皮下的、靜脈內(nèi)的、肌內(nèi)的、胸骨內(nèi)的(instrasternal)、動(dòng)脈內(nèi)的注射和輸注技術(shù)等遞送方式。由于低分子量，吸入是本發(fā)明藥學(xué)有用突變蛋白的一個(gè)優(yōu)選給藥方式。
因此，本發(fā)明突變蛋白可以使用已知藥學(xué)可接受成分和制備方法制成組合物。參見例如Remington等，Pharmaceutical Sciences，第15版，Mack Pub，Easton(1975)。
用于吸入時(shí)，本發(fā)明突變蛋白可以首先制成微粒分散形式。這可以通過(guò)制備含有相應(yīng)多肽的含水氣霧劑或固體顆粒來(lái)完成。通常，通過(guò)將所需多肽的含水溶液或懸液與傳統(tǒng)藥學(xué)可接受載體和穩(wěn)定劑配制在一起來(lái)制備含水氣霧劑。載體和穩(wěn)定劑將根據(jù)每種多肽的需求不同而不同，它們可以包括非離子表面活性劑(例如Tweens.Pluronics或聚乙二醇)、無(wú)毒蛋白像血清白蛋白、山梨聚糖酯、油酸、卵磷脂、氨基酸如甘氨酸、緩沖液、鹽、糖或糖醇。制劑也可以包括氣管擴(kuò)張劑。制劑是無(wú)菌的。氣霧劑通常制備自等滲溶液。顆粒任選地包括常規(guī)肺表面活性蛋白(surfactantprotein)。用于蛋白吸入的典型制劑在例如美國(guó)專利6,099,517中公開。也可以以干粉組合物形式給藥以吸入本發(fā)明突變蛋白。合適的干粉制劑在例如美國(guó)專利6,123,936中公開。
制備適合于吸入的藥物組合物的一個(gè)可選擇方案包括，在水性或非水性懸液，例如碳氟化合物拋射劑中形成顆粒氣霧劑。此顆粒包括，例如，多肽或脂質(zhì)體或微囊包載多肽的分子內(nèi)聚集物。氣霧劑應(yīng)當(dāng)無(wú)肺刺激物，即引起急性支氣管收縮、咳嗽、肺水腫或組織破壞的物質(zhì)。然而，非刺激性吸收增強(qiáng)劑在此處使用是適宜的。
適合腸胃外給藥的組合物包括藥學(xué)可接受無(wú)菌水性或非水性溶液、分散體、懸液或乳劑及用于在臨用之前重新形成無(wú)菌可注射溶液或分散體的無(wú)菌粉末。適合的水性和非水性載體、稀釋劑、溶劑或賦形劑的典型例子包括水、乙醇、多羥基化合物例如甘油、丙二醇、聚乙二醇和其適宜的混合物、植物油例如橄欖油、和可注射的有機(jī)酯例如油酸乙酯。通過(guò)各種方法可以保持流動(dòng)性，包括使用包衣材料例如卵磷脂、保持所需的顆粒大小(在分散體情況下)和使用表面活性劑。
組合物也可以包含輔藥例如防腐劑、潤(rùn)濕劑、乳化劑、分散劑、抗細(xì)菌和抗真菌劑例如對(duì)羥基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚和山梨酸、等滲劑例如糖、氯化鈉、或延緩吸收劑例如單硬脂酸鋁和白明膠。突變蛋白可以摻入緩釋或持續(xù)釋放或定向遞送系統(tǒng)例如聚合物基質(zhì)、脂質(zhì)體和微球體中。
可注射的制劑可以用多種方法滅菌，包括通過(guò)阻滯細(xì)菌的過(guò)濾器過(guò)濾或者以無(wú)菌固體組合物形式混合滅菌劑，所述組合物可以在臨用前溶解或分散在無(wú)菌水或其他無(wú)菌可注射介質(zhì)中。
本文中用作支架的每種蛋白的編碼序列都能作為誘變本發(fā)明所選肽片段的起始點(diǎn)。例如Bundgard等Biochem.Biophys.Res.Commun.202(1994)，1468-1475中已經(jīng)描述了hNGAL的編碼序列。A2m和24p3的編碼序列分別已經(jīng)公開在例如，Chan等Nucleic Acid Res.16(1988)11638和Stoesz等Oncogene 11(1995)，2233-2241中。對(duì)于四個(gè)肽環(huán)中的氨基酸的誘變，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以任意使用用于定點(diǎn)誘變或用于通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進(jìn)行誘變的各種已知方法。例如，誘變方法可以以如下為特征利用在所需位置具有簡(jiǎn)并堿基組成的合成寡脫氧核苷酸的混合物引入突變。使用有減弱的堿基配對(duì)特異性的核苷酸構(gòu)件，例如次黃嘌呤核苷，也是將突變引入所選序列片段或氨基酸位置的一個(gè)可選擇方案。與抗體相比，此處對(duì)靶標(biāo)結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行誘變的方法更為簡(jiǎn)單，因?yàn)閔NGAL僅有4個(gè)而不是6個(gè)序列片段——對(duì)應(yīng)于4個(gè)上述肽環(huán)——必須為此目的而被操作。另外的可能性是所謂的三聯(lián)體誘變。此方法使用不同核苷酸三聯(lián)體的混合物，其中每個(gè)三聯(lián)體編碼一個(gè)用于整入編碼序列的氨基酸。
將突變引入本文所用支架蛋白的四個(gè)所選肽環(huán)區(qū)域(即，在hNGAL情況下，序列位置33-54、66-83、94-106、123-136)的多種可應(yīng)用方法之一是基于使用四個(gè)寡脫氧核苷酸，這些寡脫氧核苷酸的每一個(gè)都部分地衍生自待突變的四個(gè)相應(yīng)序列片段之一。在生產(chǎn)這些寡脫氧核苷酸時(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用核酸構(gòu)件的混合物來(lái)合成與待突變的氨基酸位置相對(duì)應(yīng)的那些核苷酸三聯(lián)體，以便可以隨機(jī)出現(xiàn)針對(duì)所有氨基酸的密碼子或反密碼子，或者根據(jù)遺傳密碼和該混合物的組成在此位置出現(xiàn)針對(duì)選定的所需氨基酸的密碼子或反密碼子。
例如，第一個(gè)寡脫氧核苷酸的序列(除突變位置外)可以至少部分地對(duì)應(yīng)于肽環(huán)的編碼鏈，此肽環(huán)位于hNGAL多肽序列的最N端位置。因此，第二個(gè)寡脫氧核苷酸至少部分地對(duì)應(yīng)于多肽序列中隨后第二序列片段的非編碼鏈。第三個(gè)寡脫氧核苷酸依次至少部分地對(duì)應(yīng)于相應(yīng)的第三序列片段的編碼鏈。最后，第四個(gè)寡脫氧核苷酸至少部分地對(duì)應(yīng)于第四序列片段的非編碼鏈?？梢杂孟鄳?yīng)第一和相應(yīng)第二寡脫氧核苷酸，以及如果需要的話，單獨(dú)地用相應(yīng)第三和相應(yīng)第四寡脫氧核苷酸，以編碼支架蛋白的核酸和/或其互補(bǔ)鏈作為模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。
有多種已知方法可以把這兩個(gè)反應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合成含有從第一到第四序列片段的序列并在所選氨基酸位置帶有突變的核酸。為此，兩個(gè)產(chǎn)物可以例如進(jìn)行新的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，其中用側(cè)翼寡脫氧核苷酸為引物并使用一個(gè)或多個(gè)中間核酸分子來(lái)提供第二和第三序列片段之間的序列。在

圖1中示意性地再現(xiàn)了這個(gè)過(guò)程。在選擇用于誘變的寡脫氧核苷酸的數(shù)目及它們?cè)谒玫鞍椎幕蛐蛄兄械呐帕蟹绞綍r(shí)，本領(lǐng)域技術(shù)人員也有多種可隨意選擇的方案。
編碼含有所用蛋白的四個(gè)肽環(huán)的序列區(qū)段并且在上述所選定位置含有突變的核酸分子可以例如，通過(guò)連接反應(yīng)與遺失的hNGAL編碼核酸的5’和3’序列連接，和/或與載體連接，并可以克隆入已知宿主生物體。有多種方法可以任意選擇用于連接和克隆。例如，在擴(kuò)增過(guò)程中，將帶有限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列的合成核酸分子(此識(shí)別序列也出現(xiàn)在hNGAL核酸序列的相應(yīng)位置)連接到將被克隆的核酸的兩端以便使用相應(yīng)限制酶水解之后可以進(jìn)行連接反應(yīng)。遺失的本發(fā)明所用脂卡林的編碼核酸的5’-和3’-序列也可以通過(guò)PCR連接到含有突變序列位置的核酸分子上。
在編碼所選用于誘變的蛋白的基因中，更長(zhǎng)的序列片段也可以通過(guò)已知方法進(jìn)行隨機(jī)突變，例如在增加錯(cuò)誤率的條件下使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、通過(guò)化學(xué)誘變或者使用細(xì)菌增變菌株(Low等，J.Mol.Biol.260(1996)，359-368)進(jìn)行隨機(jī)突變。這些方法也可以用于進(jìn)一步優(yōu)化已經(jīng)制備的突變蛋白的靶標(biāo)親合力或靶標(biāo)特異性。例如，發(fā)生在具有hNGAL序列位置33-54、66-83、94-106和123-136的片段之外的突變常常是可以被耐受的，并且甚至可能被證實(shí)是有利的，例如當(dāng)突變有助于提高突變蛋白的折疊效率或折疊穩(wěn)定性的時(shí)候。
在誘變后的編碼核酸序列得以表達(dá)之后，可以從獲得的文庫(kù)中篩選出載有編碼可結(jié)合給定靶標(biāo)的突變蛋白的遺傳信息的多個(gè)克隆。篩選這些克隆時(shí)可以使用已知的表達(dá)策略和篩選策略。這類方法在生產(chǎn)或構(gòu)建重組抗體片段的情況中已經(jīng)描述，例如“噬菌體展示”技術(shù)(Hoess，Curr.Opin.Struct.Biol.3(1993)，572-579；Wells和Lowman，Curr.Opin.Struct.Biol.2(1992)，597-604)或“菌落篩查”方法(Skerra等，Anal.Biochem.196(1991)，151-155)或“核糖體展示”(Roberts，Curr.Opin.Chem.Biol.3(1999)268-273)。
此處給出“噬菌體展示”技術(shù)(Hoess，上引文；Wells和Lowman，上引文；Kay等，Phage Display of Peptides and Proteins-A laboratoryManual(1996)，Academic Press)的一個(gè)實(shí)施方案作為本發(fā)明篩選方法的例子，此篩選方法用于篩選有所需結(jié)合特性的突變蛋白。在此將“噬菌體展示”技術(shù)的各種其他可能實(shí)施方案并入作為參考。對(duì)于示例的篩選方法，制備可使突變hNGAL結(jié)構(gòu)基因以融合蛋白形式表達(dá)的噬粒，其中所述融合蛋白在N-端帶有信號(hào)序列，優(yōu)選OmpA信號(hào)序列，并在C-端帶有M13噬菌體的外殼蛋白pIII(Model和Russel，″The Bacteriophages″，Vol.2(1988)，Plenum Press，New York，375-456)或可以整入噬菌體外殼中的此外殼蛋白的片段。此噬菌體外殼蛋白的C端片段ΔpIII只含有天然外殼蛋白pIII的氨基酸第217-406位，并優(yōu)選用于制備融合蛋白。特別優(yōu)選的是pIII的C端片段，其中在201位的半胱氨酸殘基發(fā)生缺失或由另一氨基酸代替。
融合蛋白可以含有其他成分，例如親合標(biāo)簽或用于抗體的表位序列，它們將允許融合蛋白或其部分固定化或隨后純化。而且，可以將終止密碼子置于編碼hNGAL或其突變蛋白的區(qū)域和編碼外殼蛋白或其片段的基因片段之間，此終止密碼子，優(yōu)選琥珀終止密碼子在合適的抑制型菌株中在翻譯過(guò)程中將至少部分地翻譯成氨基酸。
此處的質(zhì)粒是帶有絲狀噬菌體，例如M13或f1(Beck和Zink，Gene 16(1981)，35-58)的基因間隔區(qū)或其功能部分的質(zhì)粒，這樣在用輔助噬菌體，例如M13K07、VCS-M13或R408超感染細(xì)菌細(xì)胞的過(guò)程中，環(huán)狀質(zhì)粒DNA的一條鏈與外殼蛋白一起包裝并作為所謂的噬粒輸出到培養(yǎng)基中。一方面，此噬粒帶有由相應(yīng)質(zhì)粒編碼的hNGAL突變蛋白，此突變蛋白與外殼蛋白pIII或其片段以融合蛋白形式嵌入噬粒表面，其中融合蛋白的信號(hào)序列通常被切除。另一方面，所述噬粒帶有來(lái)自輔助噬菌體的一個(gè)或多個(gè)拷貝的天然外殼蛋白pIII，因此能感染受體——通常為載有F-或F’-質(zhì)粒的細(xì)菌株。這樣，保證了在載有相應(yīng)hNGAL突變蛋白的遺傳信息的包裝核酸和至少部分地以功能形式呈現(xiàn)在噬粒表面的編碼蛋白之間存在物理偶聯(lián)。
例如，可以使用載體phNGAL5(圖1)構(gòu)建具有編碼hNGAL突變蛋白的序列的質(zhì)粒。編碼肽環(huán)的核酸可以，例如，通過(guò)兩個(gè)BstXI限制位點(diǎn)插入載體phNGAL5。通過(guò)轉(zhuǎn)化將重組質(zhì)粒整合入大腸桿菌菌株，例如XL1-blue(Bullock等，BioTechniques 5(1987)，376-379)或TG1中。這樣，得到能以融合蛋白形式生產(chǎn)許多不同hNGAL突變蛋白的克隆。
此文庫(kù)，即所獲克隆的集合，隨后根據(jù)已知方法用M13輔助噬菌體在液體培養(yǎng)基中超感染。感染之后，為了產(chǎn)生噬粒可以降低培養(yǎng)物的孵育溫度。優(yōu)選的孵育溫度是預(yù)期hNGAL突變蛋白——作為帶有噬菌體外殼蛋白或其片段的融合蛋白的一個(gè)組分——能實(shí)現(xiàn)最佳折疊的溫度。可以在感染期間或之后，通過(guò)例如加入無(wú)水四環(huán)素，誘導(dǎo)帶有hNGAL突變蛋白的融合蛋白的編碼基因在細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)。選擇誘導(dǎo)條件以使產(chǎn)生的相當(dāng)大部分的噬粒都展示至少一個(gè)hNGAL突變蛋白。培養(yǎng)孵育期之后，例如6-8小時(shí)后分離噬粒。用于分離噬粒的各種方法是已知的，例如聚乙二醇沉淀。
通過(guò)與所需的靶標(biāo)孵育，可以進(jìn)行分離噬粒的篩選，其中靶標(biāo)以允許至少暫時(shí)固定如下噬粒的形式存在，這些噬粒在其外殼中帶有融合蛋白形式的具有所需結(jié)合活性的突變蛋白。在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的各種實(shí)施方案中，靶標(biāo)可以例如與載體蛋白例如血清白蛋白綴合并通過(guò)載體蛋白與蛋白結(jié)合表面例如聚苯乙烯結(jié)合。適合于ELISA技術(shù)的微量滴定板或所謂的“免疫棒(immno-stick)”可以優(yōu)選地用于靶標(biāo)的這種固定化?？蛇x擇地，也可以利用具有其他結(jié)合基團(tuán)例如生物素的靶標(biāo)綴合物。然后靶標(biāo)可以固定于能選擇性結(jié)合該基團(tuán)的表面，例如包被有鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白的微量滴定板或者順磁顆粒。
可以用已知用于ELISA方法的封閉溶液飽和加載了靶標(biāo)的表面上殘留的蛋白或噬粒結(jié)合位點(diǎn)。隨后，噬?？梢岳?，在生理緩沖液中與固定于表面的靶標(biāo)接觸。通過(guò)多次洗滌去除未結(jié)合噬粒。隨后洗脫仍留在表面上的噬粒顆粒。為了洗脫，可以以溶液形式加入游離靶標(biāo)。但也可以通過(guò)加入蛋白酶或，例如，在酸、堿、去污劑或離液鹽存在下，或在溫和的變性條件下，洗脫噬粒。優(yōu)選的方法是用pH2.2的緩沖液洗脫，其中洗脫物隨后被中和。
之后，通過(guò)通常已知的方法，用洗脫的噬粒感染大腸桿菌。也可以從洗脫的噬粒中抽提核酸并以另外的方式摻入細(xì)胞。起始自以此方式獲得的大腸桿菌克隆，根據(jù)上述方法通過(guò)用M13輔助噬菌體超感染再次產(chǎn)生噬粒，以此方式增殖的噬粒在帶有固定化靶標(biāo)的表面上再一次進(jìn)行篩選。為富集帶有本發(fā)明突變蛋白的噬粒，多個(gè)篩選循環(huán)經(jīng)常是必需的。優(yōu)選選擇篩選循環(huán)的數(shù)目以使在后續(xù)功能分析中所研究的克隆的至少0.1％產(chǎn)生對(duì)給定靶標(biāo)有可檢測(cè)的親合力的突變蛋白。依據(jù)規(guī)模，即所用文庫(kù)的復(fù)雜度，為此目的通常需要2-8個(gè)循環(huán)。
為了進(jìn)行所選突變蛋白的功能分析，用獲自篩選循環(huán)的噬粒感染大腸桿菌菌株，分離相應(yīng)的雙鏈質(zhì)粒DNA。起始自此質(zhì)粒DNA或起始自從噬粒中抽提出的單鏈DNA，通過(guò)常用于此目的的方法可以測(cè)定本發(fā)明所選突變蛋白的核酸序列，并從此衍生出氨基酸序列?？梢詫⑼蛔儏^(qū)域或完整的hNGAL突變蛋白序列亞克隆入另一表達(dá)載體中并在合適的宿主生物體中表達(dá)。例如，phNGAL7可以用作表達(dá)載體(參見圖3)，可以在大腸桿菌株系，例如大腸桿菌-TG1中，進(jìn)行phNGAL7衍生物的表達(dá)?？梢杂酶鞣N蛋白質(zhì)化學(xué)方法純化通過(guò)基因工程產(chǎn)生的hNGAL突變蛋白。例如由phNGAL7產(chǎn)生的hNGAL突變蛋白在其C端帶有親合肽Strep-Tag II(Schmidt等，同上引文)，因此優(yōu)選地可以用鏈霉抗生物素蛋白親合層析純化。
也可以用其他方法進(jìn)行篩選。許多相應(yīng)的實(shí)施方案是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的或者在文獻(xiàn)中有描述。也可以使用組合方法。例如由“噬菌體展示”篩選或至少富集的克隆可以再進(jìn)行“菌落篩查”。這個(gè)方案的益處是可以根據(jù)對(duì)靶標(biāo)有可檢測(cè)結(jié)合親合力的hNGAL突變蛋白的生產(chǎn)來(lái)直接分離單克隆。
在“噬菌體展示”技術(shù)或“菌落篩查”方法中，除了用大腸桿菌作為宿主生物體外，例如其他細(xì)菌株系、酵母或昆蟲細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞也可以用于此目的。除了從產(chǎn)生自突變蛋白的編碼核酸序列的初級(jí)文庫(kù)中篩選hNGAL突變蛋白外，也可以使用類似的方法以便通過(guò)對(duì)編碼核酸序列進(jìn)行重復(fù)且任選地有限的誘變來(lái)優(yōu)化突變蛋白對(duì)所需靶標(biāo)的親合力或特異性。
令人驚喜的是，通過(guò)使用本發(fā)明的方法，可以分離出對(duì)給定靶標(biāo)顯示出可檢測(cè)親合力的hNGAL突變蛋白(參見，實(shí)施例4、5)。
此外，還可以對(duì)所產(chǎn)生的突變蛋白進(jìn)行進(jìn)一步的、任選地部分的隨機(jī)誘變，以便從由此獲得的新文庫(kù)中篩選出具有甚至更高親合力的變體。針對(duì)后膽色素結(jié)合蛋白的地高辛配基結(jié)合突變蛋白，本領(lǐng)域中已經(jīng)描述了用于“親合力成熟”目的的相應(yīng)方案(DE 199 26 068，WO00/75308；Schlehuber等，同上引文)，本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以以相應(yīng)方式將此相應(yīng)方案用于此處公開的突變蛋白。
以下通過(guò)非限制性實(shí)施例及附圖進(jìn)一步闡述本發(fā)明，其中圖1示意性地描述質(zhì)粒載體phNGAL5；圖2示意性地闡示在核酸水平制備脂卡林突變蛋白文庫(kù)；圖3示意性地描述表達(dá)載體phNGAL7；圖4示意性地描述表達(dá)載體pTLpc3；圖5描述使用ELISA時(shí)突變蛋白T1pcA與Tear脂卡林的結(jié)合及使用hNGAL的相應(yīng)對(duì)照實(shí)驗(yàn)；圖6示意性地描述質(zhì)粒載體phNGAL12；圖7示意性地描述表達(dá)載體phNGAL15；圖8描述ELISA中突變蛋白R(shí)FY-B、RFY-C和RFY-E以及作為對(duì)照的hNGAL與血小板反應(yīng)蛋白肽(SEQ ID NO18)的結(jié)合；圖9描述根據(jù)表面等離子體共振譜學(xué)(SPR)突變蛋白R(shí)FY-B、RFY-C和RFY-E以及作為對(duì)照的hNGAL與血小板反應(yīng)蛋白肽(SEQ ID NO18)的結(jié)合；圖10描述ELISA中hNGAL突變蛋白N4與白介素-8的結(jié)合；圖11示意性地描述表達(dá)載體pTNFα；圖12描述菌落斑點(diǎn)分析中TNFα與hNGAL突變蛋白TNF-V1和TNF-V2的結(jié)合，以及與作為對(duì)照的hNGAL的結(jié)合。
圖1顯示phNGAL5的示意圖。此載體編碼融合蛋白，該蛋白的組成為OmpA信號(hào)序列、帶有三個(gè)氨基酸替換Gln28→His、Leu137-Ile及Thr145→Ala的修飾hNGAL、Strep-Tag II親合標(biāo)簽和含有氨基酸217-406(pIII)的M13外殼蛋白pIII的截短形式。整個(gè)的結(jié)構(gòu)基因由四環(huán)素啟動(dòng)子/操縱基因(tetp/o)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄控制，并在脂蛋白轉(zhuǎn)錄終止子(tlpp)處終止。載體的其它元件有復(fù)制起點(diǎn)(ori)、絲狀噬菌體f1的基因間隔區(qū)(f1-IG)、編碼β-內(nèi)酰胺酶的氨芐青霉素抗性基因(bla)和四環(huán)素阻遏基因(tetR)。在SupE琥珀抑制型宿主菌株中部分地翻譯成Gln的琥珀終止密碼子定位于帶有OmpA信號(hào)序列和Strep-Tag II的hNGAL編碼區(qū)與截短的噬菌體外殼蛋白pIII編碼區(qū)之間。用于突變基因盒克隆的兩個(gè)BstXI限制位點(diǎn)和此結(jié)構(gòu)基因兩側(cè)的限制位點(diǎn)都已標(biāo)出。在序列表SEQ ID NO7中顯示了來(lái)自phNGAL5的相關(guān)核酸序列片段及編碼的氨基酸序列。片段起始于XbaI限制位點(diǎn)，終止于HindIII限制位點(diǎn)。此區(qū)域外的載體元件與載體pASK75上的是相同的，其完整的核苷酸序列在德國(guó)專利出版物DE4417598A1中給出。
圖2示意性地顯示通過(guò)重復(fù)使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)對(duì)hNGAL中20個(gè)選定的氨基酸位置進(jìn)行協(xié)同誘變的策略。針對(duì)其中氨基酸待突變的四個(gè)肽環(huán)的每一個(gè)，合成寡脫氧核苷酸(SEQ ID NO1，SEQ ID NO2，SEQ ID NO3和SEQ ID NO4)，其中在突變位置使用在序列表中給出的相應(yīng)核苷酸混合物。由于所選組成的原因，所有三個(gè)可能的終止密碼子中只有琥珀終止密碼子TAG被允許存在于突變密碼子位置，它在用于基因表達(dá)的大腸桿菌supE-菌株XL1-blue(Bullock等，BioTechniques 5(1987)，376-378)或TG1(Sambrook等，分子克隆，實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(1989)，ColdSpring Harbor Press)中將翻譯成谷氨酰胺。對(duì)于某些應(yīng)用，例如在其他細(xì)菌菌株或生物體中表達(dá)基因，此無(wú)義密碼子當(dāng)它出現(xiàn)在所選hNGAL突變蛋白的結(jié)構(gòu)基因中時(shí)可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員將其替換為編碼谷氨酰胺的密碼子，例如通過(guò)定點(diǎn)誘變替換。用引物SEQ ID NO1和SEQ ID NO2擴(kuò)增出有168個(gè)堿基對(duì)的核酸片段(1.PCR，PCR A)，其中使用含有克隆的hNGAL cDNA的phNGAL3質(zhì)粒DNA(SEQ ID NO8)作為模板。在另一個(gè)PCR中，用引物SEQ ID NO3和SEQ ID NO4擴(kuò)增出有179個(gè)堿基對(duì)的核酸片段(1.PCR，PCR B)，其中也用phNGAL3為模板。與phNGAL5唯一不同的是，phNGAL3在283和630位缺失兩個(gè)BstXI限制位點(diǎn)而在675位存在一個(gè)另外的BstXI限制位點(diǎn)，由此顯示hNGAL野生型序列。兩個(gè)PCR產(chǎn)物部分重疊，它們的混合物在另一個(gè)擴(kuò)增(2.PCR)中用作模板，其中使用兩個(gè)側(cè)翼PCR引物SEQ ID NO5和SEQ ID NO6，獲得有386個(gè)堿基對(duì)的基因片段。此片段含有所有20個(gè)突變密碼子的混合并隨后用兩個(gè)BstX限制位點(diǎn)克隆到載體phNGAL5上。使用這兩個(gè)限制位點(diǎn)，由于它們的特定排列在限制消化中導(dǎo)致兩個(gè)不相匹配的DNA突出末端，故使得可以獲得特別有效的連接。在構(gòu)建phNGAL5時(shí)已經(jīng)預(yù)先完成了相對(duì)于原始序列而言的氨基酸Gln28到His和Thr145到Ala的替換及Ser156密碼子的沉默突變，以便將兩個(gè)BstXI限制位點(diǎn)引入hNGAL結(jié)構(gòu)基因中。
圖3顯示phNGAL7的示意圖。PhNGAL7編碼融合蛋白，此蛋白由以下組成OmpA信號(hào)序列、根據(jù)圖1的修飾hNGAL、Strep-Tag_II親合標(biāo)簽、鏈球菌屬(Streptococcus)蛋白G的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域(abd)(Kraulis等，F(xiàn)EBS Lett.378(1996)，190-194)。所有另外的遺傳元件與phNGAL5一致。在序列表SEQ ID NO9中顯示了來(lái)自phNGAL7的核酸序列相關(guān)片段及編碼的氨基酸序列。片段起始于XbaI限制位點(diǎn)并終止于HindIII限制位點(diǎn)。此區(qū)域外的載體元件與載體pASK75是一致的，其完整的核苷酸序列由德國(guó)專利出版物DE4417598A1給出。
圖4顯示pTLpc3的示意圖。pTLpc3編碼融合蛋白，此蛋白由以下組成OmpA信號(hào)序列、帶有Cys97到Ser氨基酸替換的修飾人Tear脂卡林、Strep-Tag_II親合標(biāo)簽。所有另外的遺傳元件與phNGAL5一致。在序列表SEQ ID NO9中顯示了來(lái)自pTLpc3的核酸序列相關(guān)片段及編碼的氨基酸序列。片段起始于XbaI限制位點(diǎn)并終止于HindIII限制位點(diǎn)。此區(qū)域外的載體元件與載體pASK75是一致的，其完整的核酸序列在德國(guó)專利出版物DE4417 598A1中給出。
圖5顯示來(lái)自實(shí)施例5的數(shù)據(jù)的圖解表示，其中用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)測(cè)量與hNGAL突變蛋白T1pcA的結(jié)合。T1pcA和Tear脂卡林的結(jié)合(方形)與hNGAL和Tear脂卡林的相互作用(空心圓)對(duì)比。T1pcA以濃度依賴方式與Tear脂卡林結(jié)合。hNGAL沒(méi)有顯示顯著的結(jié)合信號(hào)。
圖6顯示phNGAL12的示意圖。此載體編碼融合蛋白，該蛋白的組成為OmpA信號(hào)序列、帶有Gln28到His、Cys87到Ser、Leu137到Ile及Thr145到Ala四個(gè)氨基酸替換的修飾hNGAL、Strep-Tag_II親合標(biāo)簽和含有氨基酸217-406(pIII)的M13外殼蛋白pIII縮短形式。另外，phNGAL12在OmpA信號(hào)序列編碼區(qū)內(nèi)有兩個(gè)沉默突變以去除EcoK12限制位點(diǎn)。整個(gè)結(jié)構(gòu)基因通過(guò)四環(huán)素啟動(dòng)子/操縱基因(tetp/o)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄控制并終止于脂蛋白轉(zhuǎn)錄終止子(tlpp)。載體的其它元件包括復(fù)制起點(diǎn)(ori)、絲狀噬菌體f1的基因間隔區(qū)(f1-IG)、編碼β-內(nèi)酰胺酶的氨芐青霉素抗性基因(bla)、四環(huán)素阻遏基因(tetR)。在supE琥珀抑制型宿主菌株中部分地翻譯為Gln的琥珀終止密碼子定位于與OmpA信號(hào)序列及Strap-Tag_II融合的hNGAL編碼區(qū)與截短的pIII噬菌體外殼蛋白的編碼區(qū)之間。圖中標(biāo)出了用于突變基因盒克隆的兩個(gè)BstXI限制位點(diǎn)和位于結(jié)構(gòu)基因兩側(cè)的限制位點(diǎn)。在序列表SEQ ID NO19中顯示了phNGAL12的相關(guān)核酸序列片段及編碼的氨基酸序列。片段起始于XbaI限制位點(diǎn)并終止于HindIII限制位點(diǎn)。該區(qū)域之外的載體元件與載體pASK75是一致的，其完整的核苷酸序列由德國(guó)專利出版物DE4417 598A1給出。
圖7顯示phNGAL15的示意圖。PhNGAL15編碼融合蛋白，該蛋白具有OmpA信號(hào)序列、根據(jù)圖6的修飾hNGAL及Strep-Tag_II親合標(biāo)簽。phNGAL15在OmpA信號(hào)序列編碼區(qū)內(nèi)帶有與phNGAL12相同的沉默突變。在序列表SEQ ID NO21中顯示了phNGAL15的核酸序列相關(guān)片段及編碼的氨基酸序列。片段起始于XbaI限制位點(diǎn)并終止于HindIII限制位點(diǎn)。此區(qū)域外的載體元件與載體pASK75是一致的，其完整的核苷酸序列由德國(guó)專利出版物DE4417 598A1給出。
圖8顯示來(lái)自實(shí)施例10的數(shù)據(jù)的圖解表示，其中用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)進(jìn)行hNGAL突變蛋白和血小板反應(yīng)蛋白肽的結(jié)合測(cè)量。hNGAL突變蛋白R(shí)FY-B(圓形)、RFY-C(方形)和RFY-E(菱形)和血小板反應(yīng)蛋白肽的結(jié)合與hNGAL(三角形)和血小板反應(yīng)蛋白肽的相互作用進(jìn)行對(duì)比。血小板反應(yīng)蛋白肽通過(guò)與其C端連接的生物素基團(tuán)固定于抗生物素蛋白包被的微量滴定板上。hNGAL突變蛋白以濃度依賴的方式與血小板反應(yīng)蛋白肽結(jié)合，而hNGAL并沒(méi)有產(chǎn)生顯著結(jié)合信號(hào)。在缺乏此肽時(shí)(空心符號(hào))，觀察到hNGAL突變蛋白與抗生物素蛋白有低水平的交叉反應(yīng)。
圖9顯示來(lái)自實(shí)施例11的數(shù)據(jù)的圖解表示，其中用表面等離子體共振譜學(xué)(SPR)進(jìn)行hNGAL突變蛋白與血小板反應(yīng)蛋白肽的結(jié)合測(cè)量。將hNGAL突變蛋白R(shí)FY-B(圓形)、RFY-C(方形)和RFY-E(菱形)分別和血小板反應(yīng)蛋白肽的分子相互作用與hNGAL(三角)和血小板反應(yīng)蛋白肽的相互作用進(jìn)行對(duì)比。hNGAL突變蛋白以濃度依賴方式結(jié)合血小板反應(yīng)蛋白肽，而hNGAL沒(méi)有出現(xiàn)顯著的結(jié)合信號(hào)。沒(méi)有檢測(cè)到hNGAL突變蛋白與傳感器芯片SA的交叉反應(yīng)(未顯示)。
圖10顯示來(lái)自實(shí)施例15的數(shù)據(jù)的圖解表示，其中用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)進(jìn)行hNGAL突變蛋白N4的結(jié)合測(cè)量。白介素8通過(guò)與其賴氨酸殘基結(jié)合的生物素基團(tuán)固定于抗生物素蛋白包被的微量滴定板上。將hNGAL突變蛋白N4和白介素8(實(shí)心圓)的結(jié)合與hNGAL突變蛋白N4與單獨(dú)抗生物素蛋白(空心圓)的結(jié)合進(jìn)行對(duì)比。hNGAL突變蛋白N4以濃度依賴的方式與白介素8結(jié)合，其沒(méi)有顯示出與單獨(dú)抗生物素蛋白的顯著結(jié)合信號(hào)。
圖11顯示質(zhì)粒pTNFα的示意圖，pTNFα編碼融合蛋白，該蛋白由以下組成腫瘤壞死因子α(TNFα)成熟形式及在其N端的六個(gè)組氨酸標(biāo)簽。所有另外的元件與質(zhì)粒pRSET(Schoepfer，Gene 124(1993)，82-85)是一致的。在序列表SEQ ID NO31中顯示了pTNFα的核酸序列相關(guān)片段及編碼的氨基酸序列。片段起始于NdeI限制位點(diǎn)并終止于HindIII限制位點(diǎn)。此區(qū)域外的載體元件與載體pRSET5a是一致的，其完整核苷酸序列在EMB登錄號(hào)X54202中給出。
圖12(A)顯示實(shí)施例18菌落斑點(diǎn)分析的結(jié)果，其中測(cè)試三聚體TNFα與固定的hNGAL突變蛋白的結(jié)合。根據(jù)圖12(B)，將表達(dá)以下ABD-融合蛋白的大腸桿菌TG1-F-細(xì)胞點(diǎn)在親水膜上四或五次hNGAL、后膽色素結(jié)合蛋白(BBP)、來(lái)自實(shí)施例6的文庫(kù)的兩個(gè)無(wú)關(guān)突變蛋白、在實(shí)施例17描述的菌落篩查分析中分離的9個(gè)克隆和(作為對(duì)照)沒(méi)有蛋白。如實(shí)施例18中所述將各個(gè)菌落分泌的突變蛋白固定于HSA包被的疏水膜上。使用抗地高辛配基Fab-堿性磷酸酶綴合物觀察地高辛化TNFα的結(jié)合。(B)描述點(diǎn)在膜上的各個(gè)克隆的位置。
實(shí)施例實(shí)施例1制備hNGAL突變蛋白文庫(kù)除非另外指明，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的基因工程方法，例如Sambrook等(同上引文)描述的方法。
根據(jù)圖2在多個(gè)步驟中使用PCR，以使在hNGAL四個(gè)肽環(huán)中的所有20個(gè)所選氨基酸位置進(jìn)行協(xié)同誘變。在兩個(gè)第一擴(kuò)增步驟中都進(jìn)行100μl體積的PCR反應(yīng)，其中20ng phNGAL3質(zhì)粒DNA用作模板，并使用相應(yīng)引物每個(gè)50pmol(分別地SEQ ID NO1和SEQ ID NO2或SEQ ID NO3和SEQ ID NO4)，這些引物用傳統(tǒng)的亞磷酰胺法合成。另外，反應(yīng)混合物含有10μl 10x Taq緩沖液(100mM Tris/HCl pH9.0，500mM KCl，15mM MgCl2，1％(v/v)Triton X-100)，10μl dNTP混合物(2mM dATP、dCTP、dGTP、dTTP)。加水補(bǔ)足體積后，加入5U Taq DNA聚合酶(5U/μl，Promega)，在有加熱蓋的熱循環(huán)儀(Eppendorf)中進(jìn)行94℃1分鐘，60℃1分鐘，72℃1.5分鐘的20個(gè)溫度循環(huán)，之后在60℃溫育5分鐘。用Jetsorb DNA抽提試劑盒(Genomed)通過(guò)制備型瓊脂糖凝膠電泳從低熔點(diǎn)瓊脂糖(Roche Diagnostics)中分離出所需的擴(kuò)增產(chǎn)物。
也在100μl混合物中進(jìn)行隨后的擴(kuò)增步驟，其中兩個(gè)相應(yīng)片段大約6ng用作模板，在引物SEQ ID NO5和SEQ ID NO6每個(gè)50pmol存在下進(jìn)行反應(yīng)。PCR混合物的剩余成分以和前面擴(kuò)增步驟中相同的量加入。用94℃1分鐘、55℃1分鐘、72℃1.5分鐘的20個(gè)溫度循環(huán)進(jìn)行PCR，之后在60℃溫育5分鐘。用E.Z.N.A..Cycle-Pure試劑盒(PeqLab)純化PCR產(chǎn)物。
為了克隆該片段，即核酸形式的hNGAL突變蛋白文庫(kù)，首先該片段根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明書用限制酶BstXI(New England Biolabs)切割，并用E.Z.N.A.Cycle-Pure試劑盒純化。第二次BstXI限制消化后，用制備型瓊脂糖凝膠電泳純化核酸片段，得到347個(gè)核苷酸大小的雙鏈DNA。以相同方式用BstXI切割載體phNGAL5的DNA，分離兩個(gè)所得片段的較大者(3971bp)。
為了連接，在有180 Weiss單位T4 DNA連接酶(New EnglandBiolabs)存在下，在600μl總體積中(50mM Tris/HCl pH7.8，10mMMgCl2，10mM DTT，1mM ATP，50μg/ml BSA)，16℃溫育2.75μg(12pmol)PCR片段和31.45μg(12pmol)載體片段四天。隨后通過(guò)每120μl連接混合物中加入5μg來(lái)自酵母的tRNA(Boehringer Mannheim)、125μl 5M乙酸銨及500μl乙醇來(lái)沉淀DNA。-20℃溫育3天之后離心(30分鐘，16000g，4℃)。每個(gè)沉淀用750μl乙醇(70％v/v，-20℃)洗滌，離心(5分鐘，16000g，4℃)，并真空干燥(2分鐘)。DNA最后溶于200μl TE/10中(1mM Tris/HCl pH8.0，0.1m MEDTA pH8.0)并加水調(diào)整至終體積260μl。
根據(jù)Tung和Chow(Trends Genet.11(1995)，128-129)及Hengen(Trends Biochem.Sci.21(1996)，75-76)描述的方法進(jìn)行大腸桿菌K12菌株XL1 Blue(Bullock等，同上引文)電感受態(tài)細(xì)胞的制備。通過(guò)加入穩(wěn)定期的XL1-blue過(guò)夜培養(yǎng)物將1L LB培養(yǎng)基調(diào)整為600nm光密度為OD600＝0.08，26℃以200rpm在2L三角瓶中溫育，達(dá)到OD600＝0.6后，在冰上冷卻培養(yǎng)物30分鐘，隨后4℃4000g離心15分鐘。用冰冷的10％w/v甘油(每次使用500ml)洗滌細(xì)胞沉淀兩次，最后重懸于2ml冰冷GYT培養(yǎng)基中(10％w/v甘油，0.125％w/v酵母抽提物，0.25％w/v胰蛋白胨)。
使用Micro Pulser系統(tǒng)(BioRad)與來(lái)自同一供應(yīng)商的電穿孔杯(電極間距2mm)用于電穿孔。在4℃冷室中進(jìn)行所有步驟。每5μl上面提到的DNA溶液與40μl細(xì)胞懸液混合，冰上溫育1分鐘，最后轉(zhuǎn)入電穿孔杯中。電穿孔后，懸液立即在2ml冰冷的SOC培養(yǎng)基(2％w/v胰蛋白胨，0.5％w/v酵母抽提物，10mM NaCl，10mM MgSO4，10mM MgCl2)中稀釋，37℃200rpm搖60分鐘。培養(yǎng)物稀釋于有100μg/ml氨芐青霉素的2L 2xYT培養(yǎng)基(2YT/Amp)中，培養(yǎng)直到由細(xì)胞增復(fù)制引起的OD550升至0.64。以此方式，使用總計(jì)34.2μg連接DNA，通過(guò)49次電穿孔得到7×107個(gè)轉(zhuǎn)化體。根據(jù)實(shí)施例2進(jìn)一步使用轉(zhuǎn)化體。
實(shí)施例2噬粒呈遞與針對(duì)人Tear脂卡林對(duì)hNGAL突變蛋白的篩選。
將200ml含有轉(zhuǎn)化了質(zhì)粒載體的細(xì)胞的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入無(wú)菌三角瓶中，此質(zhì)粒載體類似于phNGAL5但編碼融合蛋白形式的脂卡林突變蛋白文庫(kù)。用VCS-M13輔助噬菌體(Stratagene)感染，感染復(fù)數(shù)約為10，之后培養(yǎng)物37℃，160rpm再搖30分鐘。隨后加入卡那霉素(70μg/ml)，培養(yǎng)箱溫度降至30℃，10分鐘后加入無(wú)水四環(huán)素(200μl在二甲基甲酰胺(DMF)中的100μg/ml儲(chǔ)液)至100μg/L以誘導(dǎo)基因表達(dá)。30℃，160rpm繼續(xù)再溫育5小時(shí)。
從此培養(yǎng)物中取50ml，通過(guò)離心沉淀細(xì)胞(15分鐘，12000g，4℃)。含有噬粒顆粒的上清液進(jìn)行無(wú)菌過(guò)濾(0.45μm)，與1/4體積(12.5ml)20％(w/v)PEG8000，15％w/v NaCl混合，4℃溫育過(guò)夜。離心后(20分鐘，18000g，4℃)，沉淀的噬粒顆粒溶解于2ml冷的PBS(4mM KH2PO4，16mM Na2HPO4，115mM NaCl，pH7.4)中。溶液在冰上溫育30分鐘，分裝入兩個(gè)1.5ml反應(yīng)容器中。未溶解成分離心后(5分鐘，18500g，4℃)，每個(gè)上清液轉(zhuǎn)移到新反應(yīng)容器中。
與1/4體積20％w/v PEG8000，15％w/v NaCl混合并在冰上溫育30-60分鐘，用于重沉淀噬粒顆粒。離心后(20分鐘，18500g，4℃)，去除上清并將沉淀的噬粒顆粒溶解并合并于總計(jì)400μl PBS中。冰上溫育30分鐘后溶液離心(5分鐘，18500g，4℃)，以去除殘留的聚集物，上清液直接用于親合富集。
免疫棒(Immuno-sticks)(NUNC)用于載有hNGAL突變蛋白融合蛋白的重組噬粒的親合富集。這些免疫棒用800μl于PBS中的人Tear脂卡林(Tlpc)(450μg/ml)過(guò)夜包被。
為了產(chǎn)生重組Tlpc，用帶有Tlpc cDNA(對(duì)于Tlpc的cDNA，參看Holzfeind和Redl，Gene 139.(1994)，177-183)的表達(dá)質(zhì)粒pTLpc3轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM83細(xì)胞(Yanisch-Perron等，Giene33(1985)，103-119)，并將這些細(xì)胞用于根據(jù)實(shí)施例3的蛋白生產(chǎn)和純化。蛋白產(chǎn)量約為2.2mg每1L培養(yǎng)體積。
免疫棒表面上未被占據(jù)的結(jié)合位點(diǎn)通過(guò)室溫下與1.2ml PBST(有0.1％v/v Tween20的PBS)中的2％w/v BSA溫育2小時(shí)來(lái)飽和。之后免疫棒在室溫下與250μl噬粒溶液和500μl封閉緩沖液(PBST中的3％w/vBSA)的混合物溫育1小時(shí)。
為了去除未結(jié)合的噬粒，進(jìn)行8次洗滌，每次用950μl PBST洗2分鐘。用950μl 0.1M甘氨酸/HCl pH2.2處理免疫棒10分鐘以最后洗脫吸附的噬粒，之后通過(guò)與150μl 0.5M Tris混合立即中和洗脫級(jí)分的pH。
為了擴(kuò)增，將此噬粒溶液(1.1ml，含有106-108菌落形成單位，這依賴于篩選循環(huán))很快地加溫到37℃，與3ml大腸桿菌XL1-Blue指數(shù)生長(zhǎng)期培養(yǎng)物(OD550＝0.5)混合，37℃200rpm溫育30分鐘。隨后沉淀(2分鐘，4420g，4℃)感染有噬粒的細(xì)胞，在600μl培養(yǎng)基中重懸，鋪在三個(gè)含有100μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂平板(LB/Amp；直徑140mm)上。
32℃溫育14小時(shí)后，從瓊脂平板上刮取細(xì)胞，每個(gè)平板加上10ml2xYT/Amp培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到無(wú)菌三角瓶中，37℃200rpm搖20分鐘以完全懸浮。把適當(dāng)體積的此懸液接種到200ml 37℃預(yù)熱的2x YT/Amp培養(yǎng)基中至OD550＝0.08。
為了噬粒顆粒的重復(fù)生產(chǎn)和親合富集，使用與本實(shí)施例開始時(shí)描述的方法相同的方法。這種情況下，將瓊脂平板上生長(zhǎng)的細(xì)胞的0.2-1ml懸液接種入50ml 2x YT/Amp培養(yǎng)基中，在30℃經(jīng)7小時(shí)而不是5小時(shí)生產(chǎn)噬粒。這樣用Tlpc進(jìn)行四次另外的篩選循環(huán)。
實(shí)施例3用“菌落篩查”法鑒定與人Tear脂卡林結(jié)合的hNGAL突變蛋白為了以融合蛋白形式生產(chǎn)帶有Strep-Tag_II及白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的hNGAL突變蛋白用于分析且為了通過(guò)菌落篩查鑒定它們，將兩個(gè)BstXI切割位點(diǎn)之間的基因盒從載體phNGAL5亞克隆到phNGAL7上。
為了此目的，使用Perfectprep Plasmid Midi Kit(Eppendorf)從大腸桿菌克隆混合物分離質(zhì)粒DNA，此克隆混合物是通過(guò)用來(lái)自實(shí)施例2作為最后篩選循環(huán)的結(jié)果洗脫的噬粒感染而得到的。用限制酶BstXI切割DNA，用如實(shí)施例1所述方法通過(guò)制備型瓊脂糖凝膠電泳純化出兩個(gè)片段的較小者(347bp)。用BstXI切割載體phNGAL7的DNA并以同樣的方法分離兩個(gè)片段的較大者(3971bp)。
為了連接，兩個(gè)DNA片段每個(gè)100fmol與1.5 Weiss單位T4 DNA連接酶(Promega)混合，總計(jì)體積為20μl(30mM Tris/HCl pH7.8，10mMMgCl2，10mM DTT，1mM ATP)，之后16℃溫育過(guò)夜。使用CaCl2法(Sambrook等，同上引文)用2μl此連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1-F-(大腸桿菌K12 TG1，通過(guò)在無(wú)選擇條件下重復(fù)培養(yǎng)丟失了其附加體)。
親水的PVDF膜(Millipore，GVWP型，孔徑大小0.22μm)在一個(gè)位置處標(biāo)記并剪成合適大小，鋪在LB/Amp瓊脂平板上。來(lái)自此批轉(zhuǎn)化的150μl細(xì)胞懸液離心(5000g，2分鐘，4℃)并在500μl培養(yǎng)基中重懸，然后均一地鋪到此膜上。瓊脂平板37℃溫育7.5小時(shí)直至菌落達(dá)到約0.5mm大小。
同時(shí)，將也剪成合適大小的疏水膜(Millipore，Immobilon P，孔徑大小0.45μm)根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明書用PBS弄濕。隨后在10mg/ml人血清白蛋白(HSA，Sigma)的PBS溶液中室溫下攪動(dòng)4小時(shí)。膜上剩余的結(jié)合位點(diǎn)通過(guò)室溫下與PBS中的3％w/vBSA，0.5％v/v Tween20溫育2小時(shí)而飽和。膜洗滌兩次，每次用20ml PBS洗10分鐘，之后在加有200μg/L無(wú)水四環(huán)素的10ml LB/Amp培養(yǎng)基中攪動(dòng)10分鐘。隨后在膜的一個(gè)位置作上標(biāo)記并置于額外含有200μg/L無(wú)水四環(huán)素的LB/Amp瓊脂培養(yǎng)板上。將其上菌落已經(jīng)長(zhǎng)出來(lái)的親水膜置于疏水膜上，使兩個(gè)標(biāo)記重疊。培養(yǎng)板與兩張膜22℃溫育15小時(shí)。在此期間，各個(gè)hNGAL突變蛋白自菌落分泌出來(lái)并通過(guò)白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域固定于下層膜的HSA上。
此后，有菌落的上層膜轉(zhuǎn)移到新鮮LB/Amp瓊脂平板上，4℃存放。拿去疏水膜并洗滌三次，每次用20ml PBST洗5分鐘，隨后在10ml Tear脂卡林與生物素的綴合物的PBST溶液(10μg/ml)中溫育1小時(shí)。為了制備綴合物，將0.285mg D-生物素?；?ε-酰氨基己酸-N-羥基琥珀酰亞胺酯(Roche)在9μl DMSD中的溶液緩慢加入在5％w/v NaHCO3(pH8.2)中的2.5ml 450μg/ml Tlpc中。室溫下攪動(dòng)1小時(shí)后，通過(guò)PD-10凝膠過(guò)濾柱(Pharmacia)去除過(guò)多的反應(yīng)物，用PBS作為流動(dòng)緩沖液。
與綴合物溫育之后，用PBST洗三次膜，之后與10ml抗生物素蛋白-堿性磷酸酶綴合物(Sigma，PBST中1∶40000稀釋)溫育1小時(shí)。隨后用PBST兩次及PBS一次每次5分鐘洗膜，并在AP緩沖液(0.1M Tris/HClpH8.8，0.1M NaCl，5mM MgCl2)中攪動(dòng)10分鐘。為了顯色反應(yīng)，膜與10ml AP緩沖液溫育，向其中加入30μl 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸4-甲苯胺鹽(Roth，在二甲基甲酰胺中50μg/ml)和5μl氮藍(lán)四唑(Roth，在70％v/v二甲基甲酰胺中75μg/ml)，直到在某些菌落的位置出現(xiàn)清楚的顏色信號(hào)。這樣，檢測(cè)到由這些菌落產(chǎn)生的hNGAL突變蛋白對(duì)蛋白配體，即Tlpc的結(jié)合活性。
從第一張膜培養(yǎng)產(chǎn)生顏色斑點(diǎn)的十二個(gè)菌落。分離它們的質(zhì)粒DNA，根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明書使用Genetic Analyzer 310系統(tǒng)(AppliedBiosystems)對(duì)hNGAL基因盒進(jìn)行序列分析，其中用寡脫氧核苷酸SEQ IDNO11作為引物。十二個(gè)測(cè)序的克隆顯示只有8個(gè)不同序列，命名為TlpcA、TlpcB、TlpcC、TlpcD、TlpcE、TlpcF、TlpcG、TlpcH。TlpcA克隆出現(xiàn)5次?？寺〉暮塑账嵝蛄蟹g成氨基酸序列，偏離hNGAL的那些氨基酸在表1中給出。也在SEQ ID NO12和SEQ ID NO13中給出了突變蛋白TlpcA的氨基酸序列和核苷酸序列。測(cè)序發(fā)現(xiàn)琥珀終止密碼子在所有選擇的變體中處于不同位置，該終止密碼子在使用的大腸桿菌株系中被抑制。
實(shí)施例4制備hNGAL突變蛋白為了制備性生產(chǎn)hNGAL及其突變蛋白，一個(gè)所選菌落及在phNGAL7上最初編碼的hNGAL(作為對(duì)照)在大腸桿菌株TG1-F-中生產(chǎn)。
為此，100ml LB/Amp培養(yǎng)基接種載有相應(yīng)質(zhì)粒的TG1-F-轉(zhuǎn)化體單菌落，30℃200rpm過(guò)夜溫育。然后將每個(gè)40ml此預(yù)培養(yǎng)物接種入在5L三角瓶中的2L LB/Amp培養(yǎng)基中，22℃200rpm搖至OD550＝0.5。通過(guò)加入200μg/L無(wú)水四環(huán)素(200μl在DMF中的2mg/ml儲(chǔ)液)進(jìn)行誘導(dǎo)，之后22℃200rpm再搖3小時(shí)。
離心來(lái)自一個(gè)三角瓶中的細(xì)胞(15分鐘，4420g，4℃)，棄去上清液后，在20ml周質(zhì)釋放緩沖液(100mM Tris/HCl pH8.0，500mM蔗糖，1mMEDTA)中重懸，在冰上冷卻30分鐘。隨后在兩個(gè)連續(xù)離心步驟中去除原生質(zhì)球(15分鐘，4420g，4℃；15分鐘，30000g，4℃)。用CP緩沖液(100mM Tris/HCl pH8.0，150mM NaCl，1mM EDTA)透析含有周質(zhì)蛋白抽提物的上清液，無(wú)菌過(guò)濾，用于層析純化。
通過(guò)位于hNGAL變體與白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域之間的Strep-Tag_II親合標(biāo)簽(Schmidt等，同上引文)進(jìn)行純化。在本情況下使用鏈霉抗生物素蛋白突變蛋白“1”(德國(guó)專利19641876.3；Voss和Skerra，Protein Eng，10(1997)，975-982)，它與NHS活化的Sepharose(Pharmacia)偶聯(lián)，相對(duì)于基質(zhì)的床體積產(chǎn)生5mg/ml固定化的鏈霉抗生物素蛋白。
裝有此材料的4ml柱床體積層析柱用20ml CP緩沖液4℃以流速40ml/h平衡。通過(guò)在流通式光度計(jì)中測(cè)量洗脫物在280nm的吸收來(lái)監(jiān)測(cè)層析。周質(zhì)蛋白抽提物上樣后，用CP緩沖液洗滌柱子直至達(dá)到基線，隨后用10ml在CP緩沖液中的2.5mM D-脫硫生物素(Sigma)溶液洗脫結(jié)合的hNGAL突變蛋白。通過(guò)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(Fling和Gregerson，Anal，Biochem，155(1986)，83-88)檢查含有純化的hNGAL突變蛋白的級(jí)分并合并。蛋白產(chǎn)量在30μg到70μg每1L培養(yǎng)物之間。
表1所選hNGAL突變蛋白的序列特征位置hNGAL TlpcA TlpcB TlpcC TlpcD TlpcE TlpcF TlpcG TlpcH40 AlaCysGlyLeuSerValGlyArgAla42 LeuValTyrProValLeuSerSerCys44 GluGlnTyrIlePheGln*PhellePro46 LysLeuGln*Gln*Gln*CysArgPheLeu47 AspLeuArgAlaSerTrpPheGln*Phe49 GlnSerTrpIleSerCysValValPhe50 LysMetSerPheAlaProGlnPheLeu70 LeuLeuLeuGluGlyAspSerProGln*72 ArgMetArgAlaAsnGluGln*AlaArg73 LysAspAspTyrLysLysGlnAsnPro77 AspArgProValAsnAsnTrpIleSer79 TrpTyrMetLysThrValArgAlaArg101 ProGlyLeuTyrTyrProPheValLeu102 GlyIleSerLeuTrpValProValThr103 LeuValLeuTyrGln*LeuSerThrMet125 LysSerTrpLeuGlyGluArgAlaLys127 SerMetAlaCysArgAlaLysLysSer128 GlnThrAspProMetSerAlaThrAsp130 ArgGln*GlnGlyGluGlnHisLysAsp132 TyrAlaTrpLysThrLeuSerLeuIle55 Ile Val°98 Lys Asn°*這些谷氨酰胺殘基由琥珀終止密碼子編碼。
這些氨基酸替換由于隨機(jī)突變引起。
實(shí)施例5測(cè)量hNGAL突變蛋白對(duì)Tear脂卡林的親合力為了檢測(cè)ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)中的結(jié)合，微量滴定板(MicroTest III Flexible Assay板；Falcon)的每個(gè)孔都用100μl PBST中的20mg/ml HSA溶液填充，室溫(RT)溫育1小時(shí)。用PBST洗三次后，向孔中加入50μl來(lái)自實(shí)施例3的hNGAL突變蛋白TlpcA和hNGAL的1μM純化融合蛋白溶液，以使蛋白通過(guò)abd和HSA之間的復(fù)合物形成而固定化。1小時(shí)后去除溶液并用PBST洗三次。然后在PBST中制備Tear脂卡林和生物素的綴合物的稀釋系列，起始自140μg/ml，(實(shí)施例3)，之后室溫下14時(shí)溫育。用PBST洗三次后，抗生物素蛋白-堿性磷酸酶綴合物(Sigma)用PBST以1∶10000稀釋，加入小孔中。室溫溫育1小時(shí)，之后用PBST洗兩次，用PBS洗兩次。由此，通過(guò)堿性磷酸酶催化水解對(duì)硝基苯磷酸完成結(jié)合固定化hNGAL突變蛋白的Tear脂卡林的檢測(cè)。為此，向孔中加入100μl在AP緩沖液(100mM NaCl，5mM MgCl2，100mMTris/HCl pH8.8)中的0.5mg/ml對(duì)硝基苯磷酸(Amresco)溶液，通過(guò)在Spectra Max 250光度計(jì)(Molecular Devices)中測(cè)量405nm的吸收來(lái)監(jiān)測(cè)產(chǎn)物形成。
實(shí)施例6制備具有超過(guò)100億個(gè)獨(dú)立的hNGAL突變蛋白的文庫(kù)根據(jù)實(shí)施例2在多個(gè)步驟中使用PCR，通過(guò)四個(gè)肽環(huán)中共計(jì)20個(gè)所選氨基酸位置的協(xié)同誘變，制備有增加的多樣性的hNGAL隨機(jī)文庫(kù)。在兩個(gè)第一擴(kuò)增步驟中進(jìn)行100μl體積的PCR反應(yīng)，其中10ng phNGAL5(圖1)質(zhì)粒DNA用作模板，并使用50pmol每對(duì)引物(SEQ ID NO1和SEQ ID NO2或者SEQ ID NO3和SEQ ID NO4，分別地)，這些引物根據(jù)傳統(tǒng)的亞磷酰胺法合成。另外，反應(yīng)混合物含有10μl 10x Taq緩沖液(100mM Tris/HCl pH9.0，500mM KCl，15mM MgCl2，1％v/vTritonX-100)和10μl dNTP混合物(2mM dATP、dCTP、dGTP、dTTP)。加入水補(bǔ)足體積后，加入5U Taq DNA聚合酶(5u/μl，Promega)。在有加熱蓋的熱循環(huán)儀(Eppendorf)中進(jìn)行94℃1分鐘、60℃1分鐘、72℃1.5分鐘的20個(gè)溫度循環(huán)，之后60℃最后溫育5分鐘。在每種情況下，用Jetsorb DNA提取試劑盒(Genomed)通過(guò)制備型凝膠電泳從GTQ瓊脂糖(Roth)中分離所需的擴(kuò)增產(chǎn)物。
也用100μl混合物進(jìn)行隨后的擴(kuò)增步驟，其中使用約6ng的兩個(gè)DNA片段為模板，在引物SEQ ID NO5和SEQ ID NO6各50pmol存在下進(jìn)行反應(yīng)。與實(shí)施例1不同，這兩個(gè)引物都在其5’端帶有生物素基團(tuán)。加入與先前擴(kuò)增步驟相同量的PCR混合物的剩余成分。用94℃1分鐘、60℃1分鐘、72℃1.5分鐘的20個(gè)溫度循環(huán)進(jìn)行PCR，之后在60℃溫育5分鐘。PCR產(chǎn)物用E.Z.N.A.Cycle-Pure Kit(PegLab)純化。
為了克隆此DNA片段，即核酸形式的hNGAL突變蛋白文庫(kù)，根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明書用限制酶BstXI(Promega)切割5’-生物素化的PCR產(chǎn)物，如上述通過(guò)制備型瓊脂糖凝膠電泳純化347個(gè)核苷酸大小的產(chǎn)生片段。沒(méi)有或不完全消化的殘余DNA片段通過(guò)此溶液與鏈霉抗生物素蛋白包被的順磁珠(Dynal)溫育，借助其5’-生物素標(biāo)簽去除，因此得到適合于隨后連接反應(yīng)的雙酶切DNA片段。
為此，用100μl TE緩沖液洗滌100μl商業(yè)上可得的濃度10mg/ml的順磁顆粒懸液3次。然后排干順磁顆粒并在室溫下與100μl TE緩沖液中的11-22pmol DNA片段混合15分鐘。借助于磁鐵在Eppendorf管壁收集順磁顆粒，回收含有純化DNA片段的上清液以在以下連接反應(yīng)中進(jìn)一步使用。
如上述用BstXI切割載體phNGAL12的DNA(圖6)，用制備型瓊脂糖凝膠電泳分離兩個(gè)產(chǎn)生的片段的較大者(3971bp)。為了連接，在855Weiss單位T4 DNA連接酶(Promega)存在下將6.85μg(30pmol)PCR片段與78.65μg(30pmol)載體片段16℃溫育4天，共計(jì)體積為8550μl(50mM Tris/HCl pH7.8，10mM MgCl2，10mM DTT，1mM ATP，50μg/ml BSA)。然后通過(guò)每350μl連接混合物中加入110μg來(lái)自酵母的tRNA(Boehringer Mannheim)、350μl 5M乙酸銨和1300μl乙醇來(lái)沉淀DNA。20℃溫育2天后離心(30分鐘，16000g，4℃)，每個(gè)沉淀用750μl乙醇(70％v/v，-20℃)洗滌，離心(5分鐘，16000g，4℃)，真空干燥(2分鐘)。DNA最后溶于總體積427.5μl水中至終濃度為200μg/ml。
根據(jù)實(shí)施例1中所述方法進(jìn)行大腸桿菌K12菌株XL1-blue(Bullock等，同上引文)的電感受態(tài)細(xì)胞制備。
Micro Pulser系統(tǒng)(BioRad)與來(lái)自同一供應(yīng)商的電穿孔杯(電極間距2mm)一起用于電穿孔。所有步驟在4℃冷室中進(jìn)行。每個(gè)來(lái)自以上的10μl DNA溶液(2μg)與100μl細(xì)胞懸液混合，冰上溫育1分鐘，轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的電穿孔杯中。然后進(jìn)行電穿孔(5ms，12.5kV/cm)，之后懸液立即在2ml冰冷的SOC培養(yǎng)基中稀釋，之后37℃以200rpm搖60分鐘。培養(yǎng)物在含有100μg/ml氨芐青霉素的1.5L 2x YT培養(yǎng)基(2YT/Amp)中稀釋至OD550為0.5，37℃培養(yǎng)直至OD550由于細(xì)胞復(fù)制而升為0.7。通過(guò)使用總計(jì)85.5μg連接DNA，以這種方式使用共計(jì)43次電穿孔得到1.8×1010個(gè)轉(zhuǎn)化體。根據(jù)實(shí)施例7進(jìn)一步使用轉(zhuǎn)化體。
實(shí)施例7噬粒呈遞及針對(duì)來(lái)自人血小板反應(yīng)蛋白1細(xì)胞結(jié)合結(jié)構(gòu)域的8氨基酸肽(“血小板反應(yīng)蛋白肽”)篩選hNGAL突變蛋白含有轉(zhuǎn)化了質(zhì)粒載體的細(xì)胞的1500ml培養(yǎng)物(此質(zhì)粒與phNGAL12相對(duì)應(yīng)但編碼融合蛋白形式的脂卡林突變蛋白文庫(kù))用VCS-M13輔助噬菌體(stratagene)感染，感染復(fù)數(shù)約為10。培養(yǎng)物37℃下160rpm再搖另外的30分鐘。然后培養(yǎng)箱溫度降至26℃，并加入卡那霉素(70μg/ml)。10分鐘后，加入無(wú)水四環(huán)素(1875μl在DMF中的20μg/ml儲(chǔ)液)至25μg/l以誘導(dǎo)基因表達(dá)。26℃，160rpm再溫育15小時(shí)。
離心沉淀細(xì)胞(60分鐘，12500g，4℃)。含有噬粒顆粒的上清液過(guò)濾除菌(0.45μm)，與1/4體積(375ml)冰冷的20％w/v PEG8000，15％w/v NaCl混合，4℃溫育1小時(shí)。離心后(30分鐘，18500g，4℃)，沉淀的噬粒顆粒溶于60ml冷PBS中。溶液在冰上溫育60分鐘，分裝到兩個(gè)SS34離心管中。未溶解成分離心后(5分鐘，18500g，4℃)，每個(gè)上清液轉(zhuǎn)移到新離心管中。
通過(guò)與1/4體積20％w/v PEG8000，15％w/v NaCl混合來(lái)重沉淀噬粒顆粒，之后在冰上溫育60分鐘。等分噬粒(2ml)并加入1mM EDTA和50mM芐脒(Sigma)用于在-20℃長(zhǎng)期存放。
衍生自人血小板反應(yīng)蛋白1細(xì)胞結(jié)合結(jié)構(gòu)域的生物素化的合成血小板反應(yīng)蛋白肽(Tulasne等，Blood 98(2001)，3346-3352，H2N-Arg-Phe-Tyr-Val-Val-Met-Trp-Lys-Aca-Aca-Lys-生物素-COOH，SEQ ID NO18，Aca氨基己酸)與鏈霉抗生物素蛋白包被的順磁顆粒(Dynal)一起作為靶標(biāo)用于從呈遞hNGAL突變蛋白的噬粒文庫(kù)中親合富集。
為此，離心來(lái)自以上的沉淀噬粒的2ml等分試樣(20分鐘，18500g，4℃)，去除上清液，沉淀的噬粒顆粒溶于1ml PBS中。冰上溫育30分鐘后，離心溶液(5分鐘，18500g，4℃)以去除殘留的聚集物，上清液直接用于親合富集。
為了富集與肽結(jié)合的噬粒，PBS中的生物素化血小板反應(yīng)蛋白肽的825nM溶液40μl(33pmol)(通過(guò)100μl 10μM于DMF中的合成肽溶液與1112μl PBS混合制備)與260μl新制備的噬粒(2×1012-5×1012個(gè)菌落形成單位，cfu)溶液混合，室溫溫育1小時(shí)以使肽與噬粒所呈遞的突變蛋白之間可以形成復(fù)合物。然后，加入PBS中的8％w/v BSA、0.4％v/vTween 20溶液100μl。
與此平行，用100μl PBS洗100μl商業(yè)上可獲得的鏈霉抗生物素蛋白順磁顆粒(Dynal)懸液三次。此處，通過(guò)旋轉(zhuǎn)1-5ml Eppendorf管保持顆粒懸浮1分鐘，然后借助于磁鐵收集于管壁，去除上清。為了飽和非特異結(jié)合位點(diǎn)，室溫下順磁顆粒與100μl PBST中的2％w/v BSA溫育1小時(shí)。
去除上清液之后，向順磁顆粒加入生物素化血小板反應(yīng)蛋白肽和噬粒的混合物，重懸顆粒并在室溫下溫育10分鐘。最后，通過(guò)向混合物中加入10μl PBS中的4mM D-脫硫生物素(Sigma)溶液并在室溫下溫育所述混合物5分鐘來(lái)飽和鏈霉抗生物素蛋白的游離生物素結(jié)合位點(diǎn)。此步驟用于防止Strep-tag_II——作為突變蛋白和噬菌體外殼蛋白pIII片段的融合蛋白的一部分——與鏈霉抗生物素蛋白形成復(fù)合物。
用1ml含有1mM D-脫硫生物素的新鮮PBST洗滌順磁顆粒八次以去除未結(jié)合的噬粒。每次借助于磁鐵收集顆粒并移去上清液。最后通過(guò)在950μl 0.1M甘氨酸/HCl pH 2.2中重懸顆粒并溫育15分鐘，洗脫結(jié)合的噬粒。用磁鐵收集顆粒后，回收上清液并立即加入150μl 0.5M Tris中和。
為了擴(kuò)增，此噬粒溶液(1.1ml，含有107-1010cfu，這依賴于篩選循環(huán))很快地升溫至37℃，與3ml大腸桿菌XL1-blue對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期培養(yǎng)物(OD550＝0.5，37℃時(shí))混合，37℃200rpm溫育30分鐘。隨后沉淀感染有噬粒的細(xì)胞(2分鐘，4420g，4℃)，在600μl培養(yǎng)基中重懸，鋪于三個(gè)含有100μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)平板(LB/Amp；直徑140mm)上。
32℃溫育14小時(shí)后，從瓊脂平板上刮取細(xì)胞，每個(gè)平板加入10ml 2xYT/Amp培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移到無(wú)菌三角瓶中，37℃200rpm搖20分鐘以完全重懸。
對(duì)于噬粒顆粒的另一輪生產(chǎn)和親合富集，將0.2-1ml所述懸液接種入37℃預(yù)熱的50ml 2x YT/Amp培養(yǎng)基中，以至于細(xì)胞密度為OD550＝0.08。37℃160rpm溫育此培養(yǎng)物至細(xì)胞密度為OD550＝0.5。然后用VCS-M13輔助噬菌體(Stratagene)感染培養(yǎng)物，感染復(fù)數(shù)約為10，之后37℃160rpm再搖培養(yǎng)物30分鐘。隨后加入卡那霉素(70μg/ml)，培養(yǎng)箱溫度降低至26℃，10分鐘后加入無(wú)水四環(huán)素至25μg/L以誘導(dǎo)基因表達(dá)。26℃160rpm再溫育15小時(shí)。
離心沉淀細(xì)胞(15分鐘，12000g，4℃)。含有噬粒顆粒的上清液過(guò)濾除菌(0.45μm)，與1/4體積(12.5ml)20％w/v PEG8000，15％w/vNaCl混合，冰上溫育1小時(shí)。離心后(20分鐘，18000g，4℃)，沉淀的噬粒顆粒溶于2ml冷PBS中。冰上溫育溶液30分鐘，并分入兩個(gè)1.5ml反應(yīng)管中。未溶解成分離心后(5分鐘，18500g，4℃)，每個(gè)上清液轉(zhuǎn)移到新反應(yīng)管中。
通過(guò)與1/4體積20％w/v PEG8000，15％w/v NaCl混合，重新沉淀噬粒顆粒，之后冰上溫育60分鐘。離心后(20分鐘，18500g，4℃)，去除上清液，沉淀的噬粒顆粒溶于1ml PBS。冰上溫育30分鐘后離心溶液(5分鐘，18500g，4℃)，上清液直接用于親合富集。這樣用血小板反應(yīng)蛋白肽再進(jìn)行五個(gè)篩選循環(huán)。
實(shí)施例8使用“菌落篩查”法鑒定與血小板反應(yīng)蛋白肽結(jié)合的hNGAL突變蛋白為了與Strep-Tag_II和白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域形成融合蛋白的hNGAL突變蛋白的分析生產(chǎn)，將兩個(gè)BstXI切割位置間的基因盒從載體phNGAL12亞克隆到phNGAL7上。
為此，使用Plasmid Midi kit(Qiagen)從大腸桿菌克隆混合物中分離質(zhì)粒DNA，此克隆混合物是由來(lái)自實(shí)施例7作為第四和第五個(gè)篩選循環(huán)的結(jié)果洗脫的噬粒感染而得到的。用限制酶BstXI切割兩個(gè)制品的DNA，每種情況下均用如實(shí)施例6所述的制備型瓊脂糖凝膠電泳純化兩個(gè)片段的較小者(347bp)。用BstXI切割載體phNGAL7的DNA并以同樣的方法分離兩個(gè)片段的較大者(3971bp)。
為了連接，分離的小DNA片段每個(gè)100fmol各與100fmol大DNA片段混合，并與1.5 Weiss單位T4 DNA連接酶(Promega)混合，總計(jì)體積為20μl(30mM Tris/HCl pH 7.8，10mM MgCl2，10mM DTT，1mMATP)，之后16℃溫育過(guò)夜。使用CaCl2法(Sambrook等，同上引文)用此連接混合物各2μl分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1-F-(大腸桿菌K12 TG1，通過(guò)在無(wú)選擇條件下重復(fù)培養(yǎng)丟失了其附加體)，得到2.0ml細(xì)胞懸液。100μl此懸液鋪于含有LB/Amp培養(yǎng)基的瓊脂平板上，37℃溫育14小時(shí)。
兩個(gè)親水的PVDF膜(Millipore，GVWP型，孔徑大小0.22μm)在一個(gè)位置作上標(biāo)記并剪成合適大小，鋪在LB/Amp瓊脂平板上。來(lái)自這兩批轉(zhuǎn)化的150μl細(xì)胞懸液離心(5000g，2分鐘4℃)并在500μl培養(yǎng)基中重懸，均一地鋪到這些膜上。瓊脂平板37℃溫育7.5小時(shí)直至菌落達(dá)到約0.5mm大小。
同時(shí)，將也剪成合適大小的兩張疏水膜(Millipore，Immobilon P，孔徑大小0.45μm)根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明書用PBS浸濕。隨后每個(gè)在10mg/ml人血清白蛋白(HSA，Sigma)的10ml PBS溶液中室溫下攪動(dòng)4小時(shí)。膜上剩余的結(jié)合位點(diǎn)通過(guò)室溫下與20ml在PBS中的3％w/v BSA，0.5％v/vTween 20溫育2小時(shí)以飽和。膜洗滌兩次，每次用20ml PBS洗10分鐘。之后在加有200μg/L無(wú)水四環(huán)素的10ml LB/Amp培養(yǎng)基中浸泡10分鐘。
最后，給它們?cè)谝粋€(gè)位置處作上標(biāo)記，并置于另外含有200μg/L無(wú)水四環(huán)素的LB/Amp瓊脂培養(yǎng)平板上。將來(lái)自上面且其上有菌落長(zhǎng)出的親水膜置于疏水膜上，使兩個(gè)標(biāo)記重疊。每個(gè)培養(yǎng)板與兩張膜一起22℃溫育15小時(shí)。在此期間，上層膜上的菌落各分泌出相應(yīng)的hNGAL突變蛋白并通過(guò)其白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域固定于下層膜的HSA上。
此后，有菌落的上層膜轉(zhuǎn)移到新鮮LB/Amp瓊脂平板上，4℃存放。取出疏水膜并洗滌三次，每次用20ml PBST洗5分鐘。
為了分析固定化的hNGAL突變蛋白的結(jié)合活性，然后膜在10ml生物素化血小板結(jié)合蛋白肽在PBS中的10μg/ml溶液中溫育1小時(shí)(DMF中的1mM生物素化肽儲(chǔ)液因此在PBST中1∶100稀釋)。用PBST洗膜三次，之后與10ml抗生物素蛋白-堿性磷酸酶綴合物(Sigma，PBST中1∶40，000稀釋)溫育1小時(shí)，以通過(guò)生物素基團(tuán)檢測(cè)結(jié)合的肽。兩次PBST和一次PBS洗膜，每次5分鐘，并在AP緩沖液(0.1M Tris/HClpH8.8，0.1M NaCl，5mM MaCl2)中攪動(dòng)10分鐘。對(duì)于顯色反應(yīng)，膜與10ml AP緩沖液溫育，向其中加入30μl 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸4-甲苯胺鹽(Roth，溶于二甲基甲酰胺中50μg/ml)和5μl氮藍(lán)四唑(Roth，在70％v/v二甲基甲酰胺中75μg/ml)，直到在某些菌落位置出現(xiàn)明顯的顏色信號(hào)。
培養(yǎng)來(lái)自相應(yīng)親水膜的、在疏水膜上產(chǎn)生強(qiáng)烈顏色斑點(diǎn)的19個(gè)菌落(9個(gè)分離自第4個(gè)淘選循環(huán)，10個(gè)來(lái)自第5個(gè)淘選循環(huán))。分離它們的質(zhì)粒DNA，根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明書用Big Dye Terminator循環(huán)測(cè)序試劑盒以及Genetic Analyzer 310系統(tǒng)(Applied Biosystems)對(duì)hNGAL基因盒進(jìn)行序列分析，其中用寡脫氧核苷酸SEQ ID NO11作為測(cè)序引物。
19個(gè)測(cè)序的克隆顯示只有12個(gè)不同序列，命名為RFY-A、RFY-B、RFY-C、RFY-D、RFY-E、RFY-F、RFY-G、RFY-H、RFY-I、RFY-J、RFY-K和RFY-L。RFY-B克隆出現(xiàn)兩次，RFY-C克隆出現(xiàn)6次。RFY-J克隆顯示有3個(gè)核苷酸缺失，導(dǎo)致位于第4個(gè)肽環(huán)內(nèi)第125位的一個(gè)氨基酸缺失。琥珀終止密碼子在supE抑制菌株中翻譯成氨基酸谷氨酰胺，并在RFY-L克隆中鑒定到。克隆的核苷酸序列翻譯成氨基酸序列，偏離最初的hNGAL的那些氨基酸在表2a，b中給出。在序列表SEQ ID NO23、SEQ ID NO25和SEQ ID NO27中也給出了突變蛋白R(shí)FY-B、RFY-C和RFY-E的核苷酸序列。在序列表SEQ ID NO24、SEQ ID NO26和SEQ ID NO28中給出了這些突變蛋白的氨基酸序列。
選擇分別出現(xiàn)兩次和六次的突變蛋白R(shí)FY-B和RFY-C，用于詳細(xì)鑒定它們的結(jié)合活性。另外，選擇突變蛋白R(shí)FY-E，因?yàn)樵陔S機(jī)化區(qū)域中其氨基酸組成顯示很大程度上的獨(dú)特性。
表2a所選hNGAL突變蛋白的序列特征位置hNGAL RFY-A RFY-B RFY-C RFY-D RFY-E RFY-F RFY-G RFY-H40 AlaPheGlyGlyThrGlyLeuSerMet42 LeuGluThrHisProThrPheGlyVal44 GluLeuTyrLeuLeuValAlaProLeu46 LysSerArgAsnValThrLeuSerIle47 AspArgLeuValLeuLeuPheLeuPro49 GlnPheSerProThrSerHisArgAsn50 LysThrValAsnGluArgArgLeuVal70 LeuMetAspAspIleProThrHisPro72 ArgPheTrpLeuMetMetSerLysPro73 LysSerAlaMetAspGlySerAsnSer77 AspLeuAsnProLeuLysSerProGly79 TrpLeuLysPheProLysLysLysGlu101 ProPheLeuProAspMetProCysArg102 GlyLeuGlyPheAlaSerPheValGly103 LeuAspLeuLeuLeuAsnSerAlaAsp125 LysAsnProAsnProGlnProGluArg127 SerSerGlyProLysHisIleLeuLeu128 GlnGlnGlyArgAsnLysSerAsnLys130 ArgArgIleTyrTrpProProProGln132 TyrTyrTrpGluLysSerProLeuIle106 Phe°
表2b所選hNGAL突變蛋白的序列特征位置 hNGAL RFY-I RFY-J RFY-K RFY-L40 Ala Cys Arg Gln Ser42 Leu Gly Leu Pro Pro44 Glu Leu Cys Lys Ser46 Lys Ser Pro His Leu47 Asp Phe Phe Leu Ala49 Gln Ash Val Ser Gly50 Lys Gly Arg Leu Gln*70 Leu Lys Lys Pro Thr72 Arg His Glu Lys Asn73 Lys Gly Arg Met Ala77 Asp Arg Ala Pro Ser79 Trp Thr His Ile Arg101Pro Gly Lys Ala Asn102Gly Ser Phe Trp Phe103Leu Cys Ser Glu Ser125Lys Met ΔΔΔThr Lys127Ser Leu Pro Gly Lys128Gln Asn Ser Thr Lys130Arg Asn Ile Pro Asp132Tyr Ser Glu Thr Pro106Tyr Ser°126Val Pro°*此谷氨酰胺殘基由琥珀終止密碼子編碼。
°這些氨基酸替換由隨機(jī)化位置外的偶然突變引起。
Δ此氨基酸缺失由隨機(jī)化位置外的偶然突變引起。
實(shí)施例9制備hNGAL突變蛋白為了獲自實(shí)施例8的hNGAL突變蛋白R(shí)FY-B、RFY-C和RFY-E的制備性生產(chǎn)，將兩個(gè)BstXI切割位置之間的誘變編碼區(qū)從phNGAL7載體亞克隆到表達(dá)質(zhì)粒phNGAL15上(圖7)。因此獲得編碼突變蛋白的融合蛋白的質(zhì)粒，此融合蛋白中突變蛋白在氨基端有OmpA信號(hào)序列而在羧基端有Strep-Tag_II親合標(biāo)簽。
為了亞克隆，編碼相關(guān)突變蛋白的質(zhì)粒DNA用限制酶BstXI切割，用如實(shí)施例6所述的制備型瓊脂糖凝膠電泳純化兩個(gè)片段的較小者(347bp)。以同樣方式，用BstXI切割phNGAL15載體DNA，分離兩個(gè)片段的較大者(3398bp)。
將1.5 Weiss單位T4 DNA連接酶(Promega)加入兩個(gè)DNA片段(每個(gè)50fmol)中，總計(jì)體積20μl(30mM Tris/HCl pH7.8，10mM MgCl2，10mM DTT，1mM ATP)，混合物16℃溫育16小時(shí)以連接。然后根據(jù)CaCl2方法，5μl連接混合物用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM83(Yanisch-Perron等，Gene 33(1985)，103-119)，得到2.0ml細(xì)胞懸液。100μl此懸液鋪于LB/Amp培養(yǎng)基的瓊脂平板上，37℃溫育14小時(shí)。
大腸桿菌JM83轉(zhuǎn)化體單菌落用于接種100ml LB/Amp培養(yǎng)基，之后30℃200rpm溫育過(guò)夜。然后用40ml此預(yù)培養(yǎng)物接種5L三角瓶中的2LLB/Amp培養(yǎng)基，22℃ 200rpm搖至OD550＝0.5。通過(guò)加入200μg/L無(wú)水四環(huán)素(200μl于DMF中的2mg/ml儲(chǔ)液)之后22℃200rpm再搖3小時(shí)進(jìn)行誘導(dǎo)。
離心來(lái)自一個(gè)三角瓶的細(xì)胞(15分鐘，4420g，4℃)，去除上清液之后，在20ml預(yù)冷周質(zhì)釋放緩沖液(100mM Tris/HCl pH8.0，500mM蔗糖，1mM EDTA)中重懸，冰上溫育30分鐘。在兩個(gè)連續(xù)的離心步驟中(15分鐘，4420g，4℃和15分鐘，30000g，4℃)去除原生質(zhì)球。在CP緩沖液(100mM Tris/HCl pH8.0，150mM NaCl，1mM EDTA)中進(jìn)行含有周質(zhì)蛋白抽提物的上清液的透析，之后過(guò)濾除菌，用于hNGAL突變蛋白的層析純化。
純化方法基于C端Strep-Tag_II親合標(biāo)簽(Schmidt等，同上引文)。在本情況下，使用鏈霉抗生物素蛋白突變蛋白“1”(德國(guó)專利19641876,3；Voss和Skerra，同上引文)，它與NHS活化的Sepharose(Pharmacia)偶連，每1ml基質(zhì)柱床體積產(chǎn)生5mg/ml固定化的鏈霉抗生物素蛋白。
用此材料填裝的4ml柱床體積層析柱用20ml CP緩沖液在4℃平衡，流速為40ml/h，通過(guò)在流通式光度計(jì)中測(cè)量洗脫物在280nm的吸收來(lái)監(jiān)測(cè)層析。周質(zhì)蛋白抽提物上樣之后，用CP緩沖液洗柱子直到達(dá)到基線，隨后用在CP緩沖液中的2.5mM D-脫硫生物素(Sigma)溶液10ml洗脫結(jié)合的hNGAL突變蛋白。通過(guò)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(Fling和Gregerson，同上引文)檢查含有純化的hNGAL突變蛋白的級(jí)分并合并。為得到對(duì)于進(jìn)一步使用合適的蛋白濃度和緩沖液條件，使用Centricon管YM 10(MW-截留值1000，Millipore)超濾將突變蛋白合并物濃縮至終體積約500μl，隨后對(duì)HBS緩沖液(150mM NaCl，10mM HEPES pH7.4，3mMEDTA)透析。RFY-B、RFY-C和RFY-E的蛋白產(chǎn)量分別是70μg，60μg和200μg每1L培養(yǎng)物。這樣制備了原始hNGAL和其突變蛋白R(shí)FY-B、RFY-C和RFY-E。
實(shí)施例10在ELISA中測(cè)量hNGAL突變蛋白對(duì)血小板反應(yīng)蛋白肽的親合力為了在ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)中檢測(cè)結(jié)合，微量滴定板(Maxisorb，Nunc)的每個(gè)孔加入50μl抗生物素蛋白(Fluka)在PBS中的50μg/ml溶液，室溫(RT)下過(guò)夜溫育。用PBST洗三次后，向孔中加入50μl生物素化血小板反應(yīng)蛋白肽SEQ ID NO18在PBST中的1μM溶液，通過(guò)在生物素與預(yù)吸附的抗生物素蛋白之間形成復(fù)合物來(lái)固定該肽。溫育1小時(shí)后，去除溶液，用PBST洗微量滴定板的孔三次。為了飽和非特異結(jié)合位點(diǎn)，孔中加入100μl在PBST中的4％w/v BSA，室溫下溫育1小時(shí)，之后用PBST洗三次。
然后制備來(lái)自實(shí)施例9的突變蛋白的稀釋系列，濃度起始自100nM，之后室溫下溫育1小時(shí)。對(duì)于抗生素蛋白的非特異結(jié)合，作為對(duì)照，向孔中加入hNGAL及其突變蛋白的相似稀釋系列，而省去血小板反應(yīng)蛋白肽。用PBST洗三次之后，向孔中加入抗-Strep II-抗體-HRP-綴合物(IBA)(用PBST以1∶8000稀釋)。室溫下1小時(shí)溫育，之后用PBST洗三次用PBS洗兩次。
用3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺和H2O2作為辣根過(guò)氧化物酶的底物完成對(duì)結(jié)合的hNGAL突變蛋白的檢測(cè)。為此，向孔中加入100μl現(xiàn)成的HRP-底物溶液(Biochem，Immuosystems)，幾分鐘后加入100μl 0.3M硫酸來(lái)終止顯色。通過(guò)在Spectra Max 250光度計(jì)(Molecular Devices)中450nM的終點(diǎn)吸收測(cè)量產(chǎn)物形成。
根據(jù)[p·L]＝([P]t[L]t)/(KD+[P]t)等式在計(jì)算機(jī)程序Kaleidagraph(Synergy軟件)幫助下通過(guò)非線性最小二乘方回歸來(lái)擬合曲線。在此，[P]t是固定化血小板反應(yīng)蛋白肽的總濃度(以A450單位表示)，[L]t是上樣的突變蛋白或hNGAL的濃度，[P·L]是形成的復(fù)合物的濃度(以A450單位表示)，KD是表觀解離常數(shù)。
圖8中描述了所得的結(jié)合曲線。獲得的hNGAL突變蛋白與血小板反應(yīng)蛋白肽之間復(fù)合物的表觀解離常數(shù)的數(shù)值總結(jié)于下表hNGAL變體 KD[nM]hNGAL -*RFY-B 4.3±0.2RFY-C 4.6±0.6RFY-E 8.2±0.8*未能檢測(cè)到結(jié)合活性實(shí)施例11用SPR測(cè)量hNGAL突變蛋白時(shí)血小板反應(yīng)蛋白肽的親合力使用BIAcore X系統(tǒng)(BIACDRE)通過(guò)表面等離子體共振(SPR)測(cè)定hNGAL突變蛋白對(duì)血小板反應(yīng)蛋白肽SEQ ID NO18的結(jié)合親合力。首先，根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明書，把35μl濃度為1μg/ml的生物素化血小板反應(yīng)蛋白肽(通過(guò)將1μl于DMF中的200μg/ml肽溶液與199μl含有150mM NaCl，10mM HEPES pH 7.4，3mM EDTA的HBS緩沖液混合制備)固定于鏈霉抗生物素蛋白包被的傳感器芯片SA(BIACORE)的一個(gè)流體通道的表面，得到約400反應(yīng)單位(RU)的量。然后，35μl在HBS緩沖液中的來(lái)自實(shí)施例9的每個(gè)純化突變蛋白以濃度為500nM-25nM上樣，使用HBS-EP(含有0.005％表面活性劑P20的HBS)作為流動(dòng)緩沖液并且連續(xù)流速為5μl/分鐘，測(cè)量hNGAL突變蛋白的結(jié)合曲線。
針對(duì)每個(gè)所用蛋白濃度，對(duì)固定有血小板反應(yīng)蛋白肽的通道在注射期末測(cè)量穩(wěn)態(tài)共振值。在傳感器芯片的第二通道——它用作對(duì)照——只檢測(cè)到可忽略的緩沖液效應(yīng)。這些值直接對(duì)hNGAL突變蛋白濃度作圖。
根據(jù)[P·L]＝([P]t[L]t)/(KD+[P]t)等式在計(jì)算機(jī)程序Kaleidagraph(Synergy軟件)下通過(guò)非線性最小二乘方回歸來(lái)擬合曲線。在此，[P]t是固定化血小板反應(yīng)蛋白肽的總濃度(以RU為單位)，[L]t是上樣的突變蛋白或hNGAL的濃度，[P·L]是形成的復(fù)合物的濃度(以RU為單位)，KD是在平衡條件下的解離常數(shù)。
圖9中描述了得到的結(jié)合曲線。通過(guò)SPR測(cè)量得到的hNGAL突變蛋白和血小板反應(yīng)蛋白肽之間的復(fù)合物解離常數(shù)值總結(jié)于下表hNGAL變體 KD[nM]hNGAL -*RFY-B 105.4±6.5RFY-C 106.1±15.7RFY-E 107.2±11.4*未能檢測(cè)到結(jié)合活性實(shí)施例12篩選針對(duì)人白介素-8(IL-8)的hNGAL突變蛋白重組人細(xì)胞因子白介素-8(Baggiolini和Clark-Lewis，F(xiàn)EBS Lett.397，(1992)，97-101；H2N-AVLPRSAKELRCQCIKTYSKPFHPKFIKELRVIESGPHCANTEIIVKLSDGRELCLDPKENWVQRVVEKFLKRAENS-COOH；SEQ ID NO29)與生物素基團(tuán)綴合并作為靶用于在鏈霉抗生物素蛋白包被的順磁顆粒(Dynal)存在下從呈遞hNGAL突變蛋白的噬粒文庫(kù)中親合富集。
綴合物通過(guò)混合溶于3.4μl H2O中的5.6nmol(12.5μg)2-(生物素酰氨基)乙基-1，3-二硫代丙酸磺基琥珀酰亞胺酯(NHS-SS-生物素，Pierce)與溶于50μl H2O中的1.4nmol(12.5μg)人重組IL-8(Promocell)、36.6μl水及10μl 10x濃縮PBS/NaOH pH8.5而得到。室溫下攪動(dòng)1小時(shí)溫育混合物。然后根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明書用PBS/NaOH pH8.5為流動(dòng)緩沖液通過(guò)PD-10凝膠過(guò)濾柱(Pharmacia)從IL-8綴合物中去除過(guò)量的試劑。從PD-10柱中洗脫的生物素化IL-8用同樣的緩沖液調(diào)整到終濃度為1μM，產(chǎn)生總體積1.24ml。-80℃以等分試樣存放標(biāo)記的IL-8，用前直接解凍。
為了分離展示有對(duì)IL-8具有親合力的突變蛋白的噬粒，在-20℃長(zhǎng)期存放的如實(shí)施例7中獲得的沉淀噬粒的一個(gè)等分試樣解凍并沉淀噬粒(20分鐘，18500g，4℃)。去除上清液之后，沉淀的噬粒顆粒溶于270μl PBS中，冰上溫育30分鐘，最后離心(5分鐘，18500g，4℃)以去除殘留的聚集物。
為了富集與IL-8結(jié)合的噬粒，30μl生物素化白介素-8的1μM溶液(30pmol)與270μl于PBS中的噬粒(約1013cfu)混合，室溫溫育1小時(shí)，以允許細(xì)胞因子和噬粒呈遞的突變蛋白之間形成復(fù)合物。然后，加入100μl于PBS中的8％w/v BSA，0.4％v/v Tween 20溶液。
與此平行，用1ml PBS洗100ml商業(yè)上可獲得的鏈霉抗生物素蛋白-順磁顆粒(Dynal)懸液三次。此處，通過(guò)旋轉(zhuǎn)1.5ml Eppendorf管保持顆粒懸浮1分鐘，然后借助于磁鐵收集于管壁，去除上清。為了飽和非特異結(jié)合位點(diǎn)，室溫下順磁顆粒與1ml于PBST中的2％(w/v)BSA溫育1小時(shí)。
去除如上上清液之后，向順磁顆粒中加入生物素化IL-8和噬粒的混合物，重懸顆粒并在室溫下溫育10分鐘。最后，通過(guò)向混合物中加入10μl于PBS中的4mM D-脫硫生物素(Sigma)溶液并在室溫下溫育所述混合物5分鐘，以飽和鏈霉抗生物素蛋白的游離生物素結(jié)合位點(diǎn)。此步驟用于防止Strep-tag_II——作為突變蛋白和噬菌體外殼蛋白pIII片段的融合蛋白的一部分——與鏈霉抗生物素蛋白形成復(fù)合物。
用1ml含有1mM D-脫硫生物素的新鮮PBST洗滌順磁顆粒1分鐘八次以去除未結(jié)合的噬粒。每次借助于磁鐵收集顆粒并吸出上清液。最后，通過(guò)在1ml含有1mM脫硫生物素和100mM DTT的PBST中重懸顆粒，在還原條件下洗脫結(jié)合的噬粒。溶液在37℃溫育1小時(shí)以還原在IL-8和生物素之間的接頭分子中所含的二硫鍵，由此從小珠上釋放特異結(jié)合IL-8的噬粒。
為了擴(kuò)增，將洗脫的噬粒溶液(1.0ml，含有107-108cfu，依賴于篩選循環(huán))很快地升溫至37℃，與3ml大腸桿菌XL1-blue對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期培養(yǎng)物(OD550＝0.5，37℃時(shí))混合，37℃，200rpm搖30分鐘。沉淀被感染的細(xì)胞(2分鐘，4420g，4℃)，在600μl培養(yǎng)基中重懸，鋪于三個(gè)含有100μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)平板上(LB/Amp；直徑140mm)。
32℃溫育14小時(shí)后，從瓊脂平板上刮取菌苔，每個(gè)平板加入10ml 2xYT/Amp培養(yǎng)基，懸液轉(zhuǎn)移到無(wú)菌三角瓶中，37℃以200rpm搖20分鐘。
對(duì)于噬粒顆粒的另一輪生產(chǎn)和親合富集，將0.2-1ml所述懸液接種入37℃預(yù)熱的50ml 2 x YT/Amp培養(yǎng)基中，以至于細(xì)胞密度為OD550＝0.08。37℃160rpm溫育此培養(yǎng)物至細(xì)胞密度為OD550＝0.5。然后，用VCS-M13輔助噬菌體(Stratagene)感染培養(yǎng)物，感染復(fù)數(shù)約為10，37℃160rpm再搖培養(yǎng)物30分鐘。隨后加入卡那霉素(70μg/ml)，培養(yǎng)箱溫度降低至26℃，10分鐘后加入無(wú)水四環(huán)素至25μg/L以誘導(dǎo)基因表達(dá)。26℃160rpm再溫育15小時(shí)。
離心沉淀細(xì)胞(15分鐘，12000g，4℃)。含有噬粒顆粒的上清液過(guò)濾除菌(0.45μm)，與1/4體積(12.5ml)20％w/v PEG8000，15％w/vNaCl混合，冰上溫育1小時(shí)。離心后(20分鐘，18000g，4℃)，沉淀的噬粒顆粒溶于2ml冷PBS中。冰上溫育溶液30分鐘，并分入兩個(gè)1.5ml反應(yīng)管中。未溶解成分離心后(5分鐘，18500g，4℃)，每個(gè)上清液轉(zhuǎn)移到新反應(yīng)管中。
通過(guò)與1/4體積20％w/v PEG8000，15％w/v NaCl混合，重新沉淀噬粒顆粒，之后冰上溫育60分鐘。離心后(20分鐘，18500g，4℃)，去除上清液，沉淀的噬粒顆粒溶于270μl PBS中。冰上溫育30分鐘后離心溶液(5分鐘，18500g，4℃)，上清液直接用于親合富集。這樣用IL-8再進(jìn)行四個(gè)篩選循環(huán)。
實(shí)施例13用“菌落篩查”法鑒定與白介素-8結(jié)合的hNGAL突變蛋白為了如實(shí)施例3所述方法分析型生產(chǎn)與Strep-Tag_II和白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域形成融合蛋白的hNGAL突變蛋白，將兩個(gè)BstXI切割位置間的基因盒從載體phNGAL12亞克隆到phNGAL7上。
為此，使用Plasmid Midi Kit(Qiagen)從大腸桿菌克隆混合物中分離質(zhì)粒DNA，此克隆混合物是由來(lái)自實(shí)施例12在第五個(gè)篩選循環(huán)后洗脫的噬粒感染而得到的。用限制酶BstXI切割DNA，用如實(shí)施例6所述的制備型瓊脂糖凝膠電泳純化兩個(gè)片段的較小者(347bp)。用BstXI切割載體phNGAL7的DNA并以同樣的方法分離兩個(gè)片段的較大者(3971bp)。
為了連接，100fmol分離的小DNA片段與100fmol大DNA片段混合，并與1.5 Weiss單位T4 DNA連接酶(Promega)溫育，共計(jì)體積20μl(30mM Tris/HClpH 7.8，10mM MgCl2，10mM DTT，1mM ATP)，之后16℃過(guò)夜溫育。根據(jù)CaCl2法(Sambrook等，同上引文)用4μl此連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1-F-(大腸桿菌K12 TG1，它在非選擇條件下重復(fù)培養(yǎng)丟失其附加體)，得到2.0ml細(xì)胞懸液。離心細(xì)胞懸液(5000g，2分鐘，4℃)，在100μl培養(yǎng)基中重懸，鋪于含有LB/Amp培養(yǎng)基的瓊脂平板上，37℃溫育14小時(shí)以測(cè)定轉(zhuǎn)化效率。
將親水PVDF膜(Millipore，GVWP型，孔徑大小0.22μm)在一個(gè)位置處作上標(biāo)記并剪成合適大小，置于LB/Amp瓊脂平板上。已經(jīng)用5-10μl上述連接混合物轉(zhuǎn)化的一批新轉(zhuǎn)化的細(xì)胞懸液離心(5000g，2分鐘，4℃)，在100μl培養(yǎng)基中重懸，均一鋪于此膜上，以獲得400-500個(gè)菌落。瓊脂平板37℃溫育7.5小時(shí)至菌落達(dá)到約0.5mm大小。
同時(shí)，取一張疏水膜(Millipore，Immobilon P，孔徑大小0.45μm)也剪成合適大小，根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明書用PBS浸濕。通過(guò)在10mg/ml HSA(Sigma)的10ml PBS溶液中室溫下攪動(dòng)4小時(shí)，完成用HSA的包被。通過(guò)室溫下與20ml于PBS中的3％(w/v)BSA，0.1％(v/v)Tween-20溫育2小時(shí)來(lái)飽和膜上的剩余結(jié)合位點(diǎn)。用20ml PBS洗兩次膜10分鐘，之后在其中加有200μg/L無(wú)水四環(huán)素的10ml LB/Amp培養(yǎng)基中浸泡10分鐘。
最后，膜在一個(gè)位置處作上標(biāo)記并置于另外加有200μg/L無(wú)水四環(huán)素的LB/Amp瓊脂培養(yǎng)平板上。將來(lái)自上面的其上菌落已長(zhǎng)出的親水膜置于疏水膜上以使兩個(gè)標(biāo)記重疊。培養(yǎng)板與兩張膜22℃溫育15小時(shí)。在此期間，上層膜上的菌落各分泌出相應(yīng)hNGAL突變蛋白，通過(guò)蛋白的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域和下層膜上的HAS，突變蛋白被固定于下層膜上。
此后，有菌落的上層膜轉(zhuǎn)到新LB/Amp瓊脂平板上，4℃存放。取下疏水膜并洗滌三次，每次用20ml PBST洗5分鐘。
為了分析固定化的hNGAL突變蛋白的結(jié)合活性，膜在3.5ml地高辛化IL-8于PBS中的100nM溶液中溫育1小時(shí)。
通過(guò)溶于2.3μlDMSO中的14n mol(9.2μg)地高辛配基-3-O-甲基羰基-ε-氨基己酸N-羥基琥珀酰亞胺酯(DIG-NHS，Roche)與溶于50μl水中的1.4n mol(12.5μg)人重組IL-8(Promocell)、37.7μl水和10μl 10x濃縮PBS/NaOH pH8.5混合，制備綴合物。攪動(dòng)下混合物室溫溫育1小時(shí)。根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明書用PBS/NaOH pH8.5為流動(dòng)緩沖液，通過(guò)PD-10凝膠過(guò)濾柱(Pharmacia)從IL-8綴合物中去除多余的試劑。用同樣的緩沖液將從PD-10柱上洗脫的地高辛化IL-8調(diào)整至終濃度為1μM，得到總體積1.56ml。-80℃以等分試樣存放標(biāo)記的IL-8，用前直接解凍。
用PBST洗三次膜，之后與10ml在PBST中1∶1000稀釋的抗-地高辛配基Fab-堿性磷酸酶綴合物溫育1小時(shí)，以通過(guò)IL-8的地高辛基團(tuán)檢測(cè)結(jié)合的IL-8。膜用PBST洗兩次，用PBS洗一次，每次5分鐘，并在AP緩沖液中攪動(dòng)10分鐘。為了顯色反應(yīng)，膜在10ml AP緩沖液中溫育，向其中加入30μl 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸4-甲苯胺鹽(Roth，在二甲基甲酰胺中50μg/ml)和5μl氮藍(lán)四唑(Roth，在70％v/v二甲基甲酰胺中75μg/ml)，直到在某些菌落的位置出現(xiàn)明顯的顏色信號(hào)。
從在膜上出現(xiàn)的200個(gè)菌落中，9個(gè)在疏水膜上出現(xiàn)強(qiáng)烈顏色斑點(diǎn)，從相應(yīng)的親水膜上培養(yǎng)此9個(gè)克隆。分離其質(zhì)粒DNA，根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明書使用Big Dye Terminator循環(huán)測(cè)序試劑盒和Genetic Analyzer 310系統(tǒng)(Applied Biosystems)對(duì)hNGAL基因盒進(jìn)行序列分析，測(cè)序使用寡脫氧核苷酸SEQ ID NO5作為引物。
所有9個(gè)克隆顯示同一序列，說(shuō)明在篩選過(guò)程中僅一個(gè)突變蛋白被優(yōu)先富集。此突變蛋白命名為變體N4。
N4克隆的核苷酸序列翻譯成氨基酸序列，偏離自初始hNGAL蛋白的那些氨基酸殘基在表3中給出。SEQ ID NO30和SEQ ID NO34中也給出了突變蛋白N4的核苷酸序列和全長(zhǎng)氨基酸序列。
表3hNGAL突變蛋白N4的序列特征位置 hNGALN440 Ala Asp42 Leu Tyr44 Glu Ala46 Lys Ser47 Asp Leu49 Gln Gly50 Lys Leu70 Leu Val72 Arg Tyr73 Lys Asp77 Asp Val79 Trp Ser101 Pro Glu102 Gly Ala103 Leu Val125 Lys Asp127 Ser Arg128 Gln Pro130 Arg Ser132 Tyr Glu
實(shí)施例14制備hNGAL突變蛋白N4對(duì)于獲自實(shí)施例13的hNGAL突變蛋白N4的制備型生產(chǎn)，從在phNGAL7中的此變體分離出BstXI盒并亞克隆到表達(dá)質(zhì)粒phNGAL15(圖7)上。產(chǎn)生的質(zhì)粒編碼在其氨基端有OmpA信號(hào)序列并在其羧基端有Strep-Tag_II親合標(biāo)簽的突變蛋白N4的融合蛋白。
為了亞克隆，編碼相關(guān)突變蛋白的phNGAL7質(zhì)粒DNA用限制酶BstXI切割，如實(shí)施例6所述用制備型瓊脂糖凝膠電泳純化兩個(gè)片段的較小者(347bp)。以同樣方法，用BstXI切割phNGAL15載體DNA，分離兩個(gè)片段的較大者(3398bp)。
將1.5 Weiss單位T4 DNA連接酶(Promega)加入兩個(gè)DNA片段(每個(gè)50fmol)中，共計(jì)體積20μl(30mM Tris/HCl pH7.8，10mM MgCl2，10mM DTT，1mM ATP)，混合物16℃溫育16小時(shí)用于連接。然后根據(jù)CaCl2方法用5μl此連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM83(Yanisch-Perron等，同上引文)，得到2.0ml細(xì)胞懸液。100μl此懸液鋪于含有LB/Amp培養(yǎng)基的瓊脂上，37℃溫育14小時(shí)。
大腸桿菌JM83轉(zhuǎn)化體單菌落用于接種100ml LB/Amp培養(yǎng)基，之后30℃200rpm過(guò)夜溫育。然后用40ml此預(yù)培養(yǎng)物接種5L三角瓶中的2LLB/Amp培養(yǎng)基，22℃200rpm搖至OD550＝0.5。通過(guò)加入200μg/L無(wú)水四環(huán)素(200μl于DMF中的2mg/ml儲(chǔ)液)誘導(dǎo)突變蛋白N4的表達(dá)，溫育再進(jìn)行3小時(shí)。
離心來(lái)自一個(gè)三角瓶中的細(xì)胞(15分鐘，5571g，4℃)，去除上清液后，在20ml預(yù)冷的周質(zhì)釋放緩沖液(100mM Tris/HCl pH8.0，500mM蔗糖，1mM EDTA)中重懸，冰上溫育30分鐘。在兩個(gè)連續(xù)離心步驟(15分鐘，2988g，4℃和15分鐘，25000g，4℃)中去除原生質(zhì)球。在CP緩沖液(100mM Tris/HCl pH8.0，150mM NaCl，1mM EDTA)中透析含有周質(zhì)蛋白抽提物的上清液，之后過(guò)濾除菌，用于hNGAL突變蛋白的層析純化。
純化方法基于C端Strep-Tag_II親合標(biāo)簽(Schmidt等，同上引文)，使用Strep-Tactin_Superflow材料(IBA)。填充有此材料的4ml柱床體積的層析柱用20ml CP緩沖液在4℃平衡，流速為2ml/分鐘。通過(guò)在流通式光度計(jì)中測(cè)量280nm吸收來(lái)監(jiān)測(cè)層析。周質(zhì)蛋白抽提物上樣(流速0.8ml/分鐘)后，用CP緩沖液洗滌柱子，流速為2ml/分鐘，直至達(dá)到基線。用2.5mM D-脫硫生物素(Sigma)在CP緩沖液中的溶液洗脫結(jié)合的hNGAL突變蛋白，流速為1ml/分鐘。合并含有純化hNGAL突變蛋白的級(jí)分(每個(gè)2.5ml)，用YM10 centricon管(分子量截留值10KDa，Millipore)濃縮至終體積約為500μl，用15％SDS聚丙烯酰胺凝膠分析(Fling和Gregerson，同上引文)。最后，材料過(guò)濾除菌(0.22μm)，4℃存放。
實(shí)施例15在ELISA中測(cè)量hNGAL突變蛋白N4對(duì)IL-8的親合力為了在ELISA實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)結(jié)合，96孔微量滴定板(Maxisorb，Nunc)的兩行(每排12個(gè)孔)用50μl抗生物素蛋白(Flukn)在PBS中的50μg/ml溶液4℃包被過(guò)夜。用PBST洗三次后，一行用50μl/孔的1μM于PBST中的生物素化IL-8溶液處理，而第二行與PBST溫育作為對(duì)照。室溫1小時(shí)后，所有孔用PBST洗三次，室溫下用100μl于PBST中的4％w/v脫脂奶粉飽和非特異結(jié)合位點(diǎn)1小時(shí)。
為了測(cè)定突變蛋白N4對(duì)IL-8的KD值，在PBST中制備來(lái)自實(shí)施例14的N4蛋白的稀釋系列，濃度起始自1μM。對(duì)于抗生物素蛋白的非特異結(jié)合，作為對(duì)照，將突變蛋白N4的相似稀釋系列加入孔中而省去IL-8。室溫1小時(shí)允許復(fù)合物形成，之后用PBST洗三次，室溫下與PBST中的抗-strep II-抗體-HRP-綴合物(IBA)的1∶8000稀釋物溫育1小時(shí)。
用3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺和H2O2作為辣根過(guò)氧化物酶的底物，完成對(duì)結(jié)合的突變蛋白N4的檢測(cè)。為此，向所有孔中都加入100μl現(xiàn)成的HRP底物溶液(Biochem Immuosystems)。幾分鐘后加入100μl 0.3M硫酸來(lái)終止顯色。通過(guò)在Spectra Max 250光度計(jì)(Molecular Devices)中的450nM終點(diǎn)吸收來(lái)測(cè)量產(chǎn)物形成。
根據(jù)實(shí)施例10借助于計(jì)算機(jī)程序Kaleidagraph(Synergy軟件)通過(guò)非線性最小二乘方回歸來(lái)擬合曲線。圖10描述了得到的曲線。對(duì)于hNGAL突變蛋白N4和IL-8之間的復(fù)合物的表觀解離常數(shù)，所獲數(shù)值是300±34nM。
實(shí)施例16篩選針對(duì)生物素化TNFα的hNGAL突變蛋白重組人腫瘤壞死因子α(TNFα，SEQ ID NO31，SEQ ID NO35)與生物素基團(tuán)綴合，并作為靶在鏈霉抗生物素蛋白包被的順磁顆粒(Dynal)存在下從如實(shí)施例7所得到的呈遞hNGAL突變蛋白的噬粒文庫(kù)中進(jìn)行親合富集。
為了制備重組TNFα，用編碼在其N端帶有Arg-Gly-Ser-His(6)-Gly(3)標(biāo)簽的細(xì)胞因子TNFα(Wang等，Science 228(1985)，149-154)的表達(dá)質(zhì)粒pTNFα轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21[DE3]的細(xì)胞。如Schmidt和Skerra(Schmidt和Skerra，J Chromatogr.676(1994)，103-119)所述的進(jìn)行TNFα的表達(dá)，但對(duì)于重組細(xì)胞因子的產(chǎn)生，30℃誘導(dǎo)4小時(shí)。在此情況下，TNFα在胞質(zhì)聚集并呈可溶性蛋白形式，通過(guò)隨后在30ml裂解緩沖液(50mM NaH2PO4/NaOH pH8.0，300mM NaCl，10mM咪唑)中凍融1L培養(yǎng)基的細(xì)胞沉淀可以將TNFα釋放。通過(guò)隨后使用固定化金屬親合層析(IMAC；Porath等，Nature 258，(1975)598-599)和大小排阻層析，從此溶液中以三聚體形式純化得到TNFα(Lohrengel等，Cytokine 12(1999)573-577)。蛋白產(chǎn)量約為1.5mg每1L培養(yǎng)體積。
通過(guò)溶于25μl H2O中的40nmol(24.3μg)NHS-SS-生物素(Pierce)與溶于235μl PBS/NaOH pH8.5中的10nmol(187.7μg)人重組TNFα反應(yīng)來(lái)制備綴合物，其中反應(yīng)在總體積1ml的PBS/NaOH pH8.5中進(jìn)行。室溫?cái)噭?dòng)下溫育混合物1小時(shí)。然后根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明書用PD-10凝膠過(guò)濾柱(Pharmacia)并用PBS為流動(dòng)緩沖液從TNFα綴合物中去除多余的試劑。
為了分離展示有對(duì)TNFα具有親合力的突變蛋白的噬粒，將-20℃長(zhǎng)期存放的如實(shí)施例7獲得的沉淀噬粒的一個(gè)等分試樣解凍并沉淀噬粒(20分鐘，18500g，4℃)。去除上清液后，沉淀的噬粒顆粒溶于270μl PBS中，冰上溫育30分鐘，最后離心(5分鐘，18500g，4℃)以去除殘留的聚集物。
30μl生物素化TNFα的1μM溶液(30pm0l)(通過(guò)200μl此生物素化細(xì)胞因子在PBS中的2.5μM溶液與300μl PBS混合制備)與270μl PBS中的噬粒(約1013cfu)混合，室溫下溫育1小時(shí)以允許細(xì)胞因子與噬粒呈遞的突變蛋白之間形成復(fù)合物。然后，加入100μl于PBS中的8％w/v BSA，0.4％v/v Tween 20溶液。
與此平行，用1ml PBS洗100μl商業(yè)上可獲得的鏈霉抗生物素蛋白-順磁顆粒(Dynal)懸液三次。此處，通過(guò)旋轉(zhuǎn)1.5ml Eppendorf管懸浮顆粒1分鐘，然后借助于磁鐵在管壁收集，吸去上清液。為了飽和非特異結(jié)合位點(diǎn)，順磁顆粒與1ml PBST中的2％(w/v)BSA室溫下溫育1小時(shí)。
去除如上上清液后，生物素化TNFα與噬粒的混合物加入到順磁顆粒中，重懸顆粒并室溫下溫育10分鐘。最后，通過(guò)向混合物中加入10μl于PBS中的4mM D-脫硫生物素(Sigma)溶液，室溫下溫育所述混合物5分鐘來(lái)飽和鏈霉抗生物素蛋白的游離生物素結(jié)合位點(diǎn)。此步驟用于防止Streptag_II——作為突變蛋白和噬菌體外殼蛋白pIII片段的融合蛋白的一部分——與鏈霉抗生物素蛋白形成復(fù)合物。
用1ml含有1mM D-脫硫生物素的新鮮PBST洗滌順磁顆粒八次1分鐘，去除未結(jié)合的噬粒。每次借助于磁鐵收集顆粒，吸去上清液。最后，通過(guò)在1ml含有1mM脫硫生物素和100mM DTT的PBST中重懸顆粒在還原條件下洗脫結(jié)合的噬粒。37℃溫育溶液1小時(shí)以還原包含于TNFα和生物素之間的接頭分子中的二硫鍵，由此從珠子上釋放特異結(jié)合TNFα的噬粒。
為了擴(kuò)增，洗脫的噬粒溶液(1.0ml，含有107-109cfu，依賴于篩選循環(huán))迅速升溫至37℃，與3ml大腸桿菌XL1-blue對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期培養(yǎng)物(OD550＝0.5，37℃時(shí))混合，37℃200rpm搖30分鐘。沉淀感染的細(xì)胞(2分鐘，4420g，4℃)，在600μl培養(yǎng)基中重懸，鋪于三個(gè)含有100μg/ml氨芐青霉素的LB瓊脂培養(yǎng)平板(LB/Amp；直徑140mm)上。
32℃溫育14小時(shí)后，從瓊脂平板上刮取菌苔，每個(gè)加入10ml 2xYT/Amp培養(yǎng)基，懸液轉(zhuǎn)移到無(wú)菌三角瓶中，37℃以200rpm搖20分鐘。
對(duì)于噬粒顆粒的另一輪生產(chǎn)和親合富集，0.2-1ml所述懸液按種預(yù)熱至37℃的50ml 2x YT/Amp培養(yǎng)基，以使細(xì)胞密度為OD550＝0.08。37℃，160rpm溫育此培養(yǎng)物至達(dá)到細(xì)胞密度OD550＝0.5。然后用VCS-M13輔助噬菌體(Stratagene)感染培養(yǎng)物，感染復(fù)數(shù)約為10，之后37℃160rpm將此培養(yǎng)物再搖30分鐘。隨后加入卡那霉素(70μg/ml)，培養(yǎng)箱溫度降低至26℃，10分鐘后，加入無(wú)水四環(huán)素至25μg/L以誘導(dǎo)基因表達(dá)。26℃160rpm再溫育15小時(shí)。
通過(guò)離心沉淀細(xì)胞(15分鐘，12000g，4℃)。含有噬粒顆粒的上清液過(guò)濾除菌(0.45μm)，與1/4體積(12.5ml)20％w/v PEG8000，15％w/v NaCl混合，冰上溫育1小時(shí)。離心后(20分鐘，18000g，4℃)，沉淀的噬粒顆粒溶于2ml冷PBS中。冰上溫育此溶液30分鐘，分入兩個(gè)1.5ml反應(yīng)管中。未溶解成分離心沉淀后(5分鐘，18500g，4℃)，每個(gè)上清液轉(zhuǎn)移到新反應(yīng)管中。
通過(guò)與1/4體積20％w/v PEG8000，15％w/v NaCl混合來(lái)重沉淀噬粒顆粒，之后冰上溫育60分鐘。離心后(20分鐘，18500g，4℃)，去除上清液，沉淀的噬粒顆粒溶于270μl PBS中。冰上溫育30分鐘后，離心此溶液(5分鐘，18500g，4℃)，上清液直接用于親合富集。以此方式用TNFα肽再進(jìn)行另外四個(gè)篩選循環(huán)。
實(shí)施例17通過(guò)“菌落篩查”法鑒定結(jié)合TNFα的hNGAL突變蛋白如實(shí)施例3所述對(duì)于與Strep-Tag_II和白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域形成融合蛋白的hNGAL突變蛋白的分析型生產(chǎn)，將兩個(gè)BstXI切割位置之間的基因盒從載體phNGAL12亞克隆到phNGAL7上。
為此，用Plasmid Midi Kit(Qiagen)從大腸桿菌克隆的混合物中分離質(zhì)粒DNA，此克隆是通過(guò)用來(lái)自實(shí)施例16在第五個(gè)篩選循環(huán)后洗脫的噬粒感染而得到的。用限制酶BstXI切割DNA，通過(guò)如實(shí)施例6所述的制備型瓊脂糖凝膠電泳純化兩個(gè)片段的較小者(347bp)。用BstXI切割載體phNGAL7的DNA，以同樣方法分離兩個(gè)片段的較大者(3971bp)。
為了連接，100fmol分離的小DNA片段與100fmol大DNA片段混合，與1.5 Weiss單位T4 DNA連接酶(Promega)溫育，總計(jì)體積20μl(30mM Tris/HCl pH 7.8，10mM MgCl2，10mM DTT，1mM ATP)，之后16℃過(guò)夜溫育。根據(jù)CaCl2法(Sambrook等，同上引文)用4μl此連接混合物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TG1-F-(大腸桿菌K12 TG1，它通過(guò)在無(wú)選擇條件下反復(fù)培養(yǎng)丟失了其附加體)，得到2.0ml細(xì)胞懸液。離心細(xì)胞懸液(5000g，2分鐘，4℃)，在100μl培養(yǎng)基中重懸，鋪于含有LB/Amp培養(yǎng)基的瓊脂平板上，37℃溫育14小時(shí)以測(cè)定轉(zhuǎn)化效率。
親水PVDF膜(Millipore，GVWP型，孔徑大小0.22μm)在一個(gè)位置處作上標(biāo)記并剪成合適大小，置于LB/Amp瓊脂平板上。將來(lái)自用3-6μl上述連接混合物轉(zhuǎn)化的一批新鮮轉(zhuǎn)化的細(xì)胞懸液離心(5000g，2分鐘，4℃)，在100μl培養(yǎng)基中重懸，均勻鋪于此膜上以得到400-500個(gè)菌落。瓊脂平板37℃溫育7.5小時(shí)至菌落達(dá)到約0.5mm大小。
同時(shí)，取一張疏水膜(Millipore，Immobilon P，孔徑大小0.45μm)也剪成合適大小，根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明書用PBS浸濕。通過(guò)在10ml于PBS中的10mg/ml HSA(Sigma)溶液中室溫下攪動(dòng)4小時(shí)，完成用HSA的包被。通過(guò)室溫下與20ml于PBS中的4％(w/v)脫脂奶粉和0.1％(v/v)Tween-20溫育2小時(shí)來(lái)飽和膜上的剩余結(jié)合位點(diǎn)。用20ml PBS洗兩次膜10分鐘，之后用其中加有200μg/L無(wú)水四環(huán)素的10ml LB/Amp培養(yǎng)基浸泡10分鐘。
最后，膜在一個(gè)位置處作上標(biāo)記并置于加有200μg/L無(wú)水四環(huán)素的LB/Amp瓊脂培養(yǎng)板上。將來(lái)自上面的其上菌落已長(zhǎng)出的親水膜置于疏水膜上，使兩個(gè)標(biāo)記重疊。培養(yǎng)板與兩張膜在22℃溫育15小時(shí)。在此期間，上層膜上的菌落各分泌出相應(yīng)hNGAL突變蛋白，這些蛋白通過(guò)其白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域及下層膜上的HAS固定于下層膜上。
此后，有菌落的上層膜轉(zhuǎn)移到新鮮LB/Amp瓊脂平板上，4℃存放。拿下疏水膜并洗三次，每次用20ml PBST洗5分鐘。
為了分析固定化hNGAL突變蛋白的結(jié)合活性，然后膜在3.5ml于含有0.5％w/v脫脂奶粉的PBST中的100nM地高辛化TNFα溶液中溫育1小時(shí)。
通過(guò)溶于27μl DMSO中的40nmol(27.5μg)DIG-NHS(Roche)與溶于235μl PBS/NaOH(pH8.5)中的10nmol(187.7μg)TNFα反應(yīng)來(lái)制備綴合物，反應(yīng)在總體積1ml的PBS/NaOH pH8.5中進(jìn)行。室溫下攪動(dòng)1小時(shí)來(lái)溫育混合物。根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明書使用PD-10凝膠過(guò)濾柱(Pharmacia)并且用PBS作為流動(dòng)緩沖液，從TNFα綴合物中去除多余試劑。
用PBST洗三次膜，之后與10ml在PBST中1∶1000稀釋的抗地高辛配基Fab-堿性磷酸酶綴合物溫育1小時(shí)，以便通過(guò)TNFα綴合物的地高辛基團(tuán)檢測(cè)結(jié)合的TNFα。膜用PBST洗兩次，用PBS洗一次，每次5分鐘，并在AP緩沖液中攪動(dòng)10分鐘。為了顯色反應(yīng)，膜在10ml AP緩沖液中溫育，向其中加入30μl 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸4-甲苯胺鹽(Roth，在二甲基甲酰胺中50μg/ml)和5μl氮藍(lán)四唑(Roth，在70％v/v二甲基甲酰胺中75μg/ml)，直到在某些菌落的位置出現(xiàn)明顯的顏色信號(hào)。
在多個(gè)菌落篩查實(shí)驗(yàn)的膜上出現(xiàn)的1800個(gè)菌落中，14個(gè)在疏水膜上出現(xiàn)強(qiáng)烈顏色斑點(diǎn)，從相應(yīng)的親水膜培養(yǎng)此14個(gè)菌落。分離其質(zhì)粒DNA，根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明書使用有Big Dye Terminator循環(huán)測(cè)序試劑盒和Genetic Analyzer 310系統(tǒng)(Applied Biosystems)對(duì)hNGAL基因盒進(jìn)行序列分析，測(cè)序使用寡脫氧核苷酸SEQ ID NO5作為引物。
這14個(gè)突變蛋白中，13個(gè)顯示同一序列，命名為TNF-V1，而第14個(gè)序列與其不同并命名為TNF-V2。
克隆TNF-V1和TNF-V2的核苷酸序列翻譯成氨基酸序列，偏離初始hNGAL突變蛋白的那些氨基酸殘基在表4中給出。SEQ ID NO32和SEQID NO33中分別給出了突變蛋白TNF-V1和TNF-V2的核苷酸序列。SEQID NO36和SEQ ID NO37中分別給出了這兩個(gè)突變蛋白的全長(zhǎng)氨基酸序列。
表4hNGAL突變蛋白TNF-V1和TNF-V2的序列特征位置hNGALTNF-V1TNF-V240 Ala Phe Gly42 Leu Phe Phe44 Glu Leu Val46 Lys Leu Phe47 Asp Glu Asn49 Gln Phe Ile50 Lys Phe Ser70 Leu Thr Asp72 Arg Leu Ala73 Lys Glu Asn77 Asp Phe Ala79 Trp Glu Arg80 Ile ΔΔΔ*Ile101 Pro Lys Gly102 Gly His Asn103 Leu Gly Val125 Lys Asp Gly127 Ser Ser Asp128 Gln Gln Ser130 Arg Arg Asn132 Tyr Asn Arg*由于核苷酸238-240的缺失，突變蛋白TNF-V1在80位缺少異亮氨酸殘基。
實(shí)施例18通過(guò)“菌落斑點(diǎn)分析”確認(rèn)所選hNGAL突變蛋的對(duì)TNFα的結(jié)合活性用與實(shí)施例17中描述的菌落篩查分析相似的方式進(jìn)行菌落斑點(diǎn)分析，除了將含有相應(yīng)表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌單菌落從原平板點(diǎn)到用格子標(biāo)記的親水膜上而不是將轉(zhuǎn)化細(xì)胞的懸液鋪板。每個(gè)克隆分別用無(wú)菌牙簽在親水膜(Millipore，GVWP型，孔徑大小0.22μm)上點(diǎn)4到5次，此膜鋪于LB/Amp瓊脂培養(yǎng)板上。細(xì)胞在37℃生長(zhǎng)5小時(shí)。
同時(shí)，疏水膜(Millipore，Immobilon P，孔徑大小0.45μm)根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明書用PBS浸濕。通過(guò)在10ml于PBS中的10mg/ml HSA(Sigma)溶液中室溫下攪動(dòng)4小時(shí)，完成用HSA的包被。通過(guò)室溫下與20ml于PBS中的3％(w/v)BSA和0.1％(v/v)Tween-20溫育2小時(shí)來(lái)飽和膜上的剩余結(jié)合位點(diǎn)。用20ml PBS洗兩次膜10分鐘，之后用其中加有200μg/L無(wú)水四環(huán)素的10ml LB/Amp培養(yǎng)基浸泡10分鐘。
最后，膜在一個(gè)位置處作上標(biāo)記，并置于含有200μg/L無(wú)水四環(huán)素的LB/Amp瓊脂培養(yǎng)板上。來(lái)自上面的其上菌落已長(zhǎng)出的親水膜置于疏水膜上，使兩個(gè)標(biāo)記重疊。培養(yǎng)板與兩張膜在22℃溫育15小時(shí)。在此期間，各個(gè)hNGAL突變蛋白自上層膜上的菌落分泌出來(lái)，并通過(guò)其白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域結(jié)合下層膜上的HAS從而固定于下層膜上。
此后，有菌落的上層膜轉(zhuǎn)移到新鮮LB/Amp瓊脂平板上，4℃存放。拿下疏水膜并洗三次，每次用20ml PBST洗5分鐘。
為了確證所點(diǎn)的突變蛋白對(duì)TNFα的結(jié)合活性，然后膜在3.5ml于含有0.5％w/v脫脂奶粉的PBST中的100nM地高辛化TNFα溶液中溫育1小時(shí)(因此地高辛化TNFα在PBS中的1.5μM儲(chǔ)液在含有脫脂奶粉的PBST中1∶15稀釋)。
用PBST洗三次膜，之后與10ml在PBST中1∶1000稀釋的抗地高辛配基Fab-堿性磷酸酶綴合物溫育1小時(shí)，以便通過(guò)TNFα綴合物的地高辛基團(tuán)檢測(cè)結(jié)合的TNFα。膜用PBST洗兩次，用PBS洗一次，每次5分鐘，并在AP緩沖液中攪動(dòng)10分鐘。為了顯色反應(yīng)，膜在10ml AP緩沖液中溫育，向其中加入30μl 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸4-甲苯胺鹽(Roth，在二甲基甲酰胺中50μg/ml)和5μl氮藍(lán)四唑(Roth，在70％v/v二甲基甲酰胺中75μg/ml)。在點(diǎn)有突變蛋白TNF-V1和TNF-V2的位置處有明顯的顏色信號(hào)，而對(duì)于hNGAL野生型(phNGAL7編碼)、后膽色素結(jié)合蛋白(由載體pBBP22編碼；Schlehuber等J.Mol.Biol.297(2000)，1105-1120)、來(lái)自如實(shí)施例6所述的hNGAL突變蛋白文庫(kù)的兩個(gè)無(wú)關(guān)突變蛋白(兩個(gè)都亞克隆到phNGAL7上)以及沒(méi)有表達(dá)蛋白的克隆(含有pBluescript(Stratagene)作為質(zhì)粒)未能觀察到結(jié)合信號(hào)。這證實(shí)TNF-V1和TNF-V2對(duì)TNFα的結(jié)合活性(圖12)。
序列表<110>皮里斯蛋白實(shí)驗(yàn)公司(Pieris Proteolab AG)<120>人嗜中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)lipocalin和有關(guān)蛋白的突變蛋白<150>PCT/EP01/11213<151>2001-09-27<150>PCT/EP02/04223<151>2002-04-16<160>37<210>1<211>71<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(20)...(22)<223>na，g，c或t；kg或t<220>
<221>misc_feature<222>(26)...(28)<223>na，g，c或t；kg或t<220>
<221>misc_feature<222>(32)...(34)<223>na，g，c或t；kg或t<220>
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<223>引物<400>1ggtaggtctc gcagggaatn nkattnnkag annkgacnnk nnkccgnnkn50nkatgtatgc caccatctat g 71<210>2<211>77<212>DNA<213>人工序列<220>
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<220>
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<223>引物<400>2ggctgggaac ctggaacaaa agtcctgatm nngtamnnac acttcttmnn50mnnaaamnng acggaggtga cattgta 77<210>3<211>79<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(53)...(61)<223>na，g，c或t；kg或t<220>
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<221>misc_feature<222>(31)...(34)<223>na，g，c或t；ma或c<220>
<221>misc_feature<222>(37)...(40)<223>na，g，c或t；ma或c<220>
<221>misc_feature<222>(44)...(49)<223>na，g，c或t；kg或t
<220>
<221>misc_feature<222>(52)...(54)<223>na，g，c或t；kg或t<220>
<223>引物<400>4ccttggttct cccgtagatg gtaatcttga amnnctcmnn gttmnnmnna50acmnncttaa agaacaccat agcatgc 77<210>5<211>54<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>5cttccaggac aaccaattcc atgggaagtg gtatgtggta ggtctcgcag50ggaa 54<210>6<211>39<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>6cctttagttc cgaagccagc tccttggttc tcccgtaga39<210>7<211>1231<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>sig_peptide<222>(22)...(84)<220>
<221>mat_peptide<222>(85)...(1221)<223>修飾的hNGAL、Strep-tag II和噬菌體外殼蛋白pIII片斷的融合蛋白<220>
<221>CDS<222>(85)...(618)<223>成熟hNGAL<220>
<221>CDS<222>(619)...(648)
<223>STrep-tagII親和標(biāo)簽<220>
<221>CDS<222>(649)...(651)<223>琥珀終止密碼子<220>
<221>CDS<222>(652)...(1221)<223>外殼蛋白pIII的第217-406位氨基酸<400>7tctagataacg agggcaaaa a atg aaa aag aca gct atc gcg att 45Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile-21 -20 -15gca gtg gca ctg gct ggt ttc gct acc gta gcg cag gcc cag gac90Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Gln Asp-10 -5 -1 1tcc acc tca gac ctg atc cca gcc cca cct ctg agc aag gtc cct135Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val Pro5 10 15ctg cag cag aac ttc cag gac aac caa ttc cat ggg aag tgg tat180Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr20 25 30ctg gta ggt ctc gca ggg aat gca att ctc aga gaa gac aaa gac225Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Ala Ile Leu Arg Glu Asp Lys Asp35 40 45ccg caa aag atg tat gcc acc atc tat gag ctg aaa gaa gac aag270Pro Gln Lys Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys50 55 60agc tac aat gtc acc tcc gtc ctg ttt agg aaa aag aag tgt gac315Ser Tyr Asn Val Thr Ser Val Leu Phe Arg Lys Lys Lys Cys Asp65 70 75tac tgg atc agg act ttt gtt cca ggt tgc cag ccc ggc gag ttc360Tyr Trp Ile Arg Thr Phe Val Pro Gly Cys Gln Pro Gly Glu Phe80 85 90acg ctg ggc aac att aag agt tac cct gga tta acg agt tac ctc405Thr Leu Gly Asn Ile Lys Ser Tyr Pro Gly Leu Thr Ser Tyr Leu95 100 105gtc cga gtg gtg agc acc aac tac aac cag cat gct atg gtg ttc450Val Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe110 115 120ttt aag aaa gtt tct caa aac agg gag tac ttc aag att acc atc495Phe Lys Lys Val Ser Gln Asn Arg Glu Tyr Phe Lys Ile Thr Ile125 130 135tac ggg aga acc aag gag ctg gct tcg gaa cta aag gag aac ttc540Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Ala Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe140 145 150atc cgc ttc tct aaa tct ctg ggc ctc cct gaa aac cac atc gtc585Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asn His Ile Val155 160 165
ttc cct gtc cca atc gac cag tgt atc gac ggc agc gct tgg tcc 630Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Asp Gly Ser Ala Trp Ser170 175 180cac ccg cag ttc gaa aaa tag gct ggc ggc ggc tct ggt ggt ggt 675His Pro Gln Phe Glu Lys Gln Ala Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly185 190 195tct ggc ggc ggc tct gag ggt ggt ggc tct gag ggt ggc ggt tct 720Ser Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser200 205 210gag ggt ggc ggc tct gag gga ggc ggt tcc ggt ggt ggc tct ggt 765Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly215 220 225tcc ggt gat ttt gat tat gaa aag atg gca aac gct aat aag ggg 810Ser Gly Asp Phe Asp Tyr Glu Lys Met Ala Asn Ala Asn Lys Gly230 235 240gct atg acc gaa aat gcc gat gaa aac gcg cta cag tct gac gct 855Ala Met Thr Glu Asn Ala Asp Glu Asn Ala Leu Gln Ser Asp Ala245 250 255aaa ggc aaa ctt gat tct gtc gct act gat tac ggt gct gct atc 900Lys Gly Lys Leu Asp Ser Val Ala Thr Asp Tyr Gly Ala Ala Ile260 265 270gat ggt ttc att ggt gac gtt tcc ggc ctt gct aat ggt aat ggt 945Asp Gly Phe Ile Gly Asp Val Ser Gly Leu Ala Asn Gly Asn Gly275 280 285gct act ggt gat ttt gct ggc tct aat tcc caa atg gct caa gtc 990Ala Thr Gly Asp Phe Ala Gly Ser Asn Ser Gln Met Ala Gln Val290 295 300ggt gac ggt gat aat tca cct tta atg aat aat ttc cgt caa tat 1035Gly Asp Gly Asp Ash Ser Pro Leu Met Asn Asn Phe Arg Gln Tyr305 310 315tta cct tcc ctc cct caa tcg gtt gaa tgt cgc cct ttt gtc ttt 1080Leu Pro Ser Leu Pro Gln Ser Val Glu Cys Arg Pro Phe Val Phe320 325 330ggc gct ggt aaa cca tat gaa ttt tct att gat tgt gac aaa ata 1125Gly Ala Gly Lys Pro Tyr Glu Phe Ser Ile Asp Cys Asp Lys Ile335 340 345aac tta ttc cgt ggt gtc ttt gcg ttt ctt tta tat gtt gcc acc 1170Asn Leu Phe Arg Gly Val Phe Ala Phe Leu Leu Tyr Val Ala Thr350 355 360ttt atg tat gta ttt tct acg ttt gct aac ata ctg cgt aat aag 1215Phe Met Tyr Val Phe Ser Thr Phe Ala Asn Ile Leu Arg Asn Lys365 370 375gag tct taataagctt 1231Glu Ser379<210>8<211>1231<212>DNA
<213>人工序列<220>
<221>sig_peptide<222>(22)...(84)<220>
<221>mat_peptide<222>(85)...(1221)<223>hNGAL、Strep-tag II和噬菌體外殼蛋白pIII片斷的融合蛋白<220>
<221>CDS<222>(85)...(618)<223>成熟hNGAL<220>
<221>CDS<222>(619)...(648)<223>Strep-tagII親和標(biāo)簽<220>
<221>CDS<222>(649)...(651)<223>琥珀終止密碼子<220>
<221>CDS<222>(652)...(1221)<223>外殼蛋白pIII的第217-406位氨基酸<400>8tctagataacg agggcaaaa a atg aaa aag aca gct atc gcg att 45Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile-21 -20 -15gca gtg gca ctg gct ggt ttc gct acc gta gcg cag gcc cag gac 90Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Gln Asp-10 -5 -1 1tcc acc tca gac ctg atc cca gcc cca cct ctg agc aag gtc cct 135Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val Pro5 10 15ctg cag cag aac ttc cag gac aac caa ttc cag ggg aag tgg tat 180Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr20 25 30ctg gta ggt ctc gca ggg aat gca att ctc aga gaa gac aaa gac 225Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Ala Ile Leu Arg Glu Asp Lys Asp35 40 45ccg caa aag atg tat gcc acc atc tat gag ctg aaa gaa gac aag 270Pro Gln Lys Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys50 55 60agc tac aat gtc acc tcc gtc ctg ttt agg aaa aag aag tgt gac 315Ser Tyr Asn Val Thr Ser Val Leu Phe Arg Lys Lys Lys Cys Asp65 70 75tac tgg atc agg act ttt gtt cca ggt tgc cag ccc ggc gag ttc 360
Tyr Trp Ile Arg Thr Phe Val Pro Gly Cys Gln Pro Gly Glu Phe80 85 90acg ctg ggc aac att aag agt tac cct gga tta acg agt tac ctc 405Thr Leu Gly Asn Ile Lys Ser Tyr Pro Gly Leu Thr Ser Tyr Leu95 100 105gtc cga gtg gtg agc acc aac tac aac cag cat gct atg gtg ttc 450Val Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe110 115 120ttt aag aaa gtt tct caa aac agg gag tac ttc aag att acc atc 495Phe Lys Lys Val Ser Gln Asn Arg Glu Tyr Phe Lys Ile Thr Ile125 130 135tac ggg aga acc aag gag ctg cct tcg gaa cta aag gag aac ttc 540Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe140 145 150atc cgc ttc tcc aaa tct ctg ggc ctc cct gaa aac cac atc gtc 585Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asn His Ile Val155 160 165ttc cct gtc cca atc gac cag tgt atc gac ggc agc gct tgg tcc 630Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Asp Gly Ser Ala Trp Ser170 175 180cac ccg cag ttc gaa aaa tag gct ggc ggc ggc tct ggt ggt ggt 675His Pro Gln Phe Glu Lys Gln Ala Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly185 190 195tct ggc ggc ggc tct gag ggt ggt ggc tct gag ggt ggc ggt tct 720Ser Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser200 205 210gag ggt ggc ggc tct gag gga ggc ggt tcc ggt ggt ggc tct ggt 765Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly215 220 225tcc ggt gat ttt gat tat gaa aag atg gca aac gct aat aag ggg 810Ser Gly Asp Phe Asp Tyr Glu Lys Met Ala Asn Ala Asn Lys Gly230 235 240gct atg acc gaa aat gcc gat gaa aac gcg cta cag tct gac gct 855Ala Met Thr Glu Asn Ala Asp Glu Asn Ala Leu Gln Ser Asp Ala245 250 255aaa ggc aaa ctt gat tct gtc gct act gat tac ggt gct gct atc 900Lys Gly Lys Leu Asp Ser Val Ala Thr Asp Tyr Gly Ala Ala Ile260 265 270gat ggt ttc att ggt gac gtt tcc ggc ctt gct aat ggt aat ggt 945Asp Gly Phe Ile Gly Asp Val Ser Gly Leu Ala Asn Gly Asn Gly275 280 285gct act ggt gat ttt gct ggc tct aat tcc caa atg gct caa gtc 990Ala Thr Gly Asp Phe Ala Gly Ser Asn Ser Gln Met Ala Gln Val290 295 300ggt gac ggt gat aat tca cct tta atg aat aat ttc cgt caa tat 1035Gly Asp Gly Asp Asn Ser Pro Leu Met Asn Asn Phe Arg Gln Tyr305 310 315tta cct tcc ctc cct caa tcg gtt gaa tgt cgc cct ttt gtc ttt 1080Leu Pro Ser Leu Pro Gln Ser Val Glu Cys Arg Pro Phe Val Phe320 325 330
ggc gct ggt aaa cca tat gaa ttt tct att gat tgt gac aaa ata 1125Gly Ala Gly Lys Pro Tyr Glu Phe Ser Ile Asp Cys Asp Lys Ile335 340 345aac tta ttc cgt ggt gtc ttt gcg ttt ctt tta tat gtt gcc acc 1170Asn Leu Phe Arg Gly Val Phe Ala Phe Leu Leu Tyr Val Ala Thr350 355 360ttt atg tat gta ttt tct acg ttt gct aac ata ctg cgt aat aag 1215Phe Met Tyr Val Phe Ser Thr Phe Ala Asn Ile Leu Arg Asn Lys365 370 375gag tct taataagctt 1231Glu Ser379<210>9<211>805<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>sig_peptide<222>(22)...(84)<220>
<221>mat_peptide<222>(85)...(795)<223>修飾的hNGAL、Strep-tag II和白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的融合蛋白<220>
<221>CDS<222>(85)...(618)<223>成熟hNGAL<220>
<221>CDS<222>(619)...(648)<223>Strep-tag II親和標(biāo)簽<220>
<221>CDS<222>(649)...(795)<223>蛋白G的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域<400>9tctagataac gagggcaaaa a atg aaa aag aca gct atc gcg att 45Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile-21 -20 -15gca gtg gca ctg gct ggt ttc gct acc gta gcg cag gcc cag gac90Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Gln Asp-10 -5 -1 1tcc acc tca gac ctg atc cca gcc cca cct ctg agc aag gtc cct135Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val Pro5 10 15ctg cag cag aac ttc cag gac aac caa ttc cag ggg aag tgg tat180
Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr20 25 30ctg gta ggt ctc gca ggg aat gca att ctc aga gaa gac aaa gac 225Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Ala Ile Leu Arg Glu Asp Lys Asp35 40 45ccg caa aag atg tat gcc acc atc tat gag ctg aaa gaa gac aag 270Pro Gln Lys Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys50 55 60agc tac aat gtc acc tcc gtc ctg ttt agg aaa aag aag tgt gac 315Ser Tyr Asn Val Thr Ser Val Leu Phe Arg Lys Lys Lys Cys Asp65 70 75tac tgg atc agg act ttt gtt cca ggt tgc cag ccc ggc gag ttc 360Tyr Trp Ile Arg Thr Phe Val Pro Gly Cys Gln Pro Gly Glu Phe80 85 90acg ctg ggc aac att aag agt tac cct gga tta acg agt tac ctc 405Thr Leu Gly Asn Ile Lys Ser Tyr Pro Gly Leu Thr Ser Tyr Leu95 100 105gtc cga gtg gtg agc acc aac tac aac cag cat gct atg gtg ttc 450Val Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe110 115 120ttt aag aaa gtt tct caa aac agg gag tac ttc aag att acc atc 495Phe Lys Lys Val Ser Gln Asn Arg Glu Tyr Phe Lys Ile Thr Ile125 130 135tac ggg aga acc aag gag ctg cct tcg gaa cta aag gag aac ttc 540Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe140 145 150atc cgc ttc tcc aaa tct ctg ggc ctc cct gaa aac cac atc gtc 585Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asn His Ile Val155 160 165ttc cct gtc cca atc gac cag tgt atc gac ggc agc gct tgg tcc 630Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Asp Gly Ser Ala Trp Ser170 175 180cac ccg cag ttc gaa aaa cca gct agc ctg gct gaa gct aaa gtt 675His Pro Gln Phe Glu Lys Pro Ala Ser Leu Ala Glu Ala Lys Val185 190 195ctg gct aac cgt gaa ctg gac aaa tac ggt gtt tcc gac tac tac 720Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly Val Ser Asp Tyr Tyr200 205 210aaa aac ctc atc aac aac gct aaa acc gtt gaa ggt gtt aaa gct 765Lys Asn Leu Ile Asn Asn Ala Lys Thr Val Glu Gly Val Lys Ala215 220 225ctg atc gac gaa att ctc gca gca ctg ccg taataagctt 805Leu Ile Asp Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro230 235<210>10<211>580<212>DNA
<213>人工序列<220>
<221>sig_peptide<222>(22)...(84)<220>
<221>mat_peptide<222>(85)...(570)<223>修飾的人tear Lipocalin和Strep-tag II的融合蛋白<220>
<221>CDS<222>(85)...(543)<223>成熟人tear Lipocalin<220>
<221>CDS<222>(544)...(570)<223>Strep-tag II親和標(biāo)簽<400>10tctagataacg agggcaaaa a atg aaa aag aca gct atc gcg att 45Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile-21 -20 -15gca gtg gca ctg gct ggt ttc gct acc gta gcg cag gcc gcc tca 90Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Ala Ser-10 -5 -1 1gac gag gag att cag gat gtg tca ggg acg tgg tat ctg aag gcc 135Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys Ala5 10 15atg acg gtg gac agg gag ttc cct gag atg aat ctg gaa tcg gtg 180Met Thr Val Asp Arg Glu Phe Pro Glu Met Asn Leu Glu Ser Val20 25 30aca ccc atg acc ctc acg acc ctg gaa ggg ggc aac ctg gaa gcc 225Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala35 40 45aag gtc acc atg ctg ata agt ggc cgg tgc cag gag gtg aag gcc 270Lys Val Thr Met Leu Ile Ser Gly Arg Cys Gln Glu Val Lys Ala50 55 60gtc ctg gag aaa act gac gag ccg gga aaa tac acg gcc gac ggg 315Val Leu Glu Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp Gly65 70 75ggc aag cac gtg gca tac atc atc agg tcg cac gtg aag gac cac 360Gly Lys His Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His80 85 90tac atc ttt tac tct gag ggc gag ctc cac ggg aag ccg gtc cga 405Tyr Ile Phe Tyr Ser Glu Gly Glu Leu His Gly Lys Pro Val Arg95 100 105cgg gtg aag Ctc gtg ggc aga gac ccc aag aac aac ctg gaa gcc 450Gly Val Lys Leu Val Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala110 115 120ttg gag gac ttt gag aaa gcc gca gga gcc cgc gga ctc agc acg 495
Leu Glu Asp Phe Glu Lys Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr125 130 135gag agc atc ctc atc ccc agg cag agc gaa acc tgc tct cca ggg 540Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg Gln Ser Glu Thr Cys Ser Pro Gly140 145 150agc gct tgg tct cac ccg cag ttc gaa aaa taataagctt 580Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys155 160<210>11<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>引物<400>11ccactcccta tcagtgat18<210>12<211>537<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1)...(537)<223>突變蛋白Tlpca<400>12cag gac tcc acc tca gac ctg atc cca gcc cca cct ctg agc aag 45Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys1 5 10 15gtc cct ctg cag cag aac ttc cag gac aac caa ttc cat ggg aag 90Val Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys20 25 30tgg tat gtg gta ggt ctc gca ggg aat tgt att gtg aga cag gac 135Trp Tyr Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Cys Ile Val Arg Gln Asp35 40 45ctt ctg ccg tct atg atg tat gcc acc atc tat gag ctg aaa gaa 180Leu Leu Pro Ser Met Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu50 55 60gac aag agc tac aat gtc acc tcc gtc tta ttt atg gat aag aag 225Asp Lys Ser Tyr Asn Val Thr Ser Val Leu Phe Met Asp Lys Lys65 70 75tgt cgg tac tat atc agg act ttt gtt cca ggt tcc cag ccg ggc 270Cys Arg Tyr Tyr Ile Arg Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly80 85 90gag ttc acg ctg ggc aac att aag agt tac ggt att gtt acg agt 315Glu Phe Thr Leu Gly Asn Ile Lys Ser Tyr Gly Ile Val Thr Ser
95 100 105tac ctc gtc cga gtg gtg agc acc aac tac aac cag cat gct atg 360Tyr Leu Val Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met110 115 120gtg ttc ttt aag tcg gtt atg acg aac tag gag gcg ttc aag att 405Val Phe Phe Lys Ser Val Met Thr Asn Gln Glu Ala Phe Lys Ile125 130 135acc atc tac ggg aga acc aag gag ctg gct tcg gaa cta aag gag 450Thr Ile Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Ala Ser Glu Leu Lys Glu140 145 150aac ttc atc cgc ttc tct aaa tct ctg ggc ctc cct gaa aac cac 495Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asn His155 160 165atc gtc ttc cct gtc cca atc gac cag tgt atc gac ggc agc 537Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Asp Gly Ser170 175<210>13<211>400<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>信號(hào)序列<222>(-21)...(-1)<220>
<221>鏈<222>(1)...(379)<223>修飾的hNGAL、Strep-tag II和噬菌體外殼蛋白pIII片斷的融合蛋白<220>
<221>
<222>(1)...(178)<223>成熟hNGAL<220>
<221>
<222>(179)...(188)<223>Strep-tag II親和標(biāo)簽<220>
<221>
<222>(189)<223>琥珀終止密碼子<220>
<221>
<222>(190)...(379)<223>外殼蛋白pIII的第217-406位氨基酸<400>13Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile-21 -20 -15Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Gln Asp-10 -5 -1 1
Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val Pro5 10 15Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr20 25 30Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Ala Ile Leu Arg Glu Asp Lys Asp35 40 45Pro Gln Lys Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys50 55 60Ser Tyr Asn Val Thr Ser Val Leu Phe Arg Lys Lys Lys Cys Asp65 70 75Tyr Trp Ile Arg Thr Phe Val Pro Gly Cys Gln Pro Gly Glu Phe80 85 90Thr Leu Gly Asn Ile Lys Ser Tyr Pro Gly Leu Thr Ser Tyr Leu95 100 105Val Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe110 15 120Phe Lys Lys Val Ser Gln Asn Arg Glu Tyr Phe Lys Ile Thr Ile125 130 135Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Ala Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe140 145 150Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asn His Ile Val155 160 165Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Asp Gly Ser Ala Trp Ser170 175 180His Pro Gln Phe Glu Lys Gln Ala Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly185 190 195Ser Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser200 205 210Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly215 220 225Ser Gly Asp Phe Asp Tyr Glu Lys Met Ala Asn Ala Asn Lys Gly230 235 240Ala Met Thr Glu Asn Ala Asp Glu Asn Ala Leu Gln Ser Asp Ala245 250 255Lys Gly Lys Leu Asp Ser Val Ala Thr Asp Tyr Gly Ala Ala Ile260 265 270Asp Gly Phe Ile Gly Asp Val Ser Gly Leu Ala Asn Gly Asn Gly275 280 285Ala Thr Gly Asp Phe Ala Gly Ser Asn Ser Gln Met Ala Gln Val290 295 300Gly Asp Gly Asp Asn Ser Pro Leu Met Asn Asn Phe Arg Gln Tyr305 310 315
Leu Pro Ser Leu Pro Gln Ser Val Glu Cys Arg Pro Phe Val Phe320 325 330Gly Ala Gly Lys Pro Tyr Glu Phe Ser Ile Asp Cys Asp Lys Ile335 340 345Asn Leu Phe Arg Gly Val Phe Ala Phe Leu Leu Tyr Val Ala Thr350 355 360Phe Met Tyr Val Phe Ser Thr Phe Ala Asn Ile Leu Arg Asn Lys365 370 375gag tctGlu Ser379<210>14<211>400<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>信號(hào)序列<222>(-21)...(-1)<220>
<221>鏈<222>(1)...(379)<223>hNGAL、Strep-tag II和噬菌體外殼蛋白pIII片斷的融合蛋白<220>
<221>
<222>(1)...(178)<223>成熟hNGAL<220>
<221>
<222>(179)...(188)<223>Strep-tag II親和標(biāo)簽<220>
<221>
<222>(189)<223>琥珀終止密碼子<220>
<221>
<222>(190)...(379)<223>外殼蛋白pIII的第217-406位氨基酸<400>14Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile-21 -20 -15Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Gln Asp-10 -5 -l 1Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val Pro5 10 15
Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr20 25 30Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Ala Ile Leu Arg Glu Asp Lys Asp35 40 45Pro Gln Lys Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys50 55 60Ser Tyr Asn Val Thr Ser Val Leu Phe Arg Lys Lys Lys Cys Asp65 70 75Tyr Trp Ile Arg Thr Phe Val Pro Gly Cys Gln Pro Gly Glu Phe80 85 90Thr Leu Gly Asn Ile Lys Ser Tyr Pro Gly Leu Thr Ser Tyr Leu95 100 105Val Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe110 115 120Phe Lys Lys Val Ser Gln Asn Arg Glu Tyr Phe Lys Ile Thr Ile125 130 135Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe140 145 150Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asn His Ile Val155 160 165Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Asp Gly Ser Ala Trp Ser170 175 180His Pro Gln Phe Glu Lys Gln Ala Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly185 190 195Ser Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser200 205 210Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly215 220 225Ser Gly Asp Phe Asp Tyr Glu Lys Met Ala Asn Ala Asn Lys Gly230 235 240Ala Met Thr Glu Asn Ala Asp Glu Asn Ala Leu Gln Ser Asp Ala245 250 255Lys Gly Lys Leu Asp Ser Val Ala Thr Asp Tyr Gly Ala Ala Ile260 265 270Asp Gly Phe Ile Gly Asp Val Ser Gly Leu Ala Asn Gly Asn Gly275 280 285Ala Thr Gly Asp Phe Ala Gly Ser Asn Ser Gln Met Ala Gln Val290 295 300Gly Asp Gly Asp Asn Ser Pro Leu Met Asn Asn Phe Arg Gln Tyr305 310 315Leu Pro Ser Leu Pro Gln Ser Val Glu Cys Arg Pro Phe Val Phe320 325 330Gly Ala Gly Lys Pro Tyr Glu Phe Ser Ile Asp Cys Asp Lys Ile335 340 345
Asn Leu Phe Arg Gly Val Phe Ala Phe Leu Leu Tyr Val Ala Thr350 355 360Phe Met Tyr Val Phe Ser Thr Phe Ala Asn Ile Leu Arg Asn Lys365 370 375Glu Ser379<210>15<211>258<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>信號(hào)序列<222>(-21)...(-1)<220>
<221>鏈<222>(1)...(237)<223>修飾的hNGAL、Strep-tagII和白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域的融合蛋白<220>
<221>
<222>(1)...(178)<223>成熟hNGAL<220>
<221>
<222>(179)...(188)<223>Strep-tag II親和標(biāo)簽<220>
<221>
<222>(189)...(237)<223>蛋白G的白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域<400>15Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile-21 -20 -15Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Gln Asp-10 -5 -1 1Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val Pro5 10 15Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr20 25 30Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Ala Ile Leu Arg Glu Asp Lys Asp35 40 45Pro Gln Lys Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys50 55 60Ser Tyr Asn Val Thr Ser Val Leu Phe Arg Lys Lys Lys Cys Asp65 70 75
Tyr Trp Ile Arg Thr Phe Val Pro Gly Cys Gln Pro Gly Glu Phe80 85 90Thr Leu Gly Asn Ile Lys Ser Tyr Pro Gly Leu Thr Ser Tyr Leu95 100 105Val Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe110 115 120Phe Lys Lys Val Ser Gln Asn Arg Glu Tyr Phe Lys Ile Thr Ile125 130 135Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe140 145 150Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asn His Ile Val155 160 165Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Asp Gly Ser Ala Trp Ser170 175 180His Pro Gln Phe Glu Lys Pro Ala Ser Leu Ala Glu Ala Lys Val185 190 195Leu Ala Asn Arg Glu Leu Asp Lys Tyr Gly Val Ser Asp Tyr Tyr200 205 210Lys Asn Leu Ile Asn Asn Ala Lys Thr Val Glu Gly Val Lys Ala215 220 225Leu Ile Asp Glu Ile Leu Ala Ala Leu Pro230 235<210>16<211>183<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>信號(hào)序列<222>(-21)...(-1)<220>
<221>鏈<222>(1)...(1)<223>修飾的人tear Lipocalin和Strep-tag II的融合蛋白<220>
<221>
<222>(1)...(152)<223>成熟人tear Lipocalin<220>
<221>
<222>(153)...(162)<223>Strep-tagII親和標(biāo)簽<400>16Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile-21 -20 -15
Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Ala Ser-10 -5 -1 1Asp Glu Glu Ile Gln Asp Val Ser Gly Thr Trp Tyr Leu Lys Ala5 10 15Met Thr Val Asp Arg Glu Phe Pro Glu Met Asn Leu Glu Ser Val20 25 30Thr Pro Met Thr Leu Thr Thr Leu Glu Gly Gly Asn Leu Glu Ala35 40 45Lys Val Thr Met Leu Ile Ser Gly Arg Cys Gln Glu Val Lys Ala50 55 60Val Leu Glu Lys Thr Asp Glu Pro Gly Lys Tyr Thr Ala Asp Gly65 70 75Gly Lys His Val Ala Tyr Ile Ile Arg Ser His Val Lys Asp His80 85 90Tyr Ile Phe Tyr Ser Glu Gly Glu Leu His Gly Lys Pro Val Arg95 100 105Gly Val Lys Leu Val Gly Arg Asp Pro Lys Asn Asn Leu Glu Ala110 115 120Leu Glu Asp Phe Glu Lys Ala Ala Gly Ala Arg Gly Leu Ser Thr125 130 135Glu Ser Ile Leu Ile Pro Arg Gln Ser Glu Thr Cys Ser Pro Gly140 145 150Ser Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys155 160<210>17<211>178<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>
<222>(1)...(178)<223>突變蛋白Tlpca<400>17Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys1 5 10 15Val Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys20 25 30Trp Tyr Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Cys Ile Val Arg Gln Asp35 40 45Leu Leu Pro Ser Met Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu50 55 60Asp Lys Ser Tyr Asn Val Thr Ser Val Leu Phe Met Asp Lys Lys65 70 75Cys Arg Tyr Tyr Ile Arg Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly80 85 95
Glu Phe Thr Leu Gly Asn Ile Lys Ser Tyr Gly Ile Val Thr Ser95 100 105Tyr Leu Val Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met110 115 120Val Phe Phe Lys Ser Val Met Thr Asn Gln Glu Ala Phe Lys Ile125 130 135Thr Ile Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Ala Ser Glu Leu Lys Glu140 145 150Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asn His155 160 165Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Asp Gly170 175<210>18<211>11<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>衍生自人血小板反應(yīng)蛋白1的肽<220>
<221>MOD_Res<222>(11)<223>生物素化<400>18Arg Phe Tyr Val Val Met Trp Lys Aca Aca Lys1 5 10<210>19<211>1231<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>sig_peptide<222>(22)...(84)<220>
<221>mat_peptide<222>(85)...(1221)<223>修飾的hNGAL、Strep-tag II和噬菌體外殼蛋白pIII片斷的融合蛋白<220>
<221>CDS<222>(85)...(618)<223>成熟hNGAL<220>
<221>CDS<222>(619)...(648)<223>Strep-tag II親和標(biāo)簽<220>
<221>CDS<222>(649)...(651)<223>琥珀終止密碼子<220>
<221>CDS<222>(652)...(1221)<223>外殼蛋白pIII的第217-406位氨基酸<400>19tctagataacg agggcaaaa a atg aaa aag aca gct atc gcg att 45Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile-21 -20 -15gca gtg gct ctg gct ggc ttc gct acc gta gcg cag gcc cag gac 90Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Gln Asp-10 -5 -1 1tcc acc tca gac ctg atc cca gcc cca cct ctg agc aag gtc cct 135Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val Pro5 10 15ctg cag cag aac ttc cag gac aac caa ttc cat ggg aag tgg tat 180Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr20 25 30ctg gta ggt ctc gca ggg aat gca att ctc aga gaa gac aaa gac 225Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Ala Ile Leu Arg Glu Asp Lys Asp35 40 45ccg caa aag atg tat gcc acc atc tat gag ctg aaa gaa gac aag 270Pro Gln Lys Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys50 55 60agc tac aat gtc acc tcc gtc ctg ttt agg aaa aag aag tgt gac 315Ser Tyr Asn Val Thr Ser Val Leu Phe Arg Lys Lys Lys Cys Asp65 70 75tac tgg atc agg act ttt gtt cca ggt tcc cag cca ggc gag ttc 360Tyr Trp Ile Arg Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe80 85 90acg ctg ggc aac att aag agt tac cct gga tta acg agt tac ctc 405Thr Leu Gly Asn Ile Lys Ser Tyr Pro Gly Leu Thr Ser Tyr Leu95 100 105gtc cga gtg gtg agc acc aac tac aac cag cat gct atg gtg ttc 450Val Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe110 115 120ttt aag aaa gtt tct caa aac agg gag tac ttc aag att acc atc 495Phe Lys Lys Val Ser Gln Asn Arg Glu Tyr Phe Lys Ile Thr Ile125 130 135tac ggg aga acc aag gag ctg gct tcg gaa cta aag gag aac ttc 540Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Ala Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe140 145 150atc cgc ttc tct aaa tct ctg ggc ctc cct gaa aac cac atc gtc 585Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asn His Ile Val155 160 165ttc cct gtc cca atc gac cag tgt atc gac ggc agc gct tgg tcc 630Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Asp Gly Ser Ala Trp Ser
170 175 180cac ccg cag ttc gaa aaa tag gct ggc ggc ggc tct ggt ggt ggt 675His Pro Gln Phe Glu Lys Gln Ala Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly185 190 195tct ggc ggc ggc tot gag ggt ggt ggc tct gag ggt ggc ggt tct 720Ser Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser200 205 210gag ggt ggc ggc tct gag gga ggc ggt tcc ggt ggt ggc tct ggt 765Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly215 220 225tcc ggt gat ttt gat tat gaa aag atg gca aac gct aat aag ggg 810Ser Gly Asp Phe Asp Tyr Glu Lys Met Ala Asn Ala Asn Lys Gly230 235 240gct atg acc gaa aat gcc gat gaa aac gcg cta cag tct gac gct 855Ala Met Thr Glu Asn Ala Asp Glu Asn Ala Leu Gln Ser Asp Ala245 250 255aaa ggc aaa ctt gat tct gtc gct act gat tac ggt gct gct atc 900Lys Gly Lys Leu Asp Ser Val Ala Thr Asp Tyr Gly Ala Ala Ile260 265 270gat ggt ttc att ggt gac gtt tcc ggc ctt gct aat ggt aat ggt 945Asp Gly Phe Ile Gly Asp Val Ser Gly Leu Ala Asn Gly Asn Gly275 280 285gct act ggt gat ttt gct ggc tct aat tcc caa atg gct caa gtc 990Ala Thr Gly Asp Phe Ala Gly Ser Asn Ser Gln Met Ala Gln Val290 295 300ggt gac ggt gat aat tca cct tta atg aat aat ttc cgt caa tat 1035Gly Asp Gly Asp Asn Ser Pro Leu Met Asn Asn Phe Arg Gln Tyr305 310 315tta cct tcc ctc cct caa tcg gtt gaa tgt cgc cct ttt gtc ttt 1080Leu Pro Ser Leu Pro Gln Ser Val Glu Cys Arg Pro Phe Val Phe320 325 330ggc gct ggt aaa cca tat gaa ttt tct att gat tgt gac aaa ata 1125Gly Ala Gly Lys Pro Tyr Glu Phe Ser Ile Asp Cys Asp Lys Ile335 340 345aac tta ttc cgt ggt gtc ttt gcg ttt ctt tta tat gtt gcc acc 1170Asn Leu Phe Arg Gly Val Phe Ala Phe Leu Leu Tyr Val Ala Thr350 355 360ttt atg tat gta ttt tct acg ttt gct aac ata ctg cgt aat aag 1215Phe Met Tyr Val Phe Ser Thr Phe Ala Asn Ile Leu Arg Asn Lys365 370 375gag tct taataagctt 1231Glu Ser379<210>20<211>400<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>信號(hào)序列<222>(-21)...(-1)<220>
<221>鏈<222>(1)...(379)<223>修飾的hNGAL、Strep-tag II和噬菌體外殼蛋白pIII片斷的融合蛋白<220>
<221>
<222>(1)...(178)<223>修飾的成熟hNGAL<220>
<221>
<222>(179)...(188)<223>Strep-tag II親和標(biāo)簽<220>
<221>
<222>(189)<223>琥珀終止密碼子<220>
<221>
<222>(190)...(379)<223>外殼蛋白pIII的第217-406位氨基酸<400>20Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile-21 -20 -15Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Gln Asp-10 -5 -1 1Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val Pro5 10 15Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe His Gly Lys Trp Tyr20 25 30Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Ala Ile Leu Arg Glu Asp Lys Asp35 40 45Pro Gln Lys Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys50 55 60Ser Tyr Asn Val Thr Ser Val Leu Phe Arg Lys Lys Lys Cys Asp65 70 75Tyr Trp Ile Arg Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe80 85 90Thr Leu Gly Asn Ile Lys Ser Tyr Pro Gly Leu Thr Ser Tyr Leu95 100 105Val Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe110 115 120Phe Lys Lys Val Ser Gln Asn Arg Glu Tyr Phe Lys Ile Thr Ile125 130 135
Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Ala Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe140 145 150Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asn His Ile Val155 160 165Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Asp Gly Ser Ala Trp Ser170 175 180His Pro Gln Phe Glu Lys Gln Ala Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly185 190 195Ser Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser200 205 210Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly215 220 225Ser Gly Asp Phe Asp Tyr Glu Lys Met Ala Asn Ala Asn Lys Gly230 235 240Ala Met Thr Glu Asn Ala Asp Glu Asn Ala Leu Gln Ser Asp Ala245 250 255Lys Gly Lys Leu Asp Ser Val Ala Thr Asp Tyr Gly Ala Ala Ile260 265 270Asp Gly Phe Ile Gly Asp Val Ser Gly Leu Ala Asn Gly Asn Gly275 280 285Ala Thr Gly Asp Phe Ala Gly Ser Asn Ser Gln Met Ala Gln Val290 295 300Gly Asp Gly Asp Asn Ser Pro Leu Met Asn Asn Phe Arg Gln Tyr305 310 315Leu Pro Ser Leu Pro Gln Ser Val Glu Cys Arg Pro Phe Val Phe320 325 330Gly Ala Gly Lys Pro Tyr Glu Phe Ser Ile Asp Cys Asp Lys Ile335 340 345Asn Leu Phe Arg Gly Val Phe Ala Phe Leu Leu Tyr Val Ala Thr350 355 360Phe Met Tyr Val Phe Ser Thr Phe Ala Asn Ile Leu Arg Asn Lys365 370 375Glu Ser379<210>21<211>658<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>sig_peptide<222>(22)...(84)<220>
<221>mat_peptide<222>(85)...(648)
<223>修飾的hNGAL和Strep-tag II的融合蛋白<220>
<221>CDS<222>(85)...(618)<223>成熟hNGAL<220>
<221>CDS<222>(619)...(648)<223>Strep-tagII親和標(biāo)簽<400>21tctagataac gagggcaaaa a atg aaa aag aca gct atc gcg att 45Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile-21 -20 -15gca gtg gct ctg gct ggc ttc gct acc gta gcg cag gcc cag gac 90Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Gln Asp-10 -5 -1 1tcc acc tca gac ctg atc cca gcc cca cct ctg agc aag gtc cct 135Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val Pro5 10 15ctg cag cag aac ttc cag gac aac caa ttc cag ggg aag tgg tat 180Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr20 25 30ctg gta ggt ctc gca ggg aat gca att ctc aga gaa gac aaa gac 225Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Ala Ile Leu Arg Glu Asp Lys Asp35 40 45ccg caa aag atg tat gcc acc atc tat gag ctg aaa gaa gac aag 270Pro Gln Lys Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys50 55 60agc tac aat gtc acc tcc gtc ctg ttt agg aaa aag aag tgt gac 315Ser Tyr Asn Val Thr Ser Val Leu Phe Arg Lys Lys Lys Cys Asp65 70 75tac tgg atc agg act ttt gtt cca ggt tcc cag cca ggc gag ttc 360Tyr Trp Ile Arg Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe80 85 90acg ctg ggc aac att aag agt tac cct gga tta acg agt tac ctc 405Thr Leu Gly Asn Ile Lys Ser Tyr Pro Gly Leu Thr Ser Tyr Leu95 100 105gtc cga gtg gtg agc acc aac tac aac cag cat gct atg gtg ttc 450Val Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe110 115 120ttt aag aaa gtt tct caa aac agg gag tac ttc aag att acc atc 495Phe Lys Lys Val Ser Gln Asn Arg Glu Tyr Phe Lys Ile Thr Ile125 130 135tac ggg aga acc aag gag ctg cct tcg gaa cta aag gag aac ttc 540Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe140 145 150atc cgc ttc tcc aaa tct ctg ggc ctc cct gaa aac cac atc gtc 585Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asn His Ile Val155 160 165
ttc cct gtc cca atc gac cag tgt atc gac ggc agc gct tgg tcc 630Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Asp Gly Ser Ala Trp Ser170 175 180cac ccg cag ttc gaa aaa taataagctt 658His Pro Gln Phe Glu Lys185<210>22<211>209<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>信號(hào)序列<222>(-21)...(-1)<220>
<221>鏈<222>(1)...(188)<223>修飾的hNGAL和Strep-tag II的融合蛋白<220><221>
<222>(1)...(178)<223>修飾的成熟hNGAL<220>
<221>
<222>(179)...(188)<223>Strep-tag II親和標(biāo)簽<400>22Met Lys Lys Thr Ala Ile Ala Ile-21 -20 -15Ala Val Ala Leu Ala Gly Phe Ala Thr Val Ala Gln Ala Gln Asp-10 -5 -1 1Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys Val Pro5 10 15Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys Trp Tyr20 25 30Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Ala Ile Leu Arg Glu Asp Lys Asp35 40 45Pro Gln Lys Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu Asp Lys50 55 60Ser Tyr Asn Val Thr Ser Val Leu Phe Arg Lys Lys Lys Cys Asp65 70 75Tyr Trp Ile Arg Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu Phe80 85 90Thr Leu Gly Asn Ile Lys Ser Tyr Pro Gly Leu Thr Ser Tyr Leu95 100 105Val Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val Phe110 115 120
Phe Lys Lys Val Ser Gln Asn Arg Glu Tyr Phe Lys Ile Thr Ile125 130 135Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn Phe140 145 150Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asn His Ile Val155 160 165Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Asp Gly Ser Ala Trp Ser170 175 180His Pro Gln Phe Glu Lys185<210>23<211>534<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1)...(534)<223>突變蛋白R(shí)FY-B<400>23cag gac tcc acc tca gac ctg atc cca gcc cca cct ctg agc aag 45Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys1 5 10 15gtc cct ctg cag cag aac ttc cag gac aac caa ttc cag ggg aag 90Val Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys20 25 30tgg tat ctg gta ggt ctc gca ggg aat ggg att acg aga tat gac 135Trp Tyr Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Gly Ile Thr Arg Tyr Asp35 40 45cgg ctg ccg tct gtg atg tat gcc acc atc tat gag ctg aaa gaa 180Arg Leu Pro Ser Val Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu50 55 60gac aag agc tac aat gtc acc tcc gtc gat ttt tgg gct aag aag 225Asp Lys Ser Tyr Asn Val Thr Ser Val Asp Phe Trp Ala Lys Lys65 70 75tgt aat tac aag atc agg act ttt gtt cca ggt tcc cag cca ggc 270Cys Asn Tyr Lys Ile Arg Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly80 85 90gag ttc acg ctg ggc aac att aag agt tac gat ctg ctt acg agt 315Glu Phe Thr Leu Gly Asn Ile Lys Ser Tyr Leu Gly Leu Thr Ser95 100 105ttc ctc gtc cga gtg gtg agc acc aac tac aac cag cat gct atg 360Phe Leu Val Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met110 115 120gtg ttc ttt aag ccg gtt ggg ggg aac att gag tgg ttc aag att 405Val Phe Phe Lys Pro Val Gly Gly Asn Ile Glu Trp Phe Lys Ile125 130 135
acc atc tac ggg aga acc aag gag ctg cct tcg gaa cta aag gag 450Thr Ile Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Thr Ser Glu Leu Lys Glu140 145 150aac ttc atc cgc ttc tcc aaa tct ctg ggc ctc cct gaa aac cac 495Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asn His155 160 165atc gtc ttc cct gtc cca atc gac cag tgt atc gac ggc 534Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Asp Gly170 175<210>24<211>178<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>
<222>(1)...(178)<223>突變蛋白R(shí)FY-B<400>24Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys1 5 10 15Val Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys20 25 30Trp Tyr Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Gly Ile Thr Arg Tyr Asp35 40 45Arg Leu Pro Ser Val Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu50 55 60Asp Lys Ser Tyr Asn Val Thr Ser Val Asp Phe Trp Ala Lys Lys65 70 75Cys Asn Tyr Lys Ile Arg Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly80 85 90Glu Phe Thr Leu Gly Asn Ile Lys Ser Tyr Leu Gly Leu Thr Ser95 100 105Phe Leu Val Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met110 115 120Val Phe Phe Lys Pro Val Gly Gly Asn Ile Glu Trp Phe Lys Ile125 130 135Thr Ile Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Thr Ser Glu Leu Lys Glu140 145 150Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asn His155 160 165Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Asp Gly170 175<210>25
<211>534<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1)...(534)<223>突變蛋白R(shí)FY-C<400>25cag gac tcc acc tca gac ctg atc cca gcc cca cct ctg agc aag 45Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys1 5 10 15gtc cct ctg cag cag aac ttc cag gac aac caa ttc cag ggg aag 90Val Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys20 25 30tgg tat ctg gta ggt ctc gca ggg aat ggg att cat aga ctg gac 135Trp Tyr Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Gly Ile His Arg Leu Asp35 40 45aat gtt ccg cct aat atg tat gcc acc atc tat gag ctg aaa gaa 180Asn Val Pro Pro Asn Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu50 55 60gac aag agc tac aat gtc acc tcc gtc gat ttt ctt atg aag aag 225Asp Lys Ser Tyr Asn Val Thr Ser Val Asp Phe Leu Met Lys Lys65 70 75tgt ccg tac ttt atc agg act ttt gtt cca ggt tcc cag cca ggc 270Cys Pro Tyr Phe Ile Arg Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly80 85 90gag ttc acg ctg ggc aac att aag agt tac ccg ttt ctt acg agt 315Glu Phe Thr Leu Gly Asn Ile Lys Ser Tyr Pro Phe Leu Thr Ser95 100 105ttc ctc gtc cga gtg gtg agc acc aac tac aac cag cat gct atg 360Phe Leu Val Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met110 115 120gtg ttc ttt aag aat gtt cct agg aac tat gag gag ttc aag att 405Val Phe Phe Lys Asn Val Pro Arg Asn Tyr Glu Glu Phe Lys Ile125 130 135acc atc tac ggg aga acc aag gag ctg cct tcg gaa cta aag gag 450Thr Ile Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Thr Ser Glu Leu Lys Glu140 145 150aac ttc atc cgc ttc tcc aaa tct ctg ggc ctc cct gaa aac cac 495Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asn His155 160 165atc gtc ttc cct gtc cca atc gac cag tgt atc gac ggc 534Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Asp Gly170 175<210>26<211>178<212>PRT<213>人工序列
<220>
<221>
<222>(1)...(178)<223>突變蛋白R(shí)FY-C<400>26Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys1 5 10 15Val Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys20 25 30Trp Tyr Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Gly Ile His Arg Leu Asp35 40 45Asn Val Pro Pro Asn Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu50 55 60Asp Lys Ser Tyr Asn Val Thr Ser Val Asp Phe Leu Met Lys Lys65 70 75Cys Pro Tyr Phe Ile Arg Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly80 85 90Glu Phe Thr Leu Gly Asn Ile Lys Ser Tyr Pro Phe Leu Thr Ser95 100 105Phe Leu Val Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met110 115 120Val Phe Phe Lys Asn Val Pro Arg Asn Tyr Glu Glu Phe Lys Ile125 130 135Thr Ile Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Thr Ser Glu Leu Lys Glu140 145 150Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asn His155 160 165Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Asp Gly170 175<210>27<211>534<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1)...(534)<223>突變蛋白R(shí)FY-E<400>27cag gac tcc acc tca gac ctg atc cca gcc cca cct ctg agc aag 45Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys1 5 10 15gtc cct ctg cag cag aac ttc cag gac aac caa ttc cag ggg aag 90Val Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys20 25 30
tgg tat ctg gta ggt ctc gca ggg aat ggg att acg aga gtt gac 135Trp Tyr Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Gly Ile Thr Arg Val Asp35 40 45acg ctg ccg tct cgg atg tat gcc acc atc tat gag ctg aaa gaa 180Thr Leu Pro Ser Arg Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu50 55 60gac aag agc tac aat gtc acc tcc gtc cct ttt atg ggt aag aag 225Asp Lys Ser Tyr Asn Val Thr Ser Val Pro Phe Met Gly Lys Lys65 70 75tgt aag tac aag atc agg act ttt gtt cca ggt tcc cag cca ggc 270Cys Lys Tyr Lys Ile Arg Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly80 85 90gag ttc acg ctg ggc aac att aag agt tac atg tcg aat acg agt 315Glu Phe Thr Leu Gly Asn Ile Lys Ser Tyr Met Ser Asn Thr Ser95 100 105ttc ctc gtc cga gtg gtg agc acc aac tac aac cag cat gct atg 360Phe Leu Val Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met110 115 120gtg ttc ttt aag cag gtt cat aag aac cct gag tct ttc aag att 405Val Phe Phe Lys Gln Val His Lys Asn Pro Glu Ser Phe Lys Ile125 130 135acc atc tac ggg aga acc aag gag ctg cct tcg gaa cta aag gag 450Thr Ile Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Thr Ser Glu Leu Lys Glu140 145 150aac ttc atc cgc ttc tcc aaa tct ctg ggc ctc cct gaa aac cac 495Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asn His155 160 165atc gtc ttc cct gtc cca atc gac cag tgt atc gac ggc 534Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Asp Gly170 175<2l0>28<211>178<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>
<222>(1)...(178)<223>突變蛋白R(shí)FY-E<400>28Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys1 5 10 15Val Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys20 25 30Trp Tyr Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Gly Ile Thr Arg Val Asp35 40 45Thr Leu Pro Ser Arg Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu50 55 60
Asp Lys Ser Tyr Asn Val Thr Ser Val Pro Phe Met Gly Lys Lys65 70 75Cys Lys Tyr Lys Ile Arg Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly80 85 90Glu Phe Thr Leu Gly Asn Ile Lys Ser Tyr Met Ser Asn Thr Ser95 100 105Phe Leu Val Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met110 115 120Val Phe Phe Lys Gln Val His Lys Asn Pro Glu Ser Phe Lys Ile125 130 135Thr Ile Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Thr Ser Glu Leu Lys Glu140 145 150Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asn His155 160 165Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Asp Gly170 175<210>29<211>77<212>PRT<213>人<220>
<221>
<222>(1)...(77)<223>重組人白介素-8<400>29Ala Val Leu Pro Arg Ser Ala Lys Glu Leu Arg Cys Gln Cys Ile1 5 10 15Lys Thr Tyr Ser Lys Pro Phe His Pro Lys Phe Ile Lys Glu Leu20 25 30Arg Val Ile Glu Ser Gly Pro His Cys Ala Asn Thr Glu Ile Ile35 40 45Val Lys Leu Ser Asp Gly Arg Glu Leu Cys Leu Asp Pro Lys Glu50 55 60Asn Trp Val Gln Arg Val Val Glu Lys Phe Leu Lys Arg Ala Glu65 70 75Asn Ser77<210>30<211>534<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1)...(534)
<223>突變蛋白N4<400>30cag gac tcc acc tca gac ctg atc cca gcc cca cct ctg agc aag 45Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys1 5 10 15gtc cct ctg cag cag aac ttc cag gac aac caa ttc cag ggg aag 90Val Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys20 25 30tgg tat ctg gta ggt ctc gca ggg aat gat att tat aga gcg gac 135Trp Tyr Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Asp Ile Tyr Arg Ala Asp35 40 45tct ttg ccg ggt ttg atg tat gcc acc atc tat gag ctg aaa gaa 180Ser Leu Pro Gly Leu Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu50 55 60gac aag agc tac aat gtc acc tcc gtc gtt ttt tat gat aag aag 225Asp Lys Ser Tyr Asn Val Thr Ser Val Val Phe Tyr Asp Lys Lys65 70 75tgt gtt tac tcg atc agg act ttt gtt cca ggt tcc cag cca ggc 270Cys Val Tyr Ser Ile Arg Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly80 85 90gag ttc acg ctg ggc aac att aag agt tac gag gct gtt acg agt 315Glu Phe Thr Leu Gly Asn Ile Lys Ser Tyr Glu Ala Val Thr Ser95 100 105ttc ctc gtc cga gtg gtg agc acc aac tac aac cag cat gct atg 360Phe Leu Val Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met110 115 120gtg ttc ttt aag gat gtt agg ccg aac agt gag gag ttc aag att 405Val Phe Phe Lys Asp Val Arg Pro Asn Ser Glu Glu Phe Lys Ile125 130 135acc atc tac ggg aga acc aag gag ctg cct tcg gaa cta aag gag 450Thr Ile Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Thr Ser Glu Leu Lys Glu140 145 150aac ttc atc cgc ttc tcc aaa tct ctg ggc ctc cct gaa aac cac 495Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asn His155 160 165atc gtc ttc cct gtc cca atc gac cag tgt atc gac ggc 534Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Asp Gly170 175<210>31<211>522<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>mat_peptide<222>(4)...(513)<223>腫瘤壞死因子α和親和標(biāo)簽的融合蛋白
<220>
<221>CDS<222>(4)...(42)<223>親和標(biāo)簽Arg-Gly-Ser-His(6)-Gly(3)<220>
<221>CDS<222>(43)...(513)<223>成熟腫瘤壞死因子α<400>31cat atg aga gga tcg cat cac cat cac cat cac ggt ggc ggg gtc 45Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Gly Gly Val1 5 10aga tca tct tct cga acc ccg agt gac aag cct gta gcc cat gtt 90Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val15 20 25gta gca aac cct caa gct gag ggg cag ctc cag tgg ctg aac cgc 135Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg30 35 40cgg gcc aat gcc ctc ctg gcc aat ggc gtg gag ctg aga gat aac 180Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn45 50 55cag ctg gtg gtg cca tca gag ggc ctg tac ctc atc tac tcc cag 225Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln60 65 70gtc ctc ttc aag ggc caa ggc tgc ccc tcc acc cat gtg ctc ctc 270Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu75 80 85acc cac acc atc agc cgc atc gcc gtc tcc tac cag acc aag gtc 315Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val90 95 100aac ctc ctc tct gcc atc aag agc ccc tgc cag agg gag acc cca 360Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro105 110 115gag ggg gct gag gcc aag ccc tgg tat gag ccc atc tat ctg gga 405Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly120 125 130ggg gtc ttc cag ctg gag aag ggt gac cga ctc agc gct gag atc 450Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile135 140 145aat cgg ccc gac tat ctc gac ttt gcc gag tct ggg cag gtc tac 495Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr150 155 160ttt ggg atc att gcc ctg tgaaagctt 522Phe Gly Ile Ile Ala Leu165 170<210>32<211>534<212>DNA
<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1)...(534)<223>突變蛋白TNF-V1<400>32CAG GAC TCC ACC TCA GAC CTG ATC CCA GCC CCA CCT CTG AGC AAG 45Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys1 5 10 15GTC CCT CTG CAG CAG AAC TTC CAG GAC AAC CAA TTC CAG GGG AAG 90Val Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys20 25 30TGG TAT CTG GTA GGT CTC GCA GGG AAT TTT ATT TTT AGA TTG GAC 135Trp Tyr Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Phe Ile Phe Arg Leu Asp35 40 45TTG GAG CCG TTT TTT ATG TAT GCC ACC ATC TAT GAG CTG AAA GAA 180Leu Glu Pro Phe Phe Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu50 55 60GAC AAG AGC TAC AAT GTC ACC TCC GTC ACG TTT TTG GAG AAG AAG 225Asp Lys Ser Tyr Asn Val Thr Ser Val Thr Phe Leu Glu Lys Lys65 70 75TGT TTT TAC GAG AGG ACT TTT GTT CCA GGT TCC CAG CCA GGC GAG 270Cys Phe Tyr Glu Arg Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu80 85 90TTC ACG CTG GGC AAC ATT AAG AGT TAC AAG CAT GGT ACG AGT TTC 315Phe Thr Leu Gly Asn Ile Lys Ser Tyr Lys His Gly Thr Ser Phe95 100 105CTC GTC CGA GTG GTG AGC ACC AAC TAC AAC CAG CAT GCT ATG GTG 360Leu Val Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val110 115 120TTC TTT AAG GAT GTT AGT CAG AAC CGT GAG AAT TTC AAG ATT ACC 405Phe Phe Lys Asp Val Ser Gln Asn Arg Glu Asn Phe Lys Ile Thr125 130 135ATC TAC GGG AGA ACC AAG GAG CTG CCT TCG GAA CTA AAG GAG AAC 450Ile Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn140 145 150TTC ATC CGC TTC TCC AAA TCT CTG GGC CTC CCT GAA AAC CAC ATC 495Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asn His Ile155 160 165GTC TTC CCT GTC CCA ATC GAC CAG TGT ATC GAC GGC 531Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Asp Gly170 175<210>33<211>534<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>CDS<222>(1)...(534)<223>突變蛋白TNF-V2<400>33cag gac tcc acc tca gac ctg atc cca gcc cca cct ctg agc aag 45Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys1 5 10 15gtc cct ctg cag cag aac ttc cag gac aac caa ttc cag ggg aag 90Val Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys20 25 30tgg tat ctg gta ggt ctc gca ggg aat ggt att ttt aga gtt gac 135Trp Tyr Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Gly Ile Phe Arg Val Asp35 40 45ttt aat ccg att tct atg tat gcc acc atc tat gag ctg aaa gaa 180Phe Asn Pro Ile Ser Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu50 55 60gac aag agc tac aat gtc acc tcc gtc gat ttt gct aat aag aag 225Asp Lys Ser Tyr Asn Val Thr Ser Val Asp Phe Ala Asn Lys Lys65 70 75tgt gcg tac cgg atc agg act ttt gtt cca ggt tcc cag cca ggc 270Cys Ala Tyr Arg Ile Arg Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly80 85 90gag ttc acg ctg ggc aac att aag agt tac ggt aat gtg acg agt 315Glu Phe Thr Leu Gly Asn Ile Lys Ser Tyr Gly Asn Val Thr Ser95 100 105ttc ctc gtc cga gtg gtg agc acc aac tac aac cag cat gct atg 360Phe Leu Val Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met110 115 120gtg ttc ttt aag ggt gtt gat tcg aac aat gag cgg ttc aag att 405Val Phe Phe Lys Gly Val Asp Ser Asn Asn Glu Arg Phe Lys Ile125 130 135acc atc tac ggg aga acc aag gag ctg cct tcg gaa cta aag gag 450Thr Ile Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Thr Ser Glu Leu Lys Glu140 145 150aac ttc atc cgc ttc tcc aaa tct ctg ggc ctc cct gaa aac cac 495Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asn His155 160 165atc gtc ttc cct gtc cca atc gac cag tgt atc gac ggc 534Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Asp Gly170 175<210>34<211>178<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>
<222>(1)...(178)
<223>突變蛋白N4<400>34Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys1 5 10 15Val Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys20 25 30Trp Tyr Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Asp Ile Tyr Arg Ala Asp35 40 45Ser Leu Pro Gly Leu Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu50 55 60Asp Lys Ser Tyr Asn Val Thr Ser Val Val Phe Tyr Asp Lys Lys65 70 75Cys Val Tyr Ser Ile Arg Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly80 85 90Glu Phe Thr Leu Gly Asn Ile Lys Ser Tyr Glu Ala Val Thr Ser95 100 105Phe Leu Val Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met110 115 120Val Phe Phe Lys Asp Val Arg Pro Asn Ser Glu Glu Phe Lys Ile125 130 135Thr Ile Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Thr Ser Glu Leu Lys Glu140 145 150Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asn His155 160 165Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Asp Gly170 175<210>35<211>170<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>鏈<222>(1)...(170)<223>腫瘤壞死因子α和親和標(biāo)簽的融合蛋白<220>
<221>
<222>(1)...(13)<223>親和標(biāo)簽Arg-Gly-Ser-His(6)-Gly(3)<220>
<221>
<222>(14)...(170)<223>成熟腫瘤壞死因子α<400>35
Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly Gly Gly Val1 5 10Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val15 20 25Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg30 35 40Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn45 50 55Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln60 65 70Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu75 80 85Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val90 95 100Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro105 110 115Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly120 125 130Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile135 140 145Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr150 155 160Phe Gly Ile Ile Ala Leu165 170<210>36<211>178<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>
<222>(1)...(178)<223>突變蛋白TNF-V1<400>36Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys1 5 10 15Val Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys20 25 30Trp Tyr Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Phe Ile Phe Arg Leu Asp35 40 45Leu Glu Pro Phe Phe Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu50 55 60Asp Lys Ser Tyr Asn Val Thr Ser Val Thr Phe Leu Glu Lys Lys
65 70 75Cys Phe Tyr Glu Arg Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly Glu80 85 90Phe Thr Leu Gly Asn Ile Lys Ser Tyr Lys His Gly Thr Ser Phe95 100 105Leu Val Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met Val110 115 120Phe Phe Lys Asp Val Ser Gln Asn Arg Glu Asn Phe Lys Ile Thr125 130 135Ile Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Thr Ser Glu Leu Lys Glu Asn140 145 150Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asn His Ile155 160 165Val Phe Pro Val Pro Ile Asp Gln Cys Ile Asp Gly170 175<210>37<211>178<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>
<222>(1)...(178)<223>突變蛋白TNF-V2<400>37Gln Asp Ser Thr Ser Asp Leu Ile Pro Ala Pro Pro Leu Ser Lys1 5 10 15Val Pro Leu Gln Gln Asn Phe Gln Asp Asn Gln Phe Gln Gly Lys20 25 30Trp Tyr Val Val Gly Leu Ala Gly Asn Gly Ile Phe Arg Val Asp35 40 45Phe Asn Pro Ile Ser Met Tyr Ala Thr Ile Tyr Glu Leu Lys Glu50 55 60Asp Lys Ser Tyr Asn Val Thr Ser Val Asp Phe Ala Asn Lys Lys65 70 75Cys Ala Tyr Arg Ile Arg Thr Phe Val Pro Gly Ser Gln Pro Gly80 85 90Glu Phe Thr Leu Gly Asn Ile Lys Ser Tyr Gly Asn Val Thr Ser95 100 105Phe Leu Val Arg Val Val Ser Thr Asn Tyr Asn Gln His Ala Met110 115 120Val Phe Phe Lys Gly Val Asp Ser Asn Asn Glu Arg Phe Lys Ile125 130 135
Thr Ile Tyr Gly Arg Thr Lys Glu Leu Thr Ser Glu Leu Lys Glu140 145 150Asn Phe Ile Arg Phe Ser Lys Ser Leu Gly Leu Pro Glu Asn His155 160 165Ile Val Phe Pro Val Pro Ile Asp G1n Cys Ile Asp Gly170 17權(quán)利要求
1.用于制備蛋白的突變蛋白的方法，其中，所述蛋白選自人嗜中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂卡林(hNGAL)、大鼠α2-微球蛋白相關(guān)蛋白(A2m)及小鼠24p3/子宮卡林(24p3)，所述突變蛋白對(duì)給定的靶標(biāo)有可檢測(cè)的親合力，所述方法包括步驟(a)將蛋白在一個(gè)或多個(gè)與hNGAL的序列位置33-54、66-83、94-106、和123-136相對(duì)應(yīng)的序列位置進(jìn)行誘變，產(chǎn)生蛋白的一個(gè)或多個(gè)突變蛋白。
2.權(quán)利要求1的方法，還包括步驟(b)通過(guò)篩選從產(chǎn)生的一個(gè)或多個(gè)突變蛋白中富集對(duì)給定靶標(biāo)有結(jié)合親合力的至少一個(gè)突變蛋白，和/或分離所述至少一個(gè)突變蛋白。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中步驟(a)的誘變導(dǎo)致蛋白的多個(gè)突變蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求1到3任一項(xiàng)的方法，其中蛋白在與hNGAL序列位置40-50、70-79、101-103和125-132相應(yīng)的一個(gè)或多個(gè)序列位置進(jìn)行誘變。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中蛋白在與hNGAL序列位置40、42、44、46、47、49、50、70、72、73、77、79、101、102、103、125、127、128、130和132相應(yīng)的一個(gè)或多個(gè)序列位置進(jìn)行誘變。
6.根據(jù)權(quán)利要求1到5任一項(xiàng)的方法，其中由誘變產(chǎn)生的編碼蛋白的一個(gè)或多個(gè)突變蛋白的核酸可操作地在其3’末端融合有編碼M13絲狀噬菌體家族外殼蛋白pIII或此外殼蛋白的片段的基因，從而允許根據(jù)與給定靶標(biāo)的結(jié)合篩選出至少一個(gè)突變蛋白。
7.對(duì)給定的靶標(biāo)有可檢測(cè)的結(jié)合親合力的人嗜中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂卡林(hNGAL)、大鼠α2微球蛋白相關(guān)蛋白(A2m)或小鼠24p3/子宮卡林(24p3)的突變蛋白，其可以由權(quán)利要求1到6任一項(xiàng)的方法獲得。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的hNGAL突變蛋白，其中Cys87被替換和/或其中突變蛋白與hNGAL相比載有Glu28→His和Thr145→Ala中的一個(gè)或多個(gè)氨基酸替換。
9.根據(jù)權(quán)利要求7的hNGAL突變蛋白，其具有SEQ ID NO17、SEQID NO24、SEQ ID NO26或SEQ ID NO28的氨基酸序列。
10.根據(jù)權(quán)利要求7到9任一項(xiàng)的突變蛋白，其與選自下組中的標(biāo)記物綴合有機(jī)分子、酶標(biāo)記物、放射性標(biāo)記物、熒光標(biāo)記物、顯色標(biāo)記物、發(fā)光標(biāo)記物、半抗原、地高辛配基、生物素、金屬配合物、金屬和膠體金。
11.含有根據(jù)權(quán)利要求7到10任一項(xiàng)的hNGAL、A2m或24p3的突變蛋白的融合蛋白，其中酶、蛋白或蛋白結(jié)構(gòu)域、肽、信號(hào)序列和/或親和標(biāo)簽與突變蛋白的氨基端或羧基端可操作地融合。
12.含有編碼根據(jù)權(quán)利要求7到11任一項(xiàng)的hNGAL、A2m或24p3的突變蛋白或其融合蛋白的序列的核酸分子。
13.藥物組合物，其含有根據(jù)權(quán)利要求7到11任一項(xiàng)的hNGAL、A2m或24p3的突變蛋白或其融合蛋白以及藥學(xué)可接受載體。
14.用于制備根據(jù)權(quán)利要求7到11任一項(xiàng)的hNGAL、A2m或24p3的突變蛋白或其融合蛋白的方法，其中，起始自編碼突變蛋白的核酸，通過(guò)基因工程方法在細(xì)菌或真核宿主生物體內(nèi)產(chǎn)生突變蛋白或其融合蛋白，并從此宿主生物體或其培養(yǎng)物中分離之。
15.根據(jù)權(quán)利要求7到11任一項(xiàng)的hNGAL、A2m或24p3的突變蛋白或其融合蛋白在檢測(cè)給定靶標(biāo)中的用途，其包括步驟在適宜的條件下使突變蛋白與懷疑含有給定靶標(biāo)的樣品接觸，由此允許突變蛋白和給定靶標(biāo)之間形成復(fù)合物，并通過(guò)適宜的信號(hào)測(cè)定形成復(fù)合物的突變蛋白。
16.權(quán)利要求15的用途，其中給定靶標(biāo)是蛋白或蛋白結(jié)構(gòu)域、肽、核酸分子、有機(jī)分子或金屬配合物，且所述檢測(cè)用于確認(rèn)作為藥理學(xué)藥物靶標(biāo)的蛋白。
全文摘要
本發(fā)明公開了用于制備蛋白的突變蛋白的方法，其中，所述蛋白選自人嗜中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂卡林(hNGAL)、大鼠α
文檔編號(hào)G01N33/68GK1561394SQ02819007
公開日2005年1月5日 申請(qǐng)日期2002年9月18日 優(yōu)先權(quán)日2001年9月27日
發(fā)明者A·斯克拉, S·施勒胡伯爾 申請(qǐng)人:皮里斯蛋白實(shí)驗(yàn)公司