專利名稱：多肽的定量分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及多肽的定量分析。具體來說，本發(fā)明涉及用于確定選定的多肽在樣品中的實際量的方法和材料。本方法包括以相應于特定的水解產(chǎn)物的外源多肽為參照，來測量從選定的多肽中釋放出的特定的水解產(chǎn)物的量。
背景技術(shù)：
多肽在生物系統(tǒng)中具有重要的作用。例如，多肽可以作為催化生物反應的酶，作為多種分子的轉(zhuǎn)運蛋白或載體，作為分子間和分子內(nèi)信號傳導的受體，作為激素，以及作為細胞、組織和器官的結(jié)構(gòu)元件。
確定特定的多肽的量在研究中(例如在藥物發(fā)現(xiàn)和開發(fā)中)和臨床中(例如用于醫(yī)療診斷和監(jiān)測治療效果)通常都是重要的。特定的多肽通常通過例如親和的方法來定量，包括免疫分析、質(zhì)譜和高效液相色譜。放射性同位素、穩(wěn)定的同位素、熒光和化學發(fā)光試劑可以與這些方法結(jié)合使用來對多肽定量。酶可以通過對其催化活性進行生物化學分析來定量。
傳統(tǒng)的方法在測量樣品中特定的多肽的實際量而不是相對量的能力方面有所局限。這個缺點使得其難以對由于例如疾病或藥物治療的影響而引起的蛋白水平的變化作出評估。對特定的多肽在復雜混合物或水不溶性環(huán)境(例如細胞膜)中的實際量進行定量，已經(jīng)被證明是特別困難的。因此，本發(fā)明的方法避免了許多與不溶性蛋白相關(guān)的問題，這是因為可以選擇一個可溶性的蛋白水解片段來定量地代表完整的蛋白。
發(fā)明概述本發(fā)明的特征在于測定樣品中選定的多肽的實際量的方法和材料。該方法包括以相應于特定的水解產(chǎn)物的外源多肽為參照，來測量從選定的多肽中釋放出的特定的水解產(chǎn)物的量。公開的方法和材料與傳統(tǒng)的多肽定量方法相比提供了許多優(yōu)點?？梢砸砸环N容易制備的參照多肽為對照測定選定的多肽的實際量而不是相對量。參照多肽對應于被測量的特定水解產(chǎn)物，因此消除了與參照的和測量的水解產(chǎn)物的不同行為有關(guān)的誤差。膜結(jié)合蛋白的測定可以通過將一種特定的水解產(chǎn)物釋放到溶液中(例如通過對選定的多肽中溶液可進入的位點進行靶向水解)來簡化。本發(fā)明的方法和材料可以用于對甚至是在復雜樣品和水不溶性環(huán)境中的一種或多種選定的多肽進行定量。
本發(fā)明的特征在于測定樣品中一種或多種選定的多肽的實際量的方法。這種特征方法包括1)用至少一種水解試劑從每個選定的多肽上釋放出至少一種特定的水解產(chǎn)物；以及2)通過與確定量的相應的外源多肽進行比較來確定每種特定水解產(chǎn)物的實際量。每種特定水解產(chǎn)物的實際量與它從其上釋放出來的選定的多肽的實際量直接相關(guān)。
在某些實施方案中，樣品含有一種選定的多肽。在其它的實施方案中，樣品含有2到5種選定的多肽。在另一些實施方案中，樣品含有6到10種選定的多肽。
在某些實施方案中，從選定的多肽上可以釋放出一種特定的水解產(chǎn)物。在其它的實施方案中，從選定的多肽上可以釋放出2到5種特定的水解產(chǎn)物。
在某些實施方案中，在特定的水解產(chǎn)物和選定的多肽的量之間有1∶1的直接關(guān)系。
在某些實施方案中，選定的多肽是膜多肽。在某些實施方案中，選定的多肽是神經(jīng)受體。
在某些實施方案中，確定量的相應的外源多肽在釋放步驟前被加入到樣品中。
在某些實施方案中，水解試劑是一種酶(例如胰蛋白酶、Lys-C內(nèi)切蛋白酶、Arg-C內(nèi)切蛋白酶和Glu-C內(nèi)切蛋白酶)。在其它的實施方案中，水解試劑是一種化學試劑(例如溴化氰)。
在某些實施方案中，抗體被用于測量水解產(chǎn)物的量。在其它的實施方案中，串聯(lián)的或高階質(zhì)譜被用于測量水解產(chǎn)物的量。
在某些實施方案中，這種特征方法還包括1)在從選定的多肽上釋放出水解產(chǎn)物之前在樣品中先加入一種確定量的回收多肽；以及2)在從選定多肽上釋放出水解產(chǎn)物后測量回收多肽的實際量。在這些實施方案中，回收多肽相應的特定水解產(chǎn)物的實際量被調(diào)整到能夠反映出在樣品中加入回收多肽后發(fā)生的回收多肽的損失。
在某些實施方案中，這種特征方法還包括1)在從選定的多肽上釋放出水解產(chǎn)物之前在樣品中先加入一種確定量的合成的可水解多肽；2)用水解試劑從合成的可水解多肽上釋放出至少2種不同標記的多肽；以及3)測量每種不同標記的水解產(chǎn)物的實際量。在這些實施方案中，特定水解產(chǎn)物的實際量被調(diào)整到能夠反映出水解的不完全性。在某些這樣的實施方案中，一種不同標記的多肽對應于特定的水解產(chǎn)物，而特定水解產(chǎn)物的實際量被調(diào)整到能夠反映出在樣品中加入可水解多肽后發(fā)生的相應的不同標記的多肽的損失。
本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點將從下面的發(fā)明詳述和權(quán)利要求中變得明顯。
除非有特別的定義，在此所用的所有技術(shù)和科學術(shù)語都具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通專業(yè)人員所通常理解的含義。所有本文提到的著作、專利申請、專利和其它參考文獻以其全文引為參考。在有沖突的情況下，以本發(fā)明的說明書、包括定義為準。所公開的材料、方法和實施例僅僅是說明性的而沒有限制的目的。專業(yè)人員將會認識到與本文描述的方法和材料相似或等同的方法和材料可以被用于實現(xiàn)本發(fā)明。
附圖描述

圖1顯示了合成的多肽TETSQVAPA(SEQ ID NO1)的MS和MS/MS譜圖。
圖2顯示了實驗的和標準樣品的LC/MS/MS離子色譜圖。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了用于確定樣品中選定多肽的實際量的方法和材料。本發(fā)明至少部分是基于這樣一個發(fā)現(xiàn)，即人們可以通過從選定的多肽上釋放出特定的水解產(chǎn)物，然后以相應于特定的水解產(chǎn)物的外源多肽為參照，來測量這種特定的水解產(chǎn)物的量，從而確定樣品中選定多肽的實際量。不受理論的束縛，本測定方法是可能實現(xiàn)的，因為在選定的多肽和被測量的釋放多肽之間有1∶1的摩爾關(guān)系。此外，特定的水解產(chǎn)物和相應的外源多肽在測量過程中有同樣的行為，因此消除了由于測量樣本和參照樣本的不同行為而可能引起的潛在誤差。
提供的方法和材料可以被用于測定樣品中單個選定多肽的實際量，也可以被用于測定樣品中多個選定多肽的實際量?？梢詼y量一種以上的特定水解產(chǎn)物以便增加靈敏度和/或檢查準確性。
此處公開的方法可直接適用于分子生物學、蛋白化學和臨床化學中的許多現(xiàn)有的研究需要。此處公開的方法可以以比現(xiàn)有方法所能提供的更高的靈敏度、動力學范圍、精確度和速度為多種不同的多肽提供絕對的定量。由于本發(fā)明的方法需要的分析循環(huán)時間相對較短，因此可以在例如應激或急性藥劑發(fā)作后的許多時間點動態(tài)地測量特定的一組蛋白的水平，從而更清楚地闡明調(diào)節(jié)途徑。此外，由于本發(fā)明方法比現(xiàn)有可用的方法允許更短的分析循環(huán)時間，本發(fā)明的方法適合于高通量實驗。
選定的多肽和樣品選定的多肽可以是任何多肽(即兩個或更多個氨基酸被肽鍵連接起來)，而樣品可以是任何含有多肽的樣品。適合的樣品包括細胞樣品、組織樣品、體液和環(huán)境樣品。樣品可以來自動物(例如人類)，并可以包括動物細胞、組織或器官。樣品可以來自植物，并可以包括植物細胞、組織或器官。樣品也可以來自真菌、細菌和病毒。樣品也可以來自環(huán)境(例如土壤、水和空氣樣品)。多肽可以來自動物、植物、真菌、細菌和病毒。多肽可以是膜結(jié)合的(即跨過脂雙層或吸附在脂雙層的表面)。膜結(jié)合的多肽可以與例如細胞質(zhì)膜、細胞壁、細胞器膜和病毒衣殼結(jié)合。多肽可以在細胞質(zhì)中或細胞器中。多肽可以在細胞外，被發(fā)現(xiàn)在間隙中或體液中(例如血漿和脊髓液)。多肽可以是生物催化劑，多種分子的轉(zhuǎn)運蛋白或載體，細胞間和細胞內(nèi)信號傳導的受體，激素以及細胞、組織和器官的結(jié)構(gòu)元件。某些多肽是腫瘤標記。
樣品制備液根據(jù)所測定的選定多肽和特定的水解產(chǎn)物的位置和生物物理性質(zhì)測定。樣品在釋放出特定的水解產(chǎn)物之前可以對選定的多肽進行富集。組織或細胞樣品在用水解試劑處理前可以被勻漿或保持完整，這依賴于被測量的選定多肽和特定水解產(chǎn)物的細胞定位。膜結(jié)合的多肽例如受體，一般來說與細胞質(zhì)中的蛋白操作不同。在用水解試劑處理之前可以通過例如離心來分離細胞膜，從而富集膜結(jié)合的多肽。在樣品制備過程中，在用水解試劑處理之前可以分離細胞質(zhì)，從而富集細胞質(zhì)中的多肽。
在某些實施方案中，樣品在用水解試劑處理之前被可溶解。樣品多肽可以根據(jù)樣品的本性溶解在多種介質(zhì)中。例如，粗膜制備物可以溶解在含有6M尿素、還原試劑和烷基化試劑的緩沖的去污劑中。樣品在用水解試劑處理之前可以被脫脂(例如在95％的乙醇和己烷或丙酮中)。樣品在用水解試劑處理之前可以被溶解和脫脂(例如在95％的乙醇和己烷或丙酮中)。在某些情況下，特別是當特定水解產(chǎn)物可以在溶液中獲得時，樣品可以不需要溶解或脫脂就進行消化?？梢栽谌芤褐蝎@得的特定水解產(chǎn)物包括例如從細胞質(zhì)、細胞外、細胞間隙、體液和某些環(huán)境多肽上釋放的水解產(chǎn)物，以及從膜結(jié)合多肽上釋放到溶液中的水解產(chǎn)物。
特定水解產(chǎn)物和水解反應可以通過一種或多種水解試劑的處理將特定水解產(chǎn)物從選定的多肽上釋放出來。這種處理可以通過體外或原位的水解反應來完成，其中在含有多肽的樣品中加入了一種或多種水解試劑。水解試劑在多肽的特定的氨基酸之間水解肽鍵，從而釋放出特定的水解多肽。水解試劑可以單獨使用，也可以組合使用以便從選定多肽上釋放出特定水解產(chǎn)物。某些水解試劑是酶，例如Arg-C內(nèi)切蛋白酶、Glu-C內(nèi)切蛋白酶、Lys-C內(nèi)切蛋白酶和胰蛋白酶。這些特定的內(nèi)切蛋白酶從商業(yè)化的生產(chǎn)商購買到，具有嚴格的特異性，使它們成為用于蛋白定量的理想的水解工具。其它有用的水解試劑是是化學試劑，例如溴化氰。
用一種水解試劑從具有已知氨基酸序列的選定多肽上釋放出的特定水解產(chǎn)物的身份是可能預測的。這樣的預測通常被稱為“虛擬消化”。容易獲得的計算機程序可以便利地進行選定多肽的虛擬消化。大鼠的嘌呤能受體P2X3(GenBank Accession No.CAA62594)的虛擬的胰蛋白酶消化顯示在表1中。特定水解產(chǎn)物的終點相對于天然蛋白中的氨基酸位置在“從”和“到”欄中指明。
表1


一般來說，選擇具有5到100個(例如5-10、10-20、20-40、60-80和80-100個)氨基酸的特定水解產(chǎn)物進行測定。
一般來說，選擇可能被釋放并進入溶液中的特定水解產(chǎn)物來進行測定。水解和測定的可達性可以在例如選定多肽的已知的或預測的三級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上進行評估。此外，具有相對親水的氨基酸序列的特定水解產(chǎn)物特別適合于測定。特定水解產(chǎn)物的疏水性/親水性可以使用計算機軟件、或者在已知的氨基酸疏水性指數(shù)的基礎(chǔ)上手動地進行估計。
一般來說，選擇具有較低的翻譯后修飾的可能性的特定水解產(chǎn)物進行測定。用于翻譯后修飾的氨基酸序列的決定簇是熟知的(參見Han和Martinage，1992，Int J Biochem.，2419-28)，缺乏這樣的序列決定簇的特定水解產(chǎn)物可以通過手工檢查容易地鑒別。
水解反應的條件依賴于使用的水解試劑。樣品多肽可以在含有水解試劑釋放特定水解產(chǎn)物所需的任何分子(例如ATP或Mg++)的緩沖液中稀釋。用蛋白水解酶處理一般在較高的溫度(例如37℃)進行幾個小時或以上。
特定的水解產(chǎn)物可以通過例如凝膠過濾、反相色譜(例如高效液相色譜和快效液相色譜)、固相抽提、離子交換色譜、親和色譜和免疫親和分離，以及這些技術(shù)的不同組合，從水解反應中獲得。用于免疫親和分離的抗體可以使用相應于特定水解產(chǎn)物的外源肽來制備。
多肽的測量和定量特定水解產(chǎn)物的實際量可以通過本領(lǐng)域已知的任何方法測量。在某些實施方案中，特定水解產(chǎn)物的量使用質(zhì)譜(例如串聯(lián)的質(zhì)譜或更高階的質(zhì)譜(例如MSN))測量。在其它的實施方案中，特定水解產(chǎn)物的量通過親和分析例如免疫分析(例如ELISA或RIA)來測量。免疫分析可以是競爭性的，也可以是非競爭性的。對于使用RIA的測量，一般使用外源的多肽作為示蹤劑，一般用放射性同位素例如3H、14C或125I進行標記。在另外的實施方案中，特定水解產(chǎn)物的量通過高效液相色譜進行測量。在某些實施方案中，測量特定水解產(chǎn)物的實際量包括對水解產(chǎn)物進行可檢測的標記(例如通過與熒光、化學發(fā)光或放射性分子結(jié)合)。例如，特定水解產(chǎn)物可以用穩(wěn)定的同位素例如2H、15N、13C或18O進行標記以便利用質(zhì)譜進行測量。
特定水解產(chǎn)物的實際量的確定以相應的外源多肽作為參照。測量確定量的相應外源多肽，然后產(chǎn)生將獲得的信號與多肽量相關(guān)的標準曲線。實驗樣品通過同樣的方法進行測量，使用標準曲線將測量的信號轉(zhuǎn)換成實際的多肽量。選定多肽的實際量可以被測量，這部分是因為相應的外源多肽在測量中與特定水解產(chǎn)物有同樣的行為，因而消除了與特定水解產(chǎn)物和外源多肽的不同行為有關(guān)的潛在誤差。在本文中使用的化合物(例如特定水解產(chǎn)物或選定多肽)的“實際”量是指樣品中化合物的絕對量?；衔锏摹皩嶋H”量可以通過使用例如質(zhì)譜進行直接測量而獲得，也可以通過與使用確定量的相應化合物所產(chǎn)生的標準曲線進行比較而獲得。這樣的相應化合物對于樣品來說一般是外源的(即來自或產(chǎn)生于細胞、組織或器官之外)?；衔锏摹皩嶋H”或“絕對”量與化合物的“相對”量不同，后者中測定的化合物的量是基于或依賴于(即相對于)不相應于被測量的化合物的化合物(“不相應”的化合物)的量。對于本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員來說，顯然適當?shù)牟幌鄳幕衔飸撆c被測量的化合物是同樣類型的化合物(例如，如果測量多肽，不相應的化合物也應該是多肽)。
本發(fā)明的方法允許測定選定的多肽的實際量，因為在多肽和從其產(chǎn)生的獨特的水解產(chǎn)物之間有1∶1的摩爾比率。為了使1∶1的比率得到保證，需要水解試劑的完全水解。本發(fā)明還提供了在水解不完全的情況下(下面討論)測定選定多肽的實際量的方法。本發(fā)明的方法特別適合于獲得例如不能容易或有效地純化的多肽的實際量。這樣的多肽包括但不限于膜多肽(例如受體如G蛋白偶聯(lián)受體和神經(jīng)受體)?？梢哉J識到，本發(fā)明的方法可以用于在正常實驗誤差的范圍內(nèi)測定特定水解產(chǎn)物的實際量以及隨后的選定多肽的實際量。
在使用質(zhì)譜定量分析選定多肽的應用中，相應的外源多肽一般與特定水解產(chǎn)物在組成上一致。在此所用的組成一致的多肽包括同樣的氨基酸，但是可以有不同的一級序列。在使用抗體定量分析選定多肽的應用中，相應的外源多肽與結(jié)合從選定多肽水解產(chǎn)生的特定水解產(chǎn)物的抗體具有特異性免疫反應性。特異性免疫反應多肽是一個抗體制備物能夠與其結(jié)合并顯示出稀釋線性(即對一系列抗原稀釋度有成比例的反應性)的多肽?？贵w制備物不應該表現(xiàn)出與選定多肽及其片段以外的其它多肽的交叉反應性?？贵w制備物的特異性免疫反應性可以針對多肽中任意組的氨基酸(例如抗原決定簇)。與一種生物的多肽特異性反應的抗體制備物可以與另一種生物結(jié)構(gòu)相似的多肽具有特異性免疫反應性。例如，與大鼠的多肽特異性反應的抗體制備物可以與人類的多肽具有特異性免疫反應性。具有免疫反應性的相應的外源多肽應該與特定水解產(chǎn)物一致。對于本領(lǐng)域的專業(yè)人員來說，顯然用于定量選定多肽的免疫分析中使用的抗體制備物需要過量，以便100％的特定水解產(chǎn)物可以被檢測到。
回收多肽和水解對照回收多肽可以被用來校正在樣品制備、水解和/或定量分析過程中可能發(fā)生的特定水解產(chǎn)物的任何損失?；厥斩嚯氖且环N相應于特定水解產(chǎn)物的標記的外源多肽。在使用時，回收多肽可以以確定的量直接加到樣品中作為內(nèi)標。回收多肽的加入允許對在將其加入到樣品中之時一直到回收多肽被測量時為止的期間可能發(fā)生的損失進行校正。因此，為了校正在樣品制備、水解和定量分析過程中發(fā)生的所有損失，可以在開始樣品制備之前在樣品中加入確定量的回收多肽，然后在測量相應的特定水解產(chǎn)物的量時測量回收多肽的量?；厥斩嚯牡膿p失(因此也是相應的特定水解產(chǎn)物的損失)可以通過將樣品制備后存在的回收多肽的量與加入到樣品中的確定的量進行比較而確定。然后可以將特定水解產(chǎn)物的測定量調(diào)整到反映出回收多肽的損失。
回收多肽可以與被測量的特定水解產(chǎn)物一致。在使用質(zhì)譜定量分析選定多肽的應用中，回收多肽一般與被測定的特定水解產(chǎn)物一致。在使用抗體定量分析選定多肽的應用中，回收多肽一般與結(jié)合被測定的特定水解產(chǎn)物的抗體具有特異性免疫反應性。
回收多肽可以使用本領(lǐng)域已知的任何方法進行標記。例如，回收多肽可以用穩(wěn)定的同位素例如2H、15N、13C和18O進行標記以便用質(zhì)譜進行測量?；厥斩嚯目梢允褂胾H、14C或125I進行標記以便用免疫分析進行測量。回收多肽還可以用熒光或化學發(fā)光分子進行標記。當回收多肽被加入到含有標記的特定水解產(chǎn)物的樣品中時，標記的特定水解產(chǎn)物和相應的回收多肽的標記一般來說是不同的。當使用放射性免疫分析測量特定水解產(chǎn)物時，在回收多肽中的放射活性的量一般來說是足夠低的，以便不干擾特定水解產(chǎn)物的測量。
為了證實特定水解產(chǎn)物與起始的選定多肽之間有1∶1的摩爾關(guān)系，應該證實水解反應的完全性。多種方法可以被用來證實水解反應的完全性。例如，一種監(jiān)測已知的多肽(例如選定多肽)轉(zhuǎn)化為水解產(chǎn)物的動力學實驗可以被用來估計特定的水解試劑將選定多肽完全轉(zhuǎn)化為水解產(chǎn)物所需要的時間。
另一種證實選定多肽的完全水解的方法包括設(shè)計和制備具有一個可水解位點(例如，如果使用胰蛋白酶作為水解試劑，為賴氨酸)的不同標記的合成的可水解肽。在可水解位點的N-端的一種或多種氨基酸和可水解位點的C-端的一種或多種氨基酸用不同的同位素標記。例如N-端的氨基酸可以用14C標記，而可水解位點的C-端的氨基酸可以用3H標記。帶有不同標記的可水解多肽在水解反應前被加入到樣品中，既可以直接加到含有選定多肽的樣品中，也可以加入到平行樣品中。同位素的量可以使用雙通道的液閃計數(shù)器定量，一種同位素對另一種同位素的比率是水解反應完全性的一種度量單位。
如果帶有不同標記的可水解多肽直接被加入到含有選定多肽的樣品中，它被加入的量應該不干擾特定水解產(chǎn)物的測量。如果可水解的肽被直接加入到含有選定多肽的樣品中，它應該使用與任何標記的特定水解產(chǎn)物(例如通過MS/MS測量的水解產(chǎn)物)不同的標記。
在合成的可水解多肽的可水解位點一側(cè)或兩側(cè)的氨基酸可以相應于特定的水解產(chǎn)物。如果在可水解位點任何一側(cè)的氨基酸對應于被測量的特定水解產(chǎn)物，這些氨基酸可以用作回收多肽來說明特定水解產(chǎn)物的任何損失。
多個水解產(chǎn)物的測量對于任何特定的樣品，可以測量多個不同的特定水解產(chǎn)物。通過測量從一個特定的選定多肽上釋放出的多個特定水解產(chǎn)物，人們可以增加這個特定的選定多肽定量分析的靈敏度和/或證實其準確性。通過測量從不同選定多肽上釋放的特定水解產(chǎn)物，人們可以對一個特定樣品中的多個選定多肽進行定量。每個特定水解產(chǎn)物可以以相應的外源多肽作為參照進行測量，并且回收多肽可以被用來說明任何或所有被測量的特定水解產(chǎn)物的損失。
在下面的實施例中將對本發(fā)明進行進一步的描述，這并不對權(quán)利要求中描述的本發(fā)明的范圍構(gòu)成限制。
實施例實施例1人P2X3的ELISA定量本實施例描述了一種膜結(jié)合的嘌呤能受體人P2X3的定量。以相應的合成多肽為參照，測量了從人P2X3羧基端釋放的水解產(chǎn)物。該水解產(chǎn)物的氨基酸序列為QSTDSGAFSIGH(SEQ ID NO2)。相應的合成多肽具有大鼠P2X3的氨基酸序列VEKQSTDSGAYSIGH(SEQ IDNO3)。合成的多肽被用來產(chǎn)生與合成多肽和水解產(chǎn)物具有特異性免疫反應性的抗體?？贵w也通過免疫組化和Western印跡進行證實，以表明對選定多肽的特異性反應性。
樣品和水解反應含有P2X3的制備物從表達人P2X3的Hex細胞轉(zhuǎn)染子制備。簡單地說，含有P2X3的Hex細胞被懸浮在磷酸鹽緩沖液(PBS)中，超聲，在-70℃冷凍。冷凍的細胞懸浮液在冰浴中融化，超聲，然后在4℃ 100000xg離心1小時。沉淀重新懸浮在PBS中。細胞懸浮液被超聲，在4℃ 100000xg離心1小時。沉淀重懸浮在膜溶解緩沖液(6M尿素，2mM二硫蘇糖醇(DTT)，1％Chaps，0.05M Tris(pH8.0))中，以便在膜制備液中的蛋白濃度在每100μl大約1.0到1.5mg之間。通過Pierce BCA方法測定蛋白表明在樣品中存在大約8mg的總膜蛋白。Western印跡證實了在膜制備液中存在P2X3。膜制備液在-70℃冷凍。
在用水解試劑胰蛋白酶處理之前，將細胞懸浮液融化，超聲，在室溫保溫15分鐘，并在5ml Wheaton管中用50mM Tris(pH7.6)和1mMMgCl2稀釋7倍。通過在每mg蛋白中加入10μg胰蛋白酶(測序級，Promega，Madison，WI)起始水解反應。水解反應在37℃搖動保溫24小時。為了保證完全的消化，平行地用胰蛋白酶消化細胞色素C，消化的進程通過HPLC監(jiān)測。水解反應用100％TFA酸化到大約pH1-2，得到的沉淀在高速離心機中通過10000rpm離心除去。
水解反應分兩次上樣到先用10ml甲醇再用10ml 0.1％TFA洗滌過的C18 Sep-Pak(Waters Corp.)柱。用1ml 0.1％TFA和8％乙腈沖洗Sep-Pak柱。水解產(chǎn)物用1ml 0.1％TFA和48％乙腈洗脫到預先稱重的12×75mm管中。洗脫液在氮氣中干燥到大約200μl。將管稱重，通過參照管的干重將樣品體積用水調(diào)整到300μl，取200μl試樣用1％BSA-PBS稀釋5倍，并調(diào)整pH到7.2-7.4，用于ELISA。HPLC分析證實多肽包括水解產(chǎn)物得到了接近完全的回收。
ELISA測量和定量參比曲線如下產(chǎn)生。將兩份50μl含有0.078到2.5μg/ml合成多肽的BSA-PBS的樣品吸取到封閉、清洗和印跡過的96孔Nunc Polysorb板的孔中，每個孔預先用0.25μg合成的多肽包被。在每個孔中加入補充有胰蛋白酶抑制劑(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)的抗體(稀釋20000倍)50μl?？贵w通過用與牛甲狀腺球蛋白偶聯(lián)的合成的大鼠P2X3多肽VEKQSTDSGAYSIGH(SEQ IDNO3)注射兔而獲得，并通過免疫組化和Western印跡證實了其與人P2X3水解產(chǎn)物QSTDSGAFSIGH(SEQ ID NO2)和合成多肽VEKQSTDSGAYSIGH(SEQ ID NO3)具有特異性反應性。在4℃保溫24-48小時后，板被洗滌4次，倒置在印跡紙上。在每個孔中加入100μl與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的驢抗兔抗體(稀釋50000倍)，在室溫保溫45分鐘后，板被洗滌4次，并倒置在印跡紙上。在每個孔中加入100μl HRP底物顯色試劑(500μl 0.48％TMB溶液+10ml含有0.0024M H2O2的0.1M檸檬酸緩沖液(pH4.25))，保溫直到藍色完全顯現(xiàn)。在每個孔中加入100μl 2.0N H2SO4，測定在450nm的吸光度。以A450作為VEKQSTDSGAYSIGH(SEQ ID NO3)的量為函數(shù)作圖得到的參比曲線表明最小的可檢測劑量是大約1pmol。實驗樣品的分析表明當用于QSTDSGAFSIGH(SEQ ID NO2)水解產(chǎn)物時分析為線性。
ELISA分析被用來測量存在于實驗的胰蛋白酶消化樣品中的水解產(chǎn)物的量。實驗的ELISA測量與參比曲線進行比較，從而確定了存在于胰蛋白酶消化樣品中的QSTDSGAFSIGH(SEQ ID NO2)的量。參見表2。
表2

為了得到P2X3定量檢測的量，測量的水解產(chǎn)物的量被調(diào)整以校正在樣品制備、消化和加工過程中發(fā)生的損失。作為損失的對照，合成多肽VEKQSTDSGAYSIGH(SEQ ID NO3)進行了平行的樣品制備、消化和加工步驟。合成多肽的回收率被確定為67％。表3顯示了在上述實驗和重復的實驗中測定的含有P2X3的Hex細胞中存在的P2X3的量。
表3

實施例2視紫紅質(zhì)的LC/MS/MS定量本實施例說明了對一種跨膜G-蛋白偶聯(lián)受體視紫紅質(zhì)的定量。從視紫質(zhì)的羧基末端釋放的水解產(chǎn)物以相同的合成多肽作為參照進行測定。水解產(chǎn)物和相應的外源多肽的氨基酸序列如下TETSQVAPA(SEQ ID NO1)。
樣品和水解反應含視紫紅質(zhì)的制備物從牛的視桿細胞外節(jié)(ROS)制備，參考Nemis和Dratz的方法(1982，Methods Enzymol.，81116-23，Packer主編，Academic Press，New York)。含有13μg/μl或者315pmol/μl視紫紅質(zhì)的ROS制備物稀釋13倍，取20μl樣品加入微量離心管中。每一個被定量的樣品含有485pmol視紫紅質(zhì)。在某些樣品中補充了480pmol合成多肽(即12μl 40pmol/μl的儲備液)。對照樣品含有緩沖液和480pmol合成多肽。
在用水解試劑胰蛋白酶處理之前，樣品用50mM Tris緩沖液(pH8.0)+1mM CaCl2將體積調(diào)整到200μl。水解反應液為含有5μl 1μg/μl的胰蛋白酶儲液的樣品，于37℃保溫過夜。在水解反應中加入純的TFA到濃度為1％進行酸化，然后于20000xg離心30分鐘以沉淀剩余的ROS。水解反應液使用SpeedVac真空離心濃縮至體積為大約40μl。取10μl樣品用于LC/MS/MS的分析。
LC/MS/MS的測定與定量通過在幾種濃度下(即0.500pmol/μl，1pmol/μl，和40pmol/μl)使用LC/MS/MS對合成多肽TETSQVAPA(SEQID NO1)進行測定，產(chǎn)生了一個符合線性的、1倍加權(quán)的參考曲線。參考曲線使用了多個監(jiān)測的反應(即測定了來自帶單或雙電荷的合成多肽離子的多個子離子所對應的峰面積)來獲得。圖1顯示了合成多肽TETSQVAPA(SEQ ID NO1)的MS和MS/MS譜圖。上圖表示MS譜圖，箭頭指示的峰尖代表了與在m/z903Da所示的多肽的單電荷[M+H]+1離子相關(guān)的質(zhì)量。下圖顯示了來自多肽[M+H]+1離子的碰撞誘導解離的MS/MS譜圖。用于LC/MS/MS定量的子離子位于m/z 717、646和187。參考曲線表明LC/MS/MS方法的檢測極限大約為0.5pmol，線性動態(tài)范圍大約為1至2000pmol。
使用LC/MS/MS方法，測定了在實驗性胰蛋白酶消化的含有ROS、ROS+合成多肽和緩沖液+合成多肽的樣品中TETSQVAPA(SEQID NO1)多肽的量。圖2顯示實驗和標準樣品的LC/MS/MS離子譜圖。峰的面積代表從HPLC柱上洗脫下的多肽離子數(shù)。峰面積數(shù)用于線性標準曲線的計算和未知濃度的確定。實驗的LC/MS/MS測定值與參考曲線進行比較，以確定存在于胰蛋白酶消化的含有ROS、ROS+合成多肽和緩沖液+合成多肽的樣品中TETSQVAPA(SEQ ID NO1)的量。參見表4。
表4

在ROS樣品中測量的TETSQVAPA(SEQ ID NO1)多肽的量被調(diào)整，以便說明補充的合成TETSQVAPA(SEQ ID NO1)多肽的存在，并且根據(jù)回收率加以調(diào)整。含有緩沖液和合成的TETSQVAPA(SEQ IDNO1)多肽的樣品，為水解和測量后存在于補充有TETSQVAPA(SEQ IDNO1)多肽的ROS樣品中的合成多肽的量提供了一個指示，并且為TETSQVAPA(SEQ ID NO1)多肽的回收率提供了指示。假定從緩沖液樣品和ROS樣品中合成多肽的回收率是相同的。
對于補充有合成多肽的ROS樣品421.6pmol-234.9pmol＝186.7pmol，186.7pmol x(1/0.49)＝381pmol。視紫紅質(zhì)測定值與已知存在于樣品中的視紫紅質(zhì)的量完全符合(即381pmol是485pmol的78.6％)。水解產(chǎn)物測定值與在未補充的ROS樣品中測量的TETSQVAPA(SEQ ID NO1)水解產(chǎn)物的量完全符合(即186.7pmol對161.7pmol)。因此，從緩沖液樣品和ROS樣品中合成多肽的回收率是相同的這個假設(shè)很可能是有效的。
其它實施方案可以理解，當本發(fā)明已經(jīng)與其詳細的描述結(jié)合起來得以說明時，上述描述的目的是為了說明，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成限制，本發(fā)明的范圍由附加的權(quán)利要求的范圍界定。本發(fā)明其它的方面、優(yōu)點和修飾在下列的權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種測定一種或多種選定多肽在樣品中的實際量的方法，所述方法包括用至少一種水解試劑從每個所述一種或多種選定多肽中釋放出至少一種特定水解產(chǎn)物；以及通過與確定量的相應的外源多肽進行比較，確定每個所述至少一種特定水解產(chǎn)物的實際量，其中每個所述至少一種特定水解產(chǎn)物的實際量與它從其中釋放出的選定多肽的實際量直接相關(guān)。
2.權(quán)利要求1中的方法，其中所述樣品含有一種選定多肽。
3.權(quán)利要求2中的方法，其中從所述選定多肽釋放出一種特定水解產(chǎn)物。
4.權(quán)利要求1中的方法，其中所述特定水解產(chǎn)物和所述選定多肽之間的所述直接關(guān)系是1∶1。
5.權(quán)利要求3中的方法，其中所述特定水解產(chǎn)物和所述選定多肽之間的所述直接關(guān)系是1∶1。
6.權(quán)利要求1中的方法，其中所述確定量的所述相應的外源多肽在所述釋放步驟之前加到所述樣品中。
7.權(quán)利要求2中的方法，其中從所述選定多肽中釋放出2到5種特定的水解產(chǎn)物。
8.權(quán)利要求1中的方法，其中所述樣品含有2到5種選定多肽。
9.權(quán)利要求8中的方法，其中從每個所述選定多肽上釋放出一種特定水解產(chǎn)物。
10.權(quán)利要求8中的方法，其中從每個所述選定多肽上釋放出2到5種特定水解產(chǎn)物。
11.權(quán)利要求1中的方法，其中所述樣品含有6到10種選定多肽。
12.權(quán)利要求11中的方法，其中從每個所述選定多肽上釋放出一種特定水解產(chǎn)物。
13.權(quán)利要求11中的方法，其中從每個所述選定多肽上釋放出2到5種特定水解產(chǎn)物。
14.權(quán)利要求1中的方法，其中至少一種所述水解試劑是酶。
15.權(quán)利要求14中的方法，其中所述酶選自胰蛋白酶、Lys-C內(nèi)切蛋白酶、Arg-C內(nèi)切蛋白酶和Glu-C內(nèi)切蛋白酶。
16.權(quán)利要求1中的方法，其中至少一種所述水解試劑是化學試劑。
17.權(quán)利要求16中的方法，其中所述化學試劑是溴化氰。
18.權(quán)利要求1中的方法，其中至少一種所述選定多肽是膜多肽。
19.權(quán)利要求1中的方法，其中至少一種所述選定多肽是神經(jīng)受體。
20.權(quán)利要求1中的方法，其中所述測定步驟包含使用抗體測量至少一種所述水解產(chǎn)物的實際量。
21.權(quán)利要求1中的方法，其中所述測定步驟包含使用串聯(lián)質(zhì)譜或更高階的質(zhì)譜測量至少一種所述水解產(chǎn)物的實際量。
22.權(quán)利要求1中的方法，進一步包括在所述釋放步驟前向所述樣品中加入確定量的回收多肽；以及在所述釋放步驟后測量所述回收多肽的實際量，其中所述測定步驟包括對所述回收多肽與之相應的所述特定水解產(chǎn)物之一的量進行調(diào)整，以反映在所述添加步驟后發(fā)生的所述回收多肽的損失。
23.權(quán)利要求1中的方法，進一步包括在所述釋放步驟前向所述樣品中加入確定量的合成的可水解多肽；用所述水解試劑從所述合成的可水解多肽上釋放出至少兩種不同標記的多肽；以及測量每種所述不同標記的多肽的實際量，其中所述測定步驟包括對每種所述特定水解產(chǎn)物的量進行調(diào)整，以反映由所述水解試劑水解的不完全性。
24.權(quán)利要求23中的方法，其中一種所述不同標記的多肽對應于至少一種所述特定水解產(chǎn)物，以及其中所述測定步驟包括對所述至少一種特定水解產(chǎn)物的量進行調(diào)整，以反映在所述添加步驟后發(fā)生的所述相應的不同標記的多肽的損失。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過測定從選定的多肽釋放的水解產(chǎn)物的量以及利用對應于水解產(chǎn)物的外原多肽作為標準用于測定選定的多肽在樣品中的實際量的方法和材料。這些方法和材料可用于例如定量分析一種或多種選定的多肽在復雜樣品中的實際量。
文檔編號G01N33/53GK1623000SQ02823947
公開日2005年6月1日 申請日期2002年11月27日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月29日
發(fā)明者戴維·R·巴爾尼奇, 阿諾德·W·林德爾 申請人:塞莫費尼根股份有限公司