專利名稱：分析藥物效果的方法
背景技術：
草藥例如人參被認為是補品，研究顯示人參能夠提高人的免疫功能。人參包括紅參、Panax人參(又稱美國人參)的提取物被報告在動物模型和人中具有抗腫瘤的效果。此外，臨床試驗顯示人參提取物對老年人呼吸道感染有預防效果。關于人參是如何增強免疫系統(tǒng)來對抗呼吸道感染的機制，目前還不知道。
通過更深入地理解草藥等的作用機制，以及了解如何篩選具有保健價值的草藥，可以更迅速地緩解諸如流行性感冒等細菌和病毒感染。流感感染是嚴重的公共健康問題。對已知免疫功能減弱的高齡人群，流感是災難性的?？梢栽鰪娒庖吖δ茴A防流感感染并且?guī)椭颊邚牧鞲兄谢謴偷牟菟?，能夠給人們提供許多幫助。
對病毒感染的免疫應答可以被分為兩個階段初期的固有免疫應答和隨后的適應性免疫應答。作用于抗病毒感染前沿的固有免疫反應包括巨噬細胞(在人類又叫單核細胞)和自然殺傷(NK)細胞的活化，分泌細胞因子和趨化因子。這些細胞分泌的細胞因子/趨化因子可以具有直接的抗病毒功能，并且起到激活適應性免疫應答的作用。適應性免疫應答是抗原特異性的，因此也更復雜，可以進一步分為體液(抗體)和細胞介導的免疫應答。細胞所介導免疫應答的主要參與者包括1型CD4陽性T輔助細胞(Th1)和CD8陽性的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)。在某種程度上Th1促進CTL的增值，CTL可以通過識別病毒抗原直接殺死病毒感染的細胞。
發(fā)明簡述本發(fā)明提供一種分析藥物效果的方法，更具體地，提供一種分析藥物對人免疫系統(tǒng)效果的離體方法。
藥物如何影響細胞和/或刺激免疫系統(tǒng)在很大程度上還不為人所知。為了分析藥物的潛在益處，在此提供了一種分析藥物效果的方法。該方法通過使藥物與細胞接觸、并識別細胞對藥物的反應來完成的?？梢酝ㄟ^將藥物與細胞共孵育或者通過其他本領域已知方法實現(xiàn)接觸?？梢酝ㄟ^表型標志和/或化學標志的探測物來識別細胞反應。表型標志可以用來確定受藥物影響的細胞類型，而化學標志可以用來識別細胞產(chǎn)生的分子。改變表型標志和化學標志，可以識別各種細胞和/或分子。
一方面，在此提供了一種檢測藥物對免疫應答的效果的方法。該方法通過使藥物接觸免疫應答細胞形成藥物-細胞混合物，并且向藥物-細胞混合物提供至少一種探測物檢測細胞活化來實現(xiàn)。在這里，“免疫應答細胞”指被細胞結(jié)合的或不結(jié)合的抗原直接或間接活化的任何種類細胞。探測物可以包括細胞表面抗原抗體、分泌型抗原抗體和/或細胞內(nèi)抗原的抗體。細胞表面抗原的實例包括免疫應答細胞的表面蛋白或細胞膜蛋白，或者本領域已知用于識別細胞種類的任何其它種類細胞表面抗原。細胞內(nèi)抗原和/或分泌型抗原/分子的實例包括多肽，例如趨化因子和/或細胞因子。
在此還提供一種通過使藥物與免疫應答細胞接觸形成藥物-細胞混合物，并且檢測藥物-細胞混合物中至少兩種表型標志的存在來檢測細胞對藥物反應的方法。每個表型標志被用來識別特定種類的活化免疫應答細胞。免疫應答細胞種類的實例包括T細胞、B細胞、自然殺傷細胞和單核細胞。此外，至少一種化學標志的探測物可以與藥物-細胞混合物接觸。每個化學標志探測物通常識別由免疫應答細胞產(chǎn)生的一種特定的蛋白質(zhì)或一類蛋白質(zhì)。免疫應答細胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的實例包括細胞因子和趨化因子，其它細胞蛋白質(zhì)也可以被識別。這些蛋白質(zhì)可以是單一種類細胞產(chǎn)生的，也可以是一種以上細胞產(chǎn)生的。
可以以各種時間間隔篩查藥物-細胞混合物，通過分析表型標志和/或化學標志來檢測藥物的效果。此外，篩查藥物-細胞混合物以檢測活化免疫應答細胞是否存在之前，可以向混合物中加入細菌或病毒。根據(jù)所需參數(shù)和所用標志，可以在為特定實驗所選的時間間隔進行篩查，包括按分鐘、小時和/或天進行篩查。
其它種標志的探測物也可以被加入藥物-細胞混合物中，包括活化標志的探測物?；罨瘶酥驹诩毎换罨瘯r產(chǎn)生，在不同物質(zhì)存在下通常抑制或加強特定肽的轉(zhuǎn)錄?；罨瘶酥镜恼f明性實例包括CD69(對應于T細胞和單核細胞)和MHC II類(也稱HLA-DR，對應于B細胞)?；罨瘶酥疽部梢詭椭鷻z測藥物對各種類型細胞的效果。
在此還提供了一種在植物材料存在下，通過溫育外周血單個核細胞、使溫育的外周血單個核細胞接觸一組探測物形成互補的探測物-細胞復合體來檢測細胞反應的方法。每種探測物都能夠與一種免疫應答細胞的特定表型標志形成復合體。然后檢測并分析探測物-細胞復合體。也可以使用化學和/或活化標志的探測物，并且也可以檢測這些探測物-標志復合體。
附圖簡述

圖1Panax人參提取物對CD14+單核細胞的劑量依賴性活化。
圖2A流感病毒存在下，Panax人參提取物對NK細胞的特異性活化。
圖2B人參提取物對NK細胞的劑量依賴性活化。
圖3不同Panax人參提取物使NK細胞活化分泌IFN-g的效果比較。
圖4Panax人參提取物對Th1CD4陽性T細胞和CD8陽性CTL增殖的效果。
圖5Panax人參提取物(CVT 2001 009)對滅活流感病毒刺激的CLT培養(yǎng)物中NK細胞生長的效果。
發(fā)明詳述開發(fā)了一種分析藥物效果的方法。藥物可以包括天然來源和合成制備的藥物。天然來源藥物的實例包括植物材料，例如草藥。對植物材料沒有限制，可以包括葉、根、莖皮、樹液、槳果和/或它們的提取物或組合。此外，植物材料可以被研磨、干燥、分餾、滲出，或整體保留。
在一個實施方案中，藥物與外周血單個核細胞(PBMC)接觸。外周血單個核細胞是包括免疫應答細胞例如Th1、CTL、NK、B細胞和單核細胞(也稱為巨噬細胞)在內(nèi)的多種細胞混合物。每種這些免疫應答細胞具有至少一種表型標志，例如能夠被檢測的表面抗原。例如，CD4、CD8、CD56、CD19和CD14分別是Th1、CTL、NK、B細胞和單核細胞的表型標志。Th1和CTL細胞還具有抗原CD3。NK細胞還具有抗原CD16。每個表面抗原(表型標志)可以被探測物識別。探測物通常是這些表面抗原的抗體，但也可以是任何其它能夠用來識別表面抗原的探測物。探測物可以用放射性、熒光、顏色標簽以及其它本領域已知的標記進行標記。
當免疫應答細胞被活化時，通常產(chǎn)生不同的化學標志，例如肽和/或其它因子。許多這些化學標志被稱為細胞因子和趨化因子。細胞因子包括白細胞介素，例如IL-2、IL-4、IL-6、IL-10和IL-12。其它細胞因子包括干擾素-γ(ifn-γ)和腫瘤壞死因子-α(tnf-α)，以及其它由免疫應答細胞產(chǎn)生的細胞因子。適宜檢測的趨化因子(趨化吸引不同白細胞的低分子量多肽)的實例包括巨噬細胞趨化和活化因子(MCAF)、巨噬細胞炎性蛋白-1a(MIF-1a)、巨噬細胞炎性蛋白-1b(MIF-1b)、RANTES和白細胞介素8(IL-8)。這些化學標志也可以用探測物來識別。這些探測物通常是針對每一個這些肽和/或因子的抗體，也可以是任何識別由免疫應答細胞產(chǎn)生的特異性分泌型或細胞內(nèi)肽或因子的探測物。
為了檢測細胞反應，在藥物例如草藥存在下溫育PBMC。然后使溫育的PBMC與一組探測物接觸，檢測至少針對兩種特定免疫應答細胞種類(例如，Th1細胞和B細胞)的兩種表型標志。每種探測物特異性地識別一種特定的表型標志。當表型標志在溫育細胞內(nèi)存在、并且與其特異性探測物接觸時，形成探測物-標志復合體。然后通過本領域技術人員已知的方法和實驗來檢測并分析該探測物-標志復合體。
可以向溫育的PBMC中加入另外的成分，提供關于藥物效果的更多信息。例如，特定化學標志如細胞因子和趨化因子的探測物可以與溫育的PBMC接觸，形成可以被檢測和分析的另外的探測物-標志復合體。感染性制劑，例如細菌或病毒等感染性物質(zhì)也可以與PBMC以及表型標志和/或化學標志的探測物溫育。最后，可以用其它種類探測物-包括活化標志的探測物和其它本領域技術人員已知標志的探測物-接觸溫育的PBMC。其它本領域已知的制劑也可以與PBMC和藥物溫育，來檢測是否獲得有益或不利的效果。
下述實施例說明了分析藥物效果的方法。這些實施例被用于說明而不是限制這里提出的本發(fā)明的范圍。但是，在討論每個實施例之前，將先討論實驗背景，以提供對達到每個實施例結(jié)果所使用方法的充分理解。當然，如本領域所知，為了獲得相同或相似的結(jié)果，這些方法可以修改或改變，或者這些方法可以隨著技術的進步而改進或改變。
Panax人參提取物選擇用于以下實施例的藥物是Panax人參。Panax人參提取物由CV Technologies(CVT)，Edmonton，Canada提供。有三個不同批次的Panax人參提取物CVT2001 008、CVT2001 009、CVT2001 010，和兩個不同批次的對照提取物CVT HT1001-005和CVT HT1001-009。所有提取物都以粉末形式提供，并被溶于PBS緩沖液中。然后將提取物在含10％FBS(Summit Biotech CO)的組織培養(yǎng)基RPMI(Gibco，MC)中稀釋至終濃度。
外周血單個核細胞的純化將健康個體的肝素化PBMC(每次抽血20到30ml)以1200RPM離心10分鐘，分離白細胞層。收集白細胞層并小心地加入菲可梯度(Histopaque，Sigma，MO)頂部。然后將細胞以1700RPM離心30分鐘。從界面收集PBMC，離心，在用于實驗前用RPMI培養(yǎng)基洗滌兩遍。
Panax人參活化單核細胞的分析200μl AIM-V培養(yǎng)基(Gibco，MD)中的5×105PBMC與不同劑量Panax人參提取物溫育過夜(16小時)。細胞被離心沉淀，用表面抗原抗體CD14-APC、CD69-FITC和CD86-PE染色。用FACSCalibur(Becton Dickinson，CA)對染色的細胞進行流式細胞術分析，用CellQuest軟件(Becton Dickinson，CA)分析數(shù)據(jù)。圈選CD14陽性細胞，用合適的抗體分析它們的活化標志CD69和CD86的表達。
人參活化樹突細胞(DC)的分析通過本領域技術人員已知方法制備樹突細胞，例如以下簡述的實例。3ml AIM-V中新鮮分離的1.5×107PBMC被置于6孔板的孔中，在37℃溫育3小時。取出不附著的細胞。附著細胞被輕柔地洗滌兩次，在含GM-CSC(800單位/ml)和IL-4(1000單位/ml)(BioSource，CA)的5ml AIM-V中培養(yǎng)。溫育7天后，如通過培養(yǎng)物的富樹突形態(tài)以及MHC和共刺激分子高表達所確定的，培養(yǎng)物中通常含有超過50％的樹突細胞。為了分析人參對樹突細胞的效果，在第7天收集樹突細胞培養(yǎng)物中的細胞，計數(shù)并與不同劑量的Panax人參提取物溫育過夜。然后用CD86、83和MHC II(也稱為HLA-DR)抗體對細胞進行染色。
快速免疫檢測1×106PBMC與不同劑量的Panax人參提取物和對照共溫育。必要時，將含等量(10HA單位/ml)流感病毒株A/H3N2/Calvadonia、A/H1N1/Panama和B/Yamanashi的活流感病毒混合物加入PBMC。用尿囊液作為活流感病毒的對照抗原。在有或沒有流感病毒存在下，PBMC被刺激3小時，向細胞中加入布雷菲德菌素A(BFA，5μg/ml，Sigma，MO)。PBMC被繼續(xù)溫育15小時。然后，PBMC被固定(1％多聚甲醛，Sigma，MO)、透化(透化緩沖液，Becton Dickinson，CA)，并用下列標記抗體染色CD56-PE、CD4-APC、CD8-PerCP和IFN-g-FITC。用FACSCalibur細胞儀和CellQuest軟件對染色的PBMC進行流式細胞術分析。在散點圖中圈選淋巴細胞進行隨后的分析。IFN-g也為陽性的NK細胞(CD56陽性)被定義為活化的NK細胞。
CTL培養(yǎng)物1.5ml完全培養(yǎng)基(RPMI加10％FBS)中的1.5×106PBMC與不同劑量的人參提取物被置于24孔板的孔中。用流感病毒株A Calvadonia、A Panama和B Yamanashi的滅活流感病毒(來自1∶1000稀釋的流感疫苗)刺激PBMC。每48小時向培養(yǎng)物中添加低劑量的IL-2(20IU/ml)和IL-7(20ng/ml)。培養(yǎng)7到9天后，收獲細胞、計數(shù)并分析流感特異性T細胞的頻度。
CTL培養(yǎng)物中流感特異性CD4陽性或CD8陽性T細胞的定量分析在收獲CTL培養(yǎng)物用于分析之日，從其PBMC被用于建立CTL培養(yǎng)物的原供者再獲取外周血。用流感病毒感染新鮮分離的PBMC。這些新鮮分離的PBMC用于提供自身抗原呈遞細胞。感染的PBMC與從CTL培養(yǎng)物中收獲的細胞以1∶10(PBMC∶CTL)的比例混合。作為對照，用未感染的PBMC與CTL培養(yǎng)物中的細胞混合。將細胞混合物溫育3小時后，加入布雷菲德菌素A(BFA)。用類似于上述方法的快速免疫分析對流感特異性T細胞進行定量分析。流感特異性T細胞的頻度被定義為流感感染的細胞刺激后IFN-g也為陽性的CD8陽性或CD4陽性T細胞。
實施例1人參對抗原呈遞細胞例如單核細胞和樹突細胞的效果抗原呈遞細胞包括單核細胞或巨噬細胞和樹突細胞，在病毒感染中，在通過向T細胞加工呈遞病毒抗原來介導T細胞應答中起重要作用。由于更高地表達MHC和共刺激分子，已知活化的抗原呈遞細胞是更有效的抗原呈遞細胞。此外，活化的抗原呈遞細胞能夠分泌細胞因子，例如IL-12和IL-10，吸引T細胞并刺激T細胞增殖。
用以下兩個實驗檢測人參對抗原呈遞細胞的效果。第一個實驗中，PBMC與不同劑量的Panax人參提取物溫育過夜(16小時)，檢測單核細胞(CD14陽性細胞)是否被Panax人參活化。用活化標志CD69和CD86雙重陽性的單核細胞作為活化單核細胞的指標。第一個實驗的結(jié)果是，在Panax人參提取物存在下活化的單核細胞增加，并且單核細胞的活化是劑量依賴性的(圖1)。
第二個實驗用于檢測人參對體外產(chǎn)生的樹突細胞(職業(yè)抗原呈遞細胞)的效果。在GM-CSF和IL-4存在下培養(yǎng)PBMC 7天，從附著的PBMC中產(chǎn)生樹突細胞。然后收獲樹突細胞，與不同劑量的人參提取物溫育過夜，用可能的MHC II、CD86和CD83表達增加來分析活化效果。CD86是共刺激分子(B7.2)，CD83是成熟樹突細胞的標志。已知活化的樹突細胞的CD83、CD86和MHC II表達增加。結(jié)果顯示樹突細胞與人參提取物溫育過夜后，CD83的表達增加(數(shù)據(jù)未顯示)。
實施例2 Panax人參提取物對刺激NK細胞應答流感感染的效果由于NK細胞能夠直接殺死病毒感染的細胞，NK細胞在病毒感染的初期起重要作用。此外，活化的NK細胞能夠分泌細胞因子，例如IFN-g和IL-2。IFN-g具有直接抗病毒效果和促進CTL增殖的能力。用實驗檢測人參是否刺激NK細胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當PBMC與活流感病毒溫育過夜時，人參提取物刺激NK細胞(圖2A)。人參的刺激通過NK細胞分泌IFN-g來顯示。NK細胞的活化是人參提取物劑量依賴性的(圖2B)。此外，人參對NK細胞的活化是NK細胞特異性的，因為人參不活化CD3陽性T細胞(用于篩選Th1和CTL細胞)或NKT細胞(CD3和CD56雙陽性細胞)。發(fā)現(xiàn)人參對NK細胞的刺激也是病原體依賴性的，即僅在流感病毒存在時，人參才刺激NK細胞分泌IFN-g(圖2A，第二和第四幅小圖)。實驗還被用來檢測CVT提供的兩種對照人參提取物(CVT HT 1001-005和CVT HT1001-009)。已知這些對照提取物沒有可檢測到的免疫學功能。即使當培養(yǎng)物中存在流感病毒時，這兩種對照提取物也不活化NK細胞(圖2，第三幅小圖)。
這些實驗顯示人參通過特異性刺激/活化NK細胞，來刺激免疫系統(tǒng)對流感病毒感染產(chǎn)生應答。人參對NK細胞的活化是流感特異性的，并且是人參提取物劑量依賴性的。在所有檢測的三種人參提取物和兩種對照提取物中，人參提取物顯示對NK細胞的特異性刺激效果，使之分泌IFN-g，這三種不同提取物的活化程度幾乎沒有變化(見圖3)。此外，未觀察到兩種對照提取物或不加入人參時對NK細胞的刺激。
實施例3 人參對流感特異性CD4陽性Th1細胞、CD8陽性CTL細胞和NK細胞生長的效果上述實施例1和實施例2的實驗是利用新鮮分離的PBMC短期(過夜)培養(yǎng)物的離體實驗。雖然在分析人參提取物作用的細胞機制時離體實驗是優(yōu)選的，但離體實驗不能用于研究人參提取物對CTL或其它種類細胞增殖的長期效果。因此，在人參提取物存在下，建立用稀釋流感疫苗(含滅活流感病毒)刺激的PBMC的CTL培養(yǎng)物。作為對照，用CVT對照提取物或不加入人參提取物進行實驗。與疫苗共溫育7到9天后，從CTL培養(yǎng)物中收獲細胞，計數(shù)并進行快速免疫檢測。在用被流感病毒感染的抗原呈遞細胞活化后(見材料和方法部分)，IFN-g陽性的T細胞被定義為抗原特異性T細胞。在取自一名供者的CTL培養(yǎng)物中觀察到人參提取物刺激更多的流感特異性T細胞生長，特別是CD8陽性CTL細胞(供者1，CD8+細胞，圖4)。還發(fā)現(xiàn)與不加人參提取物的對照相比，當加入人參提取物時，CTL培養(yǎng)物中的NK細胞數(shù)目更多(圖5)。此外，結(jié)果顯示有人參時的NK細胞的數(shù)目以人參提取物劑量依賴性的方式增加。當使用對照提取物(CVT HT 1001-005或CVT HT 1001-009)時，CTL培養(yǎng)物中沒有觀察到NK細胞生長的增加(數(shù)據(jù)未顯示)。該結(jié)果與被流感病毒活化的早期，Panax人參提取物刺激NK細胞(分泌IFN-g)的觀察結(jié)果一致(圖2)。
如上述實施例所顯示的，Panax人參提取物直接活化單核細胞，提取物的存在還促進NK細胞活化應答流感感染。Panax人參提取物還促進流感特異性T細胞-包括Th1 CD4陽性T細胞和CD8陽性CTL細胞-的增殖，以及總NK細胞的增殖。
還觀察到，流感病毒誘導流感特異性記憶T細胞分泌IFN-g(圖2A右下格，第三幅圖)。Panax人參提取物對短期培養(yǎng)物中的T細胞，無論是流感特異性還是非流感特異性T細胞，都沒有增加效果。雖然只流感病毒本身甚至沒有人參提取物的存在下就可以觀察到NK細胞的活化，但流感病毒對NK細胞的活化需要PBMC與活流感病毒長時間的溫育(＞16小時)。在PBMC與病毒共溫育3小時后所有細胞因子都停止分泌(通過BFA)的體外條件下，除非加入Panax人參提取物，否則觀察不到NK細胞的活化。
最后，結(jié)果顯示了研究藥物如何影響細胞-包括免疫應答細胞-之機制的離體分析可行性。這提供了一種用于篩選藥物、確定其是否能夠刺激免疫系統(tǒng)的方法。該離體分析方法還可以進一步用來分析藥物-包括草藥-在對特定目標病原體應答中的免疫學效果。
權利要求
1.一種檢測藥物對免疫應答的效果的方法，包括使藥物與免疫應答細胞接觸，形成藥物-細胞混合物；和用探測物檢測藥物-細胞混合物中的細胞活化。
2.權利要求1的方法，其中用于檢測藥物-細胞混合物中細胞活化的探測物包括表型標志探測物、化學標志探測物、活化標志探測物或其組合。
3.權利要求1的方法，其中用于檢測抗原-細胞混合物中細胞活化的探測物包括細胞表面抗原的抗體、分泌型抗原的抗體、細胞內(nèi)抗原的抗體或其組合。
4.一種檢測細胞對藥物反應的方法，包括使藥物與免疫應答細胞接觸，形成藥物-細胞混合物；和檢測藥物-細胞混合物中至少兩種表型標志的存在。
5.權利要求4的方法，其中表型標志包括CD4、CD8、CD56、CD19、CD14、CD3、CD16或其組合。
6.權利要求4的方法，進一步包括使藥物-細胞混合物與化學標志的探測物接觸，并檢測藥物-細胞混合物中化學標志的存在。
7.一種檢測細胞應答的方法，包括在植物材料的存在下溫育外周血單個核細胞；和使溫育的外周血單個核細胞與一組探測物接觸形成探測物-細胞復合體。
8.權利要求7的方法，進一步包括檢測探測物-細胞復合體。
9.權利要求7的方法，進一步包括使溫育的外周血單個核細胞與化學標志的探測物、活化標志的探測物或其組合接觸，形成探測物-標志復合體，并檢測該探測物-標志復合體。
10.權利要求7的方法，進一步包括在感染性物質(zhì)的存在下溫育外周血單個核細胞。
11.權利要求1和4的方法，其中藥物包括來自Panax人參的材料。
全文摘要
本發(fā)明提供一種分析藥物效果的方法，更具體地講提供一種分析藥物對人免疫系統(tǒng)效果的離體方法。
文檔編號G01N33/567GK1608204SQ02825873
公開日2005年4月20日 申請日期2002年12月20日 優(yōu)先權日2001年12月21日
發(fā)明者鄧玉萍 申請人:東弗吉尼亞醫(yī)學院