專利名稱：利用特殊用途的隨機粒子陣列的多分析物分子分析的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及材料科學和分析化學領(lǐng)域。
本發(fā)明揭示了一種用于生產(chǎn)編碼的磁性粒子(encoded magneticparticles)以及形成包含這些粒子的平面組件的方法。本發(fā)明也揭示了一個用于實現(xiàn)多步生物分析檢測方案的平臺，該方案容許整合樣品制備步驟和對多種類型的分析物與結(jié)合物之間的相互結(jié)合作用的同步分析。
背景技術(shù)：
例如親和純化的多種生物分析方法以及例如免疫檢測與DNA雜交檢測的多種生化檢測都要求將特殊分子或成分從復雜的混合物中分離出來。在分子和細胞生物學中，磁性聚合物粒子(“珠(beads)”)已經(jīng)被廣泛地用于這個樣品制備的方面。例如，用帶有短寡dT捕獲探針的磁珠從細胞裂解物中提取信使RNA(mRNA)。在將粒子加入到裂解物中后，通過polyA尾與捕獲探針的雜交將分子捕獲，并收集于永久磁鐵所產(chǎn)生的磁場梯度中，在用空白緩沖液置換裂解物期間利用所應(yīng)用的磁場保留住分子，以及通過去除磁場將分子釋放到懸浮液中(″BiomagneticTechniques in Molecular Biology，″Technical Handbook，3rd Edition，DYNAL，1998)。以相似的方式，用帶有針對特殊的細胞表面抗原的抗體的磁珠選擇性地從給定的懸浮液中提取出所需的細胞類型(″CellSeparation and Protein Purification″，Technical Handbook，2nd edition，DYNAL，1997)。一個最近的實例描述了一種磁性細胞分離方法，該方法描述了將磁珠與對收集到的細胞光學成像相結(jié)合的用法(A.G.J.Tibbe etal.″Optical tracking and detection of immunomagnetically selected andaligned cells″Nature Biotech.，17，1999，1210-1213)。
對檢測步驟的整合，這個重要目標促進了臨床分析儀和其他實驗室自動化實例的引入，在當前的技術(shù)條件下，檢測步驟的整合依賴于適用于標準的機器人液體操作(“吸量(pipetting)”)以及用讀板器從各個孔中讀取檢測信號的多個獨立反應(yīng)孔的96孔(或相關(guān)的)微孔的格式。根據(jù)磁珠用于分離的用法，商業(yè)化的機器人吸量系統(tǒng)最近已經(jīng)被引入到自動化的樣品制備中。然而，生物化學和分析檢測操作的小型化所極為需要的對利用微液態(tài)的操作方法的樣品處理以及分析的高度平行的陣列格式的整合至今還沒有被描述。
將例如抗體和寡核苷酸的多種結(jié)合物以點或條紋的形式印記于平面基層上，這促進了在平行的(“多元(multiplexed)”)結(jié)合測定中對例如抗原和DNA的多種分析物的同步監(jiān)測。對用于增加檢測量以及研究結(jié)合動力學的檢測格式的小型化已經(jīng)被描述(R.Ekins，F(xiàn).W.Chu，Clin.Chem.37，955-967(1991)；E.M.Southem，U.Maskos，J.K.Elder，Genomics 13，1008-1017(1992))。在最近幾年里，該方法吸引了很多的興趣，尤其是與進行廣泛的遺傳分析所相關(guān)的領(lǐng)域(G.Ramsay，Nat.Biotechnol.16，40-44(1998)；P.Brown，D.Botstein，Nat.Genet.21，33-37(1999)；D.Duggan，M.Bittner，Y.Chen，P.Meltzer，J.M.Trent，Nat.Genet.21，10-14(1999)；R.Lipshutz，S.P.A.Fodor，T.R.Gingeras，D.J.Lockhart，Nat.Genet.21，20-24(1999))。
至今所報道的陣列制作的基本技術(shù)包括以將探針溶液的一小樣份(aliquot)以針轉(zhuǎn)移到或噴墨印記到不同基層的形式對原始“點樣”進行精確化(V.G.Cheung，et al.，Nat.Genet.21，15-19(1999))；將結(jié)合物依次電泳沉積于各自的電定位的基層區(qū)域(J.Cheng，et al.，Nat.Biotechnol.，541-546(1998))，以及促進在空間上可分辯的寡核苷酸原位合成(U.Maskos，E.M.Southern，Nucleic Acids Res.20，1679-1684(1992)；S.P.A.Fodor，et al.，Science 251，767-773(1991))或寡核苷酸共聚合(A.V.Vasiliskov，et al.，BioTechniques 27，592-606(1999))的方法。這些技術(shù)產(chǎn)生了空間編碼的陣列，其中陣列中的位置提示了任何成分探針的化學特性(Bio Techniques 27，592-606(1999))。所有的這些現(xiàn)有的技術(shù)都要求在相關(guān)檢測開始前完成陣列形成。因此，在現(xiàn)有技術(shù)中沒有任何的陣列形成技術(shù)允許在相關(guān)結(jié)合反應(yīng)完成后實時形成陣列。
將單分散的磁珠局限于平面基層或交界面，并暴露于一個垂直定向于交界面平面的單一磁場中，形成了各種有序的二維結(jié)構(gòu)(W.Wen，L.Zhang and P.Sheng“Planar Magnetic Colloidal Crystals”Phys.Rev.Lett.，85，(25)，5464-5466，2000；M.Golosovksy，Y.Saado，and D.Davidov″Self-assembly of floating magnetic particles into ordered structuresApromising route for the fabrication of tunable photonic bandgap materials″Appl.Phys.Lett.，75，(26)，4186-4170，(1999)；K.Zhan，R.Lenke，and G.Maret″Two-stage melting of paramagnetic colloidal crystals in twodimensions″Phys.Rev.Letter.，82，(13)，2721-2724，1999)。
許多技術(shù)已經(jīng)被建議用于合成這些粒子。這些技術(shù)嘗試賦予磁性粒子特定的性能，使得它們能滿足特定的應(yīng)用。這些技術(shù)可以被總結(jié)為兩種策略，第一種策略涉及合成一種磁性核心以及第二種策略涉及合成一種磁性外殼。
與第一種策略所相關(guān)的專利包括U.S.Patent No.4,358,388，授予Daniel和U.S.Patent No.5,356,713，授予Charmot。揭示了一種利用懸浮液聚合化操作的方法。該方法的一個缺點是難以控制所形成的磁性乳液的單分散性，以及該方法顯示不能很好地適用于熒光磁性粒子的生產(chǎn)。
U.S.Patent No.4,654,267，授予Ugelstead，揭示了一種硝化方法，該方法生成具有順磁性核心的粒子。在磁化后，用功能性聚合物包被粒子以提供一個反應(yīng)性外殼并生成了具有受控制的形態(tài)、多分散性、孔徑大小分布、磁負荷以及表面化學的超順磁性粒子。對這些粒子的編碼還沒有被描述過。
U.S.Patent No.4,873,102，授予Chang，揭示了一種形成磁性聚合物粒子的方法，該粒子的所有微孔中都含有統(tǒng)一的磁性結(jié)晶。該粒子只能在親水條件下使用。
U.S.Patent No.5,356,713，授予Charmot，揭示了磁化組合微球，該微球可用于生物學應(yīng)用，但因為它的大小分布使得它在其他應(yīng)用上受到限制。
U.S.PatentNo.5,512,439，授予Homes，揭示了單分散的、超磁性粒子，它帶有多個寡核苷酸的分子，該粒子可以用作為單一的標準核酸。該寡核苷酸可以被共價連接或親和結(jié)合。
U.S.Patent No.5,698,271，授予Liberti，揭示了一種生產(chǎn)磁性應(yīng)答粒子的方法。該粒子已經(jīng)應(yīng)用于各種制備和診斷技術(shù)。
U.S.Patent No.5,866,099，授予Owen，揭示了一種用于免疫檢測技術(shù)和生物/醫(yī)學應(yīng)用的磁聚合物粒子。利用過渡金屬和具有可獲得的均一位點的聚合物共沉淀生產(chǎn)該粒子。
被認為與第二種策略相關(guān)的專利包括U.S.Patent No.5,736,349，授予Sasaki，揭示了一種用于免疫檢測方法的磁性粒子，它包括一個核心和一個包被層?？乖蚩贵w結(jié)合于包被層表面。
U.S.Patent No.5,648,124，授予Sutor，揭示了一種利用反向電荷核心粒子以及磁性粒子通過異凝集生產(chǎn)磁性粒子的方法。分散的磁性粒子可以是被一個或多個外在聚合物被膜進一步包裹的被包裹微粒。
U.S.Patent Nos.6,013,531、5,283,079和5,091,206，授予Wang，揭示了一種生產(chǎn)磁性應(yīng)答聚合物粒子的方法。該粒子包括一個聚合物核心粒子，該核心被一層含有磁性應(yīng)答的金屬氧化物聚合物層均勻地包裹。這些磁性應(yīng)答聚合物粒子的表面可以被一層功能化聚合物進一步包裹。這些磁性應(yīng)答聚合物粒子可以被用于與生物材料被動或共價的結(jié)合并被用作為用于各種類型的免疫檢測的固體相。
一些用于合成染色的磁性粒子的各種方法已經(jīng)被描述。被認為與之相關(guān)的專利包括U.S.Patent No.5,395,688，授予Wang，它揭示了一種生產(chǎn)磁性應(yīng)答的熒光聚合物粒子的方法，該粒子包括一個熒光聚合物核心粒子，該核心被一層磁性應(yīng)答的金屬氧化物均勻地包裹。該方法利用將預(yù)先形成的熒光聚合物核心粒子與苯乙烯及水的磁性金屬氧化物乳劑混合并聚合。類似這種兩步反應(yīng)方法的缺點是熒光染料可能抑制聚合反應(yīng)或外殼的聚合過程對熒光的反向漂白。U.S.Patent No.6,013,531已經(jīng)描述了將這些含有熒光標記的磁性粒子用于校準特定的固相檢測的用途。在該步驟完成后，用功能化的聚合物包裹粒子以形成反應(yīng)性外殼。
通過多步(逐層)策略可以實現(xiàn)從分散的膠狀物質(zhì)到生成核心-外殼粒子。該方法包括將帶電荷的聚合物或納米粒子和帶相反電荷的聚電解質(zhì)吸收到膠狀粒子，利用基本的靜電相互作用進行層的構(gòu)建(Caruso et al″Magnetic Core-Shell ParticlesPreparation of Magnetite Multilayers onPolymer Latex Microspheres″Adv.Mater.1999，11，950-953)。利用靜電物理吸附所形成的外殼對于生物分析檢測是不可能的，因為它在檢測條件，特別是鹽的濃度，發(fā)生變化時是化學不穩(wěn)定的，并且它促進了帶電荷生物分子的非特異性的吸附和變性。這個以往技術(shù)參考文獻中所描述的粒子不適合于這里所計劃進行的檢測方法。
雖然先前的參考文獻揭示了磁性粒子的用法，但是先前技術(shù)中沒有一個粒子具有符合標準所必需的性能，這個標準是成功地實現(xiàn)這里所描述的檢測所必需的，包括優(yōu)選的大小范圍、重要的單分散、化學地功能化和合成的靈活性，后者允許快速地構(gòu)建編碼的磁性粒子的文庫，粒子可以被按需地功能化，文庫中所出現(xiàn)的化學多樣性大于2。另外，磁性粒子必需符合特定的質(zhì)量標準，使得能重復地組裝定制的陣列來保證定量檢測的同步進行。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了涉及實現(xiàn)用于多元分子相互作用分析的生物分析檢測過程的方案、組合物和方法。本發(fā)明的方法采用多種編碼的磁性粒子，這些粒子在它們的編碼上有所區(qū)別。這些粒子具有一種或多種結(jié)合物，這些物質(zhì)能同與這些粒子接觸的一種或多種特異的分析物相互作用。
本發(fā)明提供了一種制備粒子文庫的方法，該粒子是一種編碼粒子和多種磁性納米粒子的組合物(“組合粒子”)。這些組合粒子可被功能化使得其能應(yīng)用于特殊的檢測。這種功能化的實例包括容納結(jié)合物，例如寡核苷酸、DNA、肽或蛋白。這些組合粒子包含一種光學可區(qū)分的編碼，所選擇的這些編碼反映了所含結(jié)合物的性能，因此通過實時的、原位的觀察可以區(qū)分組合粒子以及它們所相關(guān)的結(jié)合物。利用這些文庫可以按需定制珠陣列。這些陣列可用于生物檢測，包括包含多元分子相互作用分析的測定。
這里所描述的生物分析檢測平臺利用組合粒子文庫來整合主要的檢測步驟，包括樣品的收集和制備、加工和分析。在優(yōu)選的具體實施方案中，分析在高度平行的珠陣列格式上進行，其中陣列是在樣品制備和加工步驟完成后被實時組裝的。


當參照于下面的應(yīng)當被理解為對只是用于舉例說明的具體實施方案的詳細描述以及反映該具體實施方案的附圖時，將更清楚地了解在上面簡要的解釋中所討論的本發(fā)明的其他目的、特點和優(yōu)點，其中圖1是操作流程的圖解，包括隨機編碼的珠陣列的生產(chǎn)以及它們在多元檢測中的應(yīng)用。
圖2是珠的功能化的圖解。
圖3是芯片設(shè)計以及晶片尺度的生產(chǎn)步驟的圖解。
圖4是按需組裝隨機編碼陣列的圖解。
圖5是掌上型微型實驗室的圖解。
圖6是在本發(fā)明的隨機編碼陣列檢測過程中所使用的檢測和解碼圖像的示意圖。
圖7是概括圖像分析的算法和步驟的流程圖。
圖8是通過應(yīng)用圖7所概括的圖像分析算法根據(jù)珠的類型解析檢測圖像的步驟的圖解。
圖9是隨機編碼檢測的光學可編程的(optically programmable)陣列組件的圖解。
圖10是由隨機編碼子陣列構(gòu)成的陣列的圖解。
圖11是芯片尺度的珠陣列的自動化生產(chǎn)以及質(zhì)控過程的站點的圖解。
圖12是兩種細胞因子的定量結(jié)合曲線的圖解。
圖13是設(shè)計用于多態(tài)性分析的陣列的圖解。
圖14是在多態(tài)性分析中從圖13所示的一個子陣列中記錄到的檢測及解碼圖像的熒光顯微照片。
圖15是來自對如在圖14中所示的一個檢測圖像的分析的測定結(jié)果的強度直方圖形式的圖解。
圖16是用于雜交檢測的“環(huán)狀探針”的設(shè)計的圖解。
圖17A和17B是在多種細胞因子分析中記錄到的檢測及解碼圖像的熒光顯微照片。
圖18A和18B是具有多個競爭性受體-配體相互作用的受體-配體系統(tǒng)中的交叉相互關(guān)系的數(shù)字模擬的圖解。
圖19是受體-配體結(jié)合和解離動力學的數(shù)字模擬的圖解。
圖20是整合利用磁捕獲珠的樣品捕獲以及利用本發(fā)明的隨機編碼陣列檢測方法的基于陣列的檢測的圖解。
圖21是利用組合粒子整合基因的特異性捕獲、珠上逆轉(zhuǎn)錄以及檢測后陣列組裝的多步檢測的圖解。
圖22是適用于廣泛的生化檢測的多步檢測序列的圖解。
圖23(i)是顯示四種不同類型的單一光學粒子的直方圖以及圖23(ii)是八種雙重編碼的粒子的點狀圖。
圖24是各種磁負荷的圖解。
圖25是暴露于磁場的本發(fā)明的組合粒子的圖解。
圖26是用于磁場應(yīng)用的試驗性組件的示意圖。
圖27(i)是應(yīng)用于磁場前的珠組件的2D結(jié)構(gòu)的示意圖。圖27(i)是應(yīng)用于大約100高斯磁場后的珠組件的2D結(jié)構(gòu)的示意圖。圖27(iii)是圖27(ii)的2D組件的近似示意圖。圖27(iv)是在約20高斯磁場中更高濃度珠(2x)的2D排列的示意圖。
圖28顯示了利用本發(fā)明的編碼和磁性粒子進行的抗生蛋白鏈菌素-生物素結(jié)合測定的結(jié)果。
圖29顯示了利用本發(fā)明的編碼和磁性粒子進行雜交測定的結(jié)果。
具體實施例方式
特殊應(yīng)用的珠陣列的制作可以包括多步順序中的多個操作，利用現(xiàn)有的液體操作技術(shù)和實驗室自動操作可以將該順序自動化。這里所描述的并稱為隨機編碼陣列測定(random encoded array detection，“READ”)的操作包括制作隨機編碼陣列以及將這些陣列應(yīng)用于生物測定，包括涉及多元分子相互作用分析的測定，包括但不局限于分析物和結(jié)合物分子的相互作用，例如DNA和蛋白分析。這里和U.S.Patent No.6,251,691中所描述的隨機編碼陣列克服了許多與采用多步順序所相關(guān)的缺點。
這里所用的名詞“分析物(analyte)”和“結(jié)合物(binding agent)”指的是參與于結(jié)合相互作用的分子。舉例來說，分析物和結(jié)合物可以包括DNA或RNA片段(例如，寡核苷酸)、適體(aptamer)、肽和蛋白、抗原以及小的有機分子。在具體測定中，分析了這些片段和它們的互補序列的結(jié)合(雜交)。在另一個具體檢測中，分析了配體和受體之間的結(jié)合相互作用。
這里所用的名詞“粒子(particles)”指的是膠狀粒子以及珠。名詞“粒子”也用于與本發(fā)明有關(guān)的編碼粒子(encoded particles)和磁性粒子(magnetic particles)。
這里所用的名詞“磁性粒子”指的是具有永久的或感應(yīng)的偶極力矩的粒子。
圖1提供了功能性成份以及操作流程的圖解性概括，通過該操作流程可以制備定制的珠陣列并將其用于進行根據(jù)本發(fā)明的多元生物分子分析。通過采用分開的批處理生成特殊應(yīng)用的基層(例如晶片尺度的芯片)，產(chǎn)生被編碼和功能化的珠(例如比例為-10^8/100μl懸浮液)或產(chǎn)生被編碼的、磁化的和功能化的珠，來制備陣列。在組裝珠陣列之前進行相應(yīng)的質(zhì)控步驟(QC)，例如測定形態(tài)和電特征。另外，在將懸浮液中的珠引入到基層之前對其進行準確的測定以優(yōu)化測定條件，常見的目的是使得測定敏感性和特異性最大化以及珠與珠的差異最小化。對于基層，QC步驟可以包括光學觀察、橢圓偏光法以及電傳輸測定。
一旦將化學編碼的及生物學功能化的珠與基層(例如芯片)結(jié)合，U.S.Patent No.6,251,691所描述的方法(″LEAPS″)以及PCT/US97/08159所描述的方法可以被用于在同一液體相內(nèi)在基層上所設(shè)計好的區(qū)域快速地組裝密集陣列，避免了點對點以及芯片對芯片之間的差異所引起的問題且不需要重新組裝或重新設(shè)計方法。而且，該珠陣列格式容許珠具有獨立于芯片的特性以及將檢測條件最優(yōu)化。另外，在同一芯片上所具有的被分隔的液態(tài)間隔內(nèi)可以同時形成多個珠陣列。一旦形成，這些多個珠陣列可以被用于對多個樣品的同步處理。對LEAPS和微液態(tài)的整合產(chǎn)生了用于蛋白和DNA平行分析的自備的、小型化的、光學可編程的(optically programmable)平臺。這里將U.S.Patent No.6,251,691和PCT/US97/08159的所有內(nèi)容一并進行參考。
在本發(fā)明的某些實施方案中，通過用數(shù)種光學可區(qū)分的標記物將珠染色可以實現(xiàn)化學編碼，這些標記物例如那些含有一種或多種通過激發(fā)波長、發(fā)射波長、激發(fā)態(tài)時間以及發(fā)射強度而顯著區(qū)分的熒光團染料的標記物。光學可區(qū)分的標記物可以被用于按特定比例將珠染色，例如在Fulwyler的U.S.Patent No.4,717,655中所闡述的。根據(jù)本領(lǐng)域人員所熟知的方法也可以通過將粒子膨脹來完成染色(Molday，Dreyer，Rembaum& Yen，J.Mol Biol 64，75-88(1975)；L.Bangs，″Uniform Latex Particles，Seragen Diagnostics，1984)。通過膨脹(swelling)和用兩種顏色的大塊染色(bulk staining)能編碼最多到12種類型的珠，每個珠都在四種強度水平，并以四種很小的摩爾比例(nominal molar ratios)混合。在國際申請No.PCT/US/98/10719中揭示了用于外或內(nèi)表面的組合顏色編碼，在這里一并將其全部內(nèi)容進行參考。
根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法，例如用已知技術(shù)的一些結(jié)合反應(yīng)中的一個反應(yīng)(G.T.Hermanson，Bioconjugate Techniques(Academic Press，1996)；L.Illum，P.D.E.Jones，Methods in Enzymology 112，67-84(1985))通過將結(jié)合物分子結(jié)合到珠上將珠功能化，結(jié)合物分子包括DNA(寡核苷酸)或RNA片段、肽或蛋白、適體和小的有機分子。在本發(fā)明的某些實施方案中，功能化的珠具有共價結(jié)合于珠的結(jié)合物分子(例如DNA、RNA或蛋白)。可以把珠保存于緩沖的大量懸浮液中直到使用。功能化通常需要一步或兩步反應(yīng)，如圖2所示，利用標準液體操作機器人以及96孔格式可以平行地進行這些反應(yīng)并將一些的所需的功能化分子中的任何一種分子共價地連接到設(shè)計好的珠上。在優(yōu)選的實施方案中，使用核心-外殼構(gòu)架的珠，外殼由薄的聚合物阻斷層組成，阻斷層選擇了優(yōu)選的組成成份，并如本領(lǐng)域所熟知的，根據(jù)靶向測定應(yīng)用進行功能化?？梢猿槌鰳悠愤M行自動化QC測定。每批珠給成千上萬個芯片提供了材料使得芯片對芯片的差異被最小化。
根據(jù)LEAPS的界面圖案化方法(patterning methods)可以圖案化本發(fā)明所使用的基層(例如芯片)，通過例如氧化物或其他絕緣材料的圖案化生長以便在施加AC電場的情況下產(chǎn)生所需的阻抗梯度結(jié)構(gòu)。圖案化處理可以被設(shè)計為能生成AC場誘導的液流以及相應(yīng)的粒子轉(zhuǎn)運的所需的結(jié)構(gòu)。如圖3所示，通過使用半導體圖案化技術(shù)可以在晶片尺度上圖案化基層。另外，通過沉積一種UV可圖案化的、光學透明的聚合物薄層而在基層上附著所需的液體管路和分隔的布局以便將基層分區(qū)，從而將液體局限于一個或多個分散的分隔中，由此可以為一個給定的基層提供多種樣品。
在本發(fā)明的某些實施方案中，將第一個平板電極基本上平行于第二個平板電極放置(“三明治”結(jié)構(gòu))，兩個電極之間被間隙分隔，且間隙中含有電解質(zhì)溶液，由此制備珠陣列。利用界面圖案化方法圖案化第二個平板電極的表面或內(nèi)部。將編碼的和功能化的珠引入到間隙中。當將AC電壓應(yīng)用于間隙時，珠在第二個電極(例如“芯片”)上形成了隨機編碼陣列。而且也利用LEAPS，可以在光敏電極(“芯片”)上形成珠陣列。優(yōu)選的，將個平板光敏電極和另一個平板電極也用于所述的三明治結(jié)構(gòu)。再一次的，兩個電極被一個間隙所分開并含有電解質(zhì)溶液。將功能化和編碼的珠引入到間隙中。在聯(lián)合應(yīng)用光和AC電壓下，珠在光敏電極上形成陣列。
在某些的實施方案中，根據(jù)特異的陣列組成，通過從各自的庫(reservoir)中選出所指定的編碼珠的樣份并“匯集(pooled)”，以預(yù)防樣份的最初融合的方式將匯集的懸浮液的樣份分配到所選擇的基層上(例如芯片)，可以生成用于本發(fā)明的特殊應(yīng)用的珠陣列。樣份形成了多種編碼珠的平面隨機子陣列，每個子陣列代表來自各自匯集池的珠，且物理陣列布局獨特地對應(yīng)于來自匯集珠群的樣本的特性。
可以使用基層上被化學地或物理地編碼的編碼珠的平面陣列或組件。對此，也可以添加空間編碼以增加能操縱的檢測的數(shù)目。例如在組裝陣列時可以在單液相完成空間編碼，該組件利用LEAPS按所需的反應(yīng)于相應(yīng)的電場和/或根據(jù)照射于基層的光的模式的構(gòu)型組裝平面珠陣列。LEAPS產(chǎn)生了硅芯片和溶液之間的界面阻抗的橫向梯度以調(diào)節(jié)指導陣列組裝的電流動力。電的需求是最少的兩個平板電極之間的通常100μm的液體間隙上所應(yīng)用的低AC電壓通常小于10Vpp。整個組裝過程是快速的并且它是光學可編程的在數(shù)秒內(nèi)在電場中形成包含數(shù)千個珠的陣列。多個子陣列的形成也可以發(fā)生在保持于被分隔的芯片表面的多個液相。
利用已組裝的編碼珠而不是一個陣列也可以在基層表面進行本發(fā)明的多元檢測。例如，通過將珠懸浮液定點滴到基層的多個區(qū)域并允許珠在重力下停留，可以在基層表面形成珠的組件。與LEAPS所形成的珠陣列相反，這些組件通常采用低密度和無序的結(jié)構(gòu)。然而，通過將化學編碼珠的混合物定點滴入到基層的多個不同位置所獲得的空間與顏色的聯(lián)合編碼仍提供了多元分析的可能，這對于某些生物測定是足夠的。
可以在基層上組裝編碼陣列之前或之后完成這些珠的結(jié)合物與分析物之間的結(jié)合相互作用。例如，珠陣列可以在檢測后形成，之后可以取得陣列的檢測圖像或解碼圖像。同樣的，可以用物理或化學的方法將珠組裝于陣列中并固定以形成隨機編碼陣列，例如圖10所示的陣列形狀。陣列可以被固定不動，例如通過應(yīng)用DC電壓以生成具有圖10所示的陣列形狀的隨機編碼陣列。DC電壓通常被設(shè)定為5-7V(對于2-6μm范圍的珠以及100-150μm的間隙大小)并按“反偏壓(reverse bias)”結(jié)構(gòu)應(yīng)用＜30s，以致于n摻雜硅(n-doped silicon)基層將形成陽極，引起陣列被壓縮到便于陣列內(nèi)相鄰珠之間相互接觸的范圍并同時造成珠向電極表面相鄰近端的高電場移動。一旦足夠的接近近端，珠被介導物理吸附的范德華力所錨定。通過在珠表面提供一群延伸自珠表面的“系鏈(tether)”促進了該吸附過程；多賴氨酸和抗生蛋白鏈菌素已經(jīng)被用于該用途。
在某些實施方案中，粒子陣列可以用化學方法所固定，例如通過形成組合的膠-粒子膜。在一個形成這種膠-組合粒子膜的實例中，提供有微粒懸浮液，其中含有所有隨后進行的形成原位膠的成分，就是單體、交聯(lián)劑和引發(fā)劑。用LEAPS應(yīng)用方法將粒子組裝成基層上的平面組件，例如在電極之間跨液體間隙所應(yīng)用的AC電壓為1-20Vp-p，其頻率范圍從100’赫茲到數(shù)千赫茲。陣列組裝后，在存在所應(yīng)用的AC電壓下，利用IR燈或利用水銀燈源熱加溫單元到40-50℃以觸發(fā)液相的聚合作用，并有效地俘獲膠內(nèi)的粒子陣列。膠可以由從20％到5％的不同單體濃度的丙烯酰胺和雙丙烯酰胺的混合物構(gòu)成(丙烯酰胺∶雙丙烯酰胺＝37.5∶1，摩爾比)，或者也可以同樣使用低粘度的水溶性單體或單體混合物。用這種方法制備的化學固定的功能化的微粒陣列可以用于各種生物檢測，例如配體受體結(jié)合試驗。
在一個實例中，利用二鹽酸偶氮二異丁脒(azodiisobutyramidinedihydrochloride)作為熱引發(fā)劑形成熱的水凝膠，二鹽酸偶氮二異丁脒為低濃度以保證聚合混合物的總的離子強度在0.1mM到1.0mM的范圍內(nèi)。UV聚合作用所使用的引發(fā)劑為Irgacure2959(2-Hydroxy-4′-hydroxyethoxy-2-methylpropiophenone，Ciba Geigy，Tarrytown，NY)。將引發(fā)劑加入到單體中以得到1.5％重量百分比的溶液。
在某些實施方案中，粒子陣列可以被用機械方式固定。例如用標準的半導體操作方法可以在硅基層的低阻抗區(qū)生成微孔陣列。例如通過利用LEAPS介導的水動力用這些結(jié)構(gòu)可以形成粒子陣列，以及利用重力轉(zhuǎn)運并將粒子聚集于孔陣列上。然后關(guān)閉AC電場并將粒子收集到微孔中，因此將粒子機械地固定。去除多余的珠，在基層表面留下幾何學有序的隨機珠陣列。
當將珠陣列在檢測之前固定時，陣列作用為一個兩維的親和矩陣，它具有受體或結(jié)合物(例如寡核苷酸、cDNA、適體、抗體或其他蛋白)以捕獲來源于與陣列接觸的溶液的分析物或配體(DNA、蛋白或其他小的同源配體)。珠陣列平臺可以用于進行多元分子分析，例如基因表型、基因表達譜、循環(huán)蛋白水平譜以及多種動力學研究。
可以將基層(例如芯片)放置于一個或多個封閉的間隔中，該間隔允許通過流體相互連通將樣品和試劑轉(zhuǎn)運進或出間隔。可以用這種格式進行芯片上(on-chip)細胞因子的免疫檢測，例如白介素(IL-6)。將血清樣品和熒光標記的第二抗體依次引入反應(yīng)間隔以允許其與固定于芯片的珠反應(yīng)。圖5說明了一個反應(yīng)間隔的設(shè)計，根據(jù)本發(fā)明該間隔可以用于多元檢測。反應(yīng)也可以在一個類似于微滴度板的開放的間隔格式中進行。利用機器人液體操作裝備可以將試劑吸量到芯片頂部，并可以同時操作多個樣本。這樣的一種格式提供了應(yīng)用于現(xiàn)有的微滴度板格式的標準的樣本處理以及液體操作，并整合了樣本處理和陣列測定。
在某些實施方案中，分析物-結(jié)合物相互作用的存在與參與相互作用的珠的光學信號的改變相關(guān)，并檢測和分析了這些光學改變。通過檢測與這些珠所相關(guān)的化學或物理地可區(qū)分的特性可以確定出參與相互作用的結(jié)合物的特性。優(yōu)選的，將化學可區(qū)分的特性包括化學分子包括熒光團染料、發(fā)光團以及其他化學分子用于結(jié)合檢測中的測定目的。
當粒子在基層上被組裝成平面陣列時，可以進行化學地或物理地可區(qū)分的特性的測定以及與結(jié)合相互作用相關(guān)的光學信號變化的測定，例如通過取得陣列的檢測以及解碼圖像并比較兩者的圖像，例如對檢測和解碼圖像的比較包括光學顯微鏡裝置的使用，該裝置包括圖像檢測器、計算機圖像捕獲以及分析裝置。解碼圖像可以被用于確定獨特地識別珠表面所具有的結(jié)合物的化學地和/或物理地可區(qū)分的特性，例如通過用可區(qū)分的特性確定陣列中每個粒子上的結(jié)合物的特性。陣列的檢測圖像被用于測定結(jié)合物和分析物復合物的光學信號。在某些實施方案中，可以將熒光標記物(熒光團染料)連接于分析物上，以致于當分析物結(jié)合于珠時，熒光強度的改變代表了珠的光學信號的改變。在某些實施方案中，解碼圖像的取得是在珠被組裝成陣列以及被固定之后并在取得檢測圖像之前，優(yōu)選的在將珠上的結(jié)合物與分析物接觸之前。在某些其他的實施例中，當溶液中的珠被組裝成陣列后，發(fā)生結(jié)合相互反應(yīng)并獲得解碼和檢測圖像。
通過比較解碼圖像和檢測圖像可以發(fā)現(xiàn)結(jié)合物-分析物復合物的結(jié)合物的特性。
在優(yōu)選的實施方案中，將圖像分析算法用于分析從解碼和檢測圖像中得到的數(shù)據(jù)。這些算法可以被用于獲得陣列中每個珠的定量數(shù)據(jù)。如圖7所概括的，分析軟件自動定位于珠的中心，它將陣列的一個亮視野圖像作為模板，根據(jù)珠的類型將珠分組，并給每個珠分配定量強度，排除了例如那些血清樣本中不規(guī)則形狀的“基質(zhì)(matrix)”材料所產(chǎn)生的“污點”，分析背景強度，統(tǒng)計和評估了所有類型的珠的背景校正的平均強度以及相應(yīng)的偏差。
本發(fā)明的方法可以用于測定結(jié)合和解離常數(shù)，例如通過以時間依賴性方式引入分析物并分析作為時間函數(shù)的結(jié)合，或通過以時間依賴性方式洗滌所結(jié)合的分析物并分析作為時間函數(shù)的結(jié)合。
本發(fā)明的方法可以用于測定分析物-結(jié)合物的相互作用的親和常數(shù)，用于測定形成的分析物-結(jié)合物復合物的數(shù)目。
本發(fā)明也提供了用于測定生物樣品中一種分析物的濃度的方法。
本發(fā)明的方法也用于測定一種給定的分析物對一組結(jié)合物的共親和矩陣的元件。在一個實施例中，可以確定出分析物和一組結(jié)合物之間的相互作用的程度，其相互作用為競爭性、多成分的平衡反應(yīng)。對共親和常數(shù)的測定提供了有用的應(yīng)用，如下所述。
多種類型的器官移植的成功率直接與供體和受體之間的人白細胞抗原(HLA)的相容性相關(guān)。對受體的群體反應(yīng)性抗體(PRA)的血清學測定是避免可能的排斥反應(yīng)的關(guān)鍵步驟之一。PRA測定的交叉反應(yīng)是非常常見的現(xiàn)象，這歸結(jié)于一些HLA抗原結(jié)構(gòu)的相似性以及發(fā)生這些抗體的本性。事實上，根據(jù)組間的明顯的血清學交叉反應(yīng)性可以把HLA抗原編組。這些組稱為交叉反應(yīng)組(CREG)。在目前的臨床設(shè)置中，將來自一個患者的抗體在不同的反應(yīng)中測試不同的抗原。盡管結(jié)合于不同反應(yīng)的結(jié)果可以產(chǎn)生抗體的反應(yīng)形式，但是不同抗體和抗體之間的相互反應(yīng)的競爭特性在這樣的形式中沒有被反映出來。在其他情況下，將一些抗原混合在一起用于結(jié)合測定。在該體系中缺乏對每個抗原的測定，這阻止了結(jié)合數(shù)值的產(chǎn)生。結(jié)果僅僅是來自不同抗原的平均信號。在珠陣列體系中，將一組不同的抗原呈遞給競爭結(jié)合環(huán)境中的抗體分析物，以及用與不同類型珠的相關(guān)性可以測定每個抗原。因此，競爭性反應(yīng)中的每個抗原的結(jié)合強度可以被提取于單個測定中。這種共親和矩陣系統(tǒng)將給CREG提供結(jié)合數(shù)值并極大地推動了對反應(yīng)本質(zhì)的理解以及提供了相關(guān)的臨床決定的準確性。例如，一個N抗體和M抗原體系提供了N×M種可能反應(yīng)的矩陣。測定K-nm是可能的，K-nm是控制第n個抗體對第m個抗原的相互作用的親和常數(shù)，其中m＝1，2，....M，以及n＝1，2，....N。對于不需要絕對共親和常數(shù)的應(yīng)用，根據(jù)本發(fā)明的方法將產(chǎn)生不同抗體的結(jié)合數(shù)值，以及來自患者樣品的結(jié)果可以與這些數(shù)值或這些數(shù)值的組合相匹配。
共親和矩陣也可以用于表征分析物。例如，結(jié)合共親和矩陣以及已知濃度的參與分析物-結(jié)合物復合物形成的分析物和結(jié)合物的系數(shù)并用于定義競爭性結(jié)合相互作用的描述符，例如分子相互作用參數(shù)，Pn(Rm)=Kmn[Ln]ΣjKmj[Lj]]]>它提供了結(jié)合物Rm和分析物Ln之間的分子相互作用的特性，在存在分析物時{Lj；1＜j＜N}，所有的這些都代表出結(jié)合物的有限的親和力，Kmj。也就是Pn，0≤Pn≤1，代表了在多成分競爭性反應(yīng)中結(jié)合物Rm對分析物Ln的標準化的特異性，并作為結(jié)合物的基于多成分競爭性反應(yīng)所具有的共親和力的重要特征。也見于P.H.von Hippel et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA83，1603(1986)，一并于參考。
分析物對一組結(jié)合物的結(jié)合反應(yīng)模式可以被用于表征分析物并將它與其他分子進行比較。另外，通過利用一組參照的結(jié)合物所產(chǎn)生的分析物的共親和矩陣，通過觀察結(jié)合模式的差異可以將這些親和力用于測定出隨后加入結(jié)合物組的樣品中是否含有雜質(zhì)。
本發(fā)明也提供了U.S.Patent No.5,759,820和European PatentNo.83901406.5(Sintef)所描述的超順磁性粒子(“磁性粒子”)的用法。它可以被用于整合編碼珠陣列所包含的樣品制備步驟以及檢測步驟。兩個參考文獻這里都一并進行參考。
可以用化學地或物理地區(qū)分的特性(例如熒光標記物)編碼超磁性粒子并將其用于進行本發(fā)明的生物檢測。在某些實施方案中，用LEAPS組裝粒子，如同非磁性編碼的珠一樣。這些編碼的納米粒子也能被用于生成陣列并被檢測。本發(fā)明也包括通過將磁場應(yīng)用于所述粒子可以在基層上形成編碼的和功能化的超磁性粒子的平面陣列。
本發(fā)明提供了一種用于生產(chǎn)顏色編碼磁珠的新方法，一種簡單的及靈活的將根據(jù)下述的方法制備的受較好控制的數(shù)目的磁性納米粒子，以及受較好控制的數(shù)量的一種或多種熒光染料引入到預(yù)先形成的聚合微粒中的方法。在本發(fā)明的一個具體實施方案中，控制磁性納米粒子的數(shù)量使得其在所應(yīng)用到所述粒子的磁場中在基層上形成一個陣列。這個過程包括在一個含有染料和磁性納米粒子的有機溶劑中將聚合物粒子膨脹，并因此將其應(yīng)用于任何能進入標準膨脹程序的聚合物粒子，例如那些在先前微粒的熒光染色的技術(shù)中所闡述的粒子。不同于編碼方法，其中每個磁性材料以及熒光染料被定位于磁性粒子的(核心/外殼)的不同區(qū)域，粒子的統(tǒng)一膨脹保證了磁性粒子在整個內(nèi)在容積內(nèi)的分布。這個方法也允許將納米粒子以及染料成分的數(shù)量控制在一個寬的范圍內(nèi)，因此可以定制粒子的磁化率(magnetic susceptibility)以及熒光強度。本發(fā)明的另外一個方法除了控制磁負荷外是控制宿主粒子的磁性特點，它是通過調(diào)整微膠粒合成反應(yīng)(見下)的水成分來調(diào)節(jié)磁性納米粒子的大小。利用現(xiàn)有的功能性基團物理或化學地結(jié)合了粒子表面上可能的生物分子。通過在粒子上生長更多的聚合物外殼能迅速地清除濾出的磁性納米粒子。
本發(fā)明也提供了一種通過兩步方法生產(chǎn)編碼的磁性粒子文庫的新方法。這個方法中的第一步包括生產(chǎn)磁性納米粒子的子文庫，方法中的第二步包括生產(chǎn)編碼粒子的子文庫。子文庫形成后，如下更特異的描述，每個子文庫的成員都被賦予了一種結(jié)合位點并被功能化。
通過將金屬氧化物分散相與單體溶液結(jié)合并形成包被有金屬氧化物粒子的粒子的聚合物矩陣可以生成磁性納米粒子的子文庫。該金屬氧化物分散相可以包括一種金屬氧化物，單獨或與一種不同的金屬氧化物聯(lián)合使用。該金屬氧化物可以不受限地包括氧化鐵、鎂、鈷、鋅、鎳和銅等。單體溶液可以包括一種單體，單獨或與一種不同的單體聯(lián)合使用。單體可以不受限地包括苯乙烯、甲基丙二酸、丙烯酰胺、乙二醇丙烯酸酯、羥基-乙基-甲基丙烯酸酯、乙烯基甲苯、二乙烯基苯等。同樣的，可以使用一種聚合物溶液并可以包括一種聚合物材料，例如纖維素、蛋白質(zhì)樣聚合物(protenaceous polymer)、玻璃、瓊脂糖、凝膠等。磁性納米粒子可以是任何大小和性狀，但優(yōu)選的是球形、單分散的以及從約0.01到約1微米，優(yōu)選的從約0.05到約0.4微米。
通過將一種光學標記符包被于聚合物材料可以形成編碼顆粒的子文庫。聚合物材料可以包括一種聚合物，單獨或聯(lián)合使用。聚合物可以不受限地包括聚苯乙烯、聚甲基丙二酸、聚丙烯酰胺、聚乙烯二醇、聚羥基-乙基-甲基丙烯酸酯、聚乙烯基甲苯、聚二乙烯基苯、溴化聚苯乙烯、聚丙烯醛、聚乙烯、聚氨基甲基乙酯、聚氯乙烯或它們的組合等。光學標記物可以包括一種或多種具有200m和1200nm之間的發(fā)射波長的染料。優(yōu)選的染料包括但不局限于焦甲烷(pyro-methane)和香豆素染料。可以同時使用多于一種的具有可區(qū)分的發(fā)射譜的染料，并根據(jù)染料的發(fā)射譜選擇染料。
本發(fā)明的編碼粒子可以是任何的大小和性狀，但是優(yōu)選的是聚合物的、球形、單分散的以及從約0.6到100微米，優(yōu)選的從約1.5到約10微米。
根據(jù)如下面的具體實施方案和實施例所說明的相關(guān)應(yīng)用，可以定制每個本發(fā)明的子文庫。在一個實施方案中，通過賦予磁性納米粒子結(jié)合位點或功能性位點可以進行這些定制，根據(jù)相關(guān)的應(yīng)用選擇這兩種位點。通過將相關(guān)分子基團連接到磁性粒子的外表面可以形成這些位點。結(jié)合位點可以形成于聚合步驟期間以及功能性位點可以形成于更晚的階段，但在如下圖解的組合粒子的形成之前。適用于本發(fā)明生成結(jié)合位點的分子實體不受限地包括任何基團例如羧基、酯基、氨基、醛基、乙醇基、或鹵化物、抗生蛋白鏈菌素、抗生物素蛋白、中性鏈親和素、生物素等。適合于本發(fā)明生成功能性位點的分子實體不受限地包括抗生蛋白鏈菌素、抗生物素蛋白、中性鏈親和素、生物素、蛋白A等。對賦予本發(fā)明的磁性納米粒子特殊功能性位點的分子實體的預(yù)先選擇提供了編譯一組特定的子文庫的能力，該子文庫能用于進行特定的監(jiān)測。在本發(fā)明的一個實施方案的說明中，為了進行測定相關(guān)核酸存在的檢測，它將提供可應(yīng)用的功能性位點使得能結(jié)合一個或多個寡核苷酸或cDNA。在本發(fā)明的實施方案的另一個說明中，為了進行測定相關(guān)蛋白存在的檢測，它將提供一種功能性位點使得能結(jié)合一或多種抗原或抗體，它們是特異于相關(guān)蛋白的測定或調(diào)節(jié)。這些功能性結(jié)合可以在形成本發(fā)明的組合粒子之前或之后完成。
通常地，利用本領(lǐng)域已知的方法用共價連接可以將所述的功能性或結(jié)合基團連接于磁性納米粒子的外表面。在磁性納米粒子上的相關(guān)位點形成之后，將磁性納米粒子的子文庫與編碼粒子的子文庫接觸，利用本領(lǐng)域已知的方法通過結(jié)合位點可以將磁性納米粒子連接到編碼粒子，同時留下未結(jié)合的功能性位點并用于進行相關(guān)檢測。
如下面實施例所述，在本發(fā)明的另一個應(yīng)用中，具有本發(fā)明的組合粒子的金屬氧化物可以被約束并被調(diào)節(jié)使得誘導出相關(guān)的磁性應(yīng)答?？刂平Y(jié)合于編碼粒子表面的磁性納米粒子的數(shù)目可以進行先前的操作。
如下面實施例所述，在本發(fā)明的另一個應(yīng)用中，編碼粒子的光學標記符可以被按特定的比例組合以實現(xiàn)相關(guān)應(yīng)用的目的。利用本領(lǐng)域已知的方法可以實現(xiàn)對光學標記符比例的控制，例如U.S.Patent No.4,717,655中所闡述的方法。
如下面實施例所述，在定制磁性納米粒子的子文庫后，通過將多個功能化磁性納米粒子共價連接到一個編碼粒子的外表面可以形成組合粒子的文庫。根據(jù)進行的檢測可以預(yù)先選擇這些粒子的性質(zhì)。如這里所例舉的，本發(fā)明的組合粒子文庫所呈現(xiàn)的化學多樣性大于2。在另一個實施方案中，可以在進行檢測本身的期間生成本發(fā)明的組合粒子。檢測調(diào)用了本發(fā)明的磁性納米粒子所具有的一個功能性基團和本發(fā)明的編碼粒子所具有的第二個分子基團之間的相互作用以生成本發(fā)明的組合粒子。在檢測中，在本發(fā)明的組合粒子可以被調(diào)整為用于檢測的陣列格式之后，可以形成由磁性和非磁性粒子構(gòu)成的異源結(jié)構(gòu)，這是功能性基團和分子基團之間形成復合物的結(jié)果。
可以在基層上操作本發(fā)明的組合粒子，根據(jù)U.S.Patent No.6,251,691所闡述的界面圖案化方法可以圖案化基層。在圖案化之后，利用“三明治”結(jié)構(gòu)可以制備本發(fā)明的組合粒子的陣列。
本發(fā)明的組合粒子也可以被操縱并組裝成對應(yīng)于磁場的有序的陣列。磁場梯度的存在誘導出了一種作用于組合粒子上的力(～1/2(χV/μo)del(B2)，其中χ組合粒子的磁化率，V為其體積，B為磁場大小(磁通量密度)，磁場的方向以及大小依賴于磁場分布的準確的性質(zhì)和磁場的強度。對單一軸場以及定位的磁場梯度所產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)的適當組合可以被用于捕獲并以陣列的格式固定(可逆性)本發(fā)明的組合粒子。這種能形成2D陣列以及固定這些粒子的能力有著特殊的應(yīng)用性，這種應(yīng)用性與進行包括緩沖液交換以及多步洗滌步驟的多步檢測相關(guān)。用于在垂直方向產(chǎn)生單一軸以及調(diào)節(jié)梯度的特別有用的結(jié)構(gòu)是一對電磁圈，這樣它們各自的場的方向是彼此對立的。因此通過調(diào)節(jié)圈之間的間隙或樣品對應(yīng)于圈的相對位置以及通過圈內(nèi)各自的電流，可以控制作用于本發(fā)明的組合粒子上的力(1/2(χV/μo)BdB/dz。
作為增加磁場強度的一個功能，可以形成具有磁場依賴性的數(shù)目密度(或相同地，平均粒子間距離)以及垂直位于基層的線性的串珠(strings of beads)的有序的平面組件。
在優(yōu)選的實施方案中，通過應(yīng)用垂直定位于基層平面的一個統(tǒng)一磁場可以在基層或接近基層的位置上形成平面結(jié)構(gòu)。對于具有平均直徑3.2μm的組合顆粒的常見的磁化率值，按這里的實施例所描述的制備，一個產(chǎn)生磁感應(yīng)范圍為接近1000到2000高斯的磁場足夠生成平面組件。當將永久磁場放置于極為接近基層的位置，它在接近基層表面生成一個磁場，其磁場強度足夠?qū)崿F(xiàn)所需的該組件的平面結(jié)構(gòu)。電磁體也可以生成所需的磁場結(jié)構(gòu)，例如本領(lǐng)域已知的螺線形電導管或Helmholtz結(jié)構(gòu)；可以將基層放置于磁鐵的內(nèi)腔或放置于最接近于內(nèi)腔外的線圈的位置，以保證磁場定位基本上垂直于基層平面。這樣的排列所產(chǎn)生的磁場隨著應(yīng)用于電磁體的線圈的電流而增加，因此使得所使用的磁場隨時間變化。例如對于線性變速的形式(對于電流隨時間線性增加)或正弦的形式(對于電流變化是時間的正弦函數(shù)，也就是AC電流)。
給定平面組件或陣列內(nèi)數(shù)目密度的場依賴性，通過對電流的實時控制，因此電磁體結(jié)構(gòu)提供了一種可逆地實時調(diào)整該組件的數(shù)目密度的工具。在優(yōu)選的實施方案中，將具有10Hz到10MHz范圍頻率，更常見的是10Hz到10KHz范圍頻率的AC電流添加到DC電流，所選擇的AC電流的幅度與DC電流幅度相比較是小的；前者提供了組件內(nèi)粒子間距的暫時變化，而后者設(shè)定了平均間距。平面組件的這種誘導的密度變異將引起一種電動力反應(yīng)以及周圍液體介質(zhì)的局部流動。這種磁場誘導的流動是有用的，例如提供了局部的混合器以增強發(fā)生于接近基層和/或接近粒子表面的任何相關(guān)反應(yīng)的動力學。另外，通過利用本領(lǐng)域已知的方法用透磁合金(perm-alloy)圖案化基層可以生成空間調(diào)整的磁場。
本發(fā)明揭示了一種利用本發(fā)明的組合粒子文庫進行多步生物分析檢測操作的平臺，該操作將多元分子相互作用分析以及樣品制備和處理步驟整合在一起。樣品制備可以包括從給定的混合物中捕獲和分離所需的分析物，以及樣品處理可以包括對捕獲的分析物和/或結(jié)合物進行的任何所需的變換。分析通?？梢园▽哂薪Y(jié)合物的珠與分析分子之間的分子相互作用的程度的指示物的檢測和記錄，光學信號例如熒光或化學發(fā)光物是這種指示物的典型代表。另外，分析可以包括對與各個粒子相關(guān)的結(jié)合物的特性的原位解碼。
在本發(fā)明的每個特殊的文庫中，與計劃檢測相關(guān)的結(jié)合物都連接有顏色碼形式的可區(qū)分的標記物。本發(fā)明特別相關(guān)的是能實時解碼的編碼粒子的子文庫，以及據(jù)此確定結(jié)合物的化學特性。在本發(fā)明中，預(yù)先挑選的結(jié)合物可以被分別地結(jié)合到本發(fā)明的磁性納米粒子上，以生成功能化的磁性納米粒子的子文庫，以及將該子文庫與分開制備的作為珠標記物的編碼粒子的子文庫相結(jié)合，使得編碼粒子獨特地結(jié)合于每個第一個子文庫所包含的功能化的磁性納米粒子上。這個過程提供了獨特的靈活性以控制所形成的文庫的功能基團和標記物的組合和可能的排列。
在本發(fā)明的一個實施方案中，可以將本發(fā)明的組合粒子文庫和標準微孔格式以及液體操作機器人聯(lián)合使用。根據(jù)相關(guān)的檢測的要求，微孔含有一組來自文庫的粒子。在一個或多個孔中或其他相同的反應(yīng)器皿中可以進行多元相互作用分析，優(yōu)選的在保證本發(fā)明的組合粒子仍在懸浮液中的條件下，以達到有利的反應(yīng)動力學和保持該反應(yīng)的優(yōu)化混合。本發(fā)明中的每個組合粒子能與相同的分析物分子混合物相互作用以促進在該多元檢測格式中以這里所進行的實施例中所描述的方式同步形成多個結(jié)合物復合物。在完成各個粒子的分子相互作用和形成各個粒子的結(jié)合物復合物后，在每個反應(yīng)器皿所含的組中，分析和解碼粒子，例如利用流式細胞分析以一系列分析模式解碼粒子以及同時記錄一個粒子的檢測信號，或者通過將一組或多組粒子轉(zhuǎn)移到容許形成平面組件的基層上，例如通過容許粒子在重力下停留。
在一個優(yōu)選的實施方案中，在一個微液體環(huán)境中完成檢測整合，這剔除了微孔格式。如下面所討論的，樣品捕獲、隨后的具有結(jié)合物的珠或分析物的轉(zhuǎn)換以及在完成結(jié)合相互作用后隨機編碼的編碼粒子組件的實時形成，后者根據(jù)READ方法允許即時的圖像檢測，這些都以高度平行的檢測格式所整合。隨機編碼珠陣列，由根據(jù)本發(fā)明通過使用磁場實時形成的本發(fā)明的組合粒子所構(gòu)成，提供了能用于進行多步檢測序列的平臺。
為了說明本發(fā)明的目的，可以如圖22所示進行四組步驟(稱為捕獲、轉(zhuǎn)換、轉(zhuǎn)換后陣列組件以及隨機編碼的陣列檢測)。這些步驟被下面的實施例進一步地說明并提供了進行整合生物分析的能力。該檢測方案可以在標準設(shè)計的微液體設(shè)備中完成，該設(shè)備包括一個或多個通過液體管路連接的液體間隔，并利用標準的泵方法提供了定時的液體轉(zhuǎn)運。在優(yōu)選的實施方案中，可以在第一個間隔進行樣品捕獲和轉(zhuǎn)換。轉(zhuǎn)換后，將珠轉(zhuǎn)移到裝備有磁場的第二個間隔以完成轉(zhuǎn)換后組件及READ操作。
將相關(guān)樣品以及一組定制的組合粒子引入到第一個間隔中并容許相互作用，以使得將分析物從樣品中捕獲到具有結(jié)合物的珠上。在應(yīng)用磁性收集后，進行一個或多個洗滌循環(huán)，該循環(huán)包括用空白緩沖液替換第一個間隔的內(nèi)容物，并最后開始轉(zhuǎn)換步驟，如這里的實施例中所描述的，加入轉(zhuǎn)換反應(yīng)所需的液體試劑。
以下更詳細地闡述本發(fā)明方法的四個步驟。
1.捕獲生物樣品的分析通常開始于復雜的混合物，例如血液、血清或細胞懸浮液，它們不僅含有相關(guān)的為抗體、抗原、RNA、DNA或其他生物分子的分析物，也含有大量的可能干擾預(yù)期的分析的大量成分。和用標準的分析化學分離一樣，如果非必需，通常需要將樣品的分析物成分從樣品的其他部分中分離出來。某些磁性粒子對這種目的的適用性已經(jīng)被先前技術(shù)所廣泛地闡述，所述粒子，當應(yīng)用于微孔格式時，通常需要高磁化率以容許在合理的時間內(nèi)在利用永久磁鐵在實驗室設(shè)置中可以產(chǎn)生的磁場梯度中收集和固定粒子。在這個步驟中，可以完成第一組磁性粒子對相關(guān)功能性集團的捕獲，例如基因組DNA片段等。該捕獲步驟后緊跟著一個或多個洗滌循環(huán)，包括用緩沖液取代可動的(非固定的)原始混合物的成分。感應(yīng)元件也被描述用于在小型化環(huán)境內(nèi)產(chǎn)生磁場和場梯度。
在某些情況下，可以不必要去區(qū)別不同類型的相關(guān)分析物，實例包括通過將常見的polyA尾部序列雜交到標準磁性粒子所具有的寡dT上從細胞裂解液中提取總mRNA，或和在標準親和純化中一樣，通過將分子的Fc部分結(jié)合到具有蛋白A的珠上親和純化一組抗體，指的是IgG，。
然而，在許多情況下，將多種分析物以特異分析物的方式從給定的樣品中捕獲多種分析物是需要的或必需的。在缺少本發(fā)明的組合粒子的文庫時，需要將樣品分解為多個樣份，添加的步驟不僅有著引入差錯例如吸量錯誤或污染的可能，也要求所得到的少量樣品的限制性使用。相反的，本發(fā)明的組合粒子文庫通過以特異分析物方式同步捕獲的方法推動了多元分析。實例包括從細胞裂解物中序列特異性地捕獲與珠所具有的捕獲序列相匹配的多種mRNA靶序列；將多種DNA靶序列從cDNA文庫中挑選出來；或捕獲多個罕見類型的淋巴細胞，利用它們表達的細胞表面抗原的相應(yīng)的庫對珠具有的單克隆抗體來識別。如實施例25所述，引入于特異捕獲步驟的樣品可以產(chǎn)生于第一個、非特異的含有例如本發(fā)明的磁性納米粒子的捕獲步驟中。
在一個在洗滌期間磁性捕獲組合粒子的實施方案中，本領(lǐng)域已知的永久磁鐵可以被用于進行臨時固定。這里，檢測環(huán)境的小型化保證了粒子一直處于一個短的距離內(nèi)，該距離離反應(yīng)器皿最接近的表面通常不超過100μm，因此縮短了從懸浮液將賦予了磁化率的粒子收集進磁性梯度所需要的時間，或反過來說，使得在給定的收集時間內(nèi)保證被給定的磁場和場梯度收集所需的磁化率最小化，該時間通常不超過5分鐘以及優(yōu)選的不超過0.5分鐘。對于本發(fā)明的組合粒子，是外殼的成分而不是核心決定磁化率，因此它們是特別好地適合于將檢測環(huán)境最小化。
本發(fā)明的一個實施方案可以將本領(lǐng)域已知的感應(yīng)元件的設(shè)計應(yīng)用于捕獲在或接近平面基層表面的粒子。在優(yōu)選的實施方案中，在應(yīng)用有磁場的第一微液體間隔里進行捕獲。例如，平面液體間隔可以被三明治化于兩個永久磁鐵之間，放置磁鐵使得它們能提供足夠的線性收集器(string trap)使得在存在側(cè)向液流最大到一特定的速度時將粒子固定在間隔的上下表面之間，當在出現(xiàn)更高的流速時能將它們釋放出來。利用電磁電圈磁鐵的組合也能容易地制成相同的磁場結(jié)構(gòu)。同軸對稱結(jié)構(gòu)提供了更多的選擇，例如10-100μm直徑的毛細管，它可以被插入到透磁合金場的中心以進行收集。
2.轉(zhuǎn)換(transformation)捕獲的分析物的轉(zhuǎn)換、或在一些與DNA分析情況中，分析物所介導的珠所具有的探針的轉(zhuǎn)換本身代表了一個重要的處理步驟。在分子生物學中，最重要的處理步驟包括一些被很好研究了的酶介導的RNA或DNA的修飾，主要包括，在前一種情況為逆轉(zhuǎn)錄，在后一種情況為連結(jié)、珠所具有的探針(也稱為引物)的延伸或通過循環(huán)延伸反應(yīng)的擴增，最普遍的是通過使用本領(lǐng)域熟知的聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方案的擴增。與本發(fā)明特別相關(guān)的是完成對珠RNA和DNA的修飾反應(yīng)。和捕獲步驟一樣，多元的利用珠標記引物的反應(yīng)例如PCR求援于本發(fā)明的組合粒子文庫的應(yīng)用。一個實施例是捕獲的“粒子標記的”片段的固相擴增。在轉(zhuǎn)換步驟中，將“粒子標記的”DNA片段應(yīng)用于一組“多元”轉(zhuǎn)換步驟中，例如PCR擴增。另一個實施例是聚合酶介導的珠所具有的探針的延伸以生成珠所具有的cDNA鏈，它的結(jié)構(gòu)是互補于捕獲的RNA靶序列。一般而言，作為轉(zhuǎn)換的結(jié)果，生成溶液負荷的產(chǎn)物也是可能的，然后該產(chǎn)物可以被這里所例舉的本發(fā)明的第二組組合粒子所捕獲。
捕獲的蛋白分析物也可以在進一步分析之前被轉(zhuǎn)換。例如，利用本領(lǐng)域已知的方法用鎳功能化試劑和標記物通過螯合作用可以修飾包含一個組氨酸衍生物的蛋白。
3.轉(zhuǎn)換后的陣列組件在完成轉(zhuǎn)換后，本發(fā)明利用磁場誘導形成的由本發(fā)明的組合粒子所構(gòu)成的陣列作為一種生成在高度平行的實時生物分析檢測格式中的隨機編碼組件和粒子陣列的方法。該方法可以在基層的指定區(qū)域生成本發(fā)明的組合粒子的組件以推動隨后的組件圖像，以及可以在廣泛的保證成功的分子的相互作用分析和所形成的結(jié)合物復合物的穩(wěn)定性的不同條件下生成這些組件和有序陣列，這些條件屬于緩沖液組成(鹽濃度，pH)、附加成分例如表面活性物質(zhì)或佐劑的存在、溫度等。如同在LEAPS方法中所描述的通過界面圖案化可以描繪(delineate)基層的限定區(qū)域。另外，例如通過使用例如根據(jù)標準操作的透磁合金圖案化基層可以生成空間調(diào)節(jié)的磁場。
本發(fā)明的粒子可以被組裝成對應(yīng)于所應(yīng)用的磁場的平面組件或有序的平面陣列。例如，將兩個相似平面表面所包圍的液體間隔內(nèi)的懸浮液中所含的粒子放置于人工平行的三明治幾何學結(jié)構(gòu)中，當它暴露于定位于界面垂直方向的磁場時，將形成平面組件。對于如同本發(fā)明方法所控制的給定的粒子磁化率，將形成對應(yīng)于增加的磁場強度的具有特定數(shù)目密度的有序的平面組件；另外，垂直定位于基層(以及因此實際上是平行于所應(yīng)用的磁場)的線性串珠可以形成。
利用永久磁鐵或電磁體裝置所形成的合理設(shè)計的磁場的應(yīng)用是本領(lǐng)域所熟知的?？梢詫⒂谰么盆F設(shè)計為能產(chǎn)生出所需的磁場強度以實現(xiàn)所需的組件結(jié)構(gòu)。電磁體可以產(chǎn)生所需的磁場結(jié)構(gòu)，例如本領(lǐng)域已知的螺線型電導管或Helmholtz裝置；基層可以被引入進磁鐵內(nèi)腔或放置于非常接近于線圈的內(nèi)腔外的位置以保證磁場位置基本上是垂直于基層平面。
在另一個實施方案中，在捕獲步驟中所描述的磁場收集器(magnetictrap)類型可以被應(yīng)用于將應(yīng)用于分子相互作用分析的緩沖液與第二種緩沖液的交換，這可以被優(yōu)化達到保證用LEAPS應(yīng)用程序快速組裝陣列的條件。
4.隨機編碼的陣列檢測一旦被組裝，利用這里所描述的方法和操作，本發(fā)明的組合粒子的隨機編碼的陣列可以被攝像以記錄檢測信號并被解碼以識別結(jié)合于陣列內(nèi)各個珠的結(jié)合物質(zhì)在本發(fā)明組合粒子的陣列形成后，陣列提供了可以被用于讀取多步檢測序列的結(jié)果的平臺。這里所闡述的方法容許快速地定制DNA或蛋白陣列而不需要預(yù)先設(shè)計，并避免了點對點以及芯片對芯片的變異性所帶來的問題。而且，粒子陣列格式容許粒子的芯片非依賴性特征以及對檢測條件的優(yōu)化。另外，在同一個芯片上所保持的分離的液體間隔中可以同時形成多個粒子陣列，該陣列容許并行地處理多個樣品。
為了更完全地理解這里所描述的發(fā)明，實施了以下實施例。應(yīng)當知道這些實施例只是用于說明目的而不是用作為任何形式地對本發(fā)明的限制。
實施例實施例1光學可編程的陣列的形成如圖9所示，用LEAPS同時組裝多個隨機編碼的子陣列以及將這些子陣列“拖放(drag and drop)”進一個共同的、封閉的液體環(huán)境中的芯片上的分隔的但鄰近的位置。兩組來自于不同的庫A和B的珠(2.8μmOligo-(dT)25，Dynal，Oslo，Norway)被同時組裝成同一液體內(nèi)的不同的子陣列；然后將子陣列放置于所需的目的地，這個過程可被用PC可程序化的照明圖案化器所生成并投射到基層空間的不同的照明值所指導(闡述于U.S.Serial No.09/397,793，1999年9月17日遞交，在此一起將全部內(nèi)容并入?yún)⒖?。該拖放操作將兩個子陣列之間的距離從近250μm減少到20μm。在5Vpp，頻率為2KHz以及投射到基層表面的總能量為～5mW的場中移動珠。聯(lián)合于化學和空間的編碼可以多次使用給定組的化學珠標記物，減少將珠放置于任一編碼尺度的需要，同時推動了實現(xiàn)大量編碼的能力。
實施例2在圖案化后的表面上形成陣列圖10所圖解的是在圖案化后的硅芯片上組裝的一個編碼珠陣列，該組裝利用了一個1-2Vpp以及頻率為100-150Hz的AC電壓，該電壓跨于用液態(tài)珠懸浮液所填充的100μm電極間隙上；在130μm中心內(nèi)通過將氧化物蝕刻成50-150深度和正方形形狀(～30×30μm2)來圖案化基層上的熱氧化物(～1000)。也可以生成對應(yīng)于適當?shù)恼彰餍问降南嗨聘袷降年嚵小＿@里顯示的每個子陣列包括近80個結(jié)合有抗細胞因子單克隆抗體的珠。用兩種類型的熒光染料聯(lián)合染色5.5μm直徑的羧基修飾的聚苯乙烯珠，然后用抗細胞因子單克隆抗體進行功能化。該組裝過程保證將所有的珠收集于基層表面。珠編碼如下IL-2(亮紅)；IL-4(暗紅)；IL-6(亮綠)；M-CSF(暗綠)以及TNF-α(黃色)。
實施例3磁性納米陣列的形成膠狀粒子表現(xiàn)出有限的抗磁化率(diamagnetic susceptibility)，當將其放置于平面基層上，響應(yīng)于所增強的磁場，粒子可以被組裝成有序的陣列。將商業(yè)化獲得的超順磁性粒子(Dynal，Oslo，NO)從液體懸浮液中分散到一個液體單元的兩個平行的上下面的下面的平板表面上(“三明治”幾何結(jié)構(gòu))，當這些粒子暴露于一個同源軸的磁場(方向垂直于基層平面)時將形成有序的組件。作為增加磁場強度的一個函數(shù)，對于本領(lǐng)域已知的生產(chǎn)方法所控制的粒子的設(shè)定的抗磁化率，可以形成有序的平面組件以及垂直定位于基層的線性串珠?？梢詫⒂谰么盆F設(shè)計為能產(chǎn)生出所需的磁場強度以實現(xiàn)所需的組件結(jié)構(gòu)。例如利用本領(lǐng)域已知的螺線型電導管或Helmholtz電磁體可以產(chǎn)生所需的磁場結(jié)構(gòu)；基層可以被引入進磁鐵內(nèi)腔或放置于非常接近于線圈的內(nèi)腔外的位置以保證磁場位置基本上是垂直于基層平面。利用本領(lǐng)域已知的方法通過用透磁合金圖案化基層可以生成空間調(diào)節(jié)的磁場。
實施例4隨機珠組件的形成將含有懸浮珠溶液的一樣份放置到平面硅基層的一些不同的位置上，該基層覆蓋有一層薄的氧化硅層(這里可以使用其他基層)。容許珠在重力下停放并形成隨機組件。為了描繪基層上的分隔的位置，使用了以下兩種方法的一種。根據(jù)第一種方法，將一種具有多個圓形1mm到2mm直徑孔的網(wǎng)格的硅墊圈(250μm厚度)(Grace Bio-labs，Bend，Oregon)放置于親水基層上以確定微孔(0.25μl到0.5μl體積)并用于多種分隔的珠懸浮液樣品。根據(jù)本發(fā)明的第二個方法，將含有珠(體積為0.2μl到0.5液體μl)的溶液的一小樣份直接放置到親水表面的一個或多個設(shè)定好的區(qū)域上，以保證形成獨立的液滴；在這種情況下不需要墊圈。當溶劑蒸發(fā)后(在室溫，或在提高的溫度(大約60℃)下快速干燥)，珠被留存于基層的隨機位置上。在這兩種方式形成的組件中都已經(jīng)測定了DNA多態(tài)性反應(yīng)。任選地，在重力下停放的珠可以被基層所具有的化學捕獲層所固定。實施例6中描述了使用隨機珠組件測定多元格式中的親和常數(shù)。
實施例5一種自動化的芯片級陣列的生產(chǎn)方法如圖11所示，本方法包括液體操縱以及將珠吸量到安裝于單芯片盒(single-chip cartridges)或多芯片盒(multi-chip cartridges)內(nèi)芯片上。利用實施例1、2或3中的方法形成珠陣列，之后為陣列固定和解碼。儲存所得到的解碼圖像和任選的芯片ID(“棒編碼”)一起用于稍后的應(yīng)用。
實施例6利用檢測后分析測定珠組件的親和常數(shù)細胞因子TNF-α和IL-6的定量結(jié)合曲線。通過使用懸浮液的化學編碼珠進行的三明治免疫測定法生成結(jié)合曲線，所述懸浮液可以被局限于一個或多個描繪于芯片上的反應(yīng)間隔中，或一個或多個脫離芯片的反應(yīng)間隔中。通過完成與保持于懸浮液的珠的反應(yīng)，可以獲得與同源檢測一樣的檢測動力學。在完成結(jié)合反應(yīng)之后，將珠組裝于芯片上可以進行多元定量圖像分析?？梢允褂酶鶕?jù)實施例4所制備的隨機組件或根據(jù)實施例1或2制備的有序的珠陣列。利用實施例1或2的方法生成的有序的、致密的組件的優(yōu)點是更高的空間密度以及通過處理更多數(shù)目的珠獲得的更高的檢測量。
作為圖解說明，圖12顯示了從隨機分布的珠中獲得的TNF-α和IL-6的定量結(jié)合曲線。在容許整合多框架的模式中使用了商品級的8比特視頻-CCD照相機(Cohu，San Diego，CA)。在兩個檢測中所使用的抗原的濃度范圍是為TNF-α 700fM到50pM以及IL-6 2pM到50pM。在每個濃度上，通過與結(jié)合有已知每珠的量的Cy5.5標記的BSA包被的校準珠的比較，估測每珠所結(jié)合的分子數(shù)目；進行必要的調(diào)整以補償標記的第二抗體和BSA之間的熒光量子效率的差異。
該分析格式可以測定親和常數(shù)，KA＝[LR]/([R0-LR][L])，其中依照物質(zhì)活動法則，[LR]表示每個珠的受體-配體對的數(shù)目以及[L]表示配體的溶液濃度。通過指定每ml的珠數(shù)目，nB，以及指定代表每珠的受體數(shù)目的[R0]值，計算出給定KA的理論結(jié)合曲線，將其與一組每珠的結(jié)合分子的數(shù)目進行比較并作為一個大體配體濃度的函數(shù)。通過測定每珠的平均熒光強度并將其參照于記錄于包含于陣列中的校準珠的熒光強度可以測定出給定的大體濃度的每珠所結(jié)合的配體的絕對數(shù)目。
將估計的每珠的結(jié)合分子的數(shù)目與來自于物質(zhì)作用法則的理論結(jié)合曲線進行比較。顯示的三個曲線相應(yīng)地對應(yīng)于1011/摩爾、1010/摩爾和109/摩爾的親和常數(shù)KA值。每珠的抗體的最初數(shù)目，R0等于2×105/珠以及nB＝105/ml。每個數(shù)據(jù)點代表三次重復試驗的平均值，且檢測對檢測之間的變異＜45％。將檢測敏感性設(shè)定到相應(yīng)于熒光水平，它在檢測圖像上產(chǎn)生了一個統(tǒng)一的信號對噪音水平，圖12中所描繪的細胞因子測定的敏感性設(shè)定為～2000結(jié)合配體/珠，對應(yīng)于相應(yīng)的檢測濃度TNF-α 700fM以及IL-6 2pM。
雖然商品化的ELISA試劑盒利用酶擴增增加了敏感性，但代價是增加了與檢測條件和控制所相關(guān)的復雜性，我們的陣列檢測格式，甚至沒有酶的擴增，我們的芯片上檢測格式可以監(jiān)測循環(huán)水平的細胞因子(血清正常TNF水平是50-280 fM以及血清正常IL-6水平是0-750 fM，www.apbiotech.com/technical/technical_index.html)，它所提供的動態(tài)范圍接近于標準方法的范圍，也就是擴增的單分析物ELISA檢測法(R & DSystems和Amersham的Assay kits)(不是最近的高敏檢測法)。進一步地改善硬件和軟件水平是有可能的。
實施例7通過多態(tài)性分析的基因分型為了說明用本發(fā)明實現(xiàn)基因分型，圖13顯示了陣列的設(shè)計，其中將五對對應(yīng)于基因中四個多態(tài)性區(qū)域的20聚體結(jié)合物結(jié)合于顏色編碼的珠。結(jié)合物對(pairs of binding agents)α1、α2以及β1、β2每個都在它們的相應(yīng)序列中具有單個核苷酸差異；δ3、δ4具有三個核苷酸差異，γ1、γ2、γ3、γ4組的結(jié)合物具有小的插入和缺失。將十個結(jié)合物分成兩個5個結(jié)合物的亞組，它們被結(jié)合于兩個子陣列。在本實施例中，每個類型都有數(shù)百個珠。在珠固定后，在TMAC緩沖液(2.25M四甲基氯化銨(tetramethylammonium chloride)，37mM Tris pH8.0，3mM EDTA pH8.0，以及0.15％SDS)55℃進行芯片上雜交反應(yīng)30分鐘。分析物是產(chǎn)自患者樣品的254堿基對的PCR片段，并在5’引物末端用BODIPY 630/650(Molecular Probes，Eugene，OR)熒光標記。在用純TMAC緩沖液替換檢測緩沖液后進行圖像采集。
圖14顯示了一個子陣列的解碼和檢測圖像。分析雜交后獲得的每個檢測圖像中所顯示的每個珠以測定熒光強度和珠類型，和細胞因子測定一樣，后面的操作利用模板匹配規(guī)則比較了檢測和解碼圖像。圖15顯示了每個珠類型的所獲得的強度直方圖，水平軸指的是從0到1的相對信號強度以及垂直軸指的是柱數(shù)目。直方圖顯示大多數(shù)具有探針α1的珠沒有結(jié)合分析物，而大多數(shù)具有探針α2的珠表現(xiàn)出強烈的結(jié)合。α2珠的平均信號水平超過α1珠的信號水平3.2個系數(shù)，這提示含有DNA序列的分析物互補于α2而不是α1。對于這里所出現(xiàn)的患者樣品，直方圖說明分析物DNA的基因分型的特點是互補于該基因多態(tài)性區(qū)域內(nèi)的結(jié)合物α2、β2、γ3和γ4。
實施例8基因表達分析cDNA片段本發(fā)明的方法已經(jīng)被應(yīng)用于制造由具有寡核苷酸以及DNA片段(例如最大長度到～1000個堿基對)組成的陣列。通過切口平移在多個位置將核苷酸鏈生物素化并將其連接到抗生蛋白鏈菌素功能化的珠(M-280，Dynal，Oslo，NO)上。利用800Hz的AC電壓在10Vpp進行檢測。
實施例9設(shè)計用于通用性標記的環(huán)形探針圖16中所設(shè)計的環(huán)形探針利用熒光能量轉(zhuǎn)移避免了標記靶點的需要。和分子信號(molecular beacon)的設(shè)計一樣(S.Tyagi，D.P.Bratu.F.R.Kramer，Nature Biotech.16，49-53(1998))，圖16中的探針具有在封閉環(huán)和開放環(huán)結(jié)構(gòu)的兩種不同的熒光狀態(tài)，但是與分子信號相反，它含有主干結(jié)構(gòu)內(nèi)的它的一樣份結(jié)合序列以容許在競爭性雜交檢測中進行嚴格的分子控制。
實施例10定量多元評價細胞因子的表達圖17顯示了一對在多元三明治免疫檢測中所記錄的單個隨機陣列的檢測和解碼圖像。將一個含有五種不同類型珠的陣列，每個珠帶有一個單克隆的抗細胞因子抗體(mAb)，暴露到含有兩種細胞抗原(Ag)的樣品溶液(例如血清)。隨后加入Cy5.5標記的第二種抗體(pAb*)形成三重復合物，mAb-Ag-pAb*。通過將300μl樣品以及7nM細胞因子檢測緩沖液(20mM NaPi，pH7.4，150mM NaCI，10mg/ml BSA)加入到固定于芯片的珠陣列中來進行芯片上免疫檢測，并容許在37℃進行反應(yīng)1個小時。加入12nM標記的第二抗體的檢測緩沖液溶液以替換緩沖液。在37℃孵育1個小時后，將空白緩沖液加入到芯片上并進行圖像采集。本檢測中所使用的抗體和抗原來自R & D Systems(Minneapolis，MN)；利用標準試劑盒(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)用Cy5.5標記第二抗體。
圖17B的解碼圖像顯示了五種類型珠，其偽色表現(xiàn)具有與圖10的珠的同樣的編碼形式。所有的珠都為相同的大小(5.5μm直徑)；解碼圖像中不同類型的珠的大小的外觀差異是一種假象，它反映了不同珠的內(nèi)在的染色水平以及在CCD記錄解碼圖像過程中的“霧化(blooming)”。將解碼圖像與圖14A中的檢測圖像進行比較(利用這里所闡述的圖像分析方法)發(fā)現(xiàn)黃色和亮綠色的活性珠相應(yīng)地捕獲了TNF-α和IL-6。該檢測方案已經(jīng)被擴展到以下的一組12種細胞因子的檢測IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、TGF-β1、IL-12、EGF、GM-CSF、M-CSF、MCP-1以及TNF-。芯片上免疫檢測除了在檢測步驟中替換試劑溶液外不需要其他的洗滌。檢測圖像和解碼圖像之間的比較顯示樣本中存在著兩種不同的細胞因子，也就是IL-6和TNF-α。在本實施例中預(yù)先形成的陣列也容許以類似于實施例6所描述的分析的方法測定親和常數(shù)。
實施例11用于評價蛋白的適體因為適體對血清蛋白的高結(jié)合親和力可以將適體從大的組合文庫中挑選出來(L.Gold，B.Polisky，O.Uhlenbeck，M.Yarus，Annu.Rev.Biochem.64763-797.(1995))。將適體所功能化的珠的隨機編碼陣列用于測定血清蛋白水平；陣列上的結(jié)合方式的關(guān)系(也見于實施例10)可以作為疾病狀態(tài)的一種表型。
實施例12DNA-蛋白的混合陣列與基因組功能性分析顯著相關(guān)的事實是本發(fā)明的方法提供了蛋白和DNA混合陣列，而不需要改變陣列制作的方法學。特別的，帶有DNA和相應(yīng)蛋白的珠所構(gòu)成的混合陣列可以被用于分析同一液體樣品中的基因和基因產(chǎn)物。
這已經(jīng)被用于進行對免疫監(jiān)測和DNA雜交的聯(lián)合檢測。例如，生成由用抗細胞因子單克隆抗體(mAb)和用寡核苷酸所功能化的珠所構(gòu)成的混合陣列。在單個芯片上進行兩個連續(xù)的檢測。首先，根據(jù)實施例10所描述的方案進行免疫測定。在完成芯片的免疫檢測后，采集圖像并將DNA分析物加入到雜交緩沖液中使其終濃度為20nM，且容許在37℃反應(yīng)1個小時。將空白雜交緩沖液加到芯片上并進行圖像采集以記錄附加的雜交檢測。
實施例13.親和力指紋與先前技術(shù)方法相關(guān)的對受體-配體相互作用的分析有著理想化的特異性。也就是說，理想狀態(tài)被認為是溶液中只存在單個配體與其匹配的受體相互作用，反之亦然。然而，在絕大多數(shù)多元檢測系統(tǒng)中，可以存在相當水平的交叉反應(yīng)性。也就是說，任何單個配體可以連接于一些受體，同時任何單一類型的受體對超過一個的配體可以有著一定的親和力。
本發(fā)明包括一種模型，該模型被發(fā)展用于分析多元READ檢測，對于這樣一個在以下假設(shè)下的體系用它們自己的親和常數(shù)描繪這些可逆的相互作用的每個相互作用；在大體種類之間不發(fā)生相互作用；在表面上形成的復合物之間沒有相互作用。這些假設(shè)可以是不被嚴格約束的，其代價是因為大體內(nèi)和表面種類之間的相互作用而增加了模型的復雜性。結(jié)合在每個珠表面上的多個反應(yīng)概括出了對于單個受體-配體對形成的標準的反應(yīng)-彌散公式[R.W.Glaser，Anal.Biochem.213，152-161(1993)]

公式(1)右側(cè)的第一個名詞代表了配體和受體結(jié)合成復合物的結(jié)合以及涉及表面上的自由位點的濃度。第二個名詞代表了復合物以釋放配體的方式的解離，因此釋放出受體位點以參與進一步的反應(yīng)。因為可以形成最大數(shù)目(i×j)的生物分子復合物，從所述公式生成的可以作為許多約束條件。對于平衡的情況，公式(1)的左手側(cè)被設(shè)定為零，以及共親和矩陣[Kij]＝Kon，ij/Koff，ij，然后可以被定義為說明容器內(nèi)或表面上的多個種類之間的交叉反應(yīng)。在平衡條件下的一批次反應(yīng)器中，我們可以解答不同公式的體系以得到每種類型的珠所結(jié)合的每個配體分子的數(shù)目。

作為圖解的實施例，計算了一標準組的兩種配體以及固定于兩個不同組珠的兩種類型受體的配體分布(從公式(1)的模型)。假設(shè)在標準組中每個配體-受體組合物的親和矩陣是已知的；為了檢測第三種配體，這里假設(shè)比較于非對角元件，2×2矩陣的對角元件[Kij]是大的。在有著兩種初始配體的反應(yīng)器中出現(xiàn)的第三種配體干擾了標準體系中各種復合物與反應(yīng)試劑之間的平衡，以及對于用熒光標記物標記的配體分子，從被干擾的體系中所觀察到的強度不同于從標準情況下所觀察的強度。
圖18A顯示了標準情況，其中濃度和共親和矩陣被設(shè)定為附表中所顯示的值。珠亮度被局限于0-255的線性尺度，后者代表了最亮珠的亮度。圖18A顯示了每個配體對珠的亮度分布。因為更低濃度的L1，珠1的亮度弱于珠2，基本上沒有檢測到交叉反應(yīng)。
下一步，用第三種配體干擾體系，L3濃度為1pM，并假設(shè)該新配體和每個受體都有著一定數(shù)量的交叉反應(yīng)；K3，1＝1×1011/M，K3，2＝1×1010/M。計算存在第三種配體時的每個珠的熒光強度產(chǎn)生了圖18A中的模式，它發(fā)現(xiàn)因為第三種配體增加了珠1的亮度，同時因為體系中更高濃度的L2以及L3對R2的更低親和力使得珠2的亮度沒有改變。因此在L3對其中一個受體有著相當高的親和力以及比較于競爭配體有著顯著數(shù)量的條件下可以測定L3。
在配體混合物被容許與排列于隨機編碼的珠陣列的多個受體相互作用的條件下對共親和矩陣的測定(以及和這里所闡述的理論模型的比較)提供了一種方法學，該方法學確定出多種配體和受體的相互的競爭性結(jié)合親和力的交叉關(guān)聯(lián)的特征性特點。這些共親和力提供了一種有利的手段，通過它們的親和指紋模式描繪受體-配體的結(jié)合公式。與很好設(shè)定的標準情況的偏差也容許測定溶液中的“干擾”配體。
實施例14.反應(yīng)動力學的多元分析如所述實施例所描述的一樣，通常不需要廣泛地洗滌就能將珠從溶液的背景熒光中區(qū)別開來。因此，可以以同源檢測格式記錄檢測圖像序列以進行結(jié)合反應(yīng)的評估以及測定每個發(fā)生的結(jié)合反應(yīng)的動力學數(shù)據(jù)?？梢栽诤唵蔚摹叭髦巍币后w筒中進行同源結(jié)合檢測，該檢測容許對珠陣列進行光學顯微鏡的照相以及將分析物溶液引入到含有隨機編碼的珠陣列的間隔中。更常見的，也可以在控制液體樣份的注射或持續(xù)流動的反應(yīng)物或緩沖液的條件下將陣列暴露于一個分析物或其他的反應(yīng)混合物。利用理論模型，可以確定出該珠陣列反應(yīng)器的相關(guān)操作控制參數(shù)的合理組合使得達到平衡的時間最小化或使得被陣列所捕獲的分析物部分最大化[K.Podual and M.Seul，TMKP-99/02]。利用任意一種可利用的泵原理可以控制流速。[M.Freemantle，C & EN，7727-36]。
列表-模擬檢測中所使用的參數(shù)(圖18)

在圖19中對圖像序列的分析可以從中獲得動力學數(shù)據(jù)，在所述的實施例所闡述的反應(yīng)-彌散動力學類型的理論模型的幫助下可以測定出ON-速度和OFF-速度。圖19A顯示了處于吸附-去吸附循環(huán)的階段，該循環(huán)包括溶液中所含的分析物以及固定于“三明治”反應(yīng)器皿底部的珠陣列。第一張圖描述了吸附過程的開始；第二張圖描述了絕大多數(shù)珠達到平衡時反應(yīng)器接近平衡的狀態(tài)；最后一張圖描述了在去吸附循環(huán)下反應(yīng)器的狀態(tài)，其中注射進無配體的溶液并將吸附的分子從珠表面去吸附。圖19B顯示了通過統(tǒng)計反應(yīng)-彌散體系的溶液獲得了單一類型的受體-配體反應(yīng)的單個受體-單個配體體系的吸附-去吸附動力學；顯示了兩種不同濃度配體的情況。在該模擬檢測中所使用的參數(shù)列于附表中。
與目前的技術(shù)方法[D.G.Myszka，Curr.Opin.Biotechnol.850-57.]不同，本發(fā)明依靠于成像并可以進行多元分析。另外，在實施例6中所介紹的檢測方法的通用模型可以分析多個同步受體-配體相互作用的復雜結(jié)合動力學的分析，甚至出現(xiàn)多個配體和受體之間的交叉反應(yīng)時。
以陣列格式監(jiān)測反應(yīng)動力學的能力使得能夠進行一些嘗試以增強復雜混合物中受體-配體或結(jié)合物-分析物相互作用的特異性。例如，可以進行溫度調(diào)控以增強DNA雜交反應(yīng)的特異性。同樣的，當陣列應(yīng)答被監(jiān)測時可以改變應(yīng)用于雜交反應(yīng)的條件的嚴格性，例如，可以在造成過度“非特異性”結(jié)合的條件下在雜交緩沖液中進行雜交；當監(jiān)測陣列應(yīng)答的時候，通過轉(zhuǎn)換到逐漸增加嚴格性的洗滌緩沖液能增加特異性。
實施例15.利用磁性粒子編碼陣列的多步檢測序列已經(jīng)描述了利用生化功能化的超順磁性粒子進行分子和細胞生物學中樣品制備以及進行各種酶催化的珠上反應(yīng)的方法和設(shè)備[″BiomagneticTechniques in Molecular Biology″，Technical Handbook，3rd Edition，1998，Dynal，Oslo，NO]。可以將這些以珠為基礎(chǔ)的方法和本發(fā)明的隨機編碼陣列檢測格式聯(lián)合用于進行多步芯片上檢測操作。
例如，圖20說明了利用具有多個間隔的單一芯片在小型化格式中對一系列多元基因分型步驟的整合。首先，利用功能化磁珠通過親和選擇從患者樣品中捕獲細胞，在第一個間隔中電或化學地裂解細胞，并利用非特異性結(jié)合將基因組DNA捕獲到多樣性磁珠的表面；下一步，用磁力將珠收集到第二個間隔中，第二個間隔和第一個間隔是液體相通的，在其中用所需的緩沖液洗滌珠和DNA；下一步，進一步將珠轉(zhuǎn)移到一個進行PCR的位置，該PCR利用珠結(jié)合的DNA作為模板；本領(lǐng)域已知的多步PCR方法可以應(yīng)用于本步驟(F.Fellmann，et.al.，Biotechniques，21766-770)；下一步，通過雜交將所釋放的PCR產(chǎn)物捕獲到預(yù)先組裝的具有結(jié)合物的隨機編碼陣列上，這些結(jié)合物特異于PCR擴增所靶向的不同的多樣性。
編碼磁性粒子和LEAPS光學編程的聯(lián)合應(yīng)用獲得了形成可逆固定的陣列以及在一定條件下進行可編程的多步檢測序列的能力，其中在最有利的懸浮液中使用珠，例如增加反應(yīng)動力學，以及最有利的實時形成的陣列，例如提供了用于圖像檢測以及陣列讀取的高度平行的格式。
例如，如同圖21所示，下面的cDNA珠陣列形成的步驟序列可以被整合于一個小型化的格式中。首先，將一個每個珠都具有一個基因特異性探針的編碼磁性珠庫導入到一個mRNA庫中，并且mRNA分子和它們相應(yīng)的珠進行雜交；下一步，用珠所結(jié)合的mRNA作為模板進行珠上的逆轉(zhuǎn)錄(RT)[E.Horenes，L.Korsnes，US 005759820]；下一步，從珠上釋放出mRNA；下一步，將珠導入到定制的芯片的表面并利用LEAPS形成cDNA珠陣列。這樣的一個陣列可以在使用另一組mRNA作為靶點的基因評價試驗中用作為呈遞結(jié)合物。同樣的，通過應(yīng)用標記的DNA結(jié)合物庫評價陣列內(nèi)相關(guān)基因可以分析cDNA陣列本身的表達。
實施例16.超順磁性氧化鐵γFe2O3(磁赤鐵礦)粒子的合成合成在由來源于Aldrich Chemical Co.，Milwaukee，WI的陰離子表面活性物質(zhì)丁二酸二辛酯磺酸納(bis(2-ethylhexyl)sodiumsulfosuccinate)(AOT)和異辛烷(Kommareddi et al.，Chem.Mater.1996，8，801-809)所組成的反向膠狀離子溶液中進行。在制備含有反應(yīng)物FeSO4(SigmaChemical Co.，St.Louis，MO)和NH4OH(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)的反向膠狀離子溶液中使用了0.5M AOT儲存液。特異地，將0.45ml0.9M FeSO4加入到5ml 0.5M AOT異辛烷溶液中，將0.45ml NH4OH分開地加入到5ml 0.5M AOT異辛烷溶液中。通過在大力攪拌下將NH4OH反向膠狀離子溶液加入到FeSO4反向膠狀離子溶液觸發(fā)了反應(yīng)。反應(yīng)進行2-3個小時，然后在40℃蒸發(fā)溶劑得到干燥的表面活性物的氧化鐵組合物。將該組合物重新分散于所選擇的有機溶劑中得到一深紅色的透明溶液。
實施例16a.具有功能化位點的磁性納米粒子的合成本實施例說明了磁性納米粒子上功能化位點的合成。將表面活性物質(zhì)溶解于油中以得到反向膠狀離子溶液，該溶液被用于合成實施例16的磁性納米粒子。將獲得的反應(yīng)混合物干燥得到干的表面活性物質(zhì)，之后將其重新分散于所選擇的油中。加入單體、和或預(yù)先形成的聚合物、交聯(lián)劑以及引發(fā)劑的水溶液。將混合物進行聚合步驟并干燥所聚合的反應(yīng)產(chǎn)物。將干物質(zhì)分散到水的緩沖液中；該方法可以與READ聯(lián)合使用以實現(xiàn)多步芯片上檢測操作。
實施例16b.生物分子的結(jié)合本實施例說明了一種生物分子與本發(fā)明的磁性納米粒子的結(jié)合。通過將某些分子結(jié)合到磁性納米粒子的功能性位點上可以將實施例16a的磁性納米粒子進一步地功能化以進行相關(guān)檢測，這些分子例如DNA(寡核苷酸)或RNA判斷、肽或蛋白、適體和小的有機分子。利用本領(lǐng)域已知的方法可以進行這些分子的結(jié)合，例如，利用一個或一些結(jié)合反應(yīng)(見例如G.T.Hermanson，Bioconjugate Techniques(Academic Press，1996)；L.Illum，P.D.E.Jones，Methods in Enzymology 112，67-84(1985))。相關(guān)分子與功能性位點的連接通常需要一步或兩步反應(yīng)，利用標準的液體操縱機器人以及96孔格式可以平行地進行這些反應(yīng)使得任何一個分子共價地結(jié)合到磁性納米粒子的功能性位點上。
特異地，本實施例說明了一種利用確立的碳化二亞胺(carbodiimide)化學將探針(例如一種蛋白)連接到本發(fā)明的磁性納米粒子的功能性位點的方法。在2ml小瓶中，將含有10mg羧酸功能化的磁性納米粒子和1ml 10mM硼酸緩沖液(pH＝8.5)混合。然后用永久磁鐵分離器磁性分離所得到的粒子并吸除上清。在0.1M MES緩沖液(pH＝4.5)中洗滌分離到的粒子兩次(利用和所述的相同的方案)并最終重懸于600μl同一種緩沖液中。在另外一個小瓶中，將3mg中性鏈親和素(生物素結(jié)合蛋白，PierceChemicals，Rockford，IL)溶解于300μl MES緩沖液中，將該溶液緩慢地加入到磁性粒子懸浮液中。超聲降解后，加入EDAC(1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide))(Aldrich-Sigma，Milwaukee，WI)溶液(200mg/ml)。該混合物在室溫下反應(yīng)2個小時，之后將得到的磁性納米粒子磁性分離，用結(jié)合緩沖液洗滌一次，硼酸緩沖液洗滌兩次，重懸并在2-8℃儲存于儲存緩沖液(PBS pH＝7.4，0.1％(w/v)BSA，0.5％(w/v)Tween 20，10mM EDTA和0.02％(w/v)NaN3)中。
實施例16c.組合粒子的制備本實施例舉例說明了編碼磁性粒子的生產(chǎn)。用實施例16b的磁性納米粒子和編碼粒子相互反應(yīng)。在更常見的實施方案中，也可以使用超順磁聚合物納米粒子(例如哪些來自MACS微珠，Miletnyi Biotech Inc，Aubum，CA；捕獲鐵磁流體粒子，Molecular Probes，Eugene，OR；Nanomag粒子，Micromod，Rostock，Germany)。
圖23舉例說明了一個12種類型的編碼磁性粒子的子文庫。利用具有甲苯磺酰基的直徑3.2μm的交聯(lián)聚苯乙烯粒子(Bangs Labs，F(xiàn)ishers，IN)以及兩種每個都是通過膨脹以及大體染色而導入的疏水焦甲烷染料合成編碼粒子。分別地導入染料以得到四種強度水平，并按四種極小的摩爾比例混合。之后，將100μl 1％有色Latex(PBS中)溶液與100μl或200μl捕獲鐵磁流體(抗生蛋白鏈菌素共扼物，200nm直徑，按所提供的用法使用)(Molecular Probes，Eugene，OR)或100μl右旋糖苷包被的Nanomag混合。按所提供的用法使用130nm直徑的抗生蛋白鏈菌素功能化的磁性粒子(Nanomag粒子，Micromod，Rostock，Germany)。用磷酸緩沖液pH7.8將總的反應(yīng)物體積達到500μl并且將結(jié)合反應(yīng)物反應(yīng)過夜。磁性分離所得到的粒子，洗滌1次，重懸并在2-8℃儲存于儲存緩沖液(PBS pH＝7.4，0.1％(w/v)BSA，0.5％(w/v)Tween 20，10mM EDTA和0.02％(w/v)NaN3)中。
實施例16d.對金屬氧化物含量的控制本實施例舉例說明了通過控制金屬氧化物含量賦予本發(fā)明的編碼磁性粒子磁性力矩的方法。通過變化能結(jié)合于編碼粒子表面的磁性納米粒子的數(shù)目可以實現(xiàn)本方法。為了方便監(jiān)測，用一種熒光素金納米粒子抗生蛋白鏈菌素共扼物(來自Nanoprobes，Yaphank，NY)熒光素金替代磁性納米粒子來監(jiān)測粒子的數(shù)目。反應(yīng)物含有～0.08mg/ml抗生蛋白鏈菌素并被用作為接受劑。
在本實施例中，將0.5mg生物素功能化的3.36μm直徑的聚苯乙烯珠(Spherotech，Libertyville，IL)懸浮于500μl含有0.1％BSA的20mM磷酸緩沖的pH7.4的鹽水(150mM)中。將各種數(shù)目的熒光金試劑加入到珠溶液中，在室溫下進行抗生蛋白鏈菌素-生物素結(jié)合反應(yīng)1個小時。之后，離心分離微粒并去除上清。圖24顯示了結(jié)合于表面的粒子的熒光強度作為添加的熒光金試劑數(shù)量的函數(shù)。
實施例17.熒光染色的及磁性聚合物珠組合物的合成利用將干的磁性組合物和染料重分散于所選擇的溶劑中制成了疏水性熒光染料和氧化鐵粒子的儲存溶液，所選的溶劑例如CH2Cl3(AldrichChemical Co.，Milwaukee，WI)或CH2Cl2/CH3OH混合物(70/30(v/v))(Aldrich Chemical Co.，Milwaukee，WI)。在甲醇(3x)中充分洗滌預(yù)先設(shè)定量的聚合物珠，然后蒸發(fā)干燥。通過在有機溶劑/納米粒子/染料混合物中膨脹珠達到熒光染料和氧化鐵納米粒子的同步結(jié)合。膨脹過程在大約1個小時內(nèi)完成。之后，離心分離聚合物珠并用甲醇(3x)洗滌，之后用異辛烷(2x)以及然后用甲醇(2x)洗滌，最后重新分散于0.2％SDS-DI水溶液中。
實施例18.通過應(yīng)用磁場形成陣列當本發(fā)明的組合粒子暴露于同源軸向磁場(垂直定位于基層平面)時，組合粒子可以以2D陣列格式排列。作為一個依賴于組合粒子的順磁化率的逐漸增加的磁場強度的一個功能，可以形成平面組件?？梢詫⒂谰么盆F設(shè)計為能產(chǎn)生出所需的磁場強度以實現(xiàn)所需的組件結(jié)構(gòu)。利用本領(lǐng)域已知的螺線型電導管或Helmholtz結(jié)構(gòu)可以產(chǎn)生所需的磁場結(jié)構(gòu)；基層可以被引入進磁鐵內(nèi)腔或放置于非常接近于線圈的內(nèi)腔外的位置以保證磁場位置基本上是垂直于基層平面。利用本領(lǐng)域已知的方法通過用透磁合金圖案化基層可以生成空間調(diào)節(jié)的磁場。
在本實施例中，按在此描述的合成其中編碼粒子為3.2微米、6.9微米和10.9微米的三種不同大小的組合粒子。和預(yù)期的一樣，組合粒子的磁化率隨粒子大小的增加而增加。
圖25顯示了暴露于利用永久磁鐵生成的大約1000高斯的磁場的3.2微米組合粒子的2D幾何結(jié)構(gòu)。
實施例19.二維膠狀陣列磁性“Wigner”晶體的形成本實施例舉例說明了操作本發(fā)明的組合粒子的能力。對超順磁粒子懸浮液例如超順磁寡(dT)25微粒(Dynal，Lake Success，NY)的操作提供了實例。通過混合0.01mM鹽水中濃度為5×107珠/ml的粒子形成這些粒子的懸浮液，該鹽水中含有作為穩(wěn)定劑的0.05％triton-X100(Sigma-Aldrich，Milwaukee，WI)。粒子的磁化是完全可逆的，以及在低磁場強度時，它按有效的容積磁化率(＝0.192)與外在磁場成比例。將100μm厚度的相鄰空間所分隔的用一個硅電極和一個ITO包被的玻璃電極所構(gòu)成的三明治單元中的懸浮液放置于顯微鏡載物臺上。用放置于三明治單元下方的銅線圈在樣品上產(chǎn)生一個完全統(tǒng)一的磁場。在應(yīng)用磁場后，用連接于VCR的CCD照相機記錄對懸浮液結(jié)構(gòu)的測定并將圖像數(shù)字化以進行進一步分析。圖26顯示了試驗裝置以及圖27顯示了一系列說明2維磁性陣列形成的快照。
當應(yīng)用一個磁場時，粒子要求磁場力矩m＝4/3πa3μ0χH，其中a為粒子半徑，μ0為真空磁性穿透性，而H為外在磁場。
實施例20.利用熒光磁性微粒進行的抗生蛋白鏈菌素-生物素檢測在本實施例中，將100μl已經(jīng)被按實施例16c的描述用中性鏈親和素所功能化的本發(fā)明的組合粒子懸浮液(1％)加入到1.5ml小瓶中并用900μl PBS以及0.1％(w/v)Tween-20(PBST)將懸浮液稀釋。漩渦混合本發(fā)明的組合粒子，然后磁性分離并去除上清。將沉渣重懸于980μl PBS以及20μl濃度為26.7ng/ml的生物素-寡(dT)-Cy5.5(IDT，Coralville，IA)。在室溫下孵育混合物30分鐘。在此之后，磁性地分離本發(fā)明的粒子并在PBST中洗滌2x，以及重懸于1ml PBST中。然后將本發(fā)明的粒子組裝于芯片上，利用先前描述的方法測定它們表面的熒光。結(jié)果顯示于圖28中。為了進行比較的目的，利用在本實施例中所描述的方法，缺乏本發(fā)明的磁性納米粒子但共價結(jié)合于中性鏈親和素的本發(fā)明的編碼粒子也可以作用于生物素化的探針。
實施例21.靶分子的芯片上雜交本實施例涉及靶分子對固定于本發(fā)明的組合粒子的寡核苷酸探針的芯片雜交。首先將具有已知堿基序列的生物素化的寡核苷酸結(jié)合到給定類型的顏色編碼的組合粒子上，該粒子的表面已經(jīng)用中性鏈親和素預(yù)先包被。結(jié)合反應(yīng)在0.1ml結(jié)合緩沖液(150mM NaCl，0.05mM乙二胺四乙酸(EDTA)，0.5％牛血清白蛋白，0.5mM Tris-HCl，以及100mM磷酸鈉，pH7.2)以及0.4μM生物素化寡核苷酸，以及將近6.7×105個粒子中進行。在室溫下漩渦孵育結(jié)合反應(yīng)混合物30分鐘。在完成結(jié)合反應(yīng)后，離心收集粒子。利用150mM NaCl和100mM磷酸鈉，pH7.2以及0.05％Tween-20中的0.1％生物素阻斷表面上未反應(yīng)的Neutriavidin位點。在室溫下漩渦進行阻斷反應(yīng)20分鐘。阻斷后，用0.2ml 150mM NaCl和100mM磷酸鈉，pH7.2以及0.05％Tween-20洗滌粒子。所述方法可以用于將任何相關(guān)的生物素化的寡核苷酸結(jié)合到本發(fā)明的不同類型的中性鏈親和素包被的粒子。
將已知序列的生物素化的寡核苷酸結(jié)合到本發(fā)明的一些類型的色彩編碼的粒子并將這些粒子組合到試管中用于硅芯片上的陣列組裝。然后將形成的陣列用于肽核酸(PNA)低聚體對預(yù)先結(jié)合于本發(fā)明微粒的特異性互補寡核苷酸的芯片雜交。具體的，在30μl雜交溶液(90mM NaCl，83mM硫氰酸胍，8mM MgCl2，17nM EDTA，0.02％生物素，0.1％Tween-20，70mM mM Tris-HCI，pH7.5)以及218nM生物素化PNA低聚體中進行雜交。將雜交混合物中的陣列在40℃孵育60分鐘。在完成雜交后，用50μl的250mM NaCl，10mM Tris-HCI，pH7.5，0.1％Tween-20在室溫下洗滌陣列10分鐘。為了檢測雜交于本發(fā)明的組合粒子上的生物素化的PNA低聚體，將陣列與150mM NaCl和100mM磷酸鈉，pH7.2中的Cy5.5結(jié)合的抗生蛋白鏈菌素(18μg/ml)在室溫下反應(yīng)30分鐘。用15mMNaCl，10mM Tris-HCl，pH7.5洗滌后，用熒光顯微鏡檢查陣列。利用具有特定波長的光學濾片測定從本發(fā)明的粒子以及Cy5.5標記的PNA低聚體發(fā)射出的熒光。根據(jù)粒子的顏色碼解碼本發(fā)明的粒子。利用計算機程序(READ)測定特殊粒子所發(fā)射的Cy5.5熒光。將無磁性特征的顏色編碼的粒子用作為本檢測中的對照。圖29所示的檢測結(jié)果說明PNA特異地雜交到結(jié)合于組合粒子的互補寡核苷酸。在芯片雜交檢測中，從來自兩個陣列(芯片A和B，相應(yīng)的為圖A和B)的四種類型的本發(fā)明的粒子(I、II、III和IV)測定出熒光信號強度。I型粒子是本發(fā)明的組合粒子，而II、III和IV型為本發(fā)明的三種不同類型的編碼粒子。I和II型是用生物素化的互補于PNA低聚體的寡核苷酸功能化的編碼粒子。III型是用具有與PNA非相關(guān)堿基序列的寡核苷酸功能化的編碼粒子。IV型編碼粒子表面無寡核苷酸。芯片B用作為芯片A的陰性對照，將芯片B與無靶PNA的雜交混合物一起孵育。標記“n”表示每種類型的粒子數(shù)目以及條代表平均值的標準差。
實施例22.利用熒光磁性微粒進行免疫檢測在本實施例中，將本發(fā)明的組合粒子用于進行免疫檢測。本發(fā)明的組合粒子可以被定制為在其表面具有相關(guān)的抗體?？梢詫⒈景l(fā)明的組合粒子的陣列暴露于含有相關(guān)抗原的樣品溶液(例如血清溶液)。隨后加入的熒光標記的第二抗體使得形成了三重熒光復合物，利用本發(fā)明所闡述的方法通過記錄組合粒子表面的熒光可以監(jiān)測復合物濃度。本發(fā)明的抗體功能化的組合粒子的陣列因此可以被用于監(jiān)測血清蛋白水平，以及相關(guān)抗原的結(jié)合形式可以被用于蛋白測定。
實施例23.選擇I磁場誘導的陣列形成本實施例舉例說明了圖22的操作以及從mRNA分子的序列特異性捕獲到具有cDNA的EFM珠陣列的形成的一系列反應(yīng)步驟。這樣一個陣列對于許多應(yīng)用都是有用的。例如，在基因測定中，一個平面cDNA陣列可用于測定cDNA濃度；同樣的，用標記的DNA結(jié)合物或探針庫可以直接探查cDNA陣列以測定陣列內(nèi)相關(guān)的基因。在溫度控制裝置中進行的方案包括以下步驟(1)將一組本發(fā)明的組合粒子引入到含有mRNA分子庫的第一個間隔中，每種類型的粒子都具有一個基因特異性的寡核苷酸探針；mRNA分子可以退火于它們的相應(yīng)的探針。該捕獲步驟的檢測條件是本領(lǐng)域已知的并在此是適用的；(2)將粒子所結(jié)合的mRNA作為模板進行粒子上的逆轉(zhuǎn)錄(RT)并從粒子上釋放出mRNA；(3)應(yīng)用來自永久磁鐵的磁場并保持住粒子時進行洗滌；(4)釋放磁場并將粒子重懸于緩沖液中以進行LEAPS操作；(5)指導粒子進入到含有定制的芯片的間隔中并利用LEAPS形成本發(fā)明的組合粒子的平面陣列。
實施例24.選擇II磁場誘導的陣列形成本實施例舉例說明了圖22的操作以及從mRNA分子的序列特異性捕獲到具有eDNA的EFM珠陣列的形成的一系列反應(yīng)步驟。使用在實施例21中所設(shè)定的方案除了通過使用磁場形成本發(fā)明的組合粒子的平面陣列，以及磁場的使用以及實施例21的步驟(4)和(5)被刪除。實施例25.利用編碼磁性珠的陣列進行的多步檢測序列本實施例舉例說明了一個多步生化反應(yīng)方案，它整合了第一組磁性納米粒子對基因組DNA片段的捕獲，以及隨后根據(jù)圖22描述的常用方法進行的捕獲的“粒子標記的”片段的磁性分離和固相擴增。該捕獲步驟后緊跟的是同步的“多元”PCR擴增的轉(zhuǎn)換步驟，每個反應(yīng)含有一小組引物對以生成溶液中的擴增產(chǎn)物(amplicons)。收集并將這些擴增產(chǎn)物放置到與一組本發(fā)明的組合粒子接觸以進行磁場應(yīng)用所介導的轉(zhuǎn)換后的多元分析。
所述的方法可以通過以下步驟完成1.樣品捕獲和首次轉(zhuǎn)換將給定的含有基因組DNA片段的溶液分成四個相等的部分，并將它們注射到四個分開的反應(yīng)間隔中，其配置為可以允許根據(jù)標準的PCR溫度循環(huán)方案調(diào)溫和控制。將一種或多種磁性納米粒子標記的引物注射到每個間隔中。粒子標記的引物由具有直接對抗于一個相關(guān)的基因組DNA靶片段的寡核苷酸探針的磁性納米粒子構(gòu)成，所述探針也作為隨后聚合酶催化的引物延伸反應(yīng)的第一個引物。下一個步驟容許通過將所選擇的片段雜交于與之匹配的具有探針的粒子上進行捕獲，所述靶點作為隨后延伸反應(yīng)的模板。往每個間隔中加入聚合酶以及所需要的一種或多種第二引物以容許在溫度循環(huán)下在所有的間隔中同時進行模板介導的粒子結(jié)合的捕獲探針的延伸，因此生成了第一個延伸產(chǎn)物，且錨定于磁性納米粒子上。應(yīng)用磁場以在每個間隔內(nèi)形成磁性納米粒子的平面陣列。當保持有粒子錨定的延伸產(chǎn)物時洗滌間隔。
下面是利用粒子標記的引物擴增基因組DNA片段的常用的PCR方案。設(shè)計了對應(yīng)于相關(guān)片段內(nèi)的特異性靶點的寡核苷酸探針，探針的可變的3’末端排列于靶點或接近靶點處。合成的探針包含有5’生物素-TEG以及12C間隔。根據(jù)例如如下的標準的反應(yīng)方案將探針連接到抗生蛋白鏈菌素包被的磁性珠上在室溫下將探針加入到1×TE(100mM Tris-HCl，10mM EDTA)以及500mM NaCl的磁珠懸浮液中45分鐘。用1×TE洗滌珠，用150mM NaCl洗滌3x并懸浮于50μl同種溶液中。下一步，將1μl每種珠懸浮液加入到含有1x緩沖液(100m MTris-HCl，pH9.0，1.5mM氯化鎂，500mM KCl)，40M Cy5標記的dCTP(Amersham PharmaciaBiotechNJ)，以及80μM其他三種dNTP，和3單位Taq DNA聚合酶(Amersham Pharmacia Biotech NJ)的PCR混合物中。在剛剛開始延伸之前將基因組DNA靶片段(40ng)加入到PCR混合物中。在這些條件下，利用Perkin Elmer9600熱循環(huán)器進行的十個循環(huán)的擴增足夠產(chǎn)生有效的珠錨定的延伸產(chǎn)物，溫度循環(huán)包括變性(90℃，30s)、退火(55℃，30s)以及延伸(72℃，20s)。在完成延伸反應(yīng)后，通常用1×TE緩沖液離心洗滌珠四次。
2.第二次擴增的同步操作將聚合酶以及一組一種或多種設(shè)計為對應(yīng)于粒子錨定的第一次延伸產(chǎn)物內(nèi)的選擇區(qū)域的引物對注射到每個反應(yīng)間隔中，每個間隔接受一組獨特的引物對。容許發(fā)生在溫度循環(huán)下的珠錨定片段的同步擴增，因此在每個間隔中，生成了一組加入到間隔中的相應(yīng)引物所指導的特異的擴增子。本步驟中使用了標準PCR反應(yīng)方案(REF)。
3.反應(yīng)產(chǎn)物的收集、檢測后陣列的組裝和檢測組合含有擴增子的溶液以生成分析物溶液并將其轉(zhuǎn)移到檢測間隔中，以及放置到與一組本發(fā)明的編碼的磁性的納米粒子接觸，每個粒子帶有序列特異性的寡核苷酸探針，該探針獨特地指向于分析物溶液中的一個擴增子。容許發(fā)生擴增子與具有探針的珠的退火形成雜交復合物，并利用所選擇的方法分析所選擇的靶序列的區(qū)域，例如雜交復合物的不同的熱穩(wěn)定性或探針延長。應(yīng)用磁場以形成本發(fā)明粒子的平面陣列。記錄檢測圖像信號。記錄解碼圖像以解碼捕獲探針的特征。
應(yīng)用于本步驟的用于多態(tài)性分析的標準檢測條件也提供了形成編碼的功能化的磁性珠的平面陣列的條件，在此聯(lián)合于實施例NN和圖MM(SBEFM珠陣列，由永久磁鐵誘導)舉例說明了這些條件。
實施例26.混合簇和陣列本實施例舉例說明了一種檢測格式，其中將靶DNA鏈連接于本發(fā)明的磁性納米粒子。利用本領(lǐng)域已知的標準的生物結(jié)合化學方案可以輕易地完成化學連接。例如，DNA鏈被輕易地生物素化以及然后可以被連接到抗生蛋白鏈菌素所包被的磁性納米粒子。同樣的，如實施例21中所討論的，利用珠標記的引物通過PCR生成了帶有DNA鏈的粒子。利用這里所提供的方法生成了一組必不可少的本發(fā)明的編碼粒子。利用本領(lǐng)域已知的生物結(jié)合化學的標準方法用特異的寡核苷酸探針將粒子功能化。在檢測過程中，作為形成結(jié)合配體之間的復合物的結(jié)果，形成了由磁性納米粒子和編碼粒子形成的異源結(jié)構(gòu)，并且這些復合物被組裝成平面陣列用于檢測。
這里提出了兩種可供選擇的方案。在第一個可選擇的方案中，光學編碼的珠的大小通常明顯地超過了磁性珠的大小，相應(yīng)半徑的常見比例是100∶1；如同在此以及實施例22所討論的，100直徑的抗生蛋白鏈菌素包被的磁性納米粒子是商品化可獲得的。下一步，在容許匹配的磁性珠標記的靶鏈與探針雜交的條件下，將具有DNA靶鏈的磁性珠的混合物與一組色彩編碼的具有寡核苷酸探針的珠混合。將用大量的磁性納米粒子“裝飾”每個顏色編碼的珠以生成一個磁性外殼并生成雜交混合物，造成這里所討論的結(jié)構(gòu)和組合粒子的形成。
根據(jù)本發(fā)明的方法使用磁場將生成本發(fā)明的編碼和磁性納米粒子的平面陣列，并容許記錄多色的熒光圖像以識別捕獲的目標DNA。同樣的，可以選擇檢測條件以優(yōu)化簇的形成。也就是說，本發(fā)明的磁性納米粒子作用為多齒的“配體”并介導本發(fā)明的編碼粒子“聚集”成本發(fā)明的編碼的和磁性的粒子的簇。使用通常產(chǎn)生超過1000高斯磁力的強磁場可以將這些簇從溶液中分離成擴展的孤立簇的組件。
在第二個可選擇的方案中，本發(fā)明的磁性和編碼粒子的作用以及相對大小被顛倒，以致更大的磁性納米粒子被編碼粒子所裝飾。根據(jù)實施例19所設(shè)定的條件應(yīng)用磁場，(Dynal珠-螺線管)在此生成了一個磁性納米粒子的平面陣列，其中每個粒子具有一個光學信號或不具有光學信號，這依賴于粒子是否已經(jīng)被賦予了一種光學標記物。
本實施例的這兩個可選擇的方案都要求讀取多個光學信號以識別捕獲的目標。當通過應(yīng)用常為兩種或三種的少量的編碼顏色得到光學編碼的粒子，以及根據(jù)本領(lǐng)域以致的標準方法得到的這些編碼顏色比例的差異時，利用本領(lǐng)域已知的多個濾片裝置通過標準的多色彩熒光成像容易得到多色彩圖像。另外，如果將多種不同色彩的組合用于生成顏色碼，那么通常用多光譜成像方法記錄檢測圖像。
權(quán)利要求
1.一種用于生成編碼的磁性粒子文庫的方法，包括以下步驟a.生成第一個磁性納米粒子的子文庫，b.生成第二個編碼粒子的子文庫，c.在所述第一個子文庫所包含的磁性納米粒子上提供一種結(jié)合位點，d.將所述第一個子文庫和第二個子文庫接觸使得所述磁性納米粒子共價結(jié)合于所述的編碼粒子以形成所述文庫，以及e.在所述文庫所包含的編碼的磁性粒子上提供一種功能性位點。
2.一種用于生成編碼的磁性粒子文庫的方法，包括以下步驟a.生成第一個磁性納米粒子的子文庫，b.生成第二個編碼粒子的子文庫，c.在所述第一個子文庫所包含的磁性納米粒子上提供一種結(jié)合位點，d.在所述第一個子文庫所包含的磁性納米粒子上提供一種功能性位點，以及e.將所述第一個子文庫和第二個子文庫接觸使得所述磁性納米粒子共價結(jié)合于所述的編碼粒子以形成所述文庫。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述編碼粒子由一種光學標記物進行編碼。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2的方法生成的編碼的磁性粒子的文庫。
5.權(quán)利要求4的編碼的磁性粒子的文庫，其具有的化學多樣性大于2。
6.權(quán)利要求5的編碼的磁性粒子的文庫，其在一種基層的指定區(qū)域以平面組件的形式排列于所述基層上。
7.一種檢測分析物和結(jié)合物之間的結(jié)合相互作用的方法，包括以下步驟(a)提供一群包含附著的分析物的磁性納米粒子；(b)提供一群包含附著的結(jié)合物的編碼粒子；(c)在容許所述分析物和結(jié)合物結(jié)合的條件下混合所述磁性納米粒子和編碼粒子以形成它們的包含附著的磁性納米粒子和編碼粒子的復合物；以及(d)檢測所述分析物和結(jié)合物之間的結(jié)合。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述分析物包含配體而所述結(jié)合物包含配體受體。
9.權(quán)利要求7的方法，其中所述結(jié)合物包含配體而所述分析物包含配體受體。
10.權(quán)利要求7的方法，其中所述分析物包含DNA而所述結(jié)合物包含寡核苷酸。
11.權(quán)利要求7的方法，其中所述結(jié)合物包含寡核苷酸而所述分析物包含DNA。
12.權(quán)利要求7到11中任一項的方法，進一步包含給包含所述附著的磁性納米粒子和編碼粒子的所述復合物施加磁場。
13.權(quán)利要求12的方法，其中通過施加所述磁場將所述復合物組裝成用于檢測的平面陣列。
14.權(quán)利要求12的方法，其中通過施加所述磁場將所述復合物的簇分隔為一個擴展的獨立的簇的組件。
15.權(quán)利要求7到14中任一項的方法，其中所述編碼粒子由一種光學標記物進行編碼。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述編碼粒子是熒光編碼的。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于通過生成新的磁性納米粒子以及編碼粒子的子文庫而從子文庫生成新的編碼的磁性粒子的文庫的方法。這些按需功能化的子文庫可用于形成陣列。本發(fā)明特別適用于進行定性和/或定量分析樣品中大量的分析物分子的結(jié)合相互作用的多元(平行)檢測。
文檔編號G01N33/53GK1636136SQ02828382
公開日2005年7月6日 申請日期2002年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2001年12月28日
發(fā)明者蘇坎塔·班納吉, 邁克爾·佐伊爾 申請人:生物芯片溶液有限公司