專利名稱：穩(wěn)定血液、血清或血漿樣品的方法以及包含pH緩沖劑的容器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及穩(wěn)定血液、血清或血漿樣品的方法，換句話說(shuō)，本發(fā)明涉及防止血液、血清或血漿中的成分變質(zhì)的方法以及用于該方法的容器。本發(fā)明可用于臨床診斷測(cè)試、臨床研究和基礎(chǔ)研究領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
在各種臨床診斷測(cè)試、臨床研究和基礎(chǔ)研究中廣泛進(jìn)行血液成分的分析。通常從個(gè)體的血液制備血清或血漿，并分析其中包含的各種成分。在這些分析中，重要的是那些各種成分在分析前保持穩(wěn)定并且分析結(jié)果正確反映了個(gè)體的體內(nèi)情況。
歐洲專利公開號(hào)0359201公開了穩(wěn)定血液凝結(jié)(或凝固)因子的方法。在該方法中，將甘氨酰甘氨酸或甘氨酰甘氨酰甘氨酸或二者同時(shí)加入到血液或血漿中。日本專利早期公開8-224227公開了封閉在管中的包含氨基羧酸和Good’s緩沖劑的血液收集管。氨基羧酸和Good’s緩沖劑有利于穩(wěn)定血液凝固因子。因此，已提出了用于臨床診斷測(cè)試的穩(wěn)定血液凝固因子的方法。然而，還沒(méi)有一種已知的能穩(wěn)定所有或大部分血液成分的方法。而且，也沒(méi)有一種已知的能穩(wěn)定所有或大部分血清或血漿成分的方法。
在上述情況下，通常采取對(duì)新鮮血液、血清或血漿樣品進(jìn)行分析。如果需要短時(shí)間儲(chǔ)存血液、血清或血漿，則在4℃下冷藏。如果需要長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存血液，則在采血后立即將血液冷凍，然后運(yùn)輸，并在用于分析前才解凍。如果需要更長(zhǎng)時(shí)間地儲(chǔ)存血清或血漿，則在從血液中制備出血清或血漿后立即冷凍，然后運(yùn)輸，并在用于分析前才解凍。
盡管在4℃下冷藏很方便，但通常認(rèn)為血清或血漿即使儲(chǔ)存在4℃下長(zhǎng)時(shí)間后也會(huì)降解。另外，在臨床參照實(shí)驗(yàn)室目錄中，對(duì)于大部分測(cè)試項(xiàng)目，也要求或推薦將樣品冷凍。僅對(duì)于少數(shù)幾個(gè)測(cè)試項(xiàng)目而言，在低溫(4℃)或室溫(環(huán)境溫度)下儲(chǔ)存樣品是可接受的。
在采血后立即冷凍血液、或在制備血清或血漿后立即將其冷凍并在使用前一直保持其處于冷凍狀態(tài)，這要求對(duì)其冷凍和儲(chǔ)存期間的溫度控制要非常謹(jǐn)填。而且要精確控制血清或血漿在其解凍后的溫度(例如將其置于冰上)，或在解凍后立即分析。因此，該方法不方便。
近年來(lái)，對(duì)某些測(cè)試項(xiàng)目而言，也計(jì)劃設(shè)立將樣品郵寄到臨床參照實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分析的體系。在這種體系中，非常難于將樣品保持在低溫或冷凍狀態(tài)。因此，該體系中的樣品在運(yùn)輸過(guò)程中就會(huì)變質(zhì)。這是因?yàn)闃悠酚锌赡荛L(zhǎng)時(shí)間置于室溫下和/或靠近樣品的冷隔離物會(huì)變暖，由此樣品的溫度可升高。這是很麻煩的。
本發(fā)明的目的是提供通過(guò)穩(wěn)定血液中的成分能夠準(zhǔn)確分析這些成分的方便方法，以及用于該方法的容器。
發(fā)明概述本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，用于臨床診斷測(cè)試或研究材料的血液、血清或血漿樣品，在采血或制備血清或血漿后因反映出生物體內(nèi)的況狀而具有中性pH(即pH值)，然而發(fā)現(xiàn)當(dāng)它們長(zhǎng)時(shí)間貯存、置于室溫下或加熱后，其pH值卻出人意料地升高到堿性pH。更具體的說(shuō)，樣品的pH值開始在pH7.4附近，然后迅速升高到約pH9的堿性pH。而且，當(dāng)樣品的體積小時(shí)，其pH顯著升高。
本發(fā)明人通過(guò)將新鮮血清樣品(100μl)在4℃、室溫、30℃或37℃下培養(yǎng)來(lái)檢查其pH的變化，并發(fā)現(xiàn)其pH(即pH值)在數(shù)小時(shí)內(nèi)轉(zhuǎn)變到堿性pH。這種pH的轉(zhuǎn)變?cè)跇悠繁患訜岷蠛苊黠@。實(shí)際上，通過(guò)將其在37℃下培養(yǎng)，1小時(shí)內(nèi)其pH幾乎達(dá)到pH9。即使將其置于室溫下時(shí)，其pH在1小時(shí)內(nèi)也達(dá)到約pH8.5，在3或4小時(shí)內(nèi)達(dá)到pH9。當(dāng)將該樣品的100μl樣本放置在4℃下，或?qū)?ml樣本放置在室溫下時(shí)，樣本的pH較平緩地升高。然而，樣本的pH在4小時(shí)內(nèi)達(dá)到約pH8.5。
血液、血清或血漿樣品的pH基本上都隨著時(shí)間的變化而升高。因此，可以預(yù)料在堿性條件下不穩(wěn)定的血液成分將隨著時(shí)間的變化而降解。樣品的pH尤其是在加熱時(shí)容易從中性轉(zhuǎn)化成堿性。而且，當(dāng)樣品具有堿性pH并被加熱時(shí)，與保持樣品冷卻的情況相比降解有所增強(qiáng)。近年來(lái)，用于臨床參考實(shí)驗(yàn)室等分析的樣品的體積變得越來(lái)越小。然而，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)當(dāng)樣品體積小時(shí)，在儲(chǔ)存期間或解凍后其pH容易升高。即使用于分析血液成分的試劑在適當(dāng)范圍內(nèi)可緩沖pH，但解凍后的pH仍然升高。因此，測(cè)試結(jié)果必定受到分析前pH升高導(dǎo)致的血液成降解的影響。
本發(fā)明人認(rèn)為，血液、血清或血漿樣品的穩(wěn)定性可通過(guò)防止樣品的pH升高來(lái)增強(qiáng)，并進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定性確實(shí)通過(guò)將pH緩沖劑與血液、血清或血漿樣品混和而得到增強(qiáng)。本發(fā)明就是基于這一發(fā)現(xiàn)而完成的。
也就是說(shuō)，本發(fā)明提供了穩(wěn)定血液、血清或血漿樣品的第一種方法，該方法包括1-a)向血液樣品中加入pH緩沖劑，1-b)制備血清或血漿樣品，并向樣品中加入pH緩沖劑，或1-c)將血液、血清或血漿樣品放入含有pH緩沖劑的容器中，和2)將步驟1-a、1-b或1-c中獲得的樣品儲(chǔ)存，其中pH緩沖劑具有從弱酸性pH到弱堿性pH范圍的初始pH，并具有將步驟1-a、1-b或1-c中獲得的樣品的pH在步驟2中保持在中性附近的緩沖能力。
根據(jù)上述方法的本發(fā)明可以單獨(dú)地或以其中兩個(gè)或多個(gè)組合的方式包括如下實(shí)施方案i)其中pH緩沖劑在步驟2中將樣品的pH保持在pH7.0至pH8.0范圍內(nèi)的上述方法；ii)其中pH緩沖劑具有pH5.5至pH8.0的初始pH的上述方法；iii)其中pH緩沖劑具有選自固體、粉末、顆粒、涂層、液滴和微液滴的形式的上述方法；iv)其中通過(guò)將容器中所含的pH緩沖劑水溶液進(jìn)行真空干燥(包括減壓干燥和冷凍干燥)、傳熱干燥(包括對(duì)流傳熱干燥、輻射傳熱干燥和傳導(dǎo)傳熱干燥)、內(nèi)部發(fā)熱干燥、用干燥劑干燥、超聲干燥或風(fēng)干來(lái)制備pH緩沖劑的上述方法；和v)其中容器為真空或非真空血液收集管、用于分離血清或血漿的離心管、尿收集杯、樣品儲(chǔ)存容器、96孔微滴定板或其組件、384孔板或用于將樣品郵寄到臨床參考實(shí)驗(yàn)室的樣品容器的上述方法。
此外，本發(fā)明提供了與血液、血清或血漿樣品接觸的容器，該容器含有初始pH在弱酸性pH至弱堿性pH范圍的pH緩沖劑，并且具有將樣品的pH保持在中性附近的緩沖能力。
根據(jù)上述容器的本發(fā)明可以單獨(dú)地或以其中兩個(gè)或多個(gè)組合的方式包括以下實(shí)施方案i)其中pH緩沖劑保持樣品的pH在pH7.0至pH8.0范圍內(nèi)的上述容器；ii)其中pH緩沖劑具有pH5.5至pH8.0的初始pH的上述容器；iii)其中pH緩沖劑具有選自固體、粉末、顆粒、涂層、液滴和微液滴的形式的上述容器；iv)其中通過(guò)將容器中所含的pH緩沖劑水溶液進(jìn)行真空干燥(包括減壓干燥和冷凍干燥)、傳熱干燥(包括對(duì)流傳熱干燥、輻射傳熱干燥和傳導(dǎo)傳熱干燥)、內(nèi)部發(fā)熱干燥、用干燥劑干燥、超聲干燥或風(fēng)干來(lái)制備pH緩沖劑的上述容器；和v)其中容器為真空或非真空血液收集管、用于分離血清或血漿的離心管、尿收集杯、樣品儲(chǔ)存容器、96孔微滴定板或其組件、384孔板或用于將樣品郵寄到臨床參考實(shí)驗(yàn)室的樣品容器。
此外，本發(fā)明提供了穩(wěn)定血清或血漿樣品的第二種方法，該方法包括1-a)向血液樣品中加入pH緩沖劑，或1-b)將血液樣品置于包含pH緩沖劑的容器中，2)將pH緩沖劑溶解在血液樣品中，3)從步驟2獲得的樣品制備血清或血漿樣品，和4)儲(chǔ)存步驟3中獲得的血清或血漿樣品，其中pH緩沖劑具有從弱酸性pH到弱堿性pH的初始pH，并具有將步驟3中獲得的血清或血漿樣品的pH在步驟4中保持在中性附近的緩沖能力。
發(fā)明詳述以下將具體解釋本發(fā)明。
本發(fā)明的方法和容器的特征在于，將血液、血清或血漿樣品與初始pH在弱酸性pH到弱堿性pH范圍內(nèi)、并具有將樣品的pH保持在中性附近的緩沖劑能力的pH緩沖劑接觸。
在本發(fā)明的方法中，血液、血清或血漿樣品的pH通過(guò)與pH緩沖劑共存而控制在中性附近。從而可大大減少隨時(shí)間推移在堿性條件下不一定總是穩(wěn)定的成分的變質(zhì)。該方法可通過(guò)使用本發(fā)明的容器而進(jìn)行。即血液、血清或血漿樣品的pH易于通過(guò)事先將pH緩沖劑或來(lái)自該試劑的緩沖溶液放入諸如血液收集管的樣品容器中來(lái)控制。
“pH緩沖劑”和“緩沖劑”的含義相同，指能表現(xiàn)出pH緩沖作用的有效成分?！熬彌_溶液”指溶解了pH緩沖劑的水溶液。緩沖溶液除緩沖劑外還可含有其它成分，如糖類、聚合物質(zhì)、化學(xué)物質(zhì)和生物物質(zhì)。緩沖溶液的pH可用酸(如HCl)或堿(如NaOH或KOH)調(diào)節(jié)，或者是通過(guò)用一定比例混和表現(xiàn)出不同pH的化合物如多元酸的一鈉鹽和二鈉鹽來(lái)調(diào)節(jié)?！俺跏紁H”指緩沖劑水溶液的pH。即緩沖劑水溶液制備后立即指示的pH，或用酸或堿調(diào)節(jié)的溶液的pH?！皦A的”和“堿性的”具有相同含義，均指大于7.0的pH。術(shù)語(yǔ)“中性附近”此處是指約pH6.5至pH8。
可用于本發(fā)明的pH緩沖劑的實(shí)例包括但不限于磷酸鹽緩沖劑、ACES[N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸]、ADA[N-(2-乙酰氨基)-2-亞氨基乙二酸]、BES[N，N-雙(2-羥乙基)-2-氨基乙磺酸]、BICINE[N，N-雙(2-羥乙基)氨基乙酸]、BIS-TRIS[雙(2-羥乙基)-亞氨基-三(羥甲基)甲烷]、BIS-TRIS-PROPANE[1，3-雙[三(羥甲基)甲基氨基]丙烷]、DIPSO[3-[N，N-雙(2-羥乙基)氨基]-2-羥基丙磺酸]、EPPS[N-(2-羥乙基)哌嗪-N’-(3-丙磺酸)；HEPPS]、HEPES[N-(2-羥乙基)哌嗪-N’-(2-乙磺酸)]、HEPPESO[N-(2-羥乙基)哌嗪-N’-(2-羥基丙磺酸)]、IMIDAZOLE[1，3-二氮雜-2，4-環(huán)戊二烯]、MES[2-(N-嗎啉代)乙磺酸]、MOBS[4-(N-嗎啉代)丁磺酸]、MOPS[3-(N-嗎啉代)丙磺酸]、MOPSO[3-(N-嗎啉代)2-羥基丙磺酸]、PIPES[哌嗪-N，N’-二(2-乙磺酸)]、POPSO[哌嗪-N，N’-二(2-羥基丙磺酸)]、TAPS[N-三(羥甲基)甲基-3-氨基丙磺酸]、TAPSO[3-[N-三(羥甲基)甲基氨基]-2-羥基丙磺酸]、TEA[三乙醇胺]、TES[N-三(羥甲基)甲基-2-氨基乙磺酸]、TRICINE[N-三(羥甲基)甲基氨基乙酸]、TRIS[三(羥甲基)氨基乙烷]、甘氨酰甘氨酸、乙酸鹽緩沖劑和檸檬酸鹽緩沖劑。
除以上所列外，在pH6.0至pH8.0間有強(qiáng)緩沖能力的緩沖劑也可以適當(dāng)采用。術(shù)語(yǔ)“緩沖能力”指當(dāng)緩沖劑溶解在預(yù)定量的水溶液中時(shí)所能表現(xiàn)出的緩沖作用的pH范圍。在某些特殊情況下，例如在其目的是僅僅使樣品中的特定成分不降解的情況下以及在緩沖溶液的量可增加或減少的情況下，可采用在大于等于pH8.0或小于等于pH5.9時(shí)具有強(qiáng)緩沖能力的緩沖劑。因此，緩沖劑不限于上述那些，可由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員適當(dāng)選擇。
在本發(fā)明的方法或容器中，這些緩沖劑或緩沖溶液可彼此獨(dú)立地使用或兩種或多種組合使用。
可通過(guò)pH緩沖劑將血液、血清或血漿樣品的pH范圍控制在中性附近，即從約PH6.5至pH8，優(yōu)選pH6.8至pH8.0，更優(yōu)選pH7.0至pH8.0，特別優(yōu)選pH7.1至pH7.8。
為了將pH控制在上述范圍(即pH6.5到pH8)內(nèi)，采用初始pH在弱酸性pH到弱堿性pH范圍內(nèi)的緩沖劑。緩沖劑的初始pH優(yōu)選為5.5至8.0，更優(yōu)選6.0至7.7，特別優(yōu)選6.5至7.5。原因如下。
樣品的pH隨時(shí)間推移而升高至約pH9。為了防止樣品的pH升高到pH8.0，如果緩沖劑的初始pH接近且低于pH8.0時(shí)，該緩沖劑就必須以高濃度使用。另一方面，如果初始pH低于pH5.5，樣品的最終pH就很容易地控制在中性附近。然而，當(dāng)新鮮樣品的體積小于容器所希望的體積時(shí)，具有中性pH的樣品可在與緩沖劑接觸后立即暴露于過(guò)量的酸性pH下。因此，緩沖劑的適當(dāng)初始pH為5.5至8.0，優(yōu)選6.0至7.7。為了避免將新鮮樣品與緩沖劑(或緩沖溶液)混和而出現(xiàn)的瞬時(shí)pH降低以及避免儲(chǔ)存期間pH的大幅升高，可適當(dāng)采用初始pH在pH6.5至7.5范圍內(nèi)的緩沖劑。然而，應(yīng)該注意也可以采用初始pH為6.0至6.5的緩沖劑。這是因?yàn)槿绻褂蒙倭烤彌_劑，樣品的pH可控制在目標(biāo)范圍內(nèi)。
當(dāng)選定了緩沖劑后，應(yīng)考慮其他物質(zhì)阻凝劑如檸檬酸鈉和促凝血?jiǎng)┑挠绊憽?br> 此外，能否將樣品的pH控制在目標(biāo)范圍內(nèi)，還取決于1)所用的具體緩沖劑具有強(qiáng)緩沖能力或緩沖潛力的pH范圍和2)在包含血液、血清或血漿樣品的水溶液中緩沖劑的濃度。它不能僅由具體緩沖劑的初始pH決定。重要的是將樣品的pH控制在中性附近。為了達(dá)到該目的，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可適當(dāng)選擇緩沖劑的類型和用量以及初始pH等。然而，緩沖劑的用量通常是能使其在該水溶液中的濃度為優(yōu)選的0.01～0.3M、更優(yōu)選的0.03～0.1M的量。
優(yōu)選采用基本不含水性成分的緩沖劑。即優(yōu)選基本上沒(méi)有水性成分。因?yàn)槿绻嬖诖罅克猿煞?也就是使用低濃度緩沖溶液)，則會(huì)稀釋血液、血清或血漿樣品，結(jié)果樣品中所含成分的濃度降低。因此，預(yù)先將緩沖劑放入容器中的方法的優(yōu)選實(shí)例包括除去該容器中所含緩沖溶液的水分以形成固體、粉末、顆?；蛲繉?。干燥緩沖溶液的方法的實(shí)例包括真空干燥(包括減壓干燥和冷凍干燥)、傳熱干燥(包括對(duì)流傳熱干燥、輻射傳熱干燥和傳導(dǎo)傳熱干燥)、內(nèi)部發(fā)熱干燥、用干燥劑干燥、超聲干燥、風(fēng)干及其兩種或多種的組合。另外，可以將分析中能夠忽略的體積非常小的緩沖溶液置于容器中，或者可將緩沖溶液的液滴或微液滴附著于容器內(nèi)壁。優(yōu)選在容器中預(yù)先制備固體、粉末或顆粒(尤其是粉末或顆粒)形式的緩沖劑，或者是液滴或微液滴形式的緩沖溶液。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“容器”可理解為能包含或盛有用于取樣、儲(chǔ)存、運(yùn)輸、診斷測(cè)試、研究等的血液、血清或血漿樣品的器件，而不考慮時(shí)間的長(zhǎng)短。因此，除了各種形式的玻璃或塑料管、杯、微滴定板等以外，“容器”的實(shí)例包括板狀、塊狀或條狀紙張或海綿、塑料片等。更具體地講，“容器”的實(shí)例包括真空或非真空血液收集管、用于血清或血漿分離的離心管、尿收集管、樣品儲(chǔ)存容器、96孔微滴定板或其組件、384孔板或用于將樣品郵寄到臨床參考實(shí)驗(yàn)室的樣品容器等。微滴定板組件是指在微滴定板中構(gòu)造的能移動(dòng)的一排或多排單元(如在96孔微滴定板情況下，包括一排或多排的單元，其中一排包括8或12個(gè)孔)。當(dāng)將樣品郵寄到臨床參考實(shí)驗(yàn)室時(shí)，采用樣品容器。該樣品容器用于取樣、運(yùn)輸和儲(chǔ)存樣品。盡管樣品容器的形式可根據(jù)待分析的成分、臨床參考實(shí)驗(yàn)室等的不同而變化，但經(jīng)常采用濾紙。
為了防止已置于容器中的緩沖劑溢出或剝落，從操作角度看最好是采用諸如真空血液收集管的封閉型容器。
在本發(fā)明的第一種方法中，在步驟1中，a)將pH緩沖劑加入到血液樣品中，b)由血液制備血清或血漿樣品，并將pH緩沖劑加入到血清或血漿樣品中，或c)將血液、血清或血漿樣品放入包含pH緩沖劑的容器中。在本發(fā)明的第二種方法中，在步驟1中，a)將pH緩沖劑加入到血液樣品中，或b)將血液樣品放入到包含pH緩沖劑的容器中。即可在血液、血清或血漿樣品倒入容器中之前，將緩沖劑或緩沖溶液置于容器中。另外，可在該樣品倒入容器后將緩沖劑或緩沖溶液置于容器中。為了將樣品的稀釋降至最小程度，優(yōu)選采用配制的粉末或顆粒形式的緩沖劑，所述緩沖劑溶解在預(yù)定量的含水溶液中時(shí)表現(xiàn)出一定范圍的pH。
更具體地講，在采血時(shí)，緩沖劑可存在于諸如血液收集管的容器中。另外，可在采集血液樣品后或制備血清或血漿樣品后將緩沖劑與血液、血清或血漿樣品混和。在后一種情況下，先采集或收集血液，然后轉(zhuǎn)移到含有緩沖劑的容器中。或者先采集或收集血液、由血液制備血清或血漿，然后將血清或血漿倒入含有緩沖劑的容器中?；蛘呖蓪⒕彌_劑直接加入到采集的血液或制備的血清或血漿中。然而理想地是，從采血后條件的可重復(fù)性來(lái)看，優(yōu)選將血液直接收集到含有緩沖劑的真空管中。這是因?yàn)槿绻葘⒀菏占讲缓彌_劑的管中、需要時(shí)由該血液制備血清或血漿、然后將緩沖劑加入到血液、血清或血漿樣品中或?qū)⒃摌悠忿D(zhuǎn)移到含有緩沖劑的容器中，血液收集與將樣品和緩沖劑進(jìn)行混和之間的時(shí)間是不同的。
當(dāng)將體積約1ml的樣品置于25℃空氣中時(shí)，血液收集與將樣品和緩沖劑進(jìn)行混和之間的時(shí)間優(yōu)選為1小時(shí)或更短。當(dāng)將體積約0.1ml的樣品置于25℃空氣中時(shí)，該時(shí)間優(yōu)選為15分鐘或更短，而當(dāng)將體積約0.1ml的樣品置于4℃空氣中時(shí)，該時(shí)間優(yōu)選為30分鐘或更短。
血清中含有的某些血液成分可由以下方法制備的血清樣品來(lái)分析將血液收集或采集到真空血液收集管中，然后離心分離為血清和血塊。將血清立即冷凍。儲(chǔ)存冷凍樣品然后解凍。解凍后測(cè)定出成分的量。該成分的量的標(biāo)準(zhǔn)值是基于用上述已解凍的血清樣品獲得的值而確定的。為了與標(biāo)準(zhǔn)值比較，可在冷凍血清樣品解凍后立即將pH緩沖劑加入到血清樣品中。對(duì)于血液或血漿樣品也可如此處理。
在本發(fā)明第一種方法中，將還含有緩沖劑的樣品儲(chǔ)存，直到進(jìn)行分析。儲(chǔ)存條件不受限制。然而，通常在冰箱中或室溫下短時(shí)間儲(chǔ)存，在冰柜中可儲(chǔ)存更長(zhǎng)的時(shí)間。
本發(fā)明第一種方法的步驟2中和本發(fā)明第二種方法的步驟4中的術(shù)語(yǔ)“儲(chǔ)存”是指將pH緩沖劑與血液、血清或血漿樣品的混合物放置一段時(shí)間。時(shí)間可以非常短或較長(zhǎng)。例如，當(dāng)將混合物立即進(jìn)行配制(例如與試劑混和)以用于分析時(shí)，時(shí)間則非常非常地短。同樣地在這種情況下，本發(fā)明用于避免測(cè)試期間成分的變質(zhì)。
在本發(fā)明第二種方法中，將pH緩沖劑溶解在血液樣品中，然后由該血液樣品制備血清或血漿樣品。PH緩沖劑的溶解以及血清或血漿樣品的制備可用公知方法進(jìn)行。將所獲得的血清或血漿樣品儲(chǔ)存，直到進(jìn)行分析。儲(chǔ)存條件不受限制。然而，通常在冰箱中或室溫下短時(shí)間儲(chǔ)存，在冰柜中可儲(chǔ)存更長(zhǎng)時(shí)間。
根據(jù)本發(fā)明的方法，可通過(guò)防止血液、血清或血漿樣品的pH升高來(lái)提高樣品隨時(shí)間推移的穩(wěn)定性。
收集血液后，血液、血清或血漿樣品的pH隨時(shí)間推移而升高，并從中性變?yōu)閴A性。當(dāng)樣品體積很小時(shí)，這種pH轉(zhuǎn)變很明顯。在樣品的成分中，在堿性條件下穩(wěn)定性差的成分根據(jù)該成分的特性和pH升高的程度而發(fā)生可逆或不可逆降解。這種降解在低溫下進(jìn)行得慢，然而在升高的溫度下pH增加和成分的降解都加速。在本發(fā)明的方法和容器中，pH增加通過(guò)采用pH緩沖劑而避免。結(jié)果，血液、血清或血漿樣品中在堿性條件下不穩(wěn)定的成分的降解被避免。因此，根據(jù)本發(fā)明，可得到恒定的試驗(yàn)結(jié)果。更具體地講，由已儲(chǔ)存一段時(shí)間的樣品得到的試驗(yàn)結(jié)果與由新鮮樣品得到的結(jié)果幾乎相同。同樣，在診斷測(cè)試或試驗(yàn)期間將樣品放置在室溫情況下的試驗(yàn)結(jié)果與該樣品樣品冷凍情況下的試驗(yàn)結(jié)果幾乎相同。因此，通過(guò)本發(fā)明，血液、血清或血漿樣品隨時(shí)間的穩(wěn)定性可得到增強(qiáng)，結(jié)果使臨床診斷測(cè)試以及臨床和基本研究實(shí)驗(yàn)的再現(xiàn)性和可靠性得到提高。
通過(guò)采用本發(fā)明的第一種方法、第二種方法或本發(fā)明的容器，樣品的pH保持在中性附近，因此不僅當(dāng)將樣品置于室溫下還是加熱到37℃時(shí)，可保護(hù)要分析的某些成分類型不降解。即本發(fā)明能解決樣品暴露在各種溫度條件下而導(dǎo)致的樣品不穩(wěn)定問(wèn)題。因此，本發(fā)明有助于實(shí)現(xiàn)一種新的測(cè)試系統(tǒng)，其中將樣品郵寄到臨床參考實(shí)驗(yàn)室，并在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行分析。
本發(fā)明還具有其他優(yōu)點(diǎn)。即當(dāng)采用血液、血清和血漿作為樣品時(shí)，本發(fā)明在開發(fā)診斷試劑中很有用。在開發(fā)新型診斷試劑中，單一樣品可重復(fù)用于確定試驗(yàn)條件，以及用于測(cè)定靈敏度、特異性、重復(fù)性、與通過(guò)不同方法獲得的結(jié)果的相關(guān)性、共存物質(zhì)等的影響以及儲(chǔ)存或保存穩(wěn)定性。在這種情況下，如果樣品明顯降解，測(cè)試結(jié)果會(huì)不同。本發(fā)明避免了至少由pH升高導(dǎo)致的樣品降解。因此，它在重復(fù)試驗(yàn)樣品的研究中是有益的。
本發(fā)明的上述優(yōu)點(diǎn)在近年來(lái)研究很活躍的開發(fā)采用蛋白質(zhì)芯片(即微陣列)的試驗(yàn)方法中很重要。這是因?yàn)榕c選擇用于欲分析的單一成分的最佳條件進(jìn)行單一成分的分析不同，為了嘗試用微陣列等一次確定許多成分的多項(xiàng)試驗(yàn)方法，應(yīng)找到適于所有試驗(yàn)的一組條件。因此，將樣品進(jìn)行大量次數(shù)的試驗(yàn)。在這種情況下，由于避免了樣品的降解，所以本發(fā)明能明顯加速診斷劑的開發(fā)并顯著提高測(cè)量的可靠性。
實(shí)施例下面參考實(shí)施例具體描述本發(fā)明。然而，不能理解成本發(fā)明限于這些實(shí)施例。
實(shí)施例1置于固化有pH緩沖劑的96孔微滴定板中的血清樣品的pH變化在用作樣品容器的96孔微滴定板的每個(gè)孔中加入50μl 0.1M磷酸鹽緩沖溶液(pH6.0)(以下稱為“PB 6.0”)、0.1M的磷酸鹽緩沖溶液(pH6.5)(以下稱為“PB 6.5”)、0.1M的HEPES緩沖溶液(pH6.0)(以下稱為“HEPES 6.0”)，或0.1M的HEPES緩沖溶液(pH6.5)(以下稱為“HEPES 6.5”)。在干燥器中干燥孔板，除去緩沖溶液中的液體成分，將緩沖劑固化在孔表面。將這樣獲得的每塊板稱為“pH緩沖劑固化板”。作為對(duì)比，還使用未固化緩沖劑的96孔微滴定板(以下分別稱為“未處理板”)和1.5ml樣品管。
用如下方法制備血清樣品將血液收集到含有促凝血?jiǎng)┖脱悍蛛x劑的真空血液收集管中。30分鐘后，離心血液并收集血清。將血清分成多份并冷凍。將冷凍血清解凍后得到血清樣品。
向上述制備的樣品容器中以100μl/微滴定板的每個(gè)孔或以1.0ml/1.5ml樣品管的量加入血清樣品。將該樣品容器置于25℃下。將血清加入PB固化板和HEPES固化板的孔中后，緩沖劑的濃度為50mM。將其孔中已倒入新鮮血清樣品的另一個(gè)未處理板置于4℃下。在倒入血清樣品后的1、2、4和20小時(shí)，測(cè)量血清樣品和血清樣品/緩沖劑混合物的pH。結(jié)果示于表1中。
表1血清pH的測(cè)量

*實(shí)驗(yàn)前血清的pH在未處理板和用作對(duì)照用的樣品管中觀察到血清樣品的pH變化較大。特別是，在25℃儲(chǔ)存條件下的未處理板中，血清樣品的pH在1小時(shí)內(nèi)從7.8升高到8.6，在20小時(shí)內(nèi)達(dá)到pH9.2。儲(chǔ)存于4℃下的未處理板中和1.5ml樣品管中的血清樣品的pH變化不如儲(chǔ)存于25℃下的未處理板中的劇烈。然而，在兩種情況下的pH在20小時(shí)后均達(dá)到約pH9。另一方面，在倒入pH緩沖劑固化板中的血清樣品(即血清樣品/緩沖劑混合物)中，倒入血清樣品后的時(shí)刻與20小時(shí)后之間的pH變化較小。具體說(shuō)，在PB 6.0固化板中的pH從7.0輕微變化到7.1，在PB 6.5固化板中的pH從7.5輕微變化到7.6。同樣，HEPES 6.0固化板中的pH從7.1變化到7.6，HEPES 6.5固化板中的pH從7.1變化到7.7。倒入pH緩沖劑固化板中的樣品的pH即使在20小時(shí)后也保持低于pH8。
實(shí)施例2pH緩沖劑固化板內(nèi)的血清樣品中的血清胃蛋白酶原I/II的試驗(yàn)按照與實(shí)施例1描述的相同的方式制備PB 6.0固化板和HEPES 6.5固化板，所不同的是將板在37℃培養(yǎng)箱中放置1天以將緩沖劑固化在板上。按照與實(shí)施例1描述的相同的方式制備血清樣品。
以100μl/孔的量將血清樣品倒入PB 6.0固化板、HEPES 6.5固化板和作為對(duì)照用的未處理板的孔中。將板在4℃(對(duì)照)、25℃、37℃、43℃和50℃下放置4小時(shí)。然后用夾心ELISA法試驗(yàn)血清樣品中胃蛋白酶原I和胃蛋白酶原II的量。
更具體地講，將預(yù)定量的以上制備的其中一個(gè)血清樣品進(jìn)行取樣。用ELUMINA PEPSINOGEN I/ELUMINA PEPSINOGEN II(KyokutoPharmaceutical Industrial Co.)的樣機(jī)，根據(jù)制造商推薦的反應(yīng)條件，分別測(cè)量血清樣品中的胃蛋白酶原I和胃蛋白酶原II的量。通過(guò)固化在96孔微滴定板的孔上的抗人胃蛋白酶原I單克隆抗體捕捉胃蛋白酶原I，并用堿性磷酸酶標(biāo)記的抗人胃蛋白酶原I抗體和堿性磷酸酶標(biāo)記的抗人胃蛋白酶原II抗體的混合物檢測(cè)。通過(guò)固化在96孔微滴定板的另一個(gè)孔上的抗人胃蛋白酶原II單克隆抗體捕捉胃蛋白酶原II，并用上述混合物檢測(cè)。結(jié)果示于表2和3中。
表2血清胃蛋白酶原I的試驗(yàn)

表3血清胃蛋白酶原II的試驗(yàn)

在胃蛋白酶原I的試驗(yàn)中，當(dāng)采用未處理板時(shí)，測(cè)量值在25℃時(shí)表現(xiàn)出減小的趨勢(shì)，而在37℃時(shí)的測(cè)量值明顯減小。在該溫度下，殘余含量(即每個(gè)測(cè)量值與儲(chǔ)存于4℃下的血清樣品的測(cè)量值的百分比值)僅為9.0％。另一方面，當(dāng)采用PB 6.0固化板時(shí)，直到43℃都未看到測(cè)量值的波動(dòng)。即殘余含量分別在37℃為97.8％，在43℃為92.4％。同樣，當(dāng)采用HEPES 6.5固化板時(shí)，殘余含量在37℃為91.5％。
在胃蛋白酶原II的試驗(yàn)中，溫度的影響小于在胃蛋白酶原I的試驗(yàn)中的影響。然而，未處理板與本發(fā)明的板之間的差異仍然明顯。即對(duì)于未處理板，殘余含量在43℃僅為50.4％。然而，對(duì)于PB 6.0固化板和HEPES 6.5固化板，殘余含量在43℃分別為92.8％和90.9％。因此，同樣在胃蛋白酶原II的試驗(yàn)中，當(dāng)采用本發(fā)明的板時(shí)，測(cè)量值相對(duì)于溫度負(fù)荷的穩(wěn)定性明顯提高。
實(shí)施例3pH緩沖劑固化板中儲(chǔ)存的血清樣品中的前列腺特異的酸性磷酸酶(PAP)的試驗(yàn)按照與實(shí)施例2描述的相同的方式制備PB 6.0固化板。按照與實(shí)施例1描述的相同的方式制備血清樣品。
以100μl/孔的量將血清樣品倒入PB 6.0固化板和作為對(duì)照用的未處理板的孔中。將板在4℃(對(duì)照)和37℃下放置4小時(shí)。將血清樣品立即分別回收并冷凍。
此后，用PAP RIA試劑盒(DPC-PAP-IRMA試劑盒，Diagnostic ProductsCorporation)，根據(jù)制造商推薦的方法試驗(yàn)血清中PAP的量。結(jié)果示于表4中。
表4

標(biāo)準(zhǔn)值3.5ng/ml或更低；測(cè)量方法RIA(IRMA)可見當(dāng)置于37℃下時(shí)，PAP快速喪失其活性。例如，從在37℃下將血清培養(yǎng)4小時(shí)后的數(shù)據(jù)看，與起點(diǎn)(0小時(shí))的數(shù)據(jù)相比，PAP活性(通過(guò)酶定量分析)降低到0％，PAP的蛋白質(zhì)含量(通過(guò)RIA)降低到約30％。
在該實(shí)驗(yàn)(即實(shí)施例3)中，可見當(dāng)血清樣品在37℃的未處理容器中儲(chǔ)存4小時(shí)后，與儲(chǔ)存于4℃的相同容器中的相比，PAP的量降低到13.6％，當(dāng)相同的血清樣品在37℃的本發(fā)明的容器中(即PB 6.0固化板)儲(chǔ)存4小時(shí)后，與儲(chǔ)存于4℃的相同容器中的相比，PAP的量保持在91.3％，與儲(chǔ)存于4℃的未處理容器中的相比，該量保持在95.5％。因此，本發(fā)明的方法和容器對(duì)于穩(wěn)定PAP非常有效。
本發(fā)明僅通過(guò)以下權(quán)利要求進(jìn)行定義或限制。
權(quán)利要求
1.用于穩(wěn)定血液、血清或血漿樣品的方法，該方法包括1-a)向血液樣品中加入pH緩沖劑，1-b)制備血清或血漿樣品，并向樣品中加入pH緩沖劑，或1-c)將血液、血清或血漿樣品放入含有pH緩沖劑的容器中，和2)儲(chǔ)存在步驟1-a、1-b或1-c中獲得的樣品，其中pH緩沖劑具有從弱酸性pH到弱堿性pH范圍的初始pH，并具有將步驟1-a、1-b或1-c中獲得的樣品的pH在步驟2中保持在中性附近的緩沖能力。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中pH緩沖劑將樣品的pH在步驟2中保持在pH7.0至pH8.0的范圍內(nèi)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中pH緩沖劑具有在pH5.5至pH8.0范圍內(nèi)的初始pH。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中pH緩沖劑具有選自固體、粉末、顆粒、涂層、液滴和微液滴的形式。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中pH緩沖劑通過(guò)將已在容器中含有的pH緩沖劑的水溶液進(jìn)行真空干燥(包括減壓干燥和冷凍干燥)、傳熱干燥(包括對(duì)流傳熱干燥、輻射傳熱干燥和傳導(dǎo)傳熱干燥)、內(nèi)部發(fā)熱干燥、用干燥劑干燥、超聲干燥或風(fēng)干來(lái)制備。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中容器為真空或非真空血液收集管、用于分離血清或血漿的離心管、尿收集杯、樣品儲(chǔ)存容器、96孔微滴定板或其組件、384孔板或?qū)悠粪]寄到臨床參考實(shí)驗(yàn)室時(shí)采用的樣品容器。
7.一種與血液、血清或血漿陣品接觸的容器，該容器中含有pH緩沖劑，所述pH緩沖劑具有從弱酸性pH到弱堿性pH范圍的初始pH，并具有將樣品的pH保持在中性附近的緩沖能力。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的容器，其中pH緩沖劑將樣品的pH保持在pH7.0至pH8.0的范圍內(nèi)。
9.根據(jù)權(quán)利要求7的容器，其中pH緩沖劑具有在pH5.5至pH8.0范圍內(nèi)的初始pH。
10.根據(jù)權(quán)利要求7的容器，其中pH緩沖劑具有選自固體、粉末、顆粒、涂層、液滴和微液滴的形式。
11.根據(jù)權(quán)利要求7的容器，其中pH緩沖劑通過(guò)將已在容器中含有的pH緩沖劑的水溶液進(jìn)行真空干燥(包括減壓干燥和冷凍干燥)、傳熱干燥(包括對(duì)流傳熱干燥、輻射傳熱干燥和傳導(dǎo)傳熱干燥)、內(nèi)部發(fā)熱干燥、用干燥劑干燥、超聲干燥或風(fēng)干來(lái)制備。
12.根據(jù)權(quán)利要求7的容器，其中容器為真空或非真空血液收集管、用于分離血清或血漿的離心管、尿收集杯、樣品儲(chǔ)存容器、96孔微滴定板或其組件、384孔板或?qū)悠粪]寄到臨床參考實(shí)驗(yàn)室時(shí)采用的樣品容器。
13.用于穩(wěn)定血清或血漿樣品的方法，該方法包括1-a)向血液樣品中加入pH緩沖劑，或1-b)將血液樣品置于包含pH緩沖劑的容器中，2)將pH緩沖劑溶解在血液樣品中，3)從步驟2獲得的樣品制備血清或血漿樣品，和4)儲(chǔ)存步驟3中獲得的血清或血漿樣品，其中pH緩沖劑具有從弱酸性pH到弱堿性pH范圍的初始pH，并具有將步驟3中獲得的血清或血漿樣品的pH在步驟4中保持在中性附近的緩沖能力。
全文摘要
本發(fā)明的目的是提供通過(guò)穩(wěn)定血液成分而使得可正確分析這些成分的簡(jiǎn)便方法以及用于該方法的容器。該目的通過(guò)穩(wěn)定血液、血清或血漿樣品的方法實(shí)現(xiàn)，該方法包括1－a)向血液樣品中加入pH緩沖劑，1－b)制備血清或血漿樣品，并向樣品中加入pH緩沖劑，或1－c)將血液、血清或血漿樣品置于含有pH緩沖劑的容器中，和2)儲(chǔ)存在步驟1－a、1－b或1－c中獲得的樣品，其中pH緩沖劑具有從弱酸性pH到弱堿性pH范圍的初始pH，并具有將步驟1－a、1－b或1－c中獲得的樣品的pH在步驟2中保持在中性附近的緩沖能力。該目的還通過(guò)使用與血液、血清或血漿樣品接觸的容器來(lái)實(shí)現(xiàn)，該容器中含有pH緩沖劑，該pH緩沖劑具有從弱酸性pH到弱堿性pH范圍的初始pH，并具有將樣品的pH保持在中性附近的緩沖能力。該目的通過(guò)穩(wěn)定血清或血漿樣品的另一種方法來(lái)實(shí)現(xiàn)，該方法包括1－a)向血液樣品中加入pH緩沖劑，或1－b)將血液樣品置于含有pH緩沖劑的容器中，2)將pH緩沖劑溶解在血液樣品中，3)從步驟2獲得的樣品制備血清或血漿樣品，和4)儲(chǔ)存步驟3中獲得的血清或血漿樣品，其中pH緩沖劑具有從弱酸性pH到弱堿性pH范圍的初始pH，并具有將步驟3中獲得的血清或血漿樣品的pH在步驟4中保持在中性附近的緩沖能力。
文檔編號(hào)G01N1/28GK1515907SQ03103729
公開日2004年7月28日 申請(qǐng)日期2003年1月3日 優(yōu)先權(quán)日2003年1月3日
發(fā)明者有馬和久, 小嵨雅晴, 中野真也, 郡司知子, 也, 子, 晴 申請(qǐng)人:極東制藥工業(yè)株式會(huì)社