專利名稱：基于抗原抗體作用的立體結(jié)構(gòu)信息設(shè)計新型藥物分子的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基于抗原抗體作用的立體結(jié)構(gòu)信息進行新型藥物分子設(shè)計的方法。具體而言，本發(fā)明通過在計算機上構(gòu)建抗原和抗體可變區(qū)的理論構(gòu)象，在此基礎(chǔ)上建立抗原-抗體復合物的理論構(gòu)象，識別抗原中與抗體結(jié)合的表位，并通過實驗驗證該表位，根據(jù)該表位的序列設(shè)計新的藥物分子。本發(fā)明中使用的抗原實例是腫瘤壞死因子(TNF-α)，抗體實例是從雜交瘤細胞中篩選獲得的抗TNF單克隆抗體Z12，利用這一對抗原抗體相互作用區(qū)域的構(gòu)象及結(jié)構(gòu)信息，借助計算機輔助設(shè)計的方法，獲得替代抗體Z12的短肽分子。
背景技術(shù)：
由于蛋白質(zhì)類藥物制備難度大，需要更多的分子生物學技術(shù)、手段，同時由于難以釋放、吸收，在用藥過程中只能通過注射的方式進行。蛋白質(zhì)類藥物分子量大、柔韌性大，存在多個不同的結(jié)合表位，在治療的同時可能會激活其它致病基因而產(chǎn)生意想不到的副作用。
抗體類藥物作為近年來發(fā)展迅猛的蛋白藥物，已引起人們的廣泛關(guān)注。然而，鼠源抗體引發(fā)的“人抗鼠抗體(HAMA)”反應(yīng)限制了其臨床應(yīng)用；人鼠嵌合抗體在長期給藥的過程中可以引發(fā)人抗嵌合抗體(HACA)反應(yīng)；利用人-人雜交瘤技術(shù)制備的單克隆抗體盡管能克服了上述鼠源抗體及嵌合抗體的缺點，但是人單抗的制備存在產(chǎn)量低、不穩(wěn)定、親和力低等問題，以致于不能達到相應(yīng)的治療目的。更為重要的是，在治療類風濕關(guān)節(jié)炎(RA)等疾病時，一次劑量需要1-10mg/kg抗TNF抗體或16mg/m2可溶性受體，療程需持續(xù)幾個月至半年以上。由于用藥量大，蛋白質(zhì)類藥物的副作用就更加明顯。
E Fintan Walton(精通廣泛生物技術(shù)領(lǐng)域的專家)曾指出，“從重組蛋白獲得具有轟動性的藥物的機會是十分有限的”。蛋白質(zhì)難于制備，難于釋放，并且容易產(chǎn)生副作用，而小分子藥物具有專一性，能夠以片劑、膠囊形式存在，使得小分子藥物替代蛋白分子成為當前分子設(shè)計、合理藥物設(shè)計的熱點，Moffat A S于1993年即提出“回到小分子化合物合成時代(Going back to the future with small syntheticcompounds)”。
近年來發(fā)展迅猛的計算機輔助藥物設(shè)計，無論是理論、技術(shù)，還是相關(guān)的方法都具備了相當雄厚的基礎(chǔ)，并有效地服務(wù)于實驗，為新藥設(shè)計和合成提供依據(jù)、理論思路，同時也縮短了新藥的研發(fā)周期。結(jié)合計算機藥物輔助設(shè)計方法，無疑將加速具有特定靶向的先導化合物的研發(fā)，大大提高新藥研制的成功率。
利用計算機輔助藥物設(shè)計方法獲得候選化合物進入臨床研究的成功小分子藥物很多，如Hoffmann La Roche公司利用凝血酶的晶體結(jié)構(gòu)模型，優(yōu)化候選化合物在酶催化中心的疏水區(qū)域結(jié)構(gòu)，設(shè)計、獲得凝血酶抑制劑Ro46-6240，現(xiàn)已進入抗凝血的臨床實驗；Merck研究室綜合運用碳酸酐酶(CA)的晶體結(jié)構(gòu)和量子化學構(gòu)象分析，確定已知CA抑制劑與CA結(jié)合的活性構(gòu)象，在此基礎(chǔ)上進行結(jié)構(gòu)改造獲得Trusopt(MK-507)，現(xiàn)在已作為治療青光眼疾病的藥物上市。
目前，國際上基于蛋白質(zhì)空間構(gòu)象設(shè)計小分子化合物取得較大的進展，然而利用抗原-抗體復合物模型設(shè)計抗體模擬物才剛剛開始。Takahashi M等借助抗原結(jié)合抗體高變區(qū)(CDR)位點，利用計算機輔助設(shè)計獲得了卟啉結(jié)合肽，經(jīng)實驗驗證具有生物學功能；利用二維1H核磁共振技術(shù)揭示12肽與卟啉結(jié)合的構(gòu)象特征，利用計算機輔助設(shè)計、構(gòu)建更短肽段-9肽，并最終獲得成功。國內(nèi)近年來也開展了基于大分子結(jié)構(gòu)設(shè)計小分子藥物，并在理論模型、計算方法上取得了一定的進展，與國際上在該方面的研究接軌。然而基于抗原-抗體作用復合物，針對抗原表位-抗體高變區(qū)CDR作用模式設(shè)計小分子藥物卻尚未開展。
hTNF-α是由單核細胞與巨噬細胞產(chǎn)生的具有多功能的細胞因子，能夠殺傷或抑制腫瘤細胞，具有提高中性粒細胞吞噬能力等重要的生物學活性。但是，近年來隨著對hTNF-α生物學活性研究的深入，發(fā)現(xiàn)各種原因引發(fā)的感染性休克、炎癥、自身免疫性疾病均表現(xiàn)為TNF表達水平過高，大量的研究結(jié)果表明，TNF-α參與諸如膿毒癥、感染、自身免疫疾病、移植物排斥、移植物抗宿主病等多種人類疾病。因此，關(guān)于hTNF-α拮抗物及其機理的研究逐步深入，尤其是抗TNF抗體對動物模型的效應(yīng)研究和臨床研究更是方興未艾。
由于hTNF-α在人體免疫紊亂中的有害作用，目前已著手設(shè)計治療策略以抑制或抵消hTNF-α的活性。其中，國內(nèi)外正在開展的尋找中和hTNF-α的抗體、可溶性TNF受體作為抑制hTNF-α活性的手段具有更廣泛的發(fā)展前景。
近年來，抗hTNF-α抗體、可溶性TNF受體已獲得FDA批準，并用于治療RA、節(jié)段性回腸炎。相對于早期的治療藥物(如DMARD)，獲得FDA批準的抗hTNF-α抗體、可溶性TNF受體具有更優(yōu)的治療效果，耐受性、臨床緩解作用更佳。大量的分子生物學實驗表明，不論是中和抗體，還是可溶性hTNF-α受體，只要能夠阻斷TNF活性，對上述疾病就有一定的治療作用。
該發(fā)明選擇TNF-α作為研究對象，結(jié)合本實驗室近十年來在TNF抗體方面的分子生物學研究成果，有針對性地通過計算機輔助設(shè)計方法構(gòu)建抗體與hTNF-α作用的復合物模型；通過分子生物學實驗，結(jié)合理論模擬確定的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)修正研究，進而利用同源模建、分子對接理論設(shè)計修飾復合物模型；結(jié)合分子動力學方法動態(tài)模擬復合物作用構(gòu)象的變化，確定抗體結(jié)合的抗原表位空間構(gòu)象特征；通過全新藥物設(shè)計的方法合理設(shè)計TNF抗體模擬肽。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的基于抗原-抗體作用的立體結(jié)構(gòu)信息設(shè)計新型藥物分子的方法，包括以下步驟(1)基于抗原和抗體的一級結(jié)構(gòu)序列，構(gòu)建抗原和抗體可變區(qū)的理論構(gòu)象；(2)根據(jù)抗原和抗體可變區(qū)的理論構(gòu)象，構(gòu)建抗原-抗體復合物的理論構(gòu)象；(3)識別抗原中結(jié)合抗體的表位；(4)實驗驗證抗原中結(jié)合抗體的表位；
(5)根據(jù)上述表位的序列，設(shè)計能夠影響其與抗體結(jié)合的分子。
本發(fā)明采用以結(jié)構(gòu)生物學、分子生物學、生物信息學相結(jié)合的方法，以TNF-α為實例，理論與實驗相結(jié)合確定抗體Z12特異性識別的TNF-α抗原表位。
針對從雜交瘤細胞篩選獲得的具有中和活性的抗體Z12，結(jié)合TNF-α晶體結(jié)構(gòu)，利用同源模建、分子對接的方法獲得抗原-抗體作用的復合物理論模型。
通過計算機圖形學技術(shù)，借助分子間氫鍵形成理論、反應(yīng)自由能理論、泛德華作用及靜電作用從理論上初步確定抗體Z12特異性識別TNF-α抗原表位的空間結(jié)構(gòu)。
利用分子生物學技術(shù)，設(shè)計TNF-α缺失突變體，通過ELISA、Western-Blot等生物學手段進行檢測，從而從實驗中確定理論預(yù)測結(jié)果的可靠性。
本發(fā)明通過上述方法證實理論預(yù)測的正確性，并確定Z12抗體識別TNF-α抗原表位的位置。
本發(fā)明借助確定的Z12特異性識別TNF-α的表位結(jié)構(gòu)及物理化學性質(zhì)特征，利用計算機輔助分子設(shè)計原理，從理論上設(shè)計能夠模擬抗體Z12的短肽。利用生物學手段，對短肽進行生物學評價。
本發(fā)明通過上述策略獲得了對抗原(TNF-α)-抗體(Z12)的特異性結(jié)合具有顯著抑制作用的Z12拮抗肽。
本發(fā)明的方法可參見所附流程圖(圖7)。


圖1.1抗體Z12的RT-PCR擴增產(chǎn)物。其中MDL2000；1Fd片斷基因2κ鏈基因。圖1.2含F(xiàn)d和κ鏈基因的重組子Z12的酶切鑒定。其中MDL2000；1pGEM-T Easy(Fd)/XhoI+SpeI；2pGEM-T Easy(κ)/Sac I+Xba I。
圖1.3Fd段測序結(jié)果。
圖1.4抗體Z12的κ鏈測序結(jié)果。
圖2.1利用ψ、ω及主鏈C原子旋光性ζ對抗體Z12重、輕鏈的二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測結(jié)果。
圖2.2利用Ramachandran圖對構(gòu)建的重、輕鏈可變區(qū)空間結(jié)構(gòu)進行合理性檢測。
圖2.3利用分子對接，借助分子力學、分子動力學模擬獲得的抗體Z12重、輕鏈相互作用的復合物穩(wěn)定空間構(gòu)象。圖中綠色部分代表抗體重鏈框架區(qū)(FR)，紅色部分代表抗體輕鏈框架區(qū)(FR)，紫色、橘紅色、淡蘭色分別代表重鏈CDR1、CDR2、CDR3，黃色、深蘭色、灰色分別代表輕鏈CDR1、CDR2、CDR3。
圖3.1分子力場下的TNF-α三維構(gòu)象。紅、綠、紫色飄帶分別代表TNF-α三聯(lián)體的每條單鏈，球體代表分子生物學實驗中獲得的TNF-α突變點。
圖3.2抗體Z12可變區(qū)基因CDR區(qū)表觀靜電分布。抗體Z12可變區(qū)基因CDR區(qū)表觀靜電分布(藍色代表正電區(qū)，紅色代表負電區(qū)，白色代表非電區(qū))圖3.3理論模擬獲得的TNF-α與Z12作用的穩(wěn)定空間構(gòu)象。理論模擬獲得的TNF-α與Z12作用的穩(wěn)定空間構(gòu)象(黃色、紅色、灰色分別代表TNF的三聯(lián)體模式；綠色、紫色代表抗體Z12可變區(qū)基因的FR，其中綠色代表輕鏈，紫色代表重鏈；橘紅、淺藍代表抗體Z12可變區(qū)基因的CDR，其中橘紅色代表輕鏈，淡藍色代表重鏈)圖4.1TNF-α與Z12作用復合物關(guān)鍵部位的確定。TNF-α與Z12作用復合物關(guān)鍵部位的確定(黃色線圖代表抗體Z12，綠色線圖代表TNF-α；球狀物代表作用區(qū)域，紫色球代表抗體CDR，綠色球代表TNF-α的141-146)。
圖4.2參與結(jié)合Z12的TNF-α識別區(qū)域模式圖。
圖4.3hTNF-α的大腸桿菌偏性密碼表及其對應(yīng)的氨基酸序列。
圖5.1pUTNF92-157重組質(zhì)粒構(gòu)建示意圖。
圖5.2pUTNFD53-91重組質(zhì)粒構(gòu)建示意圖。
圖5.3pGEX-2T與不同hTNF-α缺失體基因重組示意圖。①插入的外源基因為hTNF-α或hTNF92-157或hTNFD53-91或hTNFD29-88的編碼基因；②插入的外源基因為hTNF1-91編碼基因。
圖5.4重組質(zhì)粒的酶切鑒定。(A)pUTNF92-157；(B)pUTNFD53-91；(C)pUTNFD29-88；1重組質(zhì)粒pUTNF92-157；2pUTNF92-157/EcoN I；3pUTNF-α/EcoN I；4pUTNF92-157/HincII；5pUTNF-α/Hinc II；6pUTNF92-157/Hind III；7pUTNF-α/Hind III；8pUTNFD53-91/Nco I+Hind III 9pUTNFD29-88/NcoI+Hind III；10pUTNF-α/Nco I+Hind III。
圖5.5PCR擴增hTNF-α及其缺失體基因。
MDL20001PCR products of hTNF92-157(254bp)2PCR products of hTNFD29-88(347bp)3PCR products of hTNFD53-91(410bp)4PCR products of hTNF-α(527bp)。圖5.6重組質(zhì)粒的酶切鑒定。
MDL20001pGTNF92-157/EcoR I+BamH I2pGTNFD29-88/EcoR I+BamH I3pGTNFD53-91/EcoR I+BamH I4pGTNF-α/EcoR I+BamH I圖5.7pGTNF1-91重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定。
M1DL2000；M2λDNA/Hind III1hTNF-α/BamH I+Hinc II PCR產(chǎn)物；2hTNF-αPCR產(chǎn)物；3pGEX-2T/BamH I+Sma I；4，5pGTNF1-91/BamH I+EcoR I。
圖5.8hTNF-α缺失體基因測序圖。圖5.9經(jīng)IPTG誘導表達的融合蛋白的電泳分析。
(A)M蛋白質(zhì)分子量標記； 1GST(26kDa)；2GST/hTNF92-157(33kDa)；3GST/hTNFD29-88(37kDa)；4GST/hTNFD53-91(39kD)； 5GST/hTNF-α(43kDa)(B)M蛋白質(zhì)分子量標記； 1GST(26kDa)；2GST/hTNF92-157(33kDa)；3GST/hTNF 1-91(37kDa)；4GST/hTNF-α(43kDa)。
圖5.10Z12抗體的親和層析純化。(A)洗脫圖譜(B)蛋白電泳分析。
圖5.11融合蛋白的電轉(zhuǎn)移及與Z12抗體作用的Western-blot分析。
(A)蛋白電泳及轉(zhuǎn)移 (B)Western-blotM蛋白質(zhì)分子量標記；1GST(26kDa)；2GST/hTNF92-157(33kDa)；3GST/hTNFD29-88(37kDa)；4GST/hTNFD53-91(39kD)；5GST/hTNF-α(43kD)。
圖5.12融合蛋白的電轉(zhuǎn)移及與Z12抗體作用的Western-blot分析。
(A)蛋白電泳及轉(zhuǎn)移 (B)Western-blotM蛋白質(zhì)分子量標記；1GST(26kDa)；2GST/hTNF92-157(33kDa)；3GST/hTNF1-91(37kDa)；4GST/hTNF-α(43kDa)。圖5.13Z12抗體與hTNF-αN端和C端片段作用關(guān)系的ELISA檢測。圖5.14一步反向PCR法構(gòu)建hTNF-α缺失體示意圖。圖5.15PCR擴增產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳。MλDNA-HindIII片段；1引物1PCR擴增；2引物2 PCR擴增。
圖5.16重組質(zhì)粒的酶切鑒定。1pUTNF-α/Hinc II+Hind III；2pUTNFD141-146/Hinc II+Hind III；3pUTNF-α/Nco I+Hinc II；4pUTNFD29-36/Nco I+Hinc II。
圖5.17hTNF-α缺失蛋白表達的蛋白電泳分析。
1，2hTNF-α(17kDa)；3，4hTNFD141-146(16kDa)；5，6hTNFD29-36(16kDa)；7，8pUC18。
圖5.18hTNF-α及其缺失體對L929細胞的毒性檢測。
圖5.19Z12抗體與hTNF-α缺失體相互作用的ELISA分析。
圖6.1計算機輔助設(shè)計短肽與(TNF)3相互作用的復合物模型。
圖7基于抗原—抗體作用空間結(jié)構(gòu)信息進行新型藥物分子設(shè)計的流程圖。
具體實施例方式
包括以下7個部分1、TNF-α功能抗體Z12可變區(qū)基因的獲取2、抗體Z12可變區(qū)基因序列空間構(gòu)象的模擬3、抗體Z12可變區(qū)基因與TNF-α作用復合物的獲得4、抗體Z12可變區(qū)基因識別TNF-α抗原表位的確定5、利用分子生物學實驗對理論結(jié)果的驗證6、計算機輔助設(shè)計新型藥物分子7、競爭結(jié)合實驗及其它功能試驗1、抗TNF-α功能抗體Z12可變區(qū)基因的獲取1.1材料PCR產(chǎn)物克隆載體pGEM-T Easy購自Promega公司，克隆菌株JM109由本室凍存。
1.2雜交瘤細胞總RNA的提取及cDNA的合成復蘇雜交瘤(Z12)細胞，長成單層后，將其輕輕吹下，置于15ml試管中，在低速離心機上1000r/min離心10min，用生理鹽水洗滌兩次。加4ml生理鹽水重懸細胞，分裝于滅菌Ep管中。離心棄上清，加入1mlTRIzol Reagent溶液(Gibco公司)，使細胞裂解混勻，室溫靜置15-20min。每管加入0.2ml氯仿，振蕩混勻，室溫靜置10min。4℃12000r/min離心10min，小心吸取上層水相(含有細胞總RNA)置于另一滅菌Ep管中，加入0.5ml異丙醇混勻后室溫靜置10min。4℃12000r/min離心10min，棄上清，沉淀用1ml 75％無水乙醇洗兩遍。讓沉淀在室溫自然干燥(切勿抽干)，用20μl無RNAase的滅菌去離子水重懸RNA沉淀，置于冰浴立即用于cDNA的合成。
取約1-5μg細胞總RNA，加入隨機引物0.5μg，200μM dNTP，5×反轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)緩沖液4μl，用水補足使體積達18μl。將以上混合液于水浴中煮沸5min，并立即置于冰浴中冷卻，加入5U AMV反轉(zhuǎn)錄酶(Promega公司)。為防止RNA酶污染引起的RNA降解，在反應(yīng)體系中加入RNA酶抑制劑Rnasin 10-20U。將以上反應(yīng)體系混勻，42℃延伸1h后，于水浴中煮沸10min，離心待用。
1.3PCR擴增抗體Fd和κ鏈基因取上述合成的cDNA產(chǎn)物4μl作為模板，取用鼠抗體Fd和κ鏈基因的上下游引物各1uM，dNTP 200uM，10×Taq buffer 5μl，1U Taq酶，用水補足至50μl。PCR擴增條件為95℃ 5min；94℃ 1min，53℃ 1min，72℃ 1min 30個循環(huán)；72℃ 10min。
擴增用鼠抗體重鏈Fd段基因的5′端混合引物(共8條)序列如下5′--AC TCC CAGCTC GAGCTG(T)GTG C(G)AG TCA(T)GG--3′其中含有內(nèi)切酶XhoI的識別序列(劃線部分)。
擴增用鼠抗體重鏈Fd段基因的3′端引物序列如下5′--AGG CTTACT AGTACA ATC CCT GGG CAC AAT--3′其中含有內(nèi)切酶SpeI的識別序列(劃線部分)。
擴增用鼠抗體κ鏈基因的5′端混合引物(共7條)序列如下5′--CC AGT TCCGAG CTCGTT GTG ACT CAG GAA TCT--3′5′--CC AGT TCCGAG CTCGTG TTG ACG CAG CCG CCC--3′5′--CC AGT TCCGAG CTCGTG CTC ACC CAG TCT CCA--3′5′--CC AGT TCCGAG CTCCAG ATG ACC CAG TCT CCA--3′5′--CC AGA TGTGAG CTCGTG ATG ACC CAG ACT CCA--3′5′--CC AGA TGTGAG CTCGTC ATG ACC CAG TCT CCA--3′5′--CC AGT TCCGAG CTCGTG ATG ACA CAG TCT CCA--3′其中含有內(nèi)切酶SacI的識別序列(劃線部分)。
擴增用鼠抗體κ鏈基因的3′端引物序列如下5′--GCG CCGTCT AGAATT AAC ACT CAT TCC TGT TGAA--3′其中含有內(nèi)切酶XbaI的識別序列(劃線部分)。
1.4PCR產(chǎn)物的回收/純化使用北京鼎國生物公司的DNA片段快速純化/回收試劑盒，按其產(chǎn)品說明書進行。
1.5Fd和κ鏈基因的克隆與序列測定將Fd和κ鏈基因分別連入pGEM-T Easy載體，連接反應(yīng)體系如下回收純化的PCR擴增產(chǎn)物3μl，pGEM-T Easy載體1μl，T4 DNA連接酶1μl，2×T4 DNA連接酶buffer 5μl。將反應(yīng)溶液混勻，瞬時離心，室溫放置2h，便可用于轉(zhuǎn)化。將連接反應(yīng)產(chǎn)物10μl，轉(zhuǎn)化于大腸桿菌JM109中，涂板，37℃培養(yǎng)16-20h。挑取單克隆菌落，置4ml Amp+LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過夜。提取菌液質(zhì)粒。分別用XhoI+SpeI和SacI+XbaI雙酶切重組質(zhì)粒，鑒定切出的片段大小正確后，將菌液送上海博亞生物公司測序。
1.6抗體重、輕鏈可變區(qū)及CDR區(qū)序列的確定登錄美國國立生物信息中心(NCBI)的BLAST(基本局部對比搜索工具，Basic Local Alignment Search Tool)序列檢索網(wǎng)站http//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/，由剪貼板分別向文本框中粘貼Fd和κ鏈測序基因，選擇nr數(shù)據(jù)庫(包括GenBank、EMBL和DDBJ所收錄的所有非冗余序列，排除了EST、STS、GSS部分)，使用blastn程序進行序列相似性檢索。查詢序列相似性較高的基因(Query)的DNA序列文獻，根據(jù)CH1和CL基因相對保守的特性，確定目的基因(Sbjct)CH1或CL編碼區(qū)，然后查找目的基因頭部5′端引物序列所在位置，兩者之間的堿基序列基本就是編碼可變區(qū)氨基酸的基因序列?？赏ㄟ^已知同源基因的DNA序列記錄中的CDS(Coding Sequence，編碼序列)注釋，確定起始氨基酸。
將編碼可變區(qū)基因序列翻譯成氨基酸序列，以此序列為探針，在PDB數(shù)據(jù)庫中檢索，查詢序列相似性較高的蛋白(Query)的結(jié)構(gòu)特征，同時結(jié)合在Kabat免疫球蛋白氨基酸序列數(shù)據(jù)庫中的手工檢索結(jié)果，確定抗體的CDR區(qū)序列以及其它結(jié)構(gòu)特征如二硫鍵。
1.7RT-PCR擴增結(jié)果從分泌抗hTNF-α抗體的Z12雜交瘤細胞提取總RNA，經(jīng)RT-PCR擴增，可得到700bp左右大小的條帶(見圖1.1)，與Fd和κ鏈基因的大小一致。
1.8含F(xiàn)d和κ鏈基因的重組子的酶切鑒定在Taq酶催化下，進行PCR擴增得到的產(chǎn)物帶有poly(A)尾，利用此特點將擴增得到的抗體Fd和κ鏈基因產(chǎn)物直接連入pGEM-T Easy載體中。連接子轉(zhuǎn)化Ecoli JM109，擴增培養(yǎng)，并提取質(zhì)粒。由于用于擴增Fd和κ鏈基因的上下游引物的5′端分別帶有XhoI和SpeI(Fd)、SacI和XbaI(κ鏈)酶切位點，利用這兩組酶分別切割相應(yīng)的重組質(zhì)粒，均切出約700bp大小的條帶(見圖1.2)，與PCR擴增產(chǎn)物的大小一致，證明為正確的重組子。
1.9測序結(jié)果將經(jīng)酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒送公司測序，測序報告見圖1.3、1.4。具體的核苷酸序列見下面1.10節(jié)。
1.10抗體重輕鏈可變區(qū)基因的確定將Fd測序序列通過NCBI的BLAST命令檢索nr數(shù)據(jù)庫，并進行同源性分析，檢索程序為blastn，即核酸序列對核酸數(shù)據(jù)庫的檢索。檢索出來的前100條基因均為鼠(Mus Musculus)抗體(IgG1/antibody)重鏈可變區(qū)(heavy chain variable region)或Fd區(qū)(VH+CH1)基因(mRNA)，序列相似性均在93％以上。
查詢其中一些已公開的DNA序列文獻，以檢索號為AB048527、gi號為13359422的核苷酸序列為例，將該CDS中“C_region”(murineantibody heavy chain CH1 region)指示的核苷酸序列對應(yīng)到目的基因中(見下頁Fd測序基因中的斜體字母)，發(fā)現(xiàn)二者之間此部位序列完全一致。鑒于CH1區(qū)比較保守，從而確定了目的基因的CH1編碼區(qū)，在此之前的序列即是VH區(qū)編碼序列。
在測序基因頭部搜索出5′端引物序列(引物通過PCR擴增，被直接連入pGEM-T Easy載體中)用陰影表示，黑框中字母代表5′端引物中的限制酶識別序列。結(jié)合同源基因CDS記錄中的VH編碼信息，確定VH起始核苷酸，從而確定VH編碼區(qū)(用浪線表示)。
Z12抗體Fd(VH+CH1)測序基因(594bp)GGGCCCGACGTCGCATGCTCCCGGCCGCCATGGCGGCCGCGGGAATTCGATT TCAGCCAA
AACGACACCCCCATCTGTCTATCCACTGGCCCCTGGATCTGCTGCCCAAACTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTGACAGTGAGCTGGAACTCTGGATCCCTGTCCAGCGGTGTGCACAGCTTCCCAGCTTGTCTGGCN同樣地，先確定κ鏈CL編碼區(qū)，然后確定編碼可變區(qū)基因。
Z12抗體κ鏈(VL+CL)測序基因(593bp)GTCGCATGCTCCCGGCCGCCATGGCGGCCGCGGGAATTCGATT CGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAGTGAGCAGTTAACATCTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCTTCTTGAACAACTTCTACCCCAAAGACATCAATGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACGACAAAAATGGCGTCCTGAACAGTTGGGACTGGTCANGGACAGGCAAAAGACAGCACCTACC將編碼可變區(qū)的核苷酸序列翻譯成相應(yīng)的氨基酸序列。
抗hTNF-α單克隆抗體(Z12)重輕鏈可變區(qū)序列VH Seqyence Lebgth363bp 121aa 1 Q L ELVESGGGLVKSG15 16 G SLKLSCAASGFAFN30 31 N YDMSWVRQTPERRL45 46 E WVAYINTGGGYTYY60 61 P DTVKGRFTISRDNA75 76 K NTLYLQMSSLRSED90 91 T AMYYCASERYDGLY105 10 6YAMDYWGQGTSVTVS 120(VH Sequce3-9位堿基為XhoI識別序列CAGCTC GAGCTT)VL Sequence Length339bp 113aa 1 E LQMTQSPSSLAVSA15 16 G EKVTMSCKSSQSLL30 31 N SRTRKNYLAWYQQK45 46 P GQSPKLLIYWASTR60 61 E SGVPDRFTGSGSGT75 76 D FTLTISGVQAEDLA90 91 V YYCKQSYNLPWTFG105 106GGTKLEIK 113(VL sequence 1-6位堿基為SacI識別序列1GAG CTC)1.11抗體重、輕鏈CDR區(qū)的確定根據(jù)Kabat分類方案，對釣取的Z12抗體可變區(qū)基因輕、重鏈的CDR區(qū)進行分析。
2、抗體Z12可變區(qū)基因空間構(gòu)象模擬利用www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST以及www.nih.gov/FASTA序列比較方法，通過蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(PDB)檢索，獲得序列相似性高于75％的抗體Z12可變區(qū)基因重鏈序列的同源模板蛋白(PDB注冊號1AR1(83％)、1IGT(81％)、1HFN(78％)、1KFA(77％)、1OPG(76％)、1QKZ(76％)，括號內(nèi)的百分數(shù)代表與Z12重鏈的序列相似性程度)以及序列相似性高于80％的抗體Z12可變區(qū)基因輕鏈序列的同源模板蛋白(PDB注冊號1H3P(88％)、1A3R(84％)、1A5F(83％)、1AP2(83％)、1SRS(82％)、1MCP(82％)、1IFH(81％))。
利用序列分析結(jié)果，通過二面角(ψ、ω)的統(tǒng)計分析對抗體Z12重、輕鏈二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測分析。圖2.1給出了利用ψ、ω及主鏈C原子旋光性ζ對抗體Z12重、輕鏈的二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測的結(jié)果。
借助圖形工作站Octane2(R12000)，利用InsightII(2000)程序包的Homology模塊，以上述具有晶體結(jié)構(gòu)的抗體分子為模板，構(gòu)建Z12抗體可變區(qū)重、輕鏈的三維構(gòu)象。
在CVFF、Gromos力場下，依次利用最陡下降(收斂步驟10,000步，收斂判據(jù)0.01KJ/mol)、共軛梯度(收斂步驟20,000步，收斂判據(jù)0.01KJ/mol)、牛頓力學(收斂步驟25,000步，收斂判據(jù)0.001KJ/mol)三種分子力學方法對獲得的Z12重、輕鏈的初始構(gòu)象進行優(yōu)化。
利用Ramachandran圖對優(yōu)化獲得的抗體Z12重、輕鏈空間構(gòu)象進行合理性檢測，圖2.2給出了檢測結(jié)果。圖中以顏色差異標注殘基構(gòu)象的合理性程度由于甘氨酸(Gly)柔韌性大，沒有側(cè)鏈，脯氨酸(Pro)為轉(zhuǎn)角氨基酸，在評價過程中不考慮上述兩種氨基酸構(gòu)象的合理性；圖中紅色區(qū)域代表構(gòu)象匹配最佳區(qū)，深黃色區(qū)域代表殘基構(gòu)象允許區(qū)，土黃色區(qū)域代表殘基構(gòu)象尚可，白色區(qū)域代表殘基構(gòu)象為可能誤差較大的區(qū)域。從圖中可以看出，獲得的預(yù)測結(jié)構(gòu)是合理的重鏈可變區(qū)所有殘基構(gòu)象均模擬合適，輕鏈構(gòu)象稍有缺陷，其中的7個殘基構(gòu)象不確定，然而整個構(gòu)象還是趨于合理的。
利用抗體可變區(qū)基因重、輕鏈作用模式，通過CDR區(qū)、表面結(jié)構(gòu)特征，結(jié)合單鏈抗體ScFv結(jié)構(gòu)特征，通過分子對接的方法獲得了抗體重、輕鏈相互作用的復合物模型，在相關(guān)力場(CVFF、Gromos)下，通過分子力學、分子動力學常溫模擬獲得抗體Z12重、輕鏈相互作用的復合物穩(wěn)定空間構(gòu)象。圖2.3給出了抗體Z12重、輕鏈相互作用的復合物結(jié)構(gòu)。
3、抗體Z12與TNF作用復合物空間構(gòu)象的獲得以TNF-α晶體結(jié)構(gòu)(PDB號1tnf)為模板，選擇與抗體模擬時相同的力場參數(shù)，構(gòu)建理論的TNF-α結(jié)構(gòu)。結(jié)合分子生物學突變實驗，對TNF-α的實驗突變點進行空間定位。圖3.1給出了理論模擬獲得的TNF-α空間構(gòu)象。
以模擬的TNF-α三維構(gòu)象、Z12抗體可變區(qū)空間結(jié)構(gòu)為模板，利用分子對接的方法從理論上模擬TNF-α與Z12抗體相互作用的復合物模型，在分子對接的過程中，考慮溶劑效應(yīng)的影響。
通過分析TNF-α突變點的空間定位、表觀靜電分布、可及性表面積等參數(shù)，考察抗體Z12可變區(qū)基因CDR區(qū)相關(guān)參數(shù)(圖3.2)，通過動態(tài)模擬，以形成分子間氫鍵數(shù)目多、相互作用能低為評價標準，從理論上構(gòu)建TNF-α與Z12相互作用的復合物結(jié)構(gòu)。
獲得的初始復合物模型，選擇CVFF/Gromos力場，依次經(jīng)過最陡下降(收斂判據(jù)0.05KJ/mol，收斂步驟40,000步)、共軛梯度(收斂判據(jù)0.01KJ/mol，收斂步驟60,000步)、牛頓力學(收斂判據(jù)0.005KJ/mol，收斂步驟80,000步)進行構(gòu)型能量最小化處理；在考慮溶劑效應(yīng)的情況下，利用常溫分子動力學優(yōu)化的方法，對其進行模擬優(yōu)化處理。圖3.3給出了TNF-α與Z12抗體作用的復合物空間構(gòu)象。
4、抗體Z12可變區(qū)基因識別TNF-α抗原表位的確定利用分子間氫鍵理論對TNF-α與抗體Z12相互作用的復合物模型進行分析，表4.1列出了參與形成抗原—抗體作用復合物分子間氫鍵的給體(Donor)、受體(Acceptor)、距離()以及所成的角度。表中不同的背景顏色將抗體的CDR區(qū)進行了分類?？贵w可變區(qū)基因重鏈CDR2、輕鏈CDR3參與同抗原TNF-α的作用；TNF-α的135-148位殘基主要參與結(jié)合抗體重鏈CDR2，TNF-α的84-92位殘基主要參與結(jié)合抗體輕鏈CDR3。
為了進一步探討TNF-α與抗體Z12的相互作用，通過反應(yīng)自由能理論對其作用能進行計算，結(jié)果列于表4.2中。其中Van der Waals能量由排斥能及色散能組成，靜電能僅為Van der Waals能的一半，抗原TNF-α與抗體Z12的作用以疏水作用、極性作用及鹽橋作用為主，結(jié)合表4.1可以看出，抗體重鏈CDR2與TNF-α的135-148位殘基恰好以上述方式作用。
進一步利用計算機圖形學技術(shù)、距離幾何學方法，從TNF-α與Z12作用復合物模型可以獲得TNF-α與Z12作用的主要區(qū)域位于141-146。圖4.1給出了TNF-α與Z12作用的模式圖，圖中的球狀體為TNF-α與Z12作用的關(guān)鍵部位。
針對TNF-α與Z12作用模式，通過親疏水性對TNF-α參與作用的區(qū)域進行分析，圖4.2給出了抗原TNF-α參與作用區(qū)域的分布模式?？梢赃M一步確定，TNF-α的141-146位為Z12抗體特異性識別的重要區(qū)域。
5、利用分子生物學實驗對理論結(jié)果的驗證首先通過缺失方法將hTNF-α分段表達，根據(jù)Western-blot和ELISA實驗結(jié)果確定Z12抗體識別的hTNF-α片段。雖然用這種方法確定的抗原表位區(qū)域較大，但它可為進一步的表位研究工作提供有利的參考。
5.1材料與方法5.1.1材料質(zhì)粒pUTNF-α|2.1|是由本實驗室根據(jù)已發(fā)表的hTNF-α的氨基酸和核苷酸序列，用大腸桿菌偏性密碼人工合成其全長CDNA(見表5.1)，再克隆到pUC18質(zhì)粒載體上，將此重組子命名為pUTNF-α。克隆及表達宿主菌均為E.coli JM109或DH5α。以上質(zhì)粒、菌株及載體均由本室凍存。
融合表達載體pGEX-2T及菌株E.coli BL21(DE3)由本室凍存，誘導表達的藥物IPTG購自Sigma公司。
工具酶限制性內(nèi)切酶均購自BioLab公司。E.coli Klenow pol購自TaKaRa公司。T4 DNA Ligase購自Gibco公司。
ELISA所用試劑包被液0.015mol/L PH9.6碳酸鹽緩沖液(NaCO31.59g，NaHCO32.93g，H2O定容至1L)。封閉液10％牛血清蛋白。辣根過氧化物酶標記的兔抗鼠抗體(HRP-RAM)由本實驗室制備并純化。顯色底物鄰苯二胺(OPD)購自Sigma公司。終止液2mol/L H2SO4。
5.1.2基本實驗操作質(zhì)粒提取(1)堿裂解法，參照《分子克隆實驗指南》第二版(第一章第三節(jié))。(2)質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖校┐蠊井a(chǎn)品，按說明書進行。
質(zhì)粒的酶切(1)單酶切質(zhì)粒DNA 2～5μg，10×酶切反應(yīng)緩沖液2μl，限制性內(nèi)切酶10U，滅菌去離子水補足至20μl。37℃溫育1～3h。(2)雙酶切質(zhì)粒DNA 2～5μg，10×酶切反應(yīng)緩沖液2μl，兩種限制酶各10U，滅菌去離子水補足至20μl。37℃溫育1～3h。應(yīng)選兩種酶均合適的緩沖液。在進行雙酶切實驗前，先行單酶切反應(yīng)，瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果，確保兩個酶在同一緩沖液中單獨能將質(zhì)粒消化完全。
蘺落PCR在對單菌落進行擴增、提取質(zhì)粒做酶切鑒定之前，先行菌落PCR，挑取陽性克隆再進行酶切鑒定，可減少酶切實驗的盲目性。使用200μl無菌吸頭挑取分散良好的單克隆菌落，將其置于1.5ml微量離心管中，加入50μl無菌的去離子水，用旋渦振蕩器充分混勻。取5μl混合液用于25μl PCR反應(yīng)，其余置于4℃冰箱保存。
反應(yīng)體系 dNTP(2.5mM) 2μl引物(50uM) 各0.5μl10×Taq buffer 2.5μlTaq(5U/μl) 0.2/μl總體積25uL一旦電泳結(jié)果顯示為可疑的陽性菌落，將剩余的菌液于3ml含Amp的LB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)過夜，然后提取質(zhì)粒DNA進行酶切鑒定。
DNA片段的回收/純化 使用北京鼎國生物公司的DNA片段快速純化/回收試劑盒，按其產(chǎn)品說明書進行。
3’凹端的補平反應(yīng)3’凹端產(chǎn)物(載體大片段)0.5～1μg，10×Klenow buffer 2μl，E.coli Klenow pol 1μl(5U)，dNTP(2.5mmol/L)1μl，滅菌去離子水補足至20μl。37℃，反應(yīng)30min。70℃5min或在反應(yīng)液中加入1μl 0.5mol/L的EDTA溶液，以滅活Klenow，終止反應(yīng)。
連接反應(yīng)(1)分子內(nèi)連接具有雙平滑末端的大分子DNA 6μl(約50-100ng)，5×T4連接酶buffer 3μl，T4連接酶1μl(10U)，滅菌水5μl。室溫連接2h或更長時間。(2)分子間連接載體3μl(約30-60ng)，DNA片段5μl(約60-120ng)，5×T4連接酶buffer 3μl，T4連接酶1μl(10U)，滅菌水3μl。室溫連接2h或更長時間。
大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備與轉(zhuǎn)化用CaCl2法制備大腸桿菌感受態(tài)細胞，參照《分子克隆實驗指南》第二版(第一章第五節(jié))。將盛有感受態(tài)細胞的凍存管先放入冰中，置4℃冰箱中過夜，之后再置-70℃液氮中保存，可產(chǎn)生高頻轉(zhuǎn)化效率。轉(zhuǎn)化時，100μl感受態(tài)細胞中加入質(zhì)粒0.5μl或加入DNA連接產(chǎn)物8μl。
蛋白電泳、轉(zhuǎn)移及Western-blot參照《分子克隆實驗指南》(第二版)相關(guān)章節(jié)。電轉(zhuǎn)移所用儀器為‘Bio-Rad PowerPAC 200’。
5.1.3hTNF-α缺失體及C端片段基因的克隆hTNF92-157(只保留hTNF-αC端92-157位氨基酸)基因的克隆在pUTNF-α質(zhì)粒中，起始密碼ATG位置處有Nco I酶切位點，平端切割酶Hinc II的識別部位恰好在編碼hTNF-α第92位氨基酸的密碼子之前(見圖5.1)。用上述兩個酶共同消化pUTNF-α質(zhì)粒，回收的大片段只保留了hTNF-α92-157位氨基酸的編碼基因。利用E.coli Klenow pol將Nco I切割產(chǎn)生的3’凹端補平，恰好獲得起始碼ATG。在T4 DNA Ligase的催化下，兩平端首尾連接，使ATG后面接上hTNF-α92-157位氨基酸的編碼基因，將其重組質(zhì)粒命名為pUTNF92-157(見圖5.1)。
hTNFD53-91(缺失hTNF-α中間53-91位氨基酸)基因的克隆其原理及操作過程與上述pUTNF92-157重組子基本一致。用EcoN I和Hinc II雙酶切pUTNF-α質(zhì)粒，E.coli Klenow pol補平EcoN I消化后產(chǎn)生的3’凹端，進行分子內(nèi)連接，從而去除hTNF-α53-91位氨基酸的編碼基因。將此重組質(zhì)粒命名為pUTNFD53-91(見圖5.2)。
hTNF D29-88(缺失hTNF-α中間29-88位氨基酸)基因的克隆應(yīng)用一步反向PCR方法構(gòu)建hTNF D29-88基因與pUC18的重組質(zhì)粒，將其命名為pUTNFD29-88。操作步驟及原理示意圖參見第二部分二、1.8節(jié)。
對以上重組質(zhì)粒進行酶切鑒定及測序。
5.1.4pGEX-2T與hTNF-α、hTNF92-157、hTNFD53-91和hTNFD29-88融合重組子的構(gòu)建hTNF-α在pUC18載體上無需誘導便可獲得高表達，而上述缺失體即使在誘導的條件下也不能表達。因此，將缺失體基因重組到pGEX-2T融合表達載體上，獲得缺失蛋白的表達。在hTNF-α及上述缺失體與pUC18重組的質(zhì)粒中，編碼基因的起始碼之前、終止碼之后的序列完全一致，因此參照起始碼和終止碼附近的序列，設(shè)計一對引物，同時擴增hTNF-α及其缺失體基因。引物序列如下上游引物5’-CGCGGA TCCGAG GAA AAA ACC ATG-3’(劃線部分為BamHI酶切位點)。
下游引物5’-CCGGAA TTCAAG CTT GGC TGC AGT-3’(劃線部分為EcoRI酶切位點)。
取質(zhì)粒0.2μl，上下游引物各1μM，dNTP 200μM，10×Pyrobest buffer5μl，1U Pyrobest，用水補足至50μl。PCR擴增條件為95℃5min；94℃45s，52℃45s，72℃45s，30個循環(huán)；72℃5min。
回收的PCR產(chǎn)物經(jīng)BamH I和EcoR I雙酶切，與經(jīng)同樣處理的pGEX-2T載體連接，從而將外源基因連在GST編碼基因的尾部(見圖5.3中①)。重組質(zhì)粒分別命名為pGTNF-α、pGTNF92-157、pGTNFD53-91和pGTNFD29-88。
5.1.5pGEX-2T與hTNF1-91(只保留hTNF-αN端1-91位氨基酸)融合重組子的構(gòu)建平端切割酶Hinc II的識別位點恰好在編碼hTNF-α第91位氨基酸的堿基末端，而pGEX-2T載體的多克隆位點中也有另一平端切割酶SmaI的識別位點，用BamH I和HincII同時切割擴增hTNF-α全長基因的PCR產(chǎn)物，與經(jīng)BamH I和Sma I處理過的載體片段進行平-粘端連接，從而構(gòu)建pGEX-2T/hTNF1-91重組質(zhì)粒(見圖5.3中②)，將其命名為pGTNF1-91。
5.1.6融合蛋白的誘導表達將上述重組子轉(zhuǎn)化E.coli DH5α宿主菌，提取的質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定及測序正確后，轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)宿主菌，用轉(zhuǎn)化pGEX-2T空載體的菌株作對照，在1mmol/L的IPTG誘導下進行小量表達實驗，并用12％的SDS-PAGE檢測表達情況。挑選表達量最高的菌株進行大量表達。將菌體培養(yǎng)至A600＝0.3～0.6時，用終濃度為1mmol/L IPTG于37℃誘導4h，8000r/min離心10min收獲菌體，超聲破碎后，8000r/min離心30min，收集上清，采用紫外吸收法定量蛋白質(zhì)，按以下公式計算蛋白含量(mg/ml)(1.45×A280-0.74×A260)×稀釋倍數(shù)。
5.1.7抗hTNF-α單抗Z12的制備與純化將穩(wěn)定分泌抗hTNF-α單抗Z12(屬IgG1亞類)的雜交瘤細胞擴大培養(yǎng)后，接種于BLAB/c小鼠腹腔，一周后收集腹水，間隔2-3天待腹水積聚后再次抽取。用0.45μm孔徑的微孔膜過濾腹水，除去較大的固體顆粒、纖維蛋白凝塊及脂肪滴。然后，12000r/min離心15min，除去細胞殘渣以及小顆粒物質(zhì)，收集上清，備用。
取經(jīng)上述預(yù)處理的小鼠腹水Xml，加等量生理鹽水稀釋，冰浴下，滴加飽和硫酸銨2Xml使達50％飽和度，邊滴加邊攪拌。將溶液置4℃2h以上。室溫平衡后，3000r/min離心30min，棄上清，沉淀用2Xml生理鹽水溶解，逐滴加入飽和硫酸銨Xml，邊滴加邊攪拌，使達33％飽和度，置4℃2h以上。室溫平衡后，離心處理，沉淀用少量PBS溶解，此種鹽析后所得物質(zhì)即為IgG粗提物。
IgG粗提物對0.1mol/L PB(PH8.0)透析后，上樣于Protein A-Sephorase CL-4B親和層析柱，用相同PB緩沖液洗脫雜蛋白后，用PH6.0的0.1mol/L檸檬酸緩沖液洗脫目的蛋白(IgG1)，收集該洗脫峰的流出液，并立即用10mmol/L PB PH8.0緩沖液中和并對其透析。濃縮純化的樣品。
5.1.8Z12抗體識別hTNF-α缺失體的Western-blot分析hTNF-α缺失體蛋白經(jīng)SDS-PAGE，電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜上，剪下Marker，置氨基黑溶液中顯色。將轉(zhuǎn)印有蛋白的濾膜用5％脫脂奶粉封閉，4℃過夜。倒掉封閉液，用TBS-T充分洗滌濾膜3次，每次10min。將濾膜放入比其稍大一些的塑料袋中，按每平方厘米0.1ml的量加入5μg/mL的Z12抗體溶液，用塑封機將袋口封閉，于室溫平緩搖動1h。取出膜，用TBS-T洗滌，加入二抗(HRP-RAM)，于室溫平緩搖動40min。立刻用清水洗去麗春紅，使膜恢復到染色前的顏色，并進行封閉。TBS-T洗滌后，用DAB顯色。
5.1.9Z12抗體識別hTNF-α缺失體的ELISA分析(1)將抗原溶液用包被液稀釋成不同濃度，96孔板上每孔加50μl，重復3個孔，用包被液做空白對照，濕盒中4℃過夜或37℃2h。倒掉板子中的反應(yīng)液，在每一次加入下一步實驗所用試劑前，用PBS-T充分洗滌，除去未吸附的抗原或抗體，盡可能降低非特異性反應(yīng)。(2)每孔加200μl 10％小牛血清(FCS，用PBS稀釋)，進行封閉，37℃ 1h或4℃過夜。(3)加入純化的Z12抗體(5μg/mL)，每孔50μl，37℃ 1h或4℃過夜。(4)加入HRP-RAM二抗，每孔50μl，37℃或室溫40min。(5)用OPD做底物顯色，避光5-10min至反應(yīng)孔變?yōu)辄S色，并以空白對照孔不變色為準，立即用50μl 2N H2SO4終止反應(yīng)，此時反應(yīng)孔變?yōu)槌燃t色。在490nm波長下測定A值。
5.2結(jié)果5.2.1hTNF-α缺失體基因(pUC18)的酶切鑒定與表達構(gòu)建正確的pUTNF92-157質(zhì)粒，Nco I和Hinc II酶切位點消失；在被去除的編碼hTNF-α1-91位氨基酸的堿基序列中，含有EcoN I識別序列，因此EcoN I酶切位點也相應(yīng)消失。分別用EcoN I和Hinc II切割pUTNF92-157，得到的產(chǎn)物將成質(zhì)粒的條帶形狀。由于Hind III酶切位點依然存在，因此被其消化后，pUTNF92-157同pUTNF-α一樣呈現(xiàn)一條線形條帶(見圖5.4A)。
在pUTNF-α質(zhì)粒中，編碼基因的起始碼之前和終止碼之后分別有Nco I和Hind III酶切位點，用它們同時消化可得到494bp的小片段。pUTNFD53-91和pUTNFD29-88重組子分別缺失39aa(117bp)和60aa(180bp)，因此用Nco I和Hind III雙酶切分別得到377bp(見圖5.4B)和314bp(見圖5.4C)的小片段。
酶切結(jié)果均與預(yù)期的相符，證實獲得了正確的重組子。測序結(jié)果表明，缺失體基因完全正確(圖略)。將重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化E.coli JM109和DH5α感受態(tài)細胞，在無誘導或IPTG誘導的條件下，以上hTNF-α缺失基因在pUC18載體中均無表達(圖略)。
5.2.2融合重組子的構(gòu)建與鑒定由于構(gòu)建在pUC18載體上的hTNF-α缺失基因無法獲得表達，因此將以上基因轉(zhuǎn)移到pGEX-2T載體中，期望以融合方式獲得表達。設(shè)計一對通用引物，同時擴增保存在pUC18載體上的hTNF-α、hTNF92-157、hTNFD53-91和hTNFD29-88基因(見圖5.5)。利用限制性內(nèi)切酶BamHI和EcoR I，將以上基因插入到pGEX-2T載體中，并用這兩個酶鑒定，1％瓊脂糖電泳結(jié)果表明均切出了預(yù)期大小的片段(見圖5.6)，獲得了正確的重組子。
按5.1.5節(jié)所述方法構(gòu)建pGTNF1-91重組質(zhì)粒首先以BamH I和Hinc II切割hTNF-α全長基因的擴增產(chǎn)物，切膠回收294bp的片段，與經(jīng)BamH I和Sma I切割并純化的載體大片段進行平-粘端連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化E.coli JM109，挑取單菌落，擴增培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，以BamH I和EcoR I雙酶切鑒定，切出了297bp的小片段(圖5.7)，證實獲得了正確的重組子。
對以上所有重組子進行測序，結(jié)果表明基因完全正確(圖5.8)。
5.2.3融合蛋白的誘導表達將5.1.3和5.1.4節(jié)中的融合重組子轉(zhuǎn)化E.coli BL21(DE3)，以IPTG誘導表達，用適量的PBS懸浮離心后的菌體沉淀，反復凍融后進行超聲破碎。12％SDS-PAGE結(jié)果表明，幾種融合蛋白均獲得了可溶性的高表達，且經(jīng)IPTG誘導后4h，融合蛋白的表達量達到最大值，進一步延長誘導時間并不能提高表達效率?？蛰d體經(jīng)誘導，自身表達分子量在26kDa的谷胱苷肽S轉(zhuǎn)移酶(GST)，而hTNF-α、hTNFD53-91、hTNFD29-88、hTNF92-157和hTNF1-91與GST融合的分子量分別為43、39、37、33和37kDa(見圖5.9)。
5.2.4Z12抗體的純化
Protem A-Sepharose CL-4B干粉在0.1mol/L PB(PH8.0)中溶漲30min，然后裝入層析柱中，用同樣緩沖液平衡。PH為8.0時，A蛋白只與小鼠IgG結(jié)合，從而與其它類別的Ig和雜質(zhì)分開。待雜蛋白峰回復到基線后，換用PH6.0的檸檬酸buffer洗脫，并收集此洗脫峰的流出液。在PH6.0時，IgG1首先被洗脫下來，從而與其它亞類(IgG2a、IgG2b和IgG3)分開。此后用PH3.0洗脫條件，將所有吸附在A蛋白上的IgG類物質(zhì)洗脫下來，使親和層析柱獲得再生，用于下一次純化(見圖5.10A)。收集液對50倍其體積的0.01mol/L PB(PH8.0)透析12～24h，其間換液2～3次。將樣品凍干，取少量干粉，溶于適量PBS(PH7.0)中，在紫外分光光度計上測定OD280值，按下面公式計算抗體溶液濃度(mg/ml)(OD280÷1.4)×稀釋倍數(shù)。取少量樣品行10％SDS-PAGE，電泳結(jié)果顯示，純化的Z12抗體分子量在120～150kDa，純度在90％以上(見圖5.10B)。此后所有使用Z12抗體的實驗中，所用抗體試劑均為同一批次純化的樣品。
5.2.5 Z12抗體識別hTNF92-157、hTNFD53-91和hTNFD29-88的Western-blot分析融合蛋白經(jīng)12％的SDS-PAGE，電轉(zhuǎn)移(40V，恒壓，65min)到硝酸纖維素濾膜上。用麗春紅染膜，顯色結(jié)果表明蛋白轉(zhuǎn)移比較完全。剪下Marker，置氨基黑溶液中顯色。立刻用清水洗去麗春紅，使膜恢復到染色前的顏色，并進行封閉。按照Western-blot操作步驟，進行免疫印跡分析，最終用DAB顯色。結(jié)果表明Z12抗體特異性識別含有hTNF-α、hTNF92-157、hTNFD53-91和hTNFD29-88的融合蛋白，而同空載體自身表達的GST無交叉反應(yīng)(見圖5.11)。這幾個融合蛋白的共同部位是hTNF-α92-157區(qū)，提示Z12抗體識別的抗原決定簇位于hTNF-α92-157區(qū)中。
5.2.6Z12抗體不識別hTNF1-91的Western-blot分析通過前面的工作，我們認為Z12抗體識別的抗原表位位于hTNF-αC端92-157區(qū)，反過來講，若將hTNF-αN端1-91區(qū)單獨表達，抗體應(yīng)該是不識別的。Western-blot結(jié)果(圖5.12)表明Z12抗體不識別GST與hTNF1-91組成的融合蛋白，從反面證實了上面的結(jié)論，即Z12抗體特異性識別hTNF-α92-157區(qū)。
5.2.7Z12抗體與hTNF-αN端和C端片段作用關(guān)系的ELISA檢測ELISA結(jié)果(圖5.13)與前面Western-blot結(jié)果一致，證實Z12抗體識別hTNF-αC端92-157區(qū)，而不識別N端1-91區(qū)。
5.3Z12抗體識別的抗原表位的確定前面的實驗研究使我們確定了Z12抗體識別的抗原區(qū)域位于hTNF-αC端92-157區(qū)。利用計算機模擬方法預(yù)測的抗體識別表位(hTNF-α141-146位氨基酸)恰好在此區(qū)域中，初步驗證了預(yù)測結(jié)果的可靠性。利用反證法，即將hTNF-α141-146位氨基酸殘基缺失掉，檢測缺失蛋白與Z12抗體之間相互作用關(guān)系的變化，從而確定hTNF-α141-146部位是否是Z12抗體識別的抗原表位。
5.3.1材料與方法5.3.1.1材料缺失蛋白的克隆、表達載體均為pUC18，宿主菌為E.coli JM109。
工具酶限制性內(nèi)切酶均購自BioLab公司。T4 DNA Ligase購自Gibco公司。高保真DNA擴增酶PyrobestTM及其相關(guān)試劑購自TaKaRa公司。T4多聚核苷酸激酶(T4 PNK)和ATP購自TaKaRa公司。
Z12抗體的制備與純化參見5.1.7節(jié)。HRP-RAM二抗由本實驗室制備并保存。
L929細胞由本室凍存。放射菌素D購自Fluka公司。
其它試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。
5.3.1.2寡核苷酸引物的分析與合成利用Goldkey軟件分析設(shè)計好的引物，確保引物內(nèi)無發(fā)夾結(jié)構(gòu)，引物間無二聚體形成，引物與模板其它部位無特異性結(jié)合。之后，將引物序列送上海生工生物工程有限公司合成。
引物1P55’-TCTGGTCAGGTTTACTTC-3’；引物1P35’-GTCAGGACGGTTGATTTC-3’引物2P55’-CTGGCTAACGGTGTTGAA-3’引物2P35’-CCACTGCAGCTGACCTTC-3’引物1用來制造hTNF-α第141-146位缺失突變體(以下稱hTNFD141-146，其重組質(zhì)粒用pUTNFD141-146表示)擴增產(chǎn)物長度約2660bp；引物2用來制造hTNF第29-36位缺失突變體(以下稱hTNFD29-36，其重組質(zhì)粒用pUTNFD29-36表示)，擴增產(chǎn)物長度約2650bp。
5.3.1.3PCR擴增反應(yīng)體系模板0.1ug，上下游引物各1μmol/L，dNTPs 200μmol/L，10×Pyrobest buffer 5μl，Pyrobest 1U，滅菌去離子水補足至50μl，加50ul石蠟油于反應(yīng)液表面。反應(yīng)條件95℃變性5min；94℃1min，56℃1min，72℃3min(按1kb DNA 72℃延伸1min計算)擴增35個循環(huán)；72℃延伸10min。
5.3.1.4PCR擴增產(chǎn)物的回收/純化使用北京鼎國生物公司的DNA快速純化/回收試劑盒，按產(chǎn)品說明書進行。
5.3.1.5PCR產(chǎn)物5’末端磷酸化回收純化的PCR產(chǎn)物0.5μg，200mmol/L ATP 0.5μl，10×T4 PNKbuffer 2.5μl，T4 PNK 5U，滅菌去離子水補足至25μl。將反應(yīng)液混勻，置37℃水浴中30min，之后68℃10min滅活T4 PNK。
5.3.1.6線性DNA的自身環(huán)化取經(jīng)1.4步驟處理的PCR產(chǎn)物5μL(約0.1μg)，T4 DNA Ligase 5×Buffer 3μl，T4 DNA Ligase 1μL(5U)，滅菌去離子水6μL，使反應(yīng)總體積為15μL。室溫或4℃連接過夜。
5.3.1.7DNA的轉(zhuǎn)化、提取和酶切鑒定參照《分子克隆實驗指南》相關(guān)章節(jié)。
5.3.1.8hTNF-α缺失體重組質(zhì)粒的構(gòu)建與表達引物1、2分別以pUTNF-α環(huán)形質(zhì)粒為模板，在Pyrobest催化下沿相反方向進行PCR擴增?；厥占兓疨CR產(chǎn)物，使其實現(xiàn)5’末端磷酸化，之后利用T4 DNA Ligase使N端已行磷酸化的線性分子實現(xiàn)分子內(nèi)連接(見圖5.14)。轉(zhuǎn)化E.coli JM109感受態(tài)細胞，作菌落PCR初步篩選可疑菌。擴增培養(yǎng)，提取質(zhì)粒后酶切鑒定，測序。
將酶切及測序正確的質(zhì)粒重新轉(zhuǎn)化、涂板，挑單克隆在Amp抗性的LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)過夜，用轉(zhuǎn)化pUTNF-α質(zhì)粒的菌株作陽性對照，用轉(zhuǎn)化pUC18空載體的菌株作陰性對照。離心收獲的菌體沉淀，用適量PBS溶液懸浮，超聲破碎，離心收獲上清，采用紫外吸收法定量上清中蛋白含量(mg/ml)(1.45×A280-0.74×A260)×稀釋倍數(shù)。
5.3.1.9hTNF-α及其缺失體生物活性的測定復蘇L929細胞，待其長滿單層后，用0.025％胰酶消化，重懸細胞于RPMI-1640培養(yǎng)液中，調(diào)細胞濃度為3×104/孔，接種到細胞培養(yǎng)板中，每孔80μl。分別向每個孔中加入10μl放射菌素D(終濃度為2μg/ml)和10μl待測樣品(含有hTNF-α、hTNFD141-146和hTNFD29-36的超聲上清液)，設(shè)4個樣品濃度1、0.1、0.01和0.001mg/ml，并設(shè)3個復孔。同時設(shè)只加放射菌素D而不加樣品的陽性對照，和只加L929細胞而不加放射菌素D和樣品的陰性對照。將培養(yǎng)板置5％CO2孵箱內(nèi)37℃培養(yǎng)24h，倒掉混合培養(yǎng)液，并用PBS-T洗滌。每孔中加入10μl 0.5％結(jié)晶紫，室溫染色10min后用蒸餾水輕輕洗凈細胞外結(jié)晶紫。常溫干燥后，每孔加入100μl 33％醋酸，待細胞完全融解后，用自動讀數(shù)酶聯(lián)儀測定570nm下吸光度A值。用細胞毒百分率表示樣品活性，計算公式(1-b/a)×100％，ab分別為對照組和實驗組的光密度值。
5.3.1.10Z12抗體與缺失蛋白相互作用的ELISA檢測ELISA操作步驟參見5.2.1.9節(jié)。
5.3.2結(jié)果5.3.2.1hTNF-α缺失體重組質(zhì)粒的構(gòu)建首先，用稀釋的引物溶液以pUTNF-α環(huán)形質(zhì)粒為模板進行PCR擴增，反應(yīng)體系和反應(yīng)條件如材料和方法中所述。0.8％瓊脂糖凝膠電泳觀察，擴增產(chǎn)物的大小與預(yù)期的2660bp和2650bp相符(見圖5.15)。切膠回收PCR產(chǎn)物，行N端磷酸化，連接，從而完成重組質(zhì)粒的構(gòu)建。
5.3.2.2hTNF-α缺失體重組質(zhì)粒的酶切鑒定限制酶Nco I、Hind III、Hinc II的酶切位點分別在編碼hTNF-α的起始密碼前一位、終止密碼后15位和第91位氨基酸殘基末端。pUTNF-α質(zhì)粒經(jīng)Hind III和Hinc II的聯(lián)合消化，會切下一條216bp的小片段；hTNFD141-146缺失6個氨基酸(18bp)，因此其重組體經(jīng)此兩酶切產(chǎn)生的小片段大小應(yīng)為198bp。同樣，pUTNF-α和pUTNFD29-36質(zhì)粒經(jīng)Nco I和Hinc II的聯(lián)合消化，分別會被切下大小分別為277和253bp的小片段。酶切反應(yīng)的結(jié)果與預(yù)期的相符，見圖5.16。將酶切驗證正確的重組質(zhì)粒送上海博亞公司測序，結(jié)果完全正確(圖略)。
5.3.2.3hTNF-α缺失體重組子在大腸桿菌中的表達將測序正確的重組質(zhì)粒重新轉(zhuǎn)化E.coli JM109，挑取的單菌落在LB培養(yǎng)基中37℃振搖過夜，離心收獲的沉淀用PBS(菌培養(yǎng)液1/10體積)懸浮，超聲破碎后，離心收獲上清，取少量樣品行18％SDS-PAGE，考馬斯亮蘭染色(圖5.17)。
5.3.2.4hTNF-α缺失體的生物學活性分析L929細胞懸液調(diào)成3×104/ml，接種到96孔板，每孔80ul。hTNF-α及其缺失體按一定比例稀釋后每孔10ul與放射菌素D(0.1ug/3×104)共同加入。37℃5％CO2孵箱培養(yǎng)24小時，0.5％結(jié)晶紫染色，測570nm OD值。按公式(1-b/a)×100％計算細胞毒性，a、b分別為對照組和實驗組的光密度值。用hTNF-α標準品檢驗系統(tǒng)的靈敏度和準確度，繪制標準曲線，表明結(jié)果可靠。以hTNF-α上清液的細胞毒性作基數(shù)(100％)，hTNFD141-146、hTNFD29-36的相對細胞毒性分別為23.47％和17.80％(平均值，見圖5.18)，說明這兩個缺失體的生物活性均明顯降低，表明141-146和29-36區(qū)是hTNF-α的活性部位，為其發(fā)揮生物學作用所必須。
5.3.2.5Z12抗體與缺失蛋白相互作用的ELISA檢測將含有hTNF-α、hTNFD141-146和hTNFD29-36的超聲上清，用包被液稀釋成100、50、10、1μg/ml等4個不同濃度進行包被。根據(jù)預(yù)實驗所作的抗體識別抗原的飽和曲線圖，當hTNF-α超聲上清濃度在100～10μg/ml時，純化的Z12抗體與抗原反應(yīng)的最佳濃度為2～10μg/ml，因此以5μg/ml的抗體濃度進行ELISA檢測。結(jié)果表明Z12抗體識別完整hTNF-α及其29-36位缺失體的能力基本相同，而識別141-146位缺失體的能力與前兩者相比幾乎喪失。證明hTNF-α141-146部位是Z12抗體識別的抗原表位(見圖5.19)。
6、計算機輔助設(shè)計新型藥物分子根據(jù)獲得的抗體(Z12)與抗原(TNF-α)相互作用的復合物構(gòu)象，結(jié)合實驗確定的與理論模擬相同的結(jié)論，利用計算機輔助設(shè)計的方法設(shè)計獲得以下三條短肽(PT3INYTGEPTYSQSVSNVVWY；PT4YTYYPTVNENRSQSVSNVF；PT6YINTGYDGLYYNSMD)。模擬肽設(shè)計過程模擬抗體Z12識別的TNF-α表位141-146(實驗及理論模型均提示該區(qū)域為抗原參與結(jié)合抗體的重要結(jié)構(gòu)域)，設(shè)計的多肽滿足相應(yīng)的柔韌性及易折疊的特征，同時為滿足其疏水性質(zhì)，引入相應(yīng)的疏水殘基；為保證其靜電性及相應(yīng)極性，引入相關(guān)的親水性殘基。
為進行對比，針對作用模式設(shè)計無關(guān)肽PT1(GGY TYYTHSNV)。
依據(jù)從頭搭建的方法，對四條短肽進行結(jié)構(gòu)模擬。選擇CVFF/Gromos力場，依次經(jīng)最陡下降(收斂判據(jù)0.01KJ/mol，收斂步驟5000步)、共軛梯度(收斂判據(jù)0.005KJ/mol，收斂步驟5000步)、牛頓力學(收斂判據(jù)0.001KJ/mol，收斂步驟8000步)，對短肽進行分子力學的構(gòu)象優(yōu)化，獲得穩(wěn)定構(gòu)象。進而利用分子動力學方法進行動態(tài)模擬，確定常溫穩(wěn)定構(gòu)象。
選擇前面構(gòu)建的TNF-α理論模型，利用分子對接的方法搭建短肽PT3、PT4、PT6與TNF-α相互作用的復合物模型。結(jié)果提示，其中前兩條PT3、PT4具有如圖6.1(a)所示的構(gòu)象特征，第三條PT6具有如圖6.1(b)所示的結(jié)構(gòu)特征。
7、競爭結(jié)合實驗7.1肽合成對設(shè)計獲得的PT1、PT3、PT4、PT6等4條多肽分子進行合成，全部由美國Genenmed Synthesis，Inc合成純化，四條肽的純度分別為99.9％、99.9％、81.4％、92.8％。
7.2ELISA競爭結(jié)合實驗本專利應(yīng)用EILSA競爭結(jié)合實驗方法，對以上所設(shè)計與合成的短肽是否可與抗TNF-α抗體競爭結(jié)合TNF-α分子進行了驗證。方法100μl TNF-α/孔(終濃度2μg/ml)包被96微孔板，4℃過夜或37℃孵育2小時。PBS-T洗板3-4遍，200μl/孔4％酪蛋白封閉，37℃孵育30分鐘；PBS-T洗板3-4遍，用甲酰胺溶解肽后，再用PBS分別稀釋肽和Z12-HRP(辣根酶標記的小鼠抗人TNF-α單克隆抗體)，取100μl的肽(終濃度分別為0.047、0.236、1.180、4.720mmol/L)和Z12-HRP(終濃度為1∶600)加入每孔，4℃孵育過夜。PBS-T洗板3-4遍，OPD底物顯色，2N H2SO4終止反應(yīng)，490nm波長下測定OD值。
結(jié)合率計算公式 實驗組肽+Z12-HRP；對照組Z12-HRPPT3、PT4、PT6隨劑量的增加，與Z12抗體競爭結(jié)合TNF-α的作用明顯增強(表3)，而作為無關(guān)對照肽的PT1隨劑量增加未顯示出與Z12抗體競爭結(jié)合TNF-α作用，結(jié)果提示以上所設(shè)計的三條短肽均具有與Z12抗體特異性競爭結(jié)合TNF-α的作用。
7.3中和TNF-α生物活性分析應(yīng)用中和細胞毒性實驗方法分析PT3、PT4、PT6對hTNF-α所介導生物活性的作用。取L929細胞(3×104/孔)接種到96孔培養(yǎng)板，同時加或不加TNF-α10-2μg/3×104/孔與放射菌素D 0.1μg/3×104/孔，分別不加或加入不同稀釋度的短肽，37℃、5％CO2培養(yǎng)24小時，0.5％結(jié)晶紫染色，測570nm OD值。
TNF-α中和活性計算公式(1)TNF-α對細胞增殖的抑制率計算 實驗組細胞+TNF-α+放線菌素D；對照組細胞+放線菌素D(2)肽對TNF-α對細胞增殖抑制作用的中和效率計算 實驗組抑制率細胞+TNF-α+放線菌素D+肽；對照組抑制率細胞+TNF-α+放線菌素D；表4結(jié)果提示PT3、PT4、PT6對TNF-α介導的細胞毒性分別顯示出不同的劑量中和效應(yīng)，PT3、PT4中和TNF-α介導的細胞毒性的效率明顯優(yōu)于PT6。EILSA競爭實驗和TNF-α中和實驗的結(jié)果證實了本專利中根據(jù)抗體所識別的TNF-α表位所設(shè)計的短肽具有生物活性。
表1 TNF-α與Z12復合物分子間氫鍵給體(Donor)、受體(Acceptor)、距離()及形成角度(°) 表2 TNF-α與Z12形成復合物的相互作用能(Kcal/mol)
表3 合成短肽的ELISA競爭結(jié)合hTNF-α與Z12抗體的結(jié)合率(％)短肽短肽濃度(mM)0.000.14 0.681.36 2.72PT1 100±0 118.6±20.3 119.1±14.2 112.5±8.5 111.7±13.9PT3 100±0 109.0±17.3 96.1±13.2 81.4±12.4*55.2±12.1**PT4 100±0 90.8±8.988.7±9.9 79.0±3.5*54.7±3.2**PT6 100±0 70.1±17.3*59.5±15.3**54.3±20.5**37.8±9.1****P＜0.01；*P＜0.05表4 合成短肽對TNF-α介導細胞毒性的中和作用中和效率(％)短肽 短肽濃度(mM)0 0.62 1.25 2.50 5.00 10.00PT10 7.9 9.1 9.1 12.0 42.4PT30 12.9 7.4 16.7*17.3 87.9*PT40 14.8 14.7 20.6*33.9*66.0*PT60 17.3 10.8 7.1 33.2*28.3*P＜0.05
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1.基于抗原-抗體作用的立體結(jié)構(gòu)信息設(shè)計新型藥物分子的方法，包括以下步驟(1)基于抗原和抗體的一級結(jié)構(gòu)序列，構(gòu)建抗原和抗體可變區(qū)的理論構(gòu)象；(2)根據(jù)抗原和抗體可變區(qū)的理論構(gòu)象，構(gòu)建抗原-抗體復合物的理論構(gòu)象；(3)識別抗原中結(jié)合抗體的表位；(4)實驗驗證抗原中結(jié)合抗體的表位；(5)根據(jù)上述表位的序列，設(shè)計能夠影響其與抗體結(jié)合的分子。
2.權(quán)利要求1的方法，其中抗體可變區(qū)構(gòu)象的構(gòu)建過程如下根據(jù)抗體基因可變區(qū)序列的分析，確定其保守區(qū)，利用同源模建建立抗體可變區(qū)初始空間構(gòu)象，經(jīng)構(gòu)象優(yōu)化獲得抗體可變區(qū)穩(wěn)定構(gòu)象。
3.權(quán)利要求1的方法，其中對抗原晶體結(jié)構(gòu)進行理論處理獲得抗原的構(gòu)象。
4.權(quán)利要求1的方法，其中根據(jù)抗原和抗體可變區(qū)構(gòu)象的空間構(gòu)象特征，經(jīng)分子對接和分子動力學模擬獲得抗原-抗體復合物空間構(gòu)象，所述空間構(gòu)象特征是幾何結(jié)構(gòu)、可及性表面積和表觀靜電分布。
5.權(quán)利要求1的方法，其中通過構(gòu)建缺失抗原中結(jié)合抗體的表位所在區(qū)域的缺失突變體，并分析其與抗體的相互作用，確認抗原中結(jié)合抗體的表位。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述抗原是TNFα，所述抗體是Z12。
7.含有TNFα氨基酸序列141-146的抗原表位。
8.權(quán)利要求7的表位，其中所述表位可以特異性結(jié)合抗體Z12。
9.權(quán)利要求8的表位，所述表位由TNFα氨基酸序列141-146組成。
全文摘要
本發(fā)明涉及基于抗原抗體作用的立體結(jié)構(gòu)信息進行新型藥物分子設(shè)計的方法。具體而言，本發(fā)明通過在計算機上構(gòu)建抗原和抗體可變區(qū)的理論構(gòu)象，在此基礎(chǔ)上建立抗原—抗體復合物的理論構(gòu)象，識別抗原中與抗體結(jié)合的表位，并通過實驗驗證該表位，根據(jù)該表位的序列設(shè)計新的藥物分子。
文檔編號G01N33/53GK1523350SQ03104870
公開日2004年8月25日 申請日期2003年2月21日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月21日
發(fā)明者沈倍奮, 馮建男, 黎燕, 張巍 申請人:北京四環(huán)醫(yī)藥科技股份有限公司, 中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所