專利名稱：用抗磷酸膽堿抗體對(duì)氧化低密度脂蛋白的定量測(cè)定及其在診斷動(dòng)脈粥樣硬化中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及氧化低密度脂蛋白(OxLDL)的檢測(cè)，具體涉及氧化低密度脂蛋白的定量檢測(cè)方法及其試劑盒。
背景技術(shù)：
脂蛋白是血漿膽固醇和甘油三酯的主要載體。低密度脂蛋白(LDL)是由磷脂、載脂蛋白(Apo)B多肽鏈、膽固醇、甘油三酯、碳水化合物等組成的(附
圖1)。近年來人們發(fā)現(xiàn)低密度脂蛋白的氧化態(tài)變化與許多疾病有關(guān)，如糖尿病、腎衰竭和驚厥前期。最近，人們還發(fā)現(xiàn)氧化低密度脂蛋白與心血管疾病有密切的關(guān)系。例如，在動(dòng)脈壁中以及其他位點(diǎn)，LDL被氧化成氧化低密度脂蛋白(OxLDL)。OxLDL不再被正常細(xì)胞上的LDL受體識(shí)別，反而被巨噬細(xì)胞上的清道夫受體識(shí)別。使巨噬細(xì)胞攝取OxLDL不受調(diào)控，結(jié)果OxLDL中的脂類(包括被氧化的脂類)就在巨噬細(xì)胞中越積越多直到巨噬細(xì)胞變?yōu)榕菽?xì)胞。據(jù)信這種泡沫細(xì)胞分泌各種導(dǎo)致血小板不穩(wěn)和血液凝結(jié)的因子。另外，這些泡沫細(xì)胞的死亡導(dǎo)致脂類沉積在動(dòng)脈壁中。脂肪在血管壁中的沉積是導(dǎo)致心血管疾病，特別是動(dòng)脈粥樣硬化的病因之一。
根據(jù)美國心臟協(xié)會(huì)2001年的最新統(tǒng)計(jì)，心血管疾病已成為人類頭號(hào)死因，及時(shí)檢測(cè)至關(guān)重要。但目前用于心血管疾病的檢測(cè)方法主要有(1)常規(guī)預(yù)警檢測(cè)，包括血脂、家族病史和生活方式等方面的檢測(cè)。該法的缺陷包括僅能測(cè)出致病因素，與心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展變化無直接關(guān)聯(lián)；(2)非入侵性功能檢測(cè)，包括運(yùn)動(dòng)心電圖、超聲心動(dòng)圖和核磁共振等檢測(cè)手段。該法缺陷包括對(duì)心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展變化和嚴(yán)重性無法判斷，而且儀器造價(jià)昂貴；
(3)入侵性檢測(cè)，如冠狀動(dòng)脈血管造影和血管內(nèi)超聲。該法缺陷是入侵性的，會(huì)給患者帶來一定的痛苦，有并發(fā)癥危險(xiǎn)，需專業(yè)人員操作，僅適用于嚴(yán)重晚期病人的檢查，檢測(cè)費(fèi)用也較高。
因此，到目前為止尚沒有任何特別有效地預(yù)警和/或輔助檢測(cè)心血管疾病特別是動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展?fàn)顩r的方法。
盡管目前人們已經(jīng)知道OxLDL與心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展有一定的聯(lián)系，也針對(duì)OxLDL提出了一些檢測(cè)方法，但這些檢測(cè)方法都不能做到將OxLDL含量與心血管疾病的程度直接聯(lián)系起來，因此其實(shí)用性不是很大。例如Young等(參見美國專利號(hào)5,460,947)公開了使用免疫分析方法檢測(cè)血清中ApoB的含量。但這種方法測(cè)定的是氧化和非氧化LDL之和，而不能將氧化的和非氧化的LDL區(qū)別開。此外，LDL的氧化是一個(gè)復(fù)雜的過程，其被氧化的程度目前尚沒有定量的標(biāo)準(zhǔn)。因此，用體外催化獲得的OxLDL來作為標(biāo)準(zhǔn)物，確定體內(nèi)產(chǎn)生的OxLDL，既缺乏堅(jiān)實(shí)的理論支持，又會(huì)造成每次測(cè)量間的系統(tǒng)誤差。
由此可見，現(xiàn)有技術(shù)檢測(cè)心血管疾病方法操作不便，檢測(cè)指標(biāo)與心血管疾病發(fā)生、發(fā)展變化無相關(guān)性，尤其對(duì)心血管病變的早期診斷尚未發(fā)現(xiàn)行之有效的方法。冠狀動(dòng)脈狹窄(冠心病)是由動(dòng)脈粥樣硬化造成的，這是一種高發(fā)生率和高死因的心血管疾病。如果能及早發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化的危險(xiǎn)因素，做到及早預(yù)防和治療，就能很好的避免這種疾病的發(fā)作。因此，目前急需找到一種氧化低密度脂蛋白的定量檢測(cè)方法。
發(fā)明內(nèi)容
研究發(fā)現(xiàn)低密度脂蛋白經(jīng)氧化修飾后表面呈現(xiàn)與游離狀磷酸膽堿(PC)的抗原決定簇一樣的抗原決定簇，或稱表位結(jié)構(gòu)。因此，抗PC抗體只能與OxLDL結(jié)合，而不與未經(jīng)氧化的LDL結(jié)合，并且結(jié)合的量與OxLDL的氧化程度成正比。本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)這種PC表位呈現(xiàn)的量與動(dòng)脈粥樣硬化癥相關(guān)，這種抗PC的抗體與OxLDL上PC表位結(jié)合的量與冠狀動(dòng)脈狹窄程度存在線性關(guān)系(參見附圖2)。因此，本發(fā)明提供了抗PC的抗體的應(yīng)用，用于檢測(cè)哺乳動(dòng)物體內(nèi)OxLDL的氧化程度。通過抗原抗體的特異反應(yīng)定量檢測(cè)出樣品中OxLDL上PC表位的含量，并根據(jù)該含量可判斷出動(dòng)脈粥樣硬化的程度和冠心病發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)。
另一方面，本發(fā)明還提供了一種定量檢測(cè)OxLDL中PC表位的方法，其包括下列步驟(a)將抗PC的抗體與含有OxLDL的樣品接觸；(b)使所述抗體與OxLDL結(jié)合；(c)測(cè)定所述抗體與OxLDL上PC表位的結(jié)合量。
在本發(fā)明的方法中，所述抗PC的抗體可從市場(chǎng)上購買也可通過本領(lǐng)域熟知的生物工程方法制備。例如，購自Sigma化學(xué)公司的TEPC15(貨物編號(hào)M1421)即可用做本發(fā)明方法中的抗PC的抗體。如果用生物工程方法制備抗PC的抗體，優(yōu)選編碼所述抗PC抗體的基因含有重鏈可變區(qū)S107VH和輕鏈可變區(qū)V-kappa22VL。有關(guān)這方面的具體內(nèi)容，可參見文獻(xiàn)Shaw，et al.Natural antibodies with the T15 idiotype may actin atherosclerosis，apoptotic clearance，and protective immunity.J.Clin.Invest.1051731-1740(2000)。這些抗體可以是選自抗PC單克隆抗體、抗PC多克隆抗體或單鏈抗體可變區(qū)片段。本文所用的術(shù)語“磷酸膽堿”指的是磷脂酰膽堿的兩條脂肪酸尾巴被去掉后所余下的結(jié)構(gòu)部分。
本發(fā)明的方法可用于檢測(cè)任何含有帶PC表位的OxLDL的生物樣品。所述樣品優(yōu)選為血清、血漿、組織勻漿液、組織提取液，最優(yōu)選為血清。
本發(fā)明的方法基于抗原抗體間反應(yīng)特異性和標(biāo)記物檢測(cè)的靈敏性，是一種免疫標(biāo)記測(cè)定方法。即采用酶、熒光劑、放射性同位素、發(fā)光劑或電子致密物質(zhì)標(biāo)記抗體或抗原，進(jìn)行抗原抗體間的特異性反應(yīng)，從而能定量檢測(cè)抗體或抗原的量。其中將抗原特異性抗體標(biāo)記后進(jìn)行檢測(cè)的方法是直接法，采用標(biāo)記的第二抗體對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行放大的方法為間接法。
因此，在本發(fā)明的方法中，步驟(c)可采用直接化學(xué)發(fā)光免疫分析法、間接化學(xué)發(fā)光免疫分析法、直接放射免疫測(cè)定法、間接放射免疫測(cè)定法、直接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法、間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法、直接生物素一親和素系統(tǒng)測(cè)定法、間接生物素一親和素系統(tǒng)測(cè)定法中的任一種來完成。而上述這些直接法和間接法又分別可進(jìn)一步地分為夾心法和非夾心法。
雙抗體夾心法可如下完成先將抗PC抗體固定在固相載體上，加入含有OxLDL的樣品，使二者接觸，再加入抗ApoB抗體(或稱抗LDL抗體，可購自Sigma化學(xué)公司，貨物編號(hào)L8016)，使之與OxLDL接觸，測(cè)定抗ApoB抗體的量而定量OxLDL的含量?；蛘撸葘⒖笰poB抗體固定在固相載體上，加入含有OxLDL的樣品，使二者接觸，再加入抗PC抗體，使之與OxLDL接觸，測(cè)定抗PC抗體的量而定量OxLDL的含量。
非夾心法可如下完成先用含有OxLDL的樣品包被固相載體，再加入抗PC的第一抗體，使之與OxLDL接觸(如有必要還可進(jìn)一步加入抗PC抗體的第二抗體，使之抗PC的第一抗體接觸并結(jié)合)，然后測(cè)定抗PC抗體的量而定量OxLDL的含量。
為了避免人為操作、試劑盒不同批次和試驗(yàn)儀器不同而導(dǎo)致的誤差，在本發(fā)明的方法中，優(yōu)選還包括步驟(d)以PC化合物為標(biāo)準(zhǔn)品制得標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)曲線定量步驟(c)所測(cè)得的結(jié)合量所代表的OxLDL表面的氧化特異抗原決定簇的量。即，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出單位數(shù)量的OxLDL中所呈現(xiàn)的PC表位的含量，從而確定低密度脂蛋白在體內(nèi)被氧化的程度。
各種PC化合物均可用做在步驟(d)中所用的PC化合物，例如但不限于PC、氯化PC、乙酰化PC、與血清白蛋白偶聯(lián)的PC或與匙孔血藍(lán)蛋白偶聯(lián)的PC(PC-KLH)。
另一方面，本發(fā)明還提供了一種用于完成上述定量檢測(cè)OxLDL的試劑盒。本發(fā)明的試劑盒包含抗PC的抗體。所述抗體可為單克隆抗體、多克隆抗體或單鏈抗體可變區(qū)片段。編碼所述抗PC的抗體的基因優(yōu)選含有重鏈可變區(qū)S107VH和輕鏈可變區(qū)V-kappa 22VL。所述抗體進(jìn)一步更優(yōu)選為TEPC15(見文獻(xiàn)Moragan G，Berek C，Miller JF.An idiotypicdeterminant formed by both immunoglobulin constant and variable regions.Nature 1983；301(5902)720-2)或自制抗體MabHS1。
對(duì)于用于完成步驟(c)采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法(ELISA)的本發(fā)明方法的試劑盒，其中優(yōu)選所述抗PC的抗體是酶標(biāo)記的，并且該試劑盒還包括經(jīng)與酶作用能顯色的化學(xué)物質(zhì)?；蛘撸景l(fā)明的試劑盒中優(yōu)選包括抗PC的抗體、用酶標(biāo)記的抗PC抗體的二級(jí)抗體、以及經(jīng)與酶作用能顯色的化學(xué)物質(zhì)。
對(duì)于用于完成步驟(c)采用放射免疫測(cè)定法(EIA)的本發(fā)明方法的試劑盒，其還優(yōu)選包括用放射性同位素標(biāo)記的PC、同位素標(biāo)記的抗PC抗體或同位素標(biāo)記的抗PC抗體的第二抗體。
對(duì)于用于完成步驟(c)采用化學(xué)發(fā)光免疫分析法(ChemiluminescentAssay)的本發(fā)明方法的試劑盒，其中優(yōu)選所述抗PC的抗體是酶標(biāo)記的，并且該試劑盒還包括經(jīng)與酶作用能發(fā)光的化學(xué)物質(zhì)。或者，本發(fā)明的試劑盒中優(yōu)選包括抗PC的抗體、用酶標(biāo)記的抗PC抗體的二級(jí)抗體、以及經(jīng)與酶作用能發(fā)光的化學(xué)物質(zhì)。
對(duì)于用于完成步驟(c)采用生物素—親和素系統(tǒng)測(cè)定法的本發(fā)明方法的試劑盒，其中優(yōu)選所述抗PC的抗體是用生物素標(biāo)記的，并且該試劑盒還包括用酶標(biāo)記的親和素及經(jīng)與酶作用能發(fā)光或顯色的化學(xué)物質(zhì)。或者，本發(fā)明的試劑盒中優(yōu)選包括抗PC的抗體、用生物素標(biāo)記的抗PC抗體的二級(jí)抗體、用酶標(biāo)記的親和素及經(jīng)與酶作用能發(fā)光或顯色的化學(xué)物質(zhì)。
本發(fā)明在OxLDL與冠狀動(dòng)脈狹窄具有相關(guān)性的基礎(chǔ)上，尋找到了定量測(cè)定OxLDL的方法，并提供了完成本發(fā)明方法的定量檢測(cè)OxLDL的試劑盒。這對(duì)于量化動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病程度提供了可靠的測(cè)定方法和工具。
附圖描述附圖1表示低密度脂蛋白的結(jié)構(gòu)。
附圖2表示氧化低密度脂蛋白滴度與冠狀動(dòng)脈狹窄的關(guān)系。
附圖3表示氧化低密度脂蛋白測(cè)定方法的基本原理。
附圖4表示自制抗體MabHS1與OxLDL結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
附圖5表示自制抗體MabHS1與PC-KLH結(jié)合的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
附圖6表示純化自制抗體MabHS1的還原及非還原SDS-PAGE銀染圖譜。圖中1表示分子量標(biāo)準(zhǔn)，2表示細(xì)胞培養(yǎng)上清，3表示自制抗體MabHS1；A表示非還原SDS-PAGE銀染圖譜，B表示還原SDS-PAGE銀染圖譜。
具體實(shí)施例方式
1.步驟(c)采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)的本發(fā)明方法(1)雙抗夾心間接法材料96孔ELISA微滴板，抗ApoB抗體，磷酸鹽緩沖液(PBS)，檢測(cè)樣本，牛血清白蛋白(BSA)，TEPC15或自制抗體MabHS1，堿性磷酸酶(AP)或辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的抗TEPC15或自制抗體MabHS1第二抗體，ELISA讀數(shù)儀，PC化合物。
方法用PBS將抗ApoB抗體稀釋后，加入到ELISA板中，4℃放置24-48小時(shí)。用含有0.1％吐溫-20(tween-20)的PBS洗滌ELISA板。向ELISA板的各孔中分別加入待測(cè)樣品、陰性對(duì)照，37℃放置1小時(shí)。洗滌板三次，加入含1％BSA的PBS(BSA-PBS)稀釋的第一抗體TEPC15或者自制抗體MabHS1，37℃放置1小時(shí)。洗滌板2-5次，優(yōu)選3次，加入稀釋好的HRP標(biāo)記的抗TEPC15或自制抗體MabHS1第二抗體，37℃放置45分鐘。洗滌板2-5次，優(yōu)選3次，加入配好的顯色液，室溫或37℃顯色15-30分鐘，硫酸終止反應(yīng)。ELISA讀數(shù)儀測(cè)定光吸收值。以倍比稀釋的已知濃度的PC化合物包被ELISA板，加入BSA-PBS稀釋的第一抗體TEPC15或者自制抗體MabHS1，37℃放置1小時(shí)。洗滌板2-5次，優(yōu)選3次，加入稀釋好的HRP標(biāo)記的抗TEPC15或自制抗體MabHS1第二抗體，37℃放置45分鐘。洗滌板2-5次，優(yōu)選3次，加入配好的顯色液，室溫或37℃顯色15-30分鐘，硫酸終止反應(yīng)。ELISA讀數(shù)儀測(cè)定光吸收值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品的測(cè)定值查找出OxLDL氧化表位的含量。
(2)雙抗夾心直接法材料96孔ELISA微滴板，抗ApoB抗體，PBS，檢測(cè)樣本，BSA，AP或HRP標(biāo)記的TEPC15或自制抗體MabHS1，ELISA讀數(shù)儀，PC化合物。
方法用PBS將抗ApoB抗體稀釋后，加入到ELISA板中，4℃放置24-48小時(shí)。用含有0.1％tween-20的PBS洗滌ELISA板。向ELISA板的各孔中分別加入待測(cè)樣品、陰性對(duì)照，37℃放置1小時(shí)。洗滌板2-5次，優(yōu)選3次，加入BSA-PBS稀釋的AP或HRP標(biāo)記的TEPC15或自制抗體MabHS1，37℃放置1小時(shí)。洗滌板2-5次，優(yōu)選3次，加入配好的顯色液，室溫或37℃顯色15-30分鐘，硫酸終止反應(yīng)。ELISA讀數(shù)儀測(cè)定光吸收值。以倍比稀釋的已知濃度的PC化合物包被ELISA板，加入BSA-PBS稀釋的AP或HRP標(biāo)記的TEPC15或自制抗體MabHS1，37℃放置1小時(shí)。洗滌板2-5次，優(yōu)選3次，加入配好的顯色液，室溫或37℃顯色15-30分鐘，硫酸終止反應(yīng)。ELISA讀數(shù)儀測(cè)定光吸收值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品的測(cè)定值查找出OxLDL氧化表位的含量。
(3)非夾心間接法材料96孔ELISA微滴板，PBS，檢測(cè)樣本，BSA，TEPC15或自制抗體MabHS1，AP或HRP標(biāo)記的抗TEPC15或自制抗體MabHS1第二抗體，ELISA讀數(shù)儀，PC化合物。
方法將檢測(cè)樣本適當(dāng)稀釋后包被96孔ELISA微滴板，加入BSA-PBS稀釋的第一抗體TEPC15或者自制抗體MabHS1，37℃放置1小時(shí)。洗滌板2-5次，優(yōu)選3次，加入稀釋好的HRP標(biāo)記的抗TEPC15或自制抗體MabHS1第二抗體，37℃放置45分鐘。洗滌板2-5次，優(yōu)選3次，加入配好的顯色液，室溫或37℃顯色15-30分鐘，硫酸終止反應(yīng)。ELISA讀數(shù)儀測(cè)定光吸收值。以倍比稀釋的已知濃度的PC化合物包被ELISA板，加入BSA-PBS稀釋的第一抗體TEPC15或者自制抗體MabHS1，37℃放置1小時(shí)。洗滌板2-5次，優(yōu)選3次，加入稀釋好的HRP標(biāo)記的抗TEPC15或自制抗體MabHS1第二抗體，37℃放置45分鐘。洗滌板2-5次，優(yōu)選3次，加入配好的顯色液，室溫或37℃顯色15-30分鐘，硫酸終止反應(yīng)。ELISA讀數(shù)儀測(cè)定光吸收值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品的測(cè)定值查找出OxLDL氧化表位的含量。
(3)非夾心直接法材料96孔ELISA微滴板，PBS，檢測(cè)樣本，BSA，AP或HRP標(biāo)記的TEPC15或自制抗體MabHS1，ELISA讀數(shù)儀，PC化合物。
方法將檢測(cè)樣本適當(dāng)稀釋后包被96孔ELISA微滴板，加入BSA-PBS稀釋的AP或HRP標(biāo)記的TEPC15或自制抗體MabHS1，37℃放置1小時(shí)。洗滌板2-5次，優(yōu)選3次，加入配好的顯色液，室溫或37℃顯色15-30分鐘，硫酸終止反應(yīng)。ELISA讀數(shù)儀測(cè)定光吸收值。以倍比稀釋的已知濃度的PC化合物包被ELISA板，加入AP或HRP標(biāo)記的TEPC15或自制抗體MabHS1，37℃放置45分鐘。洗滌板2-5次，優(yōu)選3次，加入配好的顯色液，室溫或37℃顯色15-30分鐘，硫酸終止反應(yīng)。ELISA讀數(shù)儀測(cè)定光吸收值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品的測(cè)定值查找出OxLDL氧化表位的含量。
2.步驟(c)采用液相放射免疫測(cè)定法(EIA)的本發(fā)明方法材料放射性同位素3H、14C或32P標(biāo)記的PC，檢測(cè)樣本，TEPC15抗體或自制抗體MabHS1抗體，免疫分離劑。
方法將放射性同位素標(biāo)記的PC和被測(cè)含OxLDL樣本與限量的TEPC15抗體或自制抗體MabHS1抗體混合，4℃溫育12-24小時(shí)，加入免疫分離劑，抗原抗體復(fù)合物產(chǎn)生沉淀。離心分離，分別測(cè)定標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物(B)和游離標(biāo)記PC(F)的放射活性。計(jì)算標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物放射結(jié)合率(B/T(T＝B+F))。同時(shí)以一系列已知濃度的未標(biāo)記和一定量的放射標(biāo)記的PC以及TEPC15或者自制抗體MabHS1相混合，測(cè)出各標(biāo)準(zhǔn)濃度未標(biāo)記PC參加下的標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物放射結(jié)合率(B/T或B/T)，以放射結(jié)合率為縱座標(biāo)和已知未標(biāo)記PC為橫座標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線。根據(jù)被測(cè)抗原的放射性結(jié)合率，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上即可查出相應(yīng)的OxLDL含量。
3.步驟(c)采用固相放射免疫測(cè)定法的本發(fā)明方法(1)雙抗夾心間接法材料96孔ELISA微滴板，抗ApoB抗體，PBS，檢測(cè)樣本，BSA，TEPC15或自制抗體MabHS1，同位素標(biāo)記的抗TEPC15或自制抗體MabHS1第二抗體，放射線測(cè)定儀，PC化合物。
方法用俘獲抗體，即抗ApoB抗體包被96孔ELISA微滴板的孔。這些抗體可以是選自單克隆抗體、多克隆抗體或單鏈抗體。用PBS洗滌孔2-5次，優(yōu)選3次，然后將檢測(cè)樣本(優(yōu)選為血清)用BSA-PBS稀釋(1∶10至1∶100)后，加入微滴板的孔。室溫孵育20-60分鐘，優(yōu)選30分鐘。用PBS洗滌孔2-5次，優(yōu)選3次，將BSA-PBS稀釋的第一抗體TEPC15或自制抗體MabHS1加入孔中，并于室溫下溫育。用PBS洗滌孔2-5次，優(yōu)選3次。加入同位素標(biāo)記的抗TEPC15或自制抗體MabHS1第二抗體，接著用水漂洗，使用放射線測(cè)定儀測(cè)定射線強(qiáng)度。同時(shí)以已知濃度的PC化合物連續(xù)10倍梯度稀釋后包被96孔ELISA微滴板的孔，以BSA-PBS稀釋的第一抗體TEPC15或自制抗體MabHS1加入孔中，并于室溫下溫育。用PBS洗滌孔2-5次，優(yōu)選3次。加入同位素標(biāo)記的抗TEPC15或自制抗體MabHS1第二抗體。接著用水漂洗，使用放射線測(cè)定儀測(cè)定射線強(qiáng)度，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品的測(cè)定值查找出OxLDL氧化表位的含量。
(2)雙抗夾心直接法材料96孔ELISA微滴板，抗ApoB抗體，PBS，檢測(cè)樣本，BSA，同位素標(biāo)記的TEPC15或自制抗體MabHS1，放射線測(cè)定儀，PC化合物。
方法用俘獲抗體，即抗ApoB抗體包被ELISA微滴板的孔。這些抗體可以是選自單克隆抗體、多克隆抗體或單鏈抗體。用PBS洗滌孔2-5次，優(yōu)選3次，然后將檢測(cè)樣本(優(yōu)選為血清)用BSA-PBS稀釋(1∶10至1∶100)后，加入微滴板的孔。室溫孵育20-60分鐘，優(yōu)選30分鐘。用PBS洗滌孔2-5次，優(yōu)選3次，將BSA-PBS稀釋的同位素標(biāo)記的TEPC15或自制抗體MabHS1加入孔中，并于室溫下溫育。接著用水漂洗，使用放射線測(cè)定儀測(cè)定射線強(qiáng)度。同時(shí)將已知濃度的PC化合物連續(xù)10倍梯度稀釋后包被孔，將BSA-PBS稀釋的同位素標(biāo)記的TEPC15或自制抗體MabHS1加入孔中，并于室溫下溫育。接著用水漂洗，使用放射線測(cè)定儀測(cè)定射線強(qiáng)度。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品的測(cè)定值查找出OxLDL氧化表位的含量。
(3)非夾心間接法材料96孔ELISA微滴板，PBS，檢測(cè)樣本，BSA，TEPC15或自制抗體MabHS1，同位素標(biāo)記的抗TEPC15或自制抗體MabHS1第二抗體，放射線測(cè)定儀，PC化合物。
方法將檢測(cè)樣本適當(dāng)稀釋后包被96孔ELISA微滴板的孔。將BSA-PBS稀釋的第一抗體TEPC15或自制抗體MabHS1加入孔中，并于室溫下溫育。用PBS洗滌孔2-5次，優(yōu)選3次。加入同位素標(biāo)記的抗TEPC15或自制抗體MabHS1第二抗體，接著用水漂洗，使用放射線測(cè)定儀測(cè)定射線強(qiáng)度。同時(shí)以已知濃度的PC化合物連續(xù)10倍梯度稀釋后包被孔，以BSA-PBS稀釋的第一抗體TEPC15或自制抗體MabHS1加入孔中，并于室溫下溫育。用PBS洗滌孔2-5次，優(yōu)選3次。加入同位素標(biāo)記的抗TEPC15或自制抗體MabHS1第二抗體。接著用水漂洗，使用放射線測(cè)定儀測(cè)定射線強(qiáng)度，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品的測(cè)定值查找出OxLDL氧化表位的含量。
(4)非夾心直接法材料96孔ELISA微滴板，PBS，檢測(cè)樣本，BSA，同位素標(biāo)記的TEPC15或自制抗體MabHS1，放射線測(cè)定儀，PC化合物。
方法將檢測(cè)樣本適當(dāng)稀釋后包被96孔ELISA微滴板的孔。將BSA-PBS稀釋的同位素標(biāo)記的TEPC15或自制抗體MabHS1加入孔中，并于室溫下溫育。接著用水漂洗，使用放射線測(cè)定儀測(cè)定射線強(qiáng)度。同時(shí)以已知濃度的PC化合物連續(xù)10倍梯度稀釋后包被孔，將BSA-PBS稀釋的同位素標(biāo)記的TEPC15或自制抗體MabHS1加入孔中，并于室溫下溫育。接著用水漂洗，使用放射線測(cè)定儀測(cè)定射線強(qiáng)度，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品的測(cè)定值查找出OxLDL氧化表位的含量。
4.步驟(c)采用化學(xué)發(fā)光免疫分析法的本發(fā)明方法本發(fā)明采用化學(xué)發(fā)光免疫分析法時(shí)，除材料與檢測(cè)儀外，其原理，方法和步驟與具體實(shí)施方式
1所述完全相同。
材料包被板采用白色U形底聚苯乙烯(polystyrene)高結(jié)合力微滴板，如MicroFluor微滴板(ThermoLabsystems，F(xiàn)ranklin，MA，USA)，抗ApoB抗體，PBS，檢測(cè)樣本，BSA，TEPC15或自制抗體MabHS1，AP標(biāo)記的抗TEPC15或自制抗體MabHS1第二抗體，LumiPhos 530(LumigenInc.，Southfield，Michigan，USA)，DYNEX亮度計(jì)(DYNEXTechnologies)，PC化合物方法實(shí)施方式1中所述的方法(1)-(4)中，以“MicroFluor微滴板”取代“96孔ELISA微滴板”；以AP標(biāo)記的抗TEPC15或自制抗體MabHS1抗體為第二抗體；以LumiPhos 530為底物；用DYNEX亮度計(jì)測(cè)定相對(duì)發(fā)光度(Relative Light Unit，RLU)，即為本方法。(參見實(shí)施例3)。
基于上述原理， 此法也可用于自動(dòng)化檢測(cè)。主要步驟包括用抗ApoB抗體包被微磁顆粒，加入稀釋血清，加入抗PC抗體，加入AP標(biāo)記的第二抗體，取得數(shù)據(jù)。
5.步驟(c)采用生物素—親和素系統(tǒng)測(cè)定法的本發(fā)明方法(1)雙抗夾心間接法材料96孔ELISA微滴板，抗ApoB抗體，PBS，檢測(cè)樣本，BSA，TEPC15或者自制抗體MabHS1，生物素標(biāo)記的抗TEPC15或自制抗體MabHS1第二抗體，HRP或AP標(biāo)記親和素，顯色液，PC化合物。
方法用PBS將抗ApoB抗體稀釋后，加入到ELISA板中，4℃放置24-48小時(shí)。用含有0.1％tween-20的PBS洗滌ELISA板。向ELISA板的各孔中分別加入待測(cè)樣品、陰性對(duì)照，37℃放置1小時(shí)。洗滌板2-5次，優(yōu)選3次，加入BSA-PBS稀釋的TEPC15或者自制抗體MabHS1，37℃放置1小時(shí)。洗滌板2-5次，優(yōu)選3次，加入BSA-PBS稀釋的生物素標(biāo)記的抗TEPC15或自制抗體MabHS1第二抗體，37℃放置1小時(shí)。洗滌板2-5次，優(yōu)選3次，加入稀釋好的HRP或AP標(biāo)記親和素，37℃放置45分鐘。洗滌板2-5次，優(yōu)選3次，加入配好的顯色液，室溫或37℃顯色15-30分鐘，終止反應(yīng)。ELISA讀數(shù)儀測(cè)定光吸收值。以倍比稀釋的已知濃度的PC化合物包被ELISA板，加入BSA-PBS稀釋的第一抗體TEPC15或者自制抗體MabHS1，37℃放置1小時(shí)。洗滌板2-5次，優(yōu)選3次，加入BSA-PBS稀釋的生物素標(biāo)記的抗TEPC15或自制抗體MabHS1第二抗體，37℃放置1小時(shí)。洗滌板2-5次，優(yōu)選3次，加入稀釋好的HRP或AP標(biāo)記親和素，37℃放置45分鐘。洗滌板2-5次，優(yōu)選3次，加入配好的顯色液，室溫或37℃顯色15-30分鐘，終止反應(yīng)。ELISA讀數(shù)儀測(cè)定光吸收值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品的測(cè)定值查找出OxLDL氧化表位的含量。
(2)雙抗夾心直接法材料96孔ELISA微滴板，抗ApoB抗體，PBS，檢測(cè)樣本，BSA，生物素標(biāo)記的TEPC15或者自制抗體MabHS1，HRP或AP標(biāo)記親和素，顯色液，PC化合物。
方法用PBS將抗ApoB抗體稀釋后，加入到ELISA板中，4℃放置24-48小時(shí)。用含有0.1％tween-20的PBS洗滌ELISA板。向ELISA板的各孔中分別加入待測(cè)樣品、陰性對(duì)照，37℃放置1小時(shí)。洗滌板2-5次，優(yōu)選3次，加入BSA-PBS稀釋的生物素標(biāo)記的TEPC15或者自制抗體MabHS1，37℃放置1小時(shí)。洗滌板2-5次，優(yōu)選3次，加入稀釋好的HRP或AP標(biāo)記親和素，37℃放置45分鐘。洗滌板2-5次，優(yōu)選3次，加入配好的顯色液，室溫或37℃顯色15-30分鐘，終止反應(yīng)。ELISA讀數(shù)儀測(cè)定光吸收值。以倍比稀釋的已知濃度的PC化合物包被ELISA板，加入BSA-PBS稀釋的生物素標(biāo)記的TEPC15或者自制抗體MabHS1，37℃放置1小時(shí)。洗滌板2-5次，優(yōu)選3次，加入稀釋好的HRP或AP標(biāo)記親和素，37℃放置45分鐘。洗滌板2-5次，優(yōu)選3次，加入配好的顯色液，室溫或37℃顯色15-30分鐘，終止反應(yīng)。ELISA讀數(shù)儀測(cè)定光吸收值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品的測(cè)定值查找出OxLDL氧化表位的含量。
(3)非夾心間接法材料96孔ELISA微滴板，PBS，檢測(cè)樣本，BSA，TEPC15或者自制抗體MabHS1，生物素標(biāo)記的抗TEPC15或自制抗體MabHS1第二抗體，HRP或AP標(biāo)記親和素，顯色液，PC化合物。
方法將檢測(cè)樣本適當(dāng)稀釋后包被96孔ELISA微滴板，加入BSA-PBS稀釋的TEPC15或者自制抗體MabHS1，37℃放置1小時(shí)。洗滌板2-5次，優(yōu)選3次，加入BSA-PBS稀釋的生物素標(biāo)記的抗TEPC15或自制抗體MabHS1第二抗體，37℃放置1小時(shí)。洗滌板2-5次，優(yōu)選3次，加入稀釋好的HRP或AP標(biāo)記親和素，37℃放置45分鐘。洗滌板2-5次，優(yōu)選3次，加入配好的顯色液，室溫或37℃顯色15-30分鐘，終止反應(yīng)。ELISA讀數(shù)儀測(cè)定光吸收值。以倍比稀釋的已知濃度的PC化合物包被ELISA板，加入BSA-PBS稀釋的第一抗體TEPC15或者自制抗體MabHS1，37℃放置1小時(shí)。洗滌板2-5次，優(yōu)選3次，加入BSA-PBS稀釋的生物素標(biāo)記的抗TEPC15或自制抗體MabHS1第二抗體，37℃放置1小時(shí)。洗滌板2-5次，優(yōu)選3次，加入稀釋好的HRP或AP標(biāo)記親和素，37℃放置45分鐘。洗滌板2-5次，優(yōu)選3次，加入配好的顯色液，室溫或37℃顯色15-30分鐘，終止反應(yīng)。ELISA讀數(shù)儀測(cè)定光吸收值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品的測(cè)定值查找出OxLDL氧化表位的含量。
(4)非夾心直接法材料96孔ELISA微滴板，PBS，檢測(cè)樣本，BSA，生物素標(biāo)記的TEPC 5或者自制抗體MabHS1，HRP或AP標(biāo)記親和素，顯色液，PC化合物。
方法將檢測(cè)樣本適當(dāng)稀釋后包被％孔ELISA微滴板，加入BSA-PBS稀釋的生物素標(biāo)記的TEPC15或者自制抗體MabHS1，37℃放置1小時(shí)。洗滌板2-5次，優(yōu)選3次，加入稀釋好的HRP或AP標(biāo)記親和素，37℃放置45分鐘。洗滌板2-5次，優(yōu)選3次，加入配好的顯色液，室溫或37℃顯色15-30分鐘，終止反應(yīng)。ELISA讀數(shù)儀測(cè)定光吸收值。以倍比稀釋的已知濃度的PC化合物包被ELISA板，加入BSA-PBS稀釋的生物素標(biāo)記的TEPC15或者自制抗體MabHS1，37℃放置1小時(shí)。洗滌板2-5次，優(yōu)選3次，加入稀釋好的HRP或AP標(biāo)記親和素，37℃放置45分鐘。洗滌板2-5次，優(yōu)選3次，加入配好的顯色液，室溫或37℃顯色15-30分鐘，終止反應(yīng)。ELISA讀數(shù)儀測(cè)定光吸收值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品的測(cè)定值查找出OxLDL氧化表位的含量。
為完成本發(fā)明的上述方法，本發(fā)明人還開發(fā)出了一系列的檢測(cè)氧化低密度脂蛋白的試劑盒。本發(fā)明的試劑盒包含抗PC的抗體。其中所述抗PC的抗體的基因組成含有重鏈可變區(qū)S107 VH和輕鏈可變區(qū)V-kappa 22VL，如TEPC15，自制抗體MabHS1，或其他相同基因結(jié)構(gòu)的抗體(見文獻(xiàn)Shaw，et al.Natural antibodies with the T15 idiotype may act inatherosclerosis，apoptotic clearance，and protective immunity.J.Clin.Invest.1051731-1740(2000))。也可選自單克隆抗體、多克隆抗體或單鏈抗體可變區(qū)片段的任一種，還分別包括以化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、放射性同位素或酶標(biāo)記所述抗體或者用生物素標(biāo)記所述抗體并用酶標(biāo)記所述親和素。
本發(fā)明在OxLDL與冠狀動(dòng)脈狹窄具有相關(guān)性的基礎(chǔ)上，尋找到了定量測(cè)定OxLDL的方法，并依據(jù)該法公開了OxLDL的定量檢測(cè)試劑盒，這對(duì)于量化動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病的程度提供了可靠的參照指標(biāo)。
下文將以實(shí)施例更詳細(xì)描述本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解實(shí)施例不是限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
以下實(shí)施例中所用的試劑和設(shè)備除自制抗體MabHS1抗體和待測(cè)血清外，均從市場(chǎng)上購得。所用自制抗體MabHS1是按照實(shí)施例1的步驟制備的。
實(shí)施例1自制抗體MabHS1的制備。
1.MabHS1單克隆抗體株的建立背景TEPC15(即T15)細(xì)胞系最早分離自經(jīng)異十八烷預(yù)處理的小鼠腹膜細(xì)胞，它可以特異性地結(jié)合作為肺炎球菌和某些其它微生物病原體的磷壁酸細(xì)胞壁多糖(C-PS)免疫功能區(qū)的磷酸膽堿部分。在同系(BALB/c和C57BL/6)或遠(yuǎn)系繁殖的小鼠家系，在沒有預(yù)免疫的情況下，可以高頻率出現(xiàn)含有T15抗體基因的B細(xì)胞克隆，并且大部分的抗PC自身抗體(autoantibody)表現(xiàn)出T15獨(dú)特型。此外，已有研究顯示，表現(xiàn)這種獨(dú)特型的單克隆抗體可以對(duì)特定的肺炎球菌菌株引起的感染提供最佳的保護(hù)。進(jìn)一步地研究證實(shí)，apo-E缺陷小鼠來源的OxLDL特異性B細(xì)胞系確實(shí)表達(dá)T15抗體基因產(chǎn)物，也證實(shí)了這些B細(xì)胞分泌的抗體的重鏈可變區(qū)(VH)與輕鏈可變區(qū)(VL)在蛋白水平上是一致的，因?yàn)樗鼈兛杀?種不同的T15特異性抗血清識(shí)別。在MabHS1單克隆抗體株的建立中我們采用T15VH基因序列和T15VL基因序列，VH家族來源于S107；VL家族來源于kappa-22。T15特異性抗獨(dú)特型抗體對(duì)這些VH、VL或VH-VL配對(duì)的免疫球蛋白產(chǎn)物是特異性的。
大量研究表明發(fā)育早期T15抗PCB細(xì)胞在免疫系統(tǒng)中具有優(yōu)勢(shì)地位。它們?cè)诔錾?天達(dá)到高峰，并且已作為單一B細(xì)胞對(duì)細(xì)菌有關(guān)抗原的初次免疫反應(yīng)的典型例子被單獨(dú)討論過。
已了解到OxLDL抗原決定簇的自體抗體滴度在高膽固醇膳食喂養(yǎng)的LDL受體缺(LDLR-/-)的小鼠中是逐漸增高的，且自體抗體的滴度與動(dòng)脈粥樣硬化的程度相關(guān)。同樣，在膽固醇膳食喂養(yǎng)的apoE缺陷(apoE-/-)的小鼠血漿中，自體抗體的滴度會(huì)極度升高。將從未經(jīng)外源性免疫的膽固醇膳食喂養(yǎng)的小鼠脾臟克隆的自體抗體與OxLDL結(jié)合，可得到幾個(gè)分泌IgM的陽性克隆。表明在有廣泛性動(dòng)脈粥樣硬化和脂質(zhì)過氧化增加的apoE缺陷的小鼠中可以產(chǎn)生對(duì)各種氧化特異性抗原決定簇非常強(qiáng)的免疫反應(yīng)。這些資料證實(shí)在有明顯動(dòng)脈粥樣硬化時(shí)，體內(nèi)可產(chǎn)生大量針對(duì)OxLDL不同氧化特異性抗原決定簇的免疫學(xué)反應(yīng)。
因此，我們能夠以現(xiàn)有的技術(shù)與材料篩選出一種表達(dá)T15獨(dú)特型抗體的鼠單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞系，并用這種抗PC抗體作為檢測(cè)OxLDL上抗原決定簇的試劑。
方法我們采用上述的方法，得到結(jié)合OxLDL PC抗原決定簇的雜交瘤細(xì)胞系(CCTCC，保藏號(hào)C200304)。由于B-1細(xì)胞在胸腔和腹膜腔內(nèi)膜中占優(yōu)勢(shì)，在未經(jīng)免疫的小鼠大部分IgM主要由在脾臟和腹膜中自發(fā)性IgM分泌細(xì)胞產(chǎn)生。我們給新生C57BL/6小鼠高膽固醇膳食飼養(yǎng)4周，然后腹腔注射0.5ml異十八烷。繼續(xù)喂養(yǎng)兩周后，處死小鼠，取脾分離脾臟細(xì)胞，與從胸腔和腹膜腔內(nèi)膜中得到的細(xì)胞混合。這些細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞系P3X63Ag8.653.1(購自ATCC，序列號(hào)CRL-1580)融合，從而形成雜交瘤細(xì)胞。OxLDL和磷酸膽堿-鑰孔血藍(lán)蛋白(PC-KLH，購自BiosearchTechnologies公司，貨物編號(hào)PC-1013)作為篩選用的抗原。從單個(gè)起始克隆，得到大約2,000個(gè)可分泌免疫球蛋白的雜交瘤細(xì)胞系。從這些細(xì)胞系中首先篩選能分泌IgM抗體的細(xì)胞系。10天后混合從每2個(gè)有IgM分泌細(xì)胞的孔中得到的上清，并檢測(cè)與OxLDL和PC-KLH的結(jié)合。在200個(gè)混合樣品中，大約10％分泌IgM的雜交瘤細(xì)胞可分泌既結(jié)合OxLDL又結(jié)合PC-KLH的抗體。通過有限稀釋法，從這些雜交瘤細(xì)胞中，我們最終克隆了1株既結(jié)合OxLDL又結(jié)合PC-KLH的單克隆。該單克隆抗體具有T15獨(dú)特型，與AB1-2細(xì)胞(購自ATCC，序列號(hào)HB33)有陽性反應(yīng)，被命名為MabHS1。
上述方法中所用OxLDL采用常規(guī)方法制備按一次性密度梯度超速離心法分離人血漿脂蛋白，在血漿中加入NaBr使其密度為1.400g/ml，上層依次鋪d＝1.100及d＝1.006g/ml NaBr/血漿密度緩沖液(PDB，pH7.4，含0.9％NaCl及1mmol/L EDTA的10mmol/L Tris-HCl)，50000rpm離心5小時(shí)，收集d＝1.030-1.050g/ml的LDL組分。將LDL對(duì)PBS透析除去EDTA，取LDL(1mg/ml)與終濃度為10mmol/L的Cu2+在37℃下共同溫育8小時(shí)，用EDTA中終止反應(yīng)，即得OxLDL。
2.MabHS1單克隆抗體的制備與純化構(gòu)建MabHS1單克隆抗體株小鼠的同系小鼠，腹腔注射0.5ml的異十八烷一周后，腹腔注射3×106個(gè)1所得MabHS1單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞(CCTCC，保藏號(hào)C200304)，7～10天后，收集小鼠腹水，0.45μm微孔膜過濾及12000r/min離心15分鐘后，用親和層析法從腹水中純化抗體。自制抗體MabHS1與Cu-OxLDL和PC-KLH結(jié)合，但不與天然LDL和丙二醛修飾的LDL(MDA-LDL)結(jié)合(附圖4，5，6)。
實(shí)施例2酶聯(lián)免疫法定量測(cè)定OxLDL。
采用雙抗體法測(cè)定血清樣品中的OxLDL。
材料96孔ELISA微滴板，抗ApoB抗體，PBS，檢測(cè)樣本，BSA，TEPC15或自制抗體MabHS1，AP或HRP標(biāo)記的抗TEPC15或自制抗體MabHS1第二抗體，ELISA讀數(shù)儀，PC化合物。
方法用PBS將抗ApoB抗體，加入到ELISA板中，4℃放置24-48小時(shí)。用含有0.1％tween 20的PBS洗滌ELISA板。向ELISA板的各孔中分別加入待測(cè)樣品、陰性對(duì)照，37℃放置1小時(shí)。洗滌板三次，加入BSA-PBS稀釋的第一抗體TEPC15或者自制抗體MabHS1，37℃放置1小時(shí)。洗滌板三次，加入稀釋好的HRP標(biāo)記羊抗小鼠Ig第二抗體，37℃放置45分鐘。洗滌板三次，加入配好的顯色液，室溫或37℃顯色15-30分鐘，硫酸終止反應(yīng)。ELISA讀數(shù)儀測(cè)定光吸收值。以倍比稀釋的已知濃度的PC化合物包被ELISA板，加入BSA-PBS稀釋的第一抗體TEPC15或者自制抗體MabHS1，37℃放置1小時(shí)。洗滌板三次，加入稀釋好的HRP標(biāo)記抗TEPC15或自制抗體MabHS1第二抗體，37℃放置45分鐘。洗滌板三次，加入配好的顯色液，室溫或37℃顯色15-30分鐘，硫酸終止反應(yīng)。ELISA讀數(shù)儀測(cè)定光吸收值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(附圖5)。根據(jù)樣品的測(cè)定值查找出OxLDL氧化表位的含量。
實(shí)施例3放射免疫測(cè)定法定量測(cè)定OxLDL。
材料放射性同位素3H、14C或32P標(biāo)記的PC，檢測(cè)樣本，TEPC15抗體或自制抗體MabHS1抗體，免疫分離劑。
方法將放射性同位素標(biāo)記的PC和被測(cè)含OxLDL樣本與限量的TEPC15抗體或自制抗體MabHS1抗體混合，4℃溫育24小時(shí)，加入免疫分離劑，抗原抗體復(fù)合物產(chǎn)生沉淀。離心分離，分別測(cè)定標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物(B)和游離標(biāo)記PC(F)的放射活性。計(jì)算標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物放射結(jié)合率(B/T(T＝B+F))。同時(shí)以一系列已知濃度的未標(biāo)記PC和一定量的放射標(biāo)記的PC以及TEPC15或者自制抗體MabHS1相混合，測(cè)出各標(biāo)準(zhǔn)濃度未標(biāo)記PC參加下的標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物放射結(jié)合率(B/T或B/T)，以放射結(jié)合率為縱座標(biāo)和已知未標(biāo)記PC為橫座標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線。根據(jù)被測(cè)抗原的放射性結(jié)合率，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上即可查出相應(yīng)的OxLDL含量。
實(shí)施例4化學(xué)發(fā)光免疫分析法定量測(cè)定OxLDL。
采用雙抗體法測(cè)定血清樣品中的OxLDL。
材料MicroFluor微滴板，抗ApoB抗體，PBS，檢測(cè)樣本，BSA，TEPC15或自制抗體MabHS1，堿性磷酸酶(AP)標(biāo)記的抗TEPC15或者抗自制抗體MabHS1第二抗體，LumiPhos 530(Lumigen Inc.，Southfield，Michigan，USA)，DYNEX亮度計(jì)(DYNEX Technologies)，PC(PC)化合物方法用俘獲抗體，即抗ApoB抗體包被MicroFluor微滴板的孔。這些抗體可以是選自單克隆抗體、多克隆抗體或單鏈抗體。用PBS洗滌孔三次，然后將檢測(cè)樣本--血清用含1％BSA的PBS(BSA-PBS)稀釋(1∶10至1∶100)后，加入微滴板的孔。室溫孵育20-60分鐘，優(yōu)選30分鐘。用PBS洗滌孔三次，將BSA-PBS稀釋的第一抗體TEPC15或自制抗體MabHS1加入孔中，并于室溫下溫育。用PBS洗滌孔三次。加入堿性磷酸酶(AP)標(biāo)記的抗TEPC15或者抗自制抗體MabHS1第二抗體。接著用水漂洗，并加入LumiPhos 530溶液。使用DYNEX亮度計(jì)以相對(duì)光單位(RLU)測(cè)定光發(fā)射。同時(shí)以已知濃度的PC(PC)化合物連續(xù)10倍梯度稀釋后包被孔，以BSA-PBS稀釋的第一抗體TEPC15或自制抗體MabHS1加入孔中，并于室溫下溫育。用PBS洗滌孔三次。加入堿性磷酸酶(AP)標(biāo)記的抗TEPC15或者抗自制抗體MabHS1第二抗體。接著用水漂洗，并加入LumiPhos 530溶液，測(cè)定RLU，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品的測(cè)定值查找出OxLDL氧化表位的含量。
實(shí)施例5生物素-親和素系統(tǒng)夾心法定量測(cè)定OxLDL(附圖3)。
材料MicroFluor微滴板，抗ApoB抗體，PBS，檢測(cè)樣本，BSA，生物素標(biāo)記的TEPC15或者自制抗體MabHS1，HRP或AP標(biāo)記親和素，顯色液，PC化合物方法用磷酸鹽緩沖液將抗ApoB抗體，加入到ELISA板中，4℃放置24-48小時(shí)。用含有0.1％tween 20的PBS洗滌ELISA板。向ELISA板的各孔中分別加入待測(cè)樣品、陰性對(duì)照，37℃放置1小時(shí)。洗滌板三次，加入BSA-PBS稀釋的生物素標(biāo)記的TEPC15或者自制抗體MabHS1，37℃放置1小時(shí)。洗滌板三次，加入稀釋好的HRP或AP標(biāo)記親和素，37℃放置45分鐘。洗滌板三次，加入配好的顯色液，室溫或37℃顯色15-30分鐘，終止反應(yīng)。ELISA讀數(shù)儀測(cè)定光吸收值。以倍比稀釋的已知濃度的PC化合物包被ELISA板，加入BSA-PBS稀釋的生物素標(biāo)記的TEPC15或者自制抗體MabHS1，37℃放置1小時(shí)。洗滌板三次，加入稀釋好的HRP或AP標(biāo)記親和素，37℃放置45分鐘。洗滌板三次，加入配好的顯色液，室溫或37℃顯色15-30分鐘，終止反應(yīng)。ELISA讀數(shù)儀測(cè)定光吸收值。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品的測(cè)定值查找出OxLDL氧化表位的含量。
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權(quán)利要求
1.一種定量檢測(cè)氧化低密度脂蛋白的方法，包含下列步驟(a)將抗磷酸膽堿的抗體與含有氧化低密度脂蛋白的樣品接觸；(b)使所述抗體與氧化低密度脂蛋白結(jié)合；(c)測(cè)定所述抗體與氧化低密度脂蛋白的結(jié)合量。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述抗體為單克隆抗體、多克隆抗體或單鏈抗體可變區(qū)片段。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中編碼所述抗體的基因含有重鏈可變區(qū)S107 VH和輕鏈可變區(qū)V-kappa 22 VL。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其中所述樣品為血清、血漿、組織勻漿液或組織提取液。
5.如權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的方法，其中所述步驟(c)采用化學(xué)發(fā)光免疫分析法。
6.如權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的方法，其中所述步驟(c)采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法。
7.如權(quán)利要求1任一項(xiàng)所述的方法，其中所述步驟(c)采用生物素—親和素系統(tǒng)測(cè)定法。
8.如權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的方法，其中所述步驟(c)采用放射免疫測(cè)定法。
9.如權(quán)利要求1-4所述的方法，其還包括步驟(d)根據(jù)以磷酸膽堿化合物為標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，定量氧化低密度脂蛋白表面的氧化特異抗原決定簇的量。
10.一種檢測(cè)氧化低密度脂蛋白的試劑盒，其包含抗磷酸膽堿的抗體。
11.如權(quán)利要求10所述的試劑盒，其中所述抗體為單克隆抗體、多克隆抗體或單鏈抗體可變區(qū)片段。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其中所述抗體的基因組成含有重鏈可變區(qū)S107 VH和輕鏈可變區(qū)V-kappa 22VL。
13.如權(quán)利要求10-12任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述抗磷酸膽堿抗體是用酶標(biāo)記的，該試劑盒還包括經(jīng)與酶作用能發(fā)光或顯色的化學(xué)物質(zhì)。
14.如權(quán)利要求10-12任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中進(jìn)一步包括用酶標(biāo)記的抗磷酸膽堿抗體的二級(jí)抗體以及經(jīng)與酶作用能發(fā)光或顯色的化學(xué)物質(zhì)。
15.如權(quán)利要求10-12任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中還包括用放射性同位素標(biāo)記的磷酸膽堿、同位素標(biāo)記的抗磷酸膽堿抗體或同位素標(biāo)記的抗磷酸膽堿抗體的第二抗體。
16.如權(quán)利要求10-12任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述抗體是用生物素標(biāo)記的抗磷酸膽堿抗體，該試劑盒還包括用酶標(biāo)記的親和素及經(jīng)與酶作用能發(fā)光或顯色的化學(xué)物質(zhì)。
17.如權(quán)利要求10-12任一項(xiàng)所述的試劑盒，其中所述抗體是用生物素標(biāo)記的抗磷酸膽堿抗體的二級(jí)抗體，該試劑盒還包括用酶標(biāo)記的親和素及經(jīng)與酶作用能發(fā)光或顯色的化學(xué)物質(zhì)。
18.抗磷酸膽堿的抗體的應(yīng)用，用于檢測(cè)哺乳動(dòng)物體內(nèi)氧化低密度脂蛋白的氧化程度。
19.一種保藏號(hào)為C200304的雜交瘤細(xì)胞系。
20.一種由權(quán)利要求19所述雜交瘤細(xì)胞生產(chǎn)的單克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明涉及氧化低密度脂蛋白表面呈現(xiàn)的特異性抗原決定簇的定量檢測(cè)方法及其試劑盒。本發(fā)明公開的定量檢測(cè)方法包括下列步驟(a)將抗磷酸膽堿的抗體與含有OxLDL的樣品接觸；(b)使所述抗體與OxLDL結(jié)合；(c)測(cè)定所述抗體與OxLDL的結(jié)合量；(d)依據(jù)以磷酸膽堿為標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)得的標(biāo)準(zhǔn)曲線，定量OxLDL含量。本發(fā)明還公開了檢測(cè)OxLDL的試劑盒，該試劑盒包含抗磷酸膽堿的抗體。本發(fā)明對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化疾病發(fā)生、發(fā)展的診斷提供了可靠的參照指標(biāo)。
文檔編號(hào)G01N33/68GK1536365SQ0310993
公開日2004年10月13日 申請(qǐng)日期2003年4月8日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月8日
發(fā)明者蕭旭, 蕭 旭 申請(qǐng)人:蕭旭, 蕭 旭