專利名稱：測定鱟試劑靈敏度的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測，具體地說是測定鱟試劑靈敏度的方法。
背景技術(shù)：
細(xì)菌內(nèi)毒素(Bacterial Endotoxin)是革蘭氏陰性細(xì)菌所產(chǎn)生的具有各種生物活性的大分子物質(zhì)，其主要化學(xué)成分為脂多糖(LPS)；內(nèi)毒素是注射劑藥品(原料等)中的主要污染物質(zhì)。
細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測方法有家兔試驗法、鱟試驗法。鱟試驗法(LimulusAmebocyte Lysate，LAL，或Tachypleus Amebocyte Lysate，TAL)是利用鱟試劑與內(nèi)毒素發(fā)生凝集反應(yīng)的機(jī)理，以定性或定量檢測藥品或機(jī)體血液中的感染細(xì)菌內(nèi)毒素的一種體外檢測方法。采用產(chǎn)色或產(chǎn)螢光的肽型化合物，用于分析內(nèi)毒素，化合物結(jié)構(gòu)R1-A1-A2-A3-A4-B-R2，R2代表產(chǎn)色或產(chǎn)螢光基團(tuán)；內(nèi)毒素激活LAL的酶，酶水解肽型化合物生成顏色[文獻(xiàn)1.美國專利名稱為Peptide-type substrates useful in the quantitative determination ofendotoxin.專利號為US4510241]；利用內(nèi)毒素的脂多糖與多粘菌素或八肽或類似的環(huán)肽的相互作用來測定內(nèi)毒素，環(huán)肽或脂多糖上標(biāo)記酶以供進(jìn)一步檢測[文獻(xiàn)2.歐洲專利名稱為Endotoxin assay.專利號為EP0265127]；用于鱟試劑測定用的肽型化合物，結(jié)構(gòu)X-A1-A2-A3-B-R，A1-A2-A3是氨基酸，B是酰胺混合物，R與鱟試劑反應(yīng)釋放后產(chǎn)生氨基，進(jìn)一步形成可見顏色[文獻(xiàn)3.歐洲專利名稱為Peptide substrates and method for thequantitative assay of endotoxin.專利號為EP0228666]；一種用鱟血液變形細(xì)胞溶解物的試劑，及其測定含絲氨酸蛋白酶樣品中內(nèi)毒素的方法[文獻(xiàn)4.中國專利名稱為用于內(nèi)毒素測定的試劑以及使用該試劑進(jìn)行測定的方法，專利號為ZL94103286.8]；用于內(nèi)毒素特異性鑒別的含有鱟變形細(xì)胞溶解物試劑和烷基葡糖苷的試劑，及使用該試劑特異性鑒別樣品中內(nèi)毒素的方法[文獻(xiàn)5.中國專利名稱為用于內(nèi)毒素特異性鑒別的試劑，專利號為ZL94117898.6]；一種鱟試劑細(xì)菌內(nèi)毒素快檢盒及使用方法，是按細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法所需的鱟試劑、內(nèi)毒素、溶解液、移液滴管等有關(guān)用具經(jīng)特殊處理后，分套包裝成試劑盒，簡化實驗操作[文獻(xiàn)6.中國專利名稱為鱟試劑細(xì)菌內(nèi)毒素快檢盒及使用方法，專利號為ZL95115774.4]；一種鱟試劑的活性定向生產(chǎn)工藝，制得鱟試劑不易受污染，靈敏度高，自身空白陰性觀察時間長，產(chǎn)品穩(wěn)定性高[文獻(xiàn)7.中國專利專利號為ZL95105652.2]；一種通過鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素產(chǎn)生凝集反應(yīng)實現(xiàn)對水中細(xì)菌毒素含量進(jìn)行限量測定的儀器[文獻(xiàn)8.中國專利名稱為一種細(xì)菌內(nèi)毒素測定儀，專利號為ZL95216488.4]，它具有結(jié)構(gòu)簡單、成本低廉、操作方便、檢測判定結(jié)果可靠以及符合藥典規(guī)定等諸多優(yōu)點。
利用動態(tài)比濁法和動態(tài)比色法原理，可以采用儀器來定量測定內(nèi)毒素的濃度C，即在鱟試劑反應(yīng)過程中，觀察其濁度變化曲線或產(chǎn)色物質(zhì)的顏色變化曲線，預(yù)設(shè)一個吸光度OD值如OD0.02或拐點，以反應(yīng)曲線從開始上升到該預(yù)設(shè)值時經(jīng)歷的時間作為反應(yīng)時間(T(OD0.02)或T50，秒)，該反應(yīng)時間的對數(shù)與內(nèi)毒素濃度的對數(shù)呈線性關(guān)系，即標(biāo)準(zhǔn)曲線為LogT(OD0.02)＝a+b LogC或者Log T50＝a+b LogC，通過與標(biāo)準(zhǔn)曲線的比較來計算樣品中的內(nèi)毒素濃度。國內(nèi)外常用的相應(yīng)的檢測儀器有美國LAL-5000型、日本和光Toxinometer ET-201系列、國內(nèi)金山川EDS-98，MB-80系列檢測系統(tǒng)及天大BET-32系列檢測系統(tǒng)。
采用鱟試驗法，不管是定性還是定量測定內(nèi)毒素的含量，鱟試劑靈敏度的準(zhǔn)確性是至關(guān)重要的；常規(guī)的鱟試劑靈敏度的測定方法是限量法分別進(jìn)行預(yù)測定和正式測定，需要將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品等比稀釋為至少4個濃度，每個濃度做4個管，所用標(biāo)準(zhǔn)品多，試驗準(zhǔn)備耗時長；反應(yīng)保溫時間為60±2分鐘，反應(yīng)時間長；觀察結(jié)果用目測法，容易出現(xiàn)人為誤差；內(nèi)毒素的回收率在50-200％之間，范圍寬。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是，提供一種測定鱟試劑靈敏度的方法，以準(zhǔn)確、快速地測定鱟試劑的靈敏度，解決了測定鱟試劑靈敏度的方法穩(wěn)定性問題。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為采用一系列(3～6個)不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素溶液，在內(nèi)毒素測定儀上，對不同靈敏度的標(biāo)準(zhǔn)鱟試劑分別進(jìn)行試驗，將其反應(yīng)時間的對數(shù)與內(nèi)毒素濃度的對數(shù)做線性回歸，得到相應(yīng)的不同靈敏度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，作為判斷的依據(jù)；待測靈敏度的鱟試劑，與一個或多個(1～6個)濃度的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素反應(yīng)，得到相應(yīng)的反應(yīng)時間，利用不同靈敏度鱟試劑的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別計算內(nèi)毒素濃度及內(nèi)毒素的回收率，再根據(jù)回收率在75-120％之內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)曲線所對應(yīng)的靈敏度，來確定待測鱟試劑的靈敏度。
所述內(nèi)毒素測定儀是采用動態(tài)比濁法或動態(tài)比色法定量測定內(nèi)毒素，得到相應(yīng)的不同靈敏度鱟試劑的測定內(nèi)毒素的標(biāo)準(zhǔn)曲線；所述動態(tài)比濁法為OD限值法、透光率限值法或T50歸一化法；標(biāo)準(zhǔn)鱟試劑靈敏度范圍最好為0.01～0.5EU/ml；未知鱟試劑的靈敏度范圍最好在0.01～0.5EU/ml。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點1.快速。本發(fā)明采用定量法來測定鱟試劑的靈敏度，由于利用其定量測定的原理，采用同一個濃度的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素，在內(nèi)毒素測定儀上，分別對不同靈敏度的標(biāo)準(zhǔn)鱟試劑進(jìn)行重復(fù)試驗，得到相應(yīng)的反應(yīng)時間的均值和標(biāo)準(zhǔn)差，然后采用同一濃度的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)即可完成鱟試劑靈敏度的測定，試驗準(zhǔn)備耗時短。另外，在內(nèi)毒素測定儀器上，采用鱟試劑直接測定內(nèi)毒素，最少試驗10分鐘即可得到相應(yīng)的數(shù)據(jù)，用于鱟試劑靈敏度的計算，反應(yīng)時間短。
2.準(zhǔn)確。本發(fā)明可以利用已有的內(nèi)毒素測定儀器，實現(xiàn)鱟試劑靈敏度的準(zhǔn)確、定量化測定，內(nèi)毒素的回收率范圍在75-120％之間，遠(yuǎn)小于常規(guī)方法要求的50-200％的回收率范圍，計算的鱟試劑的靈敏度精確。觀察結(jié)果用儀器測定吸光度法，結(jié)果客觀、準(zhǔn)確。
3.應(yīng)用范圍廣。本發(fā)明可應(yīng)用于動態(tài)比濁法和動態(tài)比色法，可望應(yīng)用于科研、藥品生產(chǎn)檢驗、鱟試劑的生產(chǎn)過程監(jiān)控和質(zhì)量控制等，為藥品中內(nèi)毒素的測定提供更科學(xué)、客觀的方法。


圖1為不同靈敏度鱟試劑的標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖。
圖2為0.06EU/ml鱟試劑樣品的靈敏度判斷示意圖。
圖3為0.25EU/ml鱟試劑樣品的靈敏度判斷示意圖。
具體實施例方式
實施例1.
1)用于內(nèi)毒素測定的不同鱟試劑的標(biāo)準(zhǔn)曲線基于標(biāo)準(zhǔn)曲線LogT(OD0.02)＝a+b LogC，采用標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素濃度0.22-22EU/ml，分別對靈敏度為0.5、0.25、0.06EU/ml的標(biāo)準(zhǔn)鱟試劑進(jìn)行試驗，得到相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線為(1)y＝-0.6197x+3.1531；(2)y＝-0.3725x+3.322；(3)y＝-0.4129x+3.2038；基于標(biāo)準(zhǔn)曲線Log(T50)＝a+b LogC，采用標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素濃度0.22-22EU/ml，對靈敏度為0.01EU/ml的標(biāo)準(zhǔn)鱟試劑進(jìn)行試驗，得到相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線為(4)y＝-0.171x+2.89；基于標(biāo)準(zhǔn)曲線Log(T50)＝a+b LogC，采用標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素濃度3.125，6.25，25EU/ml，對靈敏度為0.06EU/ml的標(biāo)準(zhǔn)鱟試劑進(jìn)行試驗，得到相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線為(5)y＝-0.377x+3.48；2)鱟試劑1的靈敏度測定采用4.4、2.2、0.88、0.44、0.22EU/ml的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素，對待測鱟試劑1進(jìn)行試驗，得到T(OD0.02)值依次為810、1200、1890、2110、2920秒。分別采用標(biāo)準(zhǔn)曲線(1)、(2)、(3)計算內(nèi)毒素濃度和內(nèi)毒素的回收率，回收率依次為(56％、60％、72％、120％、142％)；(293％、204％、151％、224％、187％)；(118％、91％、76％、116％、106％)，回收率在75-120％之間的是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(3)計算的結(jié)果，所以鱟試劑1的靈敏度是0.06EU/ml；鱟試劑2的靈敏度測定采用4.4、2.2、0.88、0.44、0.22EU/ml的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素，對待測鱟試劑2進(jìn)行試驗，得到T(OD0.02)值依次為1150、1650、2240、2860、3600秒。分別采用標(biāo)準(zhǔn)曲線(1)、(2)、(3)計算內(nèi)毒素濃度和內(nèi)毒素的回收率，回收率依次為(32％、36％、55％、74％、102％)；(114％、87％、95％、99％、107％)；(50％、42％、50％、56％、64％)，回收率在75-120％之間的是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(2)計算的結(jié)果，所以鱟試劑2的靈敏度是0.25EU/ml。
實施例2.
1)用于內(nèi)毒素測定的不同鱟試劑的標(biāo)準(zhǔn)曲線采用標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素濃度0.22-22EU/ml，對靈敏度為0.125EU/ml的標(biāo)準(zhǔn)鱟試劑進(jìn)行試驗，基于標(biāo)準(zhǔn)曲線LogT(OD0.02)＝a+b LogC，得到相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線為(6)y＝-0.4204x+3.1932；2)鱟試劑3的靈敏度測定采用4.4EU/ml的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素，對待測鱟試劑3進(jìn)行試驗，得到T(OD0.02)值為820秒，分別采用標(biāo)準(zhǔn)曲線(1)、(2)、(4)計算內(nèi)毒素濃度和內(nèi)毒素的回收率，回收率依次為58％、303％、111％，回收率在75-120％之間的是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(6)計算的結(jié)果，所以鱟試劑3的靈敏度是0.125EU/ml；鱟試劑3的靈敏度測定采用22EU/ml的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素，對待測鱟試劑3進(jìn)行試驗，得到T(OD0.02)值為470秒，分別采用標(biāo)準(zhǔn)曲線(1)、(2)、(4)計算內(nèi)毒素濃度和內(nèi)毒素的回收率，回收率依次為27％、253％、79％，回收率在75-120％之間的是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(6)計算的結(jié)果，所以鱟試劑3的靈敏度是0.125EU/ml。儀器測定試驗耗時470秒，約8分鐘。
比較例1.
常規(guī)的鱟試劑靈敏度的測定方法是限量法，需要進(jìn)行預(yù)測定和正式測定，需要將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品以2倍等比稀釋，選擇能出現(xiàn)陽性和陰性結(jié)果的4個邊界稀釋液，每一稀釋液作4管，且其最高濃度的4管應(yīng)均為陽性、最低濃度的4管應(yīng)均為陰性，輕輕振動上述試管混勻內(nèi)容物，封閉管口，置37±1℃水浴中，保溫60±2分鐘觀察結(jié)果并按要求計算本批鱟試劑靈敏度(λ)，內(nèi)毒素的回收率在50～200％之間；即將不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素與鱟試劑在37℃保溫反應(yīng)1小時，根據(jù)目測是否出現(xiàn)凝膠來判斷、計算鱟試劑靈敏度。
權(quán)利要求
1.測定鱟試劑靈敏度的方法，其特征在于1)采用3-6個濃度的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素，在內(nèi)毒素測定儀上，對不同靈敏度的標(biāo)準(zhǔn)鱟試劑進(jìn)行試驗，將其反應(yīng)時間的對數(shù)與內(nèi)毒素濃度的對數(shù)做線性回歸，得到相應(yīng)的不同靈敏度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，作為判斷的依據(jù)；2)待測靈敏度的鱟試劑，與1～6個濃度的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素反應(yīng)，得到相應(yīng)的反應(yīng)時間，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計算內(nèi)毒素濃度及內(nèi)毒素的回收率，根據(jù)回收率在75-120％之內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)曲線所對應(yīng)的靈敏度，確定為待測鱟試劑的靈敏度。
2.按照權(quán)利要求1所述的測定鱟試劑的靈敏度的方法，其特征在于所述內(nèi)毒素測定儀是采用動態(tài)比濁法或動態(tài)比色法定量測定內(nèi)毒素，得到相應(yīng)的不同靈敏度鱟試劑的測定內(nèi)毒素的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
3.按照權(quán)利要求2所述的測定鱟試劑的靈敏度的方法，其特征在于所述動態(tài)比濁法為OD限值法、透光率限值法或T50歸一化法。
4.按照權(quán)利要求1所述的測定鱟試劑的靈敏度的方法，其特征在于標(biāo)準(zhǔn)鱟試劑靈敏度范圍為0.01～0.5EU/ml。
5.按照權(quán)利要求1所述的測定鱟試劑的靈敏度的方法，其特征在于未知鱟試劑的靈敏度范圍在0.01～0.5EU/ml。
全文摘要
本發(fā)明涉及細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測，具體地說是測定鱟試劑靈敏度的方法，其特征在于1)采用3－6個濃度的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素，在內(nèi)毒素測定儀上，對不同靈敏度的標(biāo)準(zhǔn)鱟試劑進(jìn)行試驗，將其反應(yīng)時間的對數(shù)與內(nèi)毒素濃度的對數(shù)做線性回歸，得到相應(yīng)的不同靈敏度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，作為判斷的依據(jù)；2)待測靈敏度的鱟試劑，與1～6個濃度的標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)毒素反應(yīng)，在相應(yīng)的反應(yīng)時間或溶液的吸光度條件下，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計算內(nèi)毒素濃度及內(nèi)毒素的回收率，根據(jù)回收率在75－120％之內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)曲線所對應(yīng)的靈敏度，確定為待測鱟試劑的靈敏度。本發(fā)明的優(yōu)點是快速、準(zhǔn)確、應(yīng)用范圍廣。
文檔編號G01N33/52GK1536363SQ03111398
公開日2004年10月13日 申請日期2003年4月9日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月9日
發(fā)明者李京華, 邵英光, 王俊德 申請人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所