專利名稱：克百威速測(cè)金標(biāo)免疫試紙條的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用膠體金標(biāo)記顯色的免疫層析法快速檢測(cè)蔬菜瓜果等農(nóng)產(chǎn)品中的農(nóng)藥殘留試紙條，尤其是一種克百威速測(cè)金標(biāo)免疫試紙條。屬于農(nóng)藥殘留的免疫化學(xué)速測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
近年來，由于使用受到有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥污染的蔬菜，而造成急性中毒的事件屢有發(fā)生，農(nóng)產(chǎn)品安全問題已日益受到人們重視。各種農(nóng)藥速測(cè)技術(shù)及其產(chǎn)品在中國(guó)、韓國(guó)、泰國(guó)等國(guó)家和地區(qū)已得到大力推廣，但其中仍有一些明顯的缺陷與不足目前用于有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留檢測(cè)的酶抑制紙片產(chǎn)品，只能對(duì)果蔬的農(nóng)藥殘留作粗略的定性鑒別，不能定量分析，方法重現(xiàn)性差，假陽(yáng)性、假陰性事件層出不窮；此外酶抑制紙片還受到溫度與濕度的局限，容易失效，導(dǎo)致“錯(cuò)案”時(shí)有發(fā)生，造成菜農(nóng)受損失，市民不放心，也給相關(guān)的主管部門增添了麻煩。而ELISA試劑盒雖然在準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性上作了改進(jìn)，其使用過程中的反復(fù)洗滌，使操作顯得繁雜，不能實(shí)現(xiàn)真正意義上的一步法現(xiàn)場(chǎng)速測(cè)。
經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)中國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)枮?2139704.x，名稱為“半定量快速檢測(cè)鹽酸克倫特羅的試紙條及生產(chǎn)和使用方法”，該項(xiàng)專利申請(qǐng)的技術(shù)方案是這樣描述的本檢測(cè)試紙條由底板、玻璃纖維紙、免疫層析復(fù)合膜即硝酸纖維或醋酸纖維膜、膠體金標(biāo)記得鹽酸克倫特羅—載體蛋白偶合物、鹽酸克倫特羅克隆抗體及吸水紙組成。該項(xiàng)專利申請(qǐng)又稱它是一種借助膠體金標(biāo)記顯色的免疫層析反映，用以快速檢測(cè)動(dòng)物各種組織、尿液、體液及飼料中的鹽酸克倫特羅的殘留物的檢測(cè)試紙。該項(xiàng)專利申請(qǐng)沒有描述該“檢測(cè)試紙條”的具體的結(jié)構(gòu)特征，使得該專利申請(qǐng)的技術(shù)不清楚，同時(shí)該專利申請(qǐng)的“檢測(cè)試紙條”不能用于對(duì)克百威農(nóng)藥殘留進(jìn)行速測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種克百威速測(cè)金標(biāo)免疫試紙條。使其成為一種便于現(xiàn)場(chǎng)操作，快速準(zhǔn)確，特異性強(qiáng)，靈敏度高的克百威農(nóng)藥殘留速測(cè)試紙條。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，本發(fā)明包括樣品墊、固載膠體金標(biāo)記克百威單抗的玻璃纖維膜、硝酸纖維膜、克百威-OVA結(jié)合物測(cè)試線、羊抗鼠IgG質(zhì)控線、吸水玻璃纖維膜、塑料底板，其連接方式為塑料底板的兩端分別設(shè)置樣品墊和吸水玻璃纖維膜，中間設(shè)置硝酸纖維膜，硝酸纖維膜上靠近樣品墊一端噴涂克百威-OVA結(jié)合物測(cè)試線，靠近吸水玻璃纖維膜一端噴涂羊抗鼠IgG質(zhì)控線，連接樣品墊和硝酸纖維膜之間噴涂有膠體金標(biāo)記克百威單抗的玻璃纖維膜。
先用Airjet定量噴頭在玻璃纖維膜上噴涂膠體金標(biāo)記克百威單抗。再用Biojet微定量噴頭在硝酸纖維膜上噴涂?jī)蓷l平行線?？拷鼧悠穳|一端的線上噴涂克百威-OVA結(jié)合物，作為測(cè)試線；靠近吸水玻璃纖維膜一端的線上噴涂羊抗鼠IgG，作為質(zhì)控線。將硝酸纖維膜放入1％牛血清白蛋白(BSA)中包被30分鐘，然后用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，37℃干燥3小時(shí)。
最后將硝酸纖維膜、固載膠體金標(biāo)記克百威單抗的玻璃纖維膜、樣品墊自下至上依次粘貼于塑料底板上。硝酸纖維膜與固載膠體金標(biāo)記克百威單抗的玻璃纖維膜交叉重疊。樣品墊與固載膠體金標(biāo)記克百威單抗的玻璃纖維膜交叉重疊。將吸水玻璃纖維膜粘貼于塑料底板，并與硝酸纖維膜交叉重疊。
本發(fā)明的原理是待測(cè)樣品根據(jù)層析原理，經(jīng)試紙條S端，向另一端移動(dòng)，先后依次經(jīng)過噴有膠體金標(biāo)記克百威單克隆抗體的玻璃纖維膜和噴有克百威-OVA結(jié)合物測(cè)試線及羊抗鼠IgG控制線的硝酸纖維膜。若待測(cè)樣品中克百威含量超標(biāo)，則樣品中的克百威農(nóng)藥就會(huì)和硝酸纖維膜測(cè)試線上的克百威-OVA結(jié)合物一起競(jìng)爭(zhēng)性地與玻璃纖維膜上的金標(biāo)克百威單克隆抗體結(jié)合。由于金標(biāo)克百威單抗受到了樣品中克百威農(nóng)藥的抑制，無法與測(cè)試線上的克百威-OVA結(jié)合物反應(yīng)，從而無法使金顆粒凝集顯色；若樣品中克百威含量不超標(biāo)，則金標(biāo)克百威單抗不受競(jìng)爭(zhēng)性抑制而與測(cè)試線上的克百威-OVA結(jié)合物反應(yīng)后，使得金顆粒凝集顯色。硝酸纖維膜上的羊抗鼠IgG控制線是為檢驗(yàn)金標(biāo)免疫層析方法本身是否有效而設(shè)定的?？刂凭€顯色，則說明試紙條的檢測(cè)結(jié)果有效；反之，則失效。
本發(fā)明具有實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著進(jìn)步，與市場(chǎng)上現(xiàn)用的速測(cè)試紙條相比，本發(fā)明具有以下顯著優(yōu)點(diǎn)檢測(cè)速度快完成一次檢測(cè)只需10分鐘，能滿足現(xiàn)場(chǎng)速測(cè)的需求；雙重保險(xiǎn)除了試紙條能檢測(cè)農(nóng)藥殘留外，同時(shí)羊抗鼠IgG控制線可檢測(cè)速測(cè)試紙條本身是否失效，避免了假陽(yáng)性和假陰性現(xiàn)象的發(fā)生；攜帶方便、操作簡(jiǎn)便無需專業(yè)人員操作。在菜場(chǎng)、超市、食堂、家庭等各場(chǎng)所，普通用戶借助使用說明即能完成現(xiàn)場(chǎng)速測(cè)；靈敏度高、特異性強(qiáng)，制備工藝簡(jiǎn)單，成本低。


圖1本發(fā)明結(jié)構(gòu)示意圖具體實(shí)施方式
如圖1所示，本發(fā)明包括樣品墊1、固載膠體金標(biāo)記克百威單抗的玻璃纖維膜2、硝酸纖維膜3、克百威-OVA結(jié)合物測(cè)試線4、羊抗鼠IgG質(zhì)控線5、吸水玻璃纖維膜6、塑料底板7，其連接方式為塑料底板7的兩端分別設(shè)置樣品墊1和吸水玻璃纖維膜6，中間設(shè)置硝酸纖維膜3，硝酸纖維膜3上靠近樣品墊1一端噴涂克百威-OVA結(jié)合物測(cè)試線4，靠近吸水玻璃纖維膜6一端噴涂羊抗鼠IgG質(zhì)控線5，連接樣品墊1和硝酸纖維膜3之間噴涂有膠體金標(biāo)記克百威單抗的玻璃纖維膜2。
將硝酸纖維膜3、固載膠體金標(biāo)記克百威單抗的玻璃纖維膜2、樣品墊1自下至上依次粘貼于塑料底板7(5×60mm)上。硝酸纖維膜3與固載膠體金標(biāo)記克百威單抗的玻璃纖維膜2交叉重疊2mm。樣品墊1與固載膠體金標(biāo)記克百威單抗的玻璃纖維膜2交叉重疊4mm。將吸水玻璃纖維膜6粘貼于塑料底板7，并與硝酸纖維膜3交叉重疊2mm。
以下提供應(yīng)用實(shí)例應(yīng)用實(shí)例一將3條試紙條S端分別插入5mg/L、0.5mg/L和0.05mg/L的克百威農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)樣品中，停留5秒后取出平放，或用滴管在樣品墊上滴加3-4滴液體樣品，10分鐘后觀察試紙條顏色變化。結(jié)果測(cè)試克百威濃度為5mg/L和0.5mg/L的試紙條上測(cè)試線不顯色，控制線上出現(xiàn)紫紅色條帶，表示陽(yáng)性；而測(cè)試克百威濃度為0.05mg/L的試紙條的測(cè)試線和控制線上均出現(xiàn)紫紅色條帶，表示陰性。
應(yīng)用實(shí)例二將采集大棚中施有過量克百威農(nóng)藥的生菜葉片，剪成1cm2的碎片，放入提取緩沖液中震蕩5分鐘。把試紙條樣品墊浸入緩沖液中達(dá)5秒鐘后取出平放，10分鐘后觀察結(jié)果，只有控制線呈紫紅色條帶，測(cè)試線不顯色，表示測(cè)試結(jié)果為陽(yáng)性。
應(yīng)用實(shí)例三采集蔬菜種植基地的土壤樣品，放入提取緩沖液中，劇烈震蕩5分鐘，測(cè)定方法如實(shí)施例二，若試紙條上出現(xiàn)二條紫紅色條帶，則結(jié)果為陰性；若只有控制線上出現(xiàn)紫紅色條帶，則結(jié)果為陽(yáng)性。
權(quán)利要求
1.一種克百威速測(cè)金標(biāo)免疫試紙條，包括樣品墊(1)、硝酸纖維膜(3)、吸水玻璃纖維膜(6)、塑料底板(7)，其特征在于，還包括固載膠體金標(biāo)記克百威單抗的玻璃纖維膜(2)、克百威-OVA結(jié)合物測(cè)試線(4)、羊抗鼠IgG質(zhì)控線(5)，其連接方式為塑料底板(7)的兩端分別設(shè)置樣品墊(1)和吸水玻璃纖維膜(6)，中間設(shè)置硝酸纖維膜(3)，硝酸纖維膜(3)上靠近樣品墊(1)一端噴涂克百威-OVA結(jié)合物測(cè)試線(4)，靠近吸水玻璃纖維膜(6)一端噴涂羊抗鼠IgG質(zhì)控線(5)，連接樣品墊(1)和硝酸纖維膜(3)之間噴涂有膠體金標(biāo)記克百威單抗的玻璃纖維膜(2)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的克百威速測(cè)金標(biāo)免疫試紙條，其特征是將硝酸纖維膜(3)、固載膠體金標(biāo)記克百威單抗的玻璃纖維膜(2)、樣品墊(1)自下至上依次粘貼于塑料底板(7)上。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的克百威速測(cè)金標(biāo)免疫試紙條，其特征是硝酸纖維膜(3)與固載膠體金標(biāo)記克百威單抗的玻璃纖維膜(2)交叉重疊。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的克百威速測(cè)金標(biāo)免疫試紙條，其特征是樣品墊(1)與固載膠體金標(biāo)記克百威單抗的玻璃纖維膜(2)交叉重疊。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的克百威速測(cè)金標(biāo)免疫試紙條，其特征是將吸水玻璃纖維膜(6)粘貼于塑料底板(7)，并與硝酸纖維膜(3)交叉重疊。
全文摘要
一種克百威速測(cè)金標(biāo)免疫試紙條。屬于農(nóng)藥殘留的免疫化學(xué)速測(cè)技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明包括樣品墊、固載膠體金標(biāo)記克百威單抗的玻璃纖維膜、硝酸纖維膜、克百威－OVA結(jié)合物測(cè)試線、羊抗鼠IgG質(zhì)控線、吸水玻璃纖維膜、塑料底板，其連接方式為塑料底板的兩端分別設(shè)置樣品墊和吸水玻璃纖維膜，中間設(shè)置硝酸纖維膜，硝酸纖維膜上靠近樣品墊一端噴涂克百威－OVA結(jié)合物測(cè)試線，靠近吸水玻璃纖維膜一端噴涂羊抗鼠IgG質(zhì)控線，連接樣品墊和硝酸纖維膜之間噴涂有膠體金標(biāo)記克百威單抗的玻璃纖維膜。本發(fā)明具有實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著進(jìn)步，檢測(cè)速度快，具有雙重保險(xiǎn)，攜帶方便、操作簡(jiǎn)便。靈敏度高、特異性強(qiáng)，制備工藝簡(jiǎn)單，成本低。
文檔編號(hào)G01N33/531GK1445547SQ0311669
公開日2003年10月1日 申請(qǐng)日期2003年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2003年4月29日
發(fā)明者周培, 陸貽通, 李斌, 周軍 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)