專利名稱：濾紙片氣相色譜-質(zhì)譜分析檢測尿有機酸/氨基酸代謝產(chǎn)物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于有機酸或氨基酸代謝產(chǎn)物的檢測方法，具體涉及采用尿濾紙通過氣相色譜-質(zhì)譜分析檢測尿有機酸/氨基酸代謝產(chǎn)物的方法。
背景技術(shù)：
由于尿中含有氨基酸、糖類、脂質(zhì)和許多其它內(nèi)源性化合物的終末或中間代謝產(chǎn)物，這些有機化合物有相對較高的水溶性和腎廓清率，其濃度通常亦高于血清和其他體液，且標本最易于收集。既往我國對遺傳代謝缺陷病僅能進行初步檢測；依賴將標本送至國外合作單位確定，嚴重滯后遺傳代謝性疾病的篩查、治療和發(fā)病機制研究工作的開展，影響我國該醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的整體水平。
北美及歐洲所采用的氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatography-massspectrometry，GC-MS)方法為利用原尿標本直接分析，或冷凍后快遞至檢測中心，不適合我國國情，易漏診支鏈酮酸代謝障礙。近年日本學(xué)者應(yīng)用濾紙收集尿標本，經(jīng)尿素酶處理后不經(jīng)有機萃取直接進行GC-MS分析，用以鑒定有機酸和部分氨基酸及糖醇代謝產(chǎn)物，試圖推行用GC-MS方法進行遺傳代謝性疾病新生兒群體篩查。但氣相色譜峰雜峰甚多，不利結(jié)果分析，且甚易污染氣相色譜柱和質(zhì)譜離子源，其簡單尿氨基酸分析結(jié)果亦不足以診斷和研究復(fù)雜氨基酸病。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于對尿濾紙進行肟化、萃取后，利用氣相色譜-質(zhì)譜分析檢測尿有機酸/氨基酸代謝產(chǎn)物的方法。
本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的1)采用濾紙片收集尿標本；2)對濾紙尿標本進行洗脫處理，測定肌酐含量確定尿液濃度，得到尿液樣本；3)對尿液樣本完成a-酮酸的肟化反應(yīng)；4)采用有機溶劑進行萃??；5)對上述處理的樣本進行甲基硅烷化衍生；6)采用氣相色譜儀-質(zhì)譜儀聯(lián)合對尿樣進行檢測。根據(jù)所要檢測的物質(zhì)建立有機酸、氨基酸及其他代謝產(chǎn)物質(zhì)譜圖譜庫。
采用本發(fā)明所建立的方法具有如下優(yōu)點1、采用濾紙收集尿標本，適合我國人口眾多、幅員遼闊、地區(qū)發(fā)展不平衡的特點，有利于進行大規(guī)模的遺傳代謝缺陷病的高危篩查、研究及遠程分析，符合我國國情；2、萃取前常規(guī)進行肟化處理程序，利于α-酮酸的檢出，不致漏診重要的支鏈酮酸代謝障礙；3、應(yīng)用乙酸乙酯和乙醚兩次有機萃取，按肌酐含量定量分析。有機酸/氨基酸代謝產(chǎn)物回收率高，重復(fù)性好。色譜雜峰少，不至污染色譜毛細管柱和質(zhì)譜離子源；4、所選定色譜-質(zhì)譜定性/定量分析條件穩(wěn)定，樣本色譜峰分離效果良好，質(zhì)譜圖信息完整，易于計算機譜庫鑒定。樣本分析時間短，適合高通量樣本篩查分析。


圖1本方法檢測的正常尿有機酸/氨基酸GC-MS分析色譜圖；圖2本方法檢測的甲基丙二酸尿癥尿GC-MS分析色譜3本方法檢測的多種羧化酶缺乏癥尿GC-MS分析色譜圖具體實施方式
1、尿標本收集采用國產(chǎn)新華3號濾紙，切成5cm×8cm大小，收集晨尿或任意次尿，稍晾干后置專用濾紙干燥袋內(nèi)。
2、濾紙尿標本處理干燥濾紙尿樣用2ml去離子雙蒸水分次洗脫，離心，收集洗脫液。
3、確定尿樣濃度測定肌酐含量確定尿液濃度，取相當(dāng)2.5μmol肌酐尿樣。
4、樣本中加入50μg內(nèi)標十五烷酸和2-酮己酸，與100μl鹽酸羥胺、200μl0.25M硫酸、500μl飽和氯化胺混合45min以完成α-酮酸的肟化反應(yīng)，改善支鏈酮酸的回收率。
5、在酸性環(huán)境下，分別用3ml乙酸乙酯和乙醚進行兩次萃取，仔細分離并合并有機溶劑相，用1g無水硫酸鈉(震蕩、離心)去除少許殘余水份，加入外標飽和24烴(C24)，用純凈氮氣吹干。
6、萃取后的樣本中加入100μl甲基硅烷化衍生劑N，O-雙-(三甲基硅烷基)-三氟乙酰胺和1％三甲基氟硅烷(BSTFA+1％TMS)，置干燥加熱器上60℃衍化30~60min，冷卻后用正己烷稀釋至500μl。取1μl上樣進行GC-MS分析。
7、氣相色譜儀-質(zhì)譜儀聯(lián)合分析應(yīng)用安捷倫5890/5973N型GC-MS進行樣本分析，配備7673型自動進樣器，HP-5毛細管色譜柱，柱長30m，直徑0.32mm，膜厚0.25μm。色譜和質(zhì)譜分析條件如下采用無分流式進樣，進樣口溫度設(shè)定為250℃。氦氣為載氣(1ml/min)，界面溫度250℃。質(zhì)譜檢測采用電子離解模式總離子掃描方式(EI 70eV)，質(zhì)荷比(m/z)范圍50~到600，掃描周期0.4s。色譜柱箱程序升溫從60℃開始，20℃/min升溫至90℃后停留4min，然后以8℃/min升溫至300℃，樣本分析時間約25min。計算機系統(tǒng)記錄色譜和質(zhì)譜圖形，應(yīng)用質(zhì)譜圖譜庫參比鑒定和各色譜峰的豐度進行定性和定量分析。
依上述對多種尿樣進行檢測如圖1所示，圖中各色譜峰依此鑒定為1.乳酸；2.乙醇酸；3.3-羥基丁酸；4.尿素；5.乙酰乙酸；6.乙基丙二酸；7.琥珀酸；8.內(nèi)標-I；9.3-甲基戊烯二酸；10.3-羥基己二酸內(nèi)酯；11.己二酸；12.庚烯酸；13.4-羥基苯乙酸；14.不飽和辛二酸；15.辛二酸；16.烏頭酸；17.高香草酸；18.枸椽酸；19.馬尿酸；20.3-甲基-4-羥基扁桃酸；21.內(nèi)標-II；22.3-羥基癸二酸；23.4-羥基馬尿酸；24.外標如圖2所示，圖中各色譜峰依此鑒定為1.乳酸；2.乙醇酸；3.3-羥基丙酸；4.丙酮酸；5.3-羥基丁酸；6.甲基丙二酸；7.丙二酸；8.苯甲酸；9.琥珀酸；10.內(nèi)標-I；11.延胡索酸；12.戊二酸；13.扁桃酸；14.2-羥基戊二酸；15.3-羥基己二酸；16.3-羥-3-甲基戊二酸；17.4-羥基苯乙酸；18.高香草酸；19.4-羥基苯乳酸；20.內(nèi)標-II；213-甲基-4-羥苯乳酸；22.外標如圖3所示，圖中各色譜峰依此鑒定為1.乳酸；2.3-羥基丙酸；3.丙酮酸；4.4-羥基丁酸；5.3-羥基戊二酸；6.尿素；7.琥珀酸；8.內(nèi)標-I；9.丙酰甘氨酸；10.異丁酰甘氨酸；11.3-羥-3-甲基戊二酸；12.3-甲基巴豆酰甘氨酸；13.甲基巴豆酰甘氨酸；14.4-羥基苯乙酸；15.烏頭酸；16.高香草酸；17.馬尿酸；18.3-甲基-4-羥基扁桃酸；19.內(nèi)標-II；20.外標。
權(quán)利要求
1.濾紙片氣相色譜-質(zhì)譜分析檢測尿有機酸/氨基酸代謝產(chǎn)物的方法，其特征步驟是1)采用濾紙片收集尿標本；2)對濾紙尿標本進行洗脫處理，測定肌酐含量確定尿液濃度，得到尿液樣本；3)對尿液樣本完成a-酮酸的肟化反應(yīng)；4)采用有機溶劑進行萃??；5)對上述處理的樣本進行甲基硅烷化衍生；6)采用氣相色譜儀-質(zhì)譜儀聯(lián)合對尿樣進行檢測。
2.如權(quán)利要求1所述濾紙片氣相色譜-質(zhì)譜分析檢測尿有機酸/氨基酸代謝產(chǎn)物的方法，其特征是所述收集的尿標本是晨尿。
3.如權(quán)利要求1所述濾紙片氣相色譜-質(zhì)譜分析檢測尿有機酸/氨基酸代謝產(chǎn)物的方法，其特征是所述a-酮酸的肟化反應(yīng)是在樣本中加入內(nèi)標十五烷酸和2-酮己酸，與鹽酸羥胺、硫酸、飽和氯化胺混合，完成α-酮酸的肟化反應(yīng)。
4.如權(quán)利要求1所述濾紙片氣相色譜-質(zhì)譜分析檢測尿有機酸/氨基酸代謝產(chǎn)物的方法，其特征是所述萃取是采用乙酸乙酯和乙醚進行兩次萃取，仔細分離并合并有機溶劑相。
5.、如權(quán)利要求1或4所述濾紙片氣相色譜-質(zhì)譜分析檢測尿有機酸/氨基酸代謝產(chǎn)物的方法，其特征是在萃取后對樣本進行殘余水份去除，其方法是加入無水硫酸鈉通過震蕩、離心，去除殘余水份，再加入加入外標C24，用純凈氮氣吹干。
6.如權(quán)利要求1所述濾紙片氣相色譜-質(zhì)譜分析檢測尿有機酸/氨基酸代謝產(chǎn)物的方法，其特征是所述甲基硅烷化衍生是在樣本中加入甲基硅烷化衍生劑，置干燥加熱器上60℃～90℃衍化30～60min，冷卻后用正己烷稀釋。
7.如權(quán)利要求1所述濾紙片氣相色譜-質(zhì)譜分析檢測尿有機酸/氨基酸代謝產(chǎn)物的方法，其特征是建立有機酸、氨基酸及其他代謝產(chǎn)物質(zhì)譜圖譜庫。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種濾紙片氣相色譜－質(zhì)譜分析檢測尿有機酸/氨基酸代謝產(chǎn)物的方法。該方法是將濾紙收集的尿液經(jīng)過洗脫、肟化反應(yīng)、萃取、甲基硅烷化衍生后采用氣相色譜儀－質(zhì)譜儀聯(lián)合對尿樣進行檢測。本發(fā)明的方法具有如下優(yōu)點1.采用濾紙收集尿標本，適合我國人口眾多、幅員遼闊、地區(qū)發(fā)展不平衡的特點，有利于進行大規(guī)模的遺傳代謝缺陷病的高危篩查、研究及遠程分析，符合我國國情；2.具有肟化處理程序，利于α－酮酸的檢出，不致漏診重要的支鏈酮酸代謝障礙；3.通過萃取，有機酸/氨基酸代謝產(chǎn)物回收率高，重復(fù)性好。色譜雜峰少，不至污染色譜毛細管柱和質(zhì)譜離子源；4.采用氣相色譜－質(zhì)譜定性/定量分析條件穩(wěn)定，樣本色譜峰分離效果良好，樣本分析時間短，適合高通量樣本篩查分析。
文檔編號G01N33/493GK1532544SQ0311879
公開日2004年9月29日 申請日期2003年3月20日 優(yōu)先權(quán)日2003年3月20日
發(fā)明者羅小平, 王慕逖, 魏虹, 梁雁, 寧琴 申請人:華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院附屬同濟醫(yī)院