專利名稱：一種基于微流控芯片的細(xì)胞分選方法及其專用芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明主要涉及在微流控芯片上實現(xiàn)細(xì)胞分選的方法。
背景技術(shù)：
細(xì)胞分選是從復(fù)雜環(huán)境中獲取性質(zhì)均一的目標(biāo)細(xì)胞的必要手段。現(xiàn)階段實現(xiàn)細(xì)胞分選的主要工具是流式細(xì)胞儀?，F(xiàn)有商品化流式細(xì)胞儀已在各醫(yī)院、科研院所得到廣泛應(yīng)用。但該設(shè)備明顯的缺點是價格昂貴，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，體積龐大，不易普及。微流控芯片的出現(xiàn)有望將細(xì)胞分選儀微型化。
在微流控芯片上實現(xiàn)細(xì)胞分選的途徑按機理來分主要有兩大類。一種是以反饋信號判斷的方式?jīng)Q定細(xì)胞流向的分選方法。比如文獻(xiàn)[1 Fu AY，Spence C，Scherer A et al..Nat.Biotech.1999，17，1109-1111。2 Fu AY，Chou HP，Spence C et al..Anal.Chem.2002，74，2451-2457。3 Wolff A，Perch-Nielsen IR，Larsen UD et al..LabChip，2003，3，22-27]報道以激光激發(fā)出的熒光作為細(xì)胞流向判據(jù)的熒光激發(fā)細(xì)胞分選(Fluorescence Activated Cell Sorter，F(xiàn)ACS)方法。該方法原理與流式細(xì)胞儀類似。除熒光信號外，文獻(xiàn)[4 Gawad S，Schild L，Renaud Ph，Lab on a Chip，2001，1，76-82]以細(xì)胞穿過通道內(nèi)電極時引起的電阻變化作為區(qū)分目標(biāo)細(xì)胞的判據(jù)。上述方法中收集到的與細(xì)胞相關(guān)的信息(如熒光，散射光，電子信號等)經(jīng)過判斷作為反饋信號影響驅(qū)動力的施加(力的大小，方向等)，從而將滿足預(yù)先設(shè)置判據(jù)的細(xì)胞在某種驅(qū)動力(電動力、壓力等)下流向指定方向。
另一類分選方式無需信號反饋，主要依靠細(xì)胞自身的某種差異在某種力場中的放大來完成細(xì)胞分選。比如，細(xì)胞表面結(jié)合磁材料的能力差異可以導(dǎo)致細(xì)胞在磁場中的分選[5 Sun L，Zborowski W，Moore LR et al..Cytometry，1998，33，469-475]。
無論是上述哪一類方法，都沒有真正在微流控芯片上實現(xiàn)高效細(xì)胞分選，目前尚缺少一種普遍認(rèn)可的分選方式。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種與現(xiàn)有分選方案不同的在微流控芯片上完成細(xì)胞分選的方法，此方法無需信號反饋，也不需將細(xì)胞預(yù)先標(biāo)記上各種分子(如磁性材料分子)。
本發(fā)明提供了一種基于微流控芯片的細(xì)胞分選方法，其特征在于首先在微流控芯片的通道壁兩側(cè)施以局部電場，使細(xì)胞在通道橫截面按照表面電荷性質(zhì)不同而重新排列；再在通道的十字交叉處施以相互垂直的電動力和壓力，相互垂直的雙力作用將使重新定位的細(xì)胞流向不同空間，從而實現(xiàn)細(xì)胞的分選。
本發(fā)明基于微流控芯片的細(xì)胞分選方法中，局部電場強度在100V/cm到1000V/cm，加在細(xì)胞上的壓力從1帕到1000帕；電場強度從10V/cm到1000V/cm。
本發(fā)明基于的原理是，壓力驅(qū)動下的細(xì)胞進(jìn)入進(jìn)樣通道，向分選區(qū)(十字形交叉區(qū))流動，其在進(jìn)樣通道橫截面的位置為隨機分布。流經(jīng)局部電場區(qū)時，細(xì)胞表面電荷與局部電場相互作用，使細(xì)胞在進(jìn)樣通道橫截面的位置按照細(xì)胞表面電荷密度的大小重新排布。經(jīng)過重新定位的細(xì)胞在壓力作用下繼續(xù)流向分選區(qū)。分選區(qū)由相互垂直的連通微通道構(gòu)成，其中流體流動驅(qū)動力分別為電動力和壓力，二力垂直。流至分選區(qū)的細(xì)胞在電動力和壓力聯(lián)合作用下，按照在進(jìn)樣通道橫截面的位置不同流向不同空間。
本發(fā)明一種專門用于上述細(xì)胞分選方法的微流控芯片，其特征在于該微流控芯片具有雙層結(jié)構(gòu)；一層的表面刻有十字型通道，垂直通道兩端的液池分別為細(xì)胞池和空池，水平通道兩端的液池分別為緩沖池和廢液池；另一層的表面鍍有成對的定位電極；上述兩層相對封接后，所述電極恰好位于所述垂直微通道內(nèi)。
本發(fā)明中進(jìn)樣通道內(nèi)定位電極數(shù)目可以是一對也可以是多對如圖2，探入通道內(nèi)電極寬度從幾個微米到幾厘米。
本發(fā)明微流控芯片中，水平通道與垂直通道的交叉區(qū)域可以是一個或多個(如圖9)。電極可以直接相對也可以錯開一定位置(如圖8)。芯片材料可以是多種聚合物，玻璃，陶瓷或它們的復(fù)合體。通道寬度在100微米到2000微米之間。細(xì)胞可以是未經(jīng)任何處理的細(xì)胞，也可以是標(biāo)有各種抗體或其他分子的細(xì)胞。
對于非細(xì)胞的帶電顆粒(直徑在幾十微米)本發(fā)明同樣適用。


圖1為芯片結(jié)構(gòu)圖，淺色部分為分選通道和儲液池，深色部分為定位電極；圖2為在壓力和局部電場力作用下細(xì)胞流向十字交叉處軌跡示意；圖3為在電動力、壓力聯(lián)合驅(qū)動下細(xì)胞沿壓力方向流動過程示意；圖4為在電動力、壓力聯(lián)合驅(qū)動下細(xì)胞雙向流動過程示意；圖5為在電動力、壓力聯(lián)合驅(qū)動下細(xì)胞沿電動力方向流動過程示意；圖6為在電動力、壓力聯(lián)合驅(qū)動下細(xì)胞沿壓力逆方向流動過程示意；圖7為經(jīng)不同處理的鯉魚血紅細(xì)胞速度遷移圖；圖8另一種定位位置；
圖9串聯(lián)兩個十字交叉區(qū)的芯片。
具體實施例方式以十字型通道的微流控芯片為操作平臺，垂直通道兩端的液池分別為細(xì)胞池和空池。水平通道兩端的液池分別為緩沖池和廢液池，并分別接高電壓和接地。芯片由上下兩層組成。下層鍍上所需形狀和位置的鉑金電極，與上層封接后，電極位于微通道內(nèi)。該電極稱為定位電極，見圖1；將緩沖液加入到緩沖池和廢液池中，使緩沖液充滿所有通道，然后將細(xì)胞液加入細(xì)胞池中，在壓力的作用下，細(xì)胞從細(xì)胞池流向空池；流經(jīng)定位電極的細(xì)胞在局部電場作用下向通道壁面移動，使不同荷電性質(zhì)和密度的細(xì)胞在通道徑向重新排布，細(xì)胞流動軌跡見示意圖2，圖2中的淺色細(xì)胞和深色細(xì)胞經(jīng)過定位電場后在通道內(nèi)徑向位置改變；在壓力和電動力的作用下，流至十字交叉處的細(xì)胞流動方向按照兩種力的大小比例可以劃分為壓力方向流，雙向流，電動力方向流，壓力方向逆流等四個區(qū)間，見示意圖3-6。在雙向流區(qū)間(圖4)，細(xì)胞的流動方向取決于進(jìn)入交叉區(qū)域時細(xì)胞所處的位置，處于不同徑向位置的細(xì)胞在雙力作用下流向不同方向。
緩沖液池和廢液池先后加入13微升10mMPBS緩沖液，顯微鏡下觀察各通道中均連續(xù)充滿緩沖液后，在緩沖液池和廢液池插入鉑金電極，分別接100V和地。進(jìn)樣通道上的三對定位電極均接入相同方向電勢差5V，從而在通道徑向產(chǎn)生電場強度為50V/cm。加13微升鯉魚紅細(xì)胞液(細(xì)胞濃度約108個mL)于細(xì)胞池。細(xì)胞在靜壓力作用下向空池流動。流經(jīng)定位電極時細(xì)胞偏離原壓力驅(qū)動軌跡，更靠近通道側(cè)壁見圖2。經(jīng)不同處理的鯉魚紅細(xì)胞在電場下遷移速度的差別見圖7和表1。
交叉區(qū)域電場強度為50V/cm，保持交叉區(qū)域內(nèi)為雙向流動區(qū)間。經(jīng)通道內(nèi)定位電場重新排位的細(xì)胞流過交叉區(qū)時，根據(jù)細(xì)胞所處位置向不同通道流動(見圖4)。
表1細(xì)胞處理事項和對應(yīng)細(xì)胞淌度

權(quán)利要求
1.一種基于微流控芯片的細(xì)胞分選方法，其特征在于首先在微流控芯片的通道壁兩側(cè)施以局部電場，使細(xì)胞在通道橫截面按照表面電荷性質(zhì)不同而重新排列；再在通道的十字交叉處施以相互垂直的電動力和壓力，相互垂直的雙力作用將使重新定位的細(xì)胞流向不同空間，從而實現(xiàn)細(xì)胞的分選。
2.按照權(quán)利要求1所述基于微流控芯片的細(xì)胞分選方法，其特征在于局部電場強度在100V/cm到1000V/cm，加在細(xì)胞上的壓力從1帕到1000帕；電場從10V/cm到1000V/cm。
3.按照權(quán)利要求1所述基于微流控芯片的細(xì)胞分選方法，其特征在于所述細(xì)胞為標(biāo)有各種抗體或其他分子的細(xì)胞。
4.一種專門用于權(quán)利要求1、2或3所述細(xì)胞分選方法的微流控芯片，其特征在于該微流控芯片具有雙層結(jié)構(gòu)；一層的表面刻有十字型通道，垂直通道兩端的液池分別為細(xì)胞池和空池，水平通道兩端的液池分別為緩沖池和廢液池；另一層的表面鍍有成對的定位電極；上述兩層相對封接后，所述電極恰好位于所述垂直微通道內(nèi)。
5.按照權(quán)利要求4所述用于細(xì)胞分選方法的微流控芯片，其特征在于所述通道寬度在100微米到2000微米之間。
6.按照權(quán)利要求5所述用于細(xì)胞分選方法的微流控芯片，其特征在于所述探入到通道內(nèi)的定位電極的寬度從1個微米到10厘米。
7.按照權(quán)利要求4、5或6所述用于細(xì)胞分選方法的微流控芯片，其特征在于所述芯片材料是多種聚合物，玻璃，陶瓷或它們的復(fù)合體。
全文摘要
一種基于微流控芯片的細(xì)胞分選方法，其特征在于首先在微流控芯片的通道壁兩側(cè)施以局部電場，使細(xì)胞在通道橫截面按照表面電荷性質(zhì)不同而重新排列；再在通道的十字交叉處施以相互垂直的電動力和壓力，相互垂直的雙力作用將使重新定位的細(xì)胞流向不同空間，從而實現(xiàn)細(xì)胞的分選。本發(fā)明方法以細(xì)胞自身表面電荷密度的差異導(dǎo)致其靜電場中的受力差異為分選基礎(chǔ)，以壓力和電動力的垂直結(jié)合為分選驅(qū)動力，其中進(jìn)樣通道內(nèi)部的局部電場使細(xì)胞按照表面電荷密度在進(jìn)樣通道徑向上重新分布，相互垂直的雙力作用將使細(xì)胞流向不同空間，從而自動完成細(xì)胞分選過程。此方法無需信號反饋，也不需將細(xì)胞預(yù)先標(biāo)記上各種分子。
文檔編號G01N27/00GK1566951SQ0313346
公開日2005年1月19日 申請日期2003年6月16日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月16日
發(fā)明者蓋宏偉, 於林芬, 戴忠鵬, 羅勇, 馬銀法, 林炳承 申請人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所