專利名稱：一種適用于流式細胞術(shù)檢測倍性的貝類樣品制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及貝類的倍性檢測技術(shù)，特別提供了適用于流式細胞術(shù)檢測倍性的貝類樣品的制備方法。
背景技術(shù)：
海洋貝類是我國海水養(yǎng)殖的主導(dǎo)種類，在我國的海水養(yǎng)殖業(yè)中占有舉足輕重的地位。目前我國海水養(yǎng)殖的貝類基本上都是野生型的，難以適應(yīng)逐漸惡化的養(yǎng)殖環(huán)境。因此，利用生物技術(shù)培育優(yōu)良的養(yǎng)殖品種，是當(dāng)前乃至未來發(fā)展海水貝類養(yǎng)殖亟待解決的關(guān)鍵問題之一。以多倍體誘發(fā)技術(shù)為主的貝類細胞遺傳技術(shù)是目前貝類遺傳育種中最活躍和最具應(yīng)用價值的一個領(lǐng)域。三倍體貝類具有許多優(yōu)良生產(chǎn)性狀，是一類很有價值的養(yǎng)殖貝類新品系。目前通常采用理化方法人工誘導(dǎo)多倍體，倍化率很難達到100％，并且因各種環(huán)境和生物因子不同，多倍體的倍化率差異很大。因此，多倍體的檢測和鑒定是多倍體培育研究必不可少的關(guān)鍵一環(huán)。在貝類多倍體誘導(dǎo)的各個階段都需要快速準確的倍性鑒定，以判明人工誘導(dǎo)是否有效。比如，在幼蟲或幼體的培育過程中是否發(fā)生生物污染或其他事件而導(dǎo)致多倍體的比例下降等；多倍體成體在海上養(yǎng)殖過程中，是否因發(fā)生異常死亡或海區(qū)的自然種苗的附著等導(dǎo)致多倍體組成比例下降等。倍性的檢測需要貫穿多倍體研究的整個過程，因此高效倍性檢測技術(shù)具有極端重要性。
在我國絕大部分從事海洋生物技術(shù)研發(fā)的高校或科研機構(gòu)，基本上采用染色體計數(shù)方法進行人工誘導(dǎo)多倍體的倍性鑒定。但這一方法樣品制備過程復(fù)雜，費時費力，制備的樣品經(jīng)過顯微觀察才能評定樣品質(zhì)量，經(jīng)常由于樣品質(zhì)量不佳而無法獲得足夠的染色體分裂相，導(dǎo)致樣品的倍性鑒定失敗。
流式細胞術(shù)是對單個細胞或其他生物微粒進行快速定量分析與分選的一門新技術(shù)。其原理是將懸浮在液流中的單細胞逐個通過測量區(qū)，用儀器檢測細胞的光學(xué)參數(shù)而達到快速、大量地測定細胞的一系列物理特性和生化特性。自20世紀80年代以來，流式細胞術(shù)在國際貝類多倍體研究得到廣泛利用。這一技術(shù)的最顯著的優(yōu)勢是能快速準確地分析大量樣品的DNA含量，其檢測速度之快，統(tǒng)計學(xué)精度之高，是染色體計數(shù)等其他方法無法比擬的，已成為貝類多倍體研究的最有效的研究手段之一。
影響流式細胞術(shù)分析成敗的關(guān)鍵因素之一是樣品制備質(zhì)量。用于流式細胞儀分析的樣品必須是單細胞懸液，因此在檢測前就需要將待檢測的生物材料(幼蟲、幼體或成體)制成單細胞懸液。樣品制備過程發(fā)生細胞粘連、團塊及細胞重疊等都嚴重影響檢出率和分析結(jié)果的精確性。樣品若在制備保存過程中因發(fā)生降解而產(chǎn)生過多雜質(zhì)碎片，則會造成分析失敗。流式細胞儀價格昂貴，目前國內(nèi)僅屈指可數(shù)幾家科研單位擁有該設(shè)備，其他單位必須將制備的樣品送交擁有流式細胞儀的科研機構(gòu)進行檢測。另一方面，海洋貝類的多倍體誘導(dǎo)培育研究，多數(shù)是在偏遠的海濱實驗場或苗種培育場進行，需要將樣品送回科研機構(gòu)檢測。近年來，由于樣品制備質(zhì)量不佳導(dǎo)致分析失敗屢屢發(fā)生，未能充分發(fā)揮流式細胞術(shù)的優(yōu)越性，嚴重影響了多倍體誘導(dǎo)研究的開展。國外多倍體研究也面臨類似的問題。
目前流式細胞術(shù)樣品的制備，要求活體樣品或冷凍保存的固定樣品，對幼蟲或幼體來說，要保持其活力需要苛刻的運輸條件，包括用海水作媒介、充氧、低溫等，為運送樣品造成了很大的局限性。國外學(xué)者嘗試利用甲醇/冰醋酸固定液或乙醇固定樣品，在常溫下運輸，研究發(fā)現(xiàn)運輸費時3～5天的這些固定樣品在流式細胞儀上的檢出率很低，通常為10～30％，對發(fā)育后期的眼點幼蟲等樣品，基本上無法檢測。由此可見，普通的固定方法制備的生物樣品，遠達不到流式細胞術(shù)對檢測樣品的要求。國內(nèi)外海洋水產(chǎn)界都迫切需要一種新的流式細胞術(shù)樣品制備方法，實現(xiàn)在常溫長時間保存下的高檢出率。到目前為止國內(nèi)外還未見成熟可行的適用于貝類的流式細胞術(shù)常溫保存樣品的制備方法的報道。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述貝類流式細胞術(shù)分析樣品的制備方法問題，本發(fā)明的目的是提供了一種適用于利用流式細胞術(shù)進行貝類的倍性檢測的樣品制備方法，實現(xiàn)貝類各類樣品在常溫下保存和長途運輸，樣品在流式細胞儀上具有穩(wěn)定的高檢出率。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下
從待檢測的貝類獲取生物樣品，制備貝類樣品的單細胞核懸浮液，進行細胞核固定；具體按如下步驟操作1)從幼蟲、稚貝、幼貝或成貝獲取生物樣品；2)往生物樣品中加入每毫克1～3mL細胞核分離液，振蕩、研磨或剁切5～10min，制備成勻漿狀，靜置沉淀5～15min，得上清懸浮液；3)將所述上清懸浮液轉(zhuǎn)移到離心管，以1000～3000r/min離心1～5min，去除上清液，收集游離的單細胞核；4)往所述單細胞核中加入細胞核固定液I，加入量為每毫克單細胞核5～15mL，重新懸浮細胞核；5)以1000～3000r/min離心1～5min，去除上清液，收集游離的單細胞核；6)往步驟5)所述單細胞核中加入細胞核固定液II，加入量為每毫克單細胞核5～15mL，懸浮細胞核，制成的單細胞核樣品可在常溫下保存或長途運輸，以備用于流式細胞儀的檢測。
其中檢測的對象(生物樣品)包括貝類的幼蟲、稚貝、幼貝或成貝的全部軟體部或部分組織，適用的組織包括鰓組織、閉殼肌以及外套膜；獲取幼蟲樣品采用篩絹網(wǎng)過濾和離心的方法，所用的篩絹網(wǎng)的孔徑為20～100μm；獲取幼貝或成貝的組織采用解剖方法，所用解剖工具可以為解剖剪或解剖鑷；當(dāng)獲取的生物樣品為幼蟲、稚貝時，獲取的過程中每1毫克樣品加入等滲緩沖液0.2～1mL；所述細胞核分離液，按體積百分比計，其成分為每100份等滲緩沖液中含有1～10份Triton X-100；所述等滲緩沖液PBS，按體積百分比計，其成分由70～85份Na2HPO4和15～30份NaH2PO4組成；所述細胞核固定液I，按體積百分比計，其成分為70～90份80～95％體積百分比濃度的乙醇水溶液和10～30份等滲緩沖液組成；酸堿度(pH值)為7.0～8.0；所述細胞核固定液II，按體積百分比計，其成分為60～80％濃度的乙醇水溶液。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點1.本發(fā)明方法簡便可行，所用的均為常見的試劑、器材等，適用于實驗條件相對較差的貝類種苗培育場。
2.采用本發(fā)明所制備的貝類樣品，實現(xiàn)了在常溫下長期保存和運輸，并且樣品在流式細胞儀上的檢出率高且穩(wěn)定(實施例可以證明，保存6個月時檢出率可達100％)，靈敏度高。本發(fā)明徹底克服了普通方法制備的樣品需要冷凍保存和運輸?shù)木窒扌浴?br> 3.應(yīng)用范圍廣。本發(fā)明適用于各種貝類以及貝類各個發(fā)育階段的樣品?？蓱?yīng)用于包括牡蠣、扇貝、蚶、青蛤、硬殼蛤、鮑等種類，包括各個發(fā)育期的幼蟲、稚貝、幼貝和成貝。
4.采用本發(fā)明制備的生物樣品可以滿足批量樣品的倍性檢測；可以對成貝實施活體倍性檢測，本發(fā)明提供了進行貝類多倍體倍性鑒定的高效手段。
具體實施例方式
以下給出幾個典型實施例，但本發(fā)明并不局限在以下實施例中。
實施例1利用本發(fā)明方法，進行長牡蠣的多倍體幼蟲樣品制備，具體操作為1)采用孔徑為80μm的篩絹過濾，去除大部分的海水，分別獲取牡蠣二倍體和人工誘導(dǎo)三倍體的眼點幼蟲各60000個，分別盛于1.5mL離心管，以2000rpm離心4min，去除上清的海水；加入按每5毫克樣品1mL量的等滲緩沖液PBS 1mL(其成分為70～85份Na2HPO4和15～30份NaH2PO4，本實施例采用Na2HPO485份，NaH2PO415份)，以2000rpm離心4min，去上清，收集幼蟲。
2)加入按每1毫克樣品2mL量的細胞核分離液10mL(每100份等滲緩沖液中含有Triton X-100 1～10份，本實施例為含Triton X-100 1％的PBS)，采用研磨器、組織勻漿器研磨、或振蕩、或解剖刀片剁切5～10min，本實施采用研磨器研磨5min，進行組織和細胞分離，靜置沉淀15min，上清懸浮液；3)而后將所述上清懸浮液轉(zhuǎn)移到15mL離心管，以2000r/min離心5min，去除上清液，獲得游離單細胞核；4)往所述收集到的每1毫克游離單細胞核加入細胞核固定液I(成分為70～90份80～95％體積百分比濃度的乙醇水溶液和10～30份等滲緩沖液PBS，pH值為7.0～8.0，本實施例采用80％乙醇的水溶液90份，PBS 10份，調(diào)整pH值為7.0，)5mL，重新懸浮細胞核；5)以2000r/min離心5min，去除上清，再次收集單細胞核；6)往所述步驟5)中收集到的每1毫克游離單細胞核加入細胞核固定液II(成分為成分為60～80％體積百分比濃度的乙醇水溶液，本實施例采用75％的乙醇水溶液)5mL，重新懸浮細胞核。即可獲得適用于流式細胞術(shù)檢測倍性的、可在常溫下保存或長途運輸?shù)呢愵悩悠贰?br> 所述樣品保存6個月后，利用流式細胞儀上機檢測，樣品的檢出率為100％。
實施例2利用本發(fā)明方法，進行櫛孔扇貝的多倍體幼蟲樣品制備，具體操作為1)采用20μm篩絹過濾海水，收集濃縮的扇貝面盤幼蟲，二倍體和人工誘導(dǎo)三倍體的幼蟲各500000個，分別盛于2.0mL離心管，以3000rpm離心5min，去上清的海水；按每5毫克樣品1mL的量加入等滲緩沖液PBS3mL(其成分為Na2HPO480份，NaH2PO420份)，以3000rpm離心5min，去上清，收集幼蟲。
2)往所述收集的幼蟲按每1毫克樣品1mL的量加入細胞核分離液15mL(本實施例為含Triton X-100 5％的PBS)，在渦旋振蕩器上振蕩6min，而后靜置沉淀15min，得上清懸浮液；3)而后將所述上清懸浮液轉(zhuǎn)移到15mL離心管，以3000r/min離心5min，去除上清液，獲得游離單細胞核；4)往所述收集到的每1毫克游離單細胞核加入細胞核固定液I(成分為90％乙醇的水溶液80份，PBS 20份，調(diào)整pH值為7.5)12mL，重新懸浮細胞核；5)以3000r/min離心5min，去除上清，再次收集單細胞核；6)往所述步驟5)收集到每毫克的游離單細胞核加入細胞核固定液II(成分為70％的乙醇水溶液)12mL，重新懸浮細胞核。即可獲得適用于流式細胞術(shù)檢測倍性的、可在常溫下保存或長途運輸?shù)呢愵悩悠贰?br> 樣品保存6個月。利用流式細胞儀上機檢測，樣品的檢出率為100％。
實施例3利用本發(fā)明方法，進行皺紋盤鮑的多倍體幼貝的樣品制備，具體操作為1)分別獲取皺紋盤鮑二倍體和人工誘導(dǎo)三倍體的幼貝各30個樣品；2)往幼貝中按每1毫克2mL量加入細胞核分離液20mL(本實施例為含Triton X-100 2％的PBS)，采用解剖刀片剁切幼貝10min，進行組織和細胞分離，靜置沉淀10min，得上清懸浮液；3)而后將所述上清懸浮液轉(zhuǎn)移到15mL離心管，以1000r/min離心2min，去除上清液，獲得游離單細胞核；4)往所述收集的每1毫克游離單細胞核加入細胞核固定液I(成分為95％乙醇的水溶液90份，PBS 10份，調(diào)整pH值為8.0)10mL，重新懸浮細胞核；5)以1000r/min離心2min，去除上清，再次收集單細胞核；6)往步驟5)收集到的每1毫克游離單細胞核加入細胞核固定液II(成分為60％的乙醇水溶液)10mL，重新懸浮細胞核。即可獲得適用于流式細胞術(shù)檢測倍性的、可在常溫下保存或長途運輸?shù)呢愵悩悠贰?br> 所述樣品保存6個月后，利用流式細胞儀上機檢測，樣品的檢出率為100％。
實施例4利用本發(fā)明方法，進行硬殼蛤的多倍體稚貝樣品制備，具體操作為1)采用孔徑為100μm的篩絹過濾去除大部分的海水，分別獲取硬殼蛤稚貝二倍體和人工誘導(dǎo)三倍體各200個，盛于1.5mL離心管，以1500rpm離心3min，去除上清的海水；按每5毫克1mL的量加入等滲緩沖液PBS 1mL，(其成分為70～85份Na2HPO4和15～30份NaH2PO4，本實施例采用Na2HPO470份，NaH2PO430份)，以1500rpm離心3min，去上清，收集幼蟲。
2)按每1毫克2mL的量加入細胞核分離液10mL(本實施例為含TritonX-100 3％的PBS)，采用組織勻漿器研磨7min，進行組織和細胞分離，靜置沉淀12min，得上清懸浮液；3)而后將所述上清懸浮液轉(zhuǎn)移到15mL離心管，以1500r/min離心3min，去除上清液，獲得游離單細胞核；4)往所述收集的每1毫克游離單細胞核加入細胞核固定液I(成分為85％乙醇的水溶液70份，PBS 30份，調(diào)整pH值為7.0)15mL，重新懸浮細胞核；5)以1500r/min離心3min，去除上清，再次收集單細胞核；6)往步驟5)所收集到的每1毫克游離單細胞核加入細胞核固定液II(采用70％的乙醇水溶液)15mL，重新懸浮細胞核。即可獲得適用于流式細胞術(shù)檢測倍性的、可在常溫下保存或長途運輸?shù)呢愵悩悠贰?br> 所述樣品保存6個月后，利用流式細胞儀上機檢測，樣品的檢出率為100％。
實施例5利用本發(fā)明方法，進行泥蚶的多倍體成貝樣品制備，具體操作為1)使用解剖剪和解剖鑷，分別從泥蚶二倍體和人工誘導(dǎo)三倍體的各20個成貝中獲取鰓組織；2)往獲得的鰓組織按每1毫克3mL的量加入細胞核分離液15mL(本實施例為含Triton X-100 5％的PBS)，采用解剖刀片剁切10min，進行組織和細胞分離，靜置沉淀5min，得上清懸浮液；3)而后將所述上清懸浮液轉(zhuǎn)移到15mL離心管，以2000r/min離心3min，去除上清液，獲得游離單細胞核；4)往所述收集的每1毫克游離單細胞核加入細胞核固定液I(成分為90％乙醇的水溶液70份，PBS 30份，調(diào)整pH值為7.8)8mL，重新懸浮細胞核；5)以2000r/min離心3min，去除上清，再次收集單細胞核；6)往步驟5)所收集到的每1毫克游離單細胞核加入細胞核固定液II(成分為成分為60～80％濃度的乙醇水溶液，本實施例采用75％的乙醇水溶液)8mL，重新懸浮細胞核。即可獲得適用于流式細胞術(shù)檢測倍性的、可在常溫下保存或長途運輸?shù)呢愵悩悠贰?br> 所述樣品保存6個月后，利用流式細胞儀上機檢測，樣品的檢出率為100％。
權(quán)利要求
1.一種適用于流式細胞術(shù)檢測倍性的貝類樣品制備方法，其特征在于從待檢測的貝類獲取生物樣品，制備貝類樣品的單細胞核懸浮液，進行細胞核固定；具體按如下步驟操作1)從幼蟲、稚貝、幼貝或成貝獲取生物樣品；2)往生物樣品中加入每毫克1～3mL細胞核分離液，振蕩、研磨或剁切5～10min，制備成勻漿狀，靜置沉淀5～15min，得上清懸浮液；3)將所述上清懸浮液轉(zhuǎn)移到離心管，以1000～3000r/min離心1～5min，去除上清液，收集游離的單細胞核；4)往所述單細胞核中加入細胞核固定液I，加入量為每毫克單細胞核5～15mL，重新懸浮細胞核；5)以1000～3000r/min離心1～5min，去除上清液，收集游離的單細胞核；6)往步驟5)所述單細胞核中加入細胞核固定液II，加入量為每毫克單細胞核5～15mL，懸浮細胞核，制成可在常溫下保存或長途運輸，以備用于流式細胞儀檢測的單細胞核樣品。
2.按照權(quán)利要求1所述適用于流式細胞術(shù)檢測倍性的貝類樣品制備方法，其特征是生物樣品包括貝類的幼蟲、稚貝、幼貝或成貝的全部軟體部或部分組織，適用的組織包括鰓組織、閉殼肌以及外套膜。
3.按照權(quán)利要求1所述適用于流式細胞術(shù)檢測倍性的貝類樣品制備方法，其特征是獲取幼蟲、稚貝樣品采用篩絹網(wǎng)過濾和離心的方法，所用的篩絹網(wǎng)的孔徑為20～100μm。
4.按照權(quán)利要求1所述適用于流式細胞術(shù)檢測倍性的貝類樣品制備方法，其特征是獲取幼貝或成貝的組織采用解剖方法，所用解剖工具可以為解剖剪刀或解剖鑷。
5.按照權(quán)利要求1所述適用于流式細胞術(shù)檢測倍性的貝類樣品制備方法，其特征是當(dāng)獲取的生物樣品為幼蟲、稚貝時，獲取的過程中按每1毫克樣品加入等滲緩沖液0.2～1mL。
6.按照權(quán)利要求1所述適用于流式細胞術(shù)檢測倍性的貝類樣品制備方法，其特征是所述細胞核分離液，按體積百分比計，其成分為每100份等滲緩沖液中含有1～10份Triton X-100。
7.按照權(quán)利要求5或6所述適用于流式細胞術(shù)檢測倍性的貝類樣品制備方法，其特征是所述等滲緩沖液PBS，按體積百分比計，其成分由70～85份Na2HPO4和15～30份NaH2PO4組成。
8.按照權(quán)利要求1所述適用于流式細胞術(shù)檢測倍性的貝類樣品制備方法，其特征是所述細胞核固定液I，按體積百分比計，其成分為70～90份80～95％體積百分比濃度的乙醇水溶液和10～30份等滲緩沖液組成；酸堿度為7.0～8.0。
9.按照權(quán)利要求1所述適用于流式細胞術(shù)檢測倍性的貝類樣品制備方法，其特征是所述細胞核固定液II，按體積百分比計，其成分為60～80％濃度的乙醇水溶液
全文摘要
本發(fā)明公開一種適用于流式細胞術(shù)檢測倍性的貝類樣品制備方法。它從幼蟲、稚貝、幼貝或成貝獲取生物樣品；往生物樣品中加入細胞核分離液，振蕩、研磨或剁切制備成勻漿狀，靜置沉淀得上清懸浮液；將上清懸浮液轉(zhuǎn)移到離心管，離心去除上清液，收集游離的單細胞核；再往單細胞核中加入細胞核固定液I，重新懸浮細胞核；然后離心去除上清液，收集游離的單細胞核；再往單細胞核中加入細胞核固定液II，懸浮細胞核，制成可在常溫下保存或長途運輸，以備用于流式細胞儀檢測的單細胞核樣品。本發(fā)明適用于流式細胞儀的檢測，具有穩(wěn)定的高檢出率。
文檔編號G01N33/00GK1580732SQ03133650
公開日2005年2月16日 申請日期2003年8月7日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月7日
發(fā)明者闕華勇, 劉曉, 張國范 申請人:中國科學(xué)院海洋研究所