專利名稱：新的呼腸病毒、其抗體、疫苗及它們的用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及與SARS相關的新呼腸病毒，特異結合或中和該病毒的抗體，用該病毒制備的疫苗，預防、診斷、和治療動物呼腸病毒感染或SARS的方法等。
背景技術：
呼腸病毒屬于呼腸病毒科(Reoviridae)，正呼腸病毒屬(Orthoreovirus)，因其最初是從動物呼吸道和腸道分離出來又找不到與之有關的疾病而得名(Respiratory and Enteric Orphan virus)。該科分為9個屬，其中有3個屬(正呼腸病毒屬、輪狀病毒屬和環(huán)狀病毒屬)(劉克洲、陳智，人類病毒性疾病，人民衛(wèi)生出版社，2002年11月第一版，P534-541)，可以感染人和動物。為區(qū)別于科名，正呼腸病毒屬的病毒常被稱為正呼腸病毒或呼腸孤病毒。
呼腸病毒的病毒粒子直徑在60-80nm之間，具有雙層同心二十面體衣殼，無包膜。雙層衣殼的病毒顆粒具有完全的感染力。另外呼腸病毒具有一定的熱穩(wěn)定性，可存活的pH值范圍較大，并可存在于氣溶膠內，相對濕度較高時更穩(wěn)定。
呼腸病毒為雙股RNA(dsRNA)組成，全基因組共約23kb，有10個片段L1、L2、L3、S1、S2、S3、S4、M1、M2、M3，分別編碼8個結構蛋白質和3個非結構蛋白質，其中S1編碼兩個蛋白質σ1和σ1S。序列高度保守的蛋白質有λ1、σ3、σ2、σNS、μ1等。
S1基因編碼的σ1蛋白質是呼腸病毒和宿主細胞相互作用的主要成分，該蛋白質可誘導宿主產生特異性中和抗體；L1基因編碼的λ3蛋白，是依賴RNA的RNA聚合酶；S3基因編碼的RNA結合多肽σNS，與單鏈RNA(dsRNA)具有很高的親和力，在呼腸病毒組裝過程中發(fā)揮重要功能。
呼腸病毒外面的雙層衣殼由8種結構蛋白質構成，其中內層衣殼也稱為核心區(qū)域，由5種蛋白質組成(λ1、λ2、λ3、μ2和σ2)，外層衣殼由另外的三種蛋白質(μ1、σ3和σ1)組成。基因組片段和病毒的轉錄酶被封裝在內層衣殼內。
非結構蛋白質有M3基因編碼的μNS蛋白、S1基因編碼的σ1S蛋白和M1基因編碼的μ2蛋白，但它們的功能目前尚不十分明確。
SARS的全球性爆發(fā)，引起了全世界的廣泛重視。2003年4月，美國國家疾病控制中心在新英格蘭醫(yī)學雜志上發(fā)表論文報道從SARS患者體內分離到冠狀病毒，并用特異性引物的RT-PCR方法檢測患者標本；其他地區(qū)的科研單位也陸續(xù)發(fā)表了數篇類似的研究論文。RT-PCR檢測的病原體包括肺炎衣原體、肺炎支原體、副黏液病毒等常見的非典型肺炎的病原體，但其中尚無呼腸病毒感染的報道，甚至沒有同一科其它病毒感染的報道。

發(fā)明內容
發(fā)明人首次從SARS患者體內分離到兩株新的呼腸病毒，分別稱為BYD1和BLD1，并證明與SARS的發(fā)病有關，由此完成本發(fā)明。
本發(fā)明涉及含有SEQ ID NO5和SEQ ID NO6的序列的分離的呼腸病毒。
本發(fā)明還涉及兩株分離的呼腸病毒，其保藏號分別為CGMCCNo.0950和CGMCC No.0951。
本發(fā)明還涉及特異結合上述本發(fā)明的呼腸病毒或其蛋白的分離的抗體。本發(fā)明的抗體可以是多克隆抗體或單克隆抗體。
本發(fā)明還涉及免疫原性組合物，其含有生理可接受的載體和本發(fā)明的呼腸病毒。
本發(fā)明還涉及一種(用于保護哺乳動物免受呼腸病毒引起的病毒感染或SARS侵襲的)疫苗，其含有生理可接受的載體和如下組中的至少一個成員
(a)活的本發(fā)明的呼腸病毒；(b)修飾的活的本發(fā)明的呼腸病毒；(c)減毒的活的本發(fā)明的呼腸病毒；(d)滅活的本發(fā)明的呼腸病毒。
在優(yōu)選實施方案中，該疫苗還含有佐劑。
本發(fā)明還涉及在動物中檢測呼腸病毒感染或診斷SARS的方法，包括將本發(fā)明的抗體或本發(fā)明的呼腸病毒與來自所述動物的生物樣品接觸，并檢測或觀察抗原-抗體復合物的存在。該動物優(yōu)選是哺乳動物，例如人。
本發(fā)明還涉及保護哺乳動物免受呼腸病毒引起的病毒感染或SARS侵襲的方法，包括給有此需要的動物接種免疫有效量的本發(fā)明的疫苗。優(yōu)選地，接種途徑是皮下、鼻內、口服、皮內、肌內、或腸胃外途徑。
本發(fā)明還涉及一種抗體，能中和本發(fā)明的病毒。所述抗體可以是單克隆抗體或多克隆抗體。
本發(fā)明還涉及治療呼腸病毒引起的病毒感染或SARS的方法，包括給動物施用本發(fā)明的中和性抗體或疫苗。
本發(fā)明還涉及抗病毒藥物的篩選方法，包括將候選藥物與本發(fā)明的病毒接觸，并測定所述病毒的活力。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明的病毒在制備本發(fā)明抗體或疫苗中的用途。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明的呼腸病毒在制備用于診斷SARS的試劑中的用途。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明的呼腸病毒在診斷SARS中的用途。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明的呼腸病毒在制備用于治療SARS的藥物中的用途。
本發(fā)明還涉及本發(fā)明的呼腸病毒在治療SARS中的用途。
具體實施例方式
發(fā)明人從北京兩位SARS患者痰漱液和咽拭子標本分離到兩株BYD1和BLD1新的病毒，最初用SCV(SARS冠狀病毒)引物擴增，但PCR無法擴增出SCV特異性基因片段。經初步血清學試驗證明，該病毒和SARS的發(fā)生相關。
通過對所述病毒的培養(yǎng)、形態(tài)學觀察、理化試驗、血清學反應和部分基因組序列測定，證實我們用Hep-2細胞分離到病毒直徑分別在60-80nm，不同于已知直徑為80-120nm的SCV(SARS冠狀病毒)，而且更為符合呼腸病毒屬病毒的特征。
尤其是，本發(fā)明人采用分子生物學方法即RT-PCR技術擴增出2個片段，經序列測定，所得PCR產物測序結果與已公布的呼腸病毒序列同源性為87％-93％(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)。鑒于可以感染人類的一般呼腸病毒沒有引起SARS的能力，因此，推測從SARS患者樣本中分離的是一種SARS相關的新呼腸病毒。
提供含有所述病毒樣本的兩位SARS患者為母女關系，女兒患病后傳染給母親。試驗結果表明，從女兒和母親的標本中均能分離呼腸病毒。所分離到的呼腸病毒能與康復病人血清凝集，表明所分離到的新呼腸病毒可能是引起SARS的病原體之一。
因此，一方面，本發(fā)明涉及含有SEQ ID NO5和SEQ ID NO6的序列的分離的呼腸病毒。在具體實施方案中，本發(fā)明涉及兩株分離的呼腸病毒(Orthoreovirus)，其保藏號分別為CGMCC No.0950和CGMCC No.0951。
根據國際承認用于專利程序的微生物保藏布達佩斯條約，本發(fā)明的兩株新病毒已經于2003年6月9日保藏在國際保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)。并給予了保藏號CGMCC No.0950(BYD1)和CGMCC No.0951(BLD1)。該國際保藏單位的地址是中國北京市海淀區(qū)中關村北一條13號。
本發(fā)明的病毒可以通過常規(guī)方法進行分離。例如，在一個具體實施方式
中，可以將痰漱液和咽拭子標本，浸于無血清1640培養(yǎng)基，8000rpm離心10min，上清經孔徑為0.22μm無菌濾膜過濾，將處理好的標本接種于長成單層的Hep-2細胞培養(yǎng)瓶中，每份標本接種兩瓶，37℃孵育1h，吸出標本液，加含有2％小牛血清的1640細胞維持液，置37℃培養(yǎng)，每天觀察細胞病變(CPE)。
本發(fā)明的病毒可以通過常規(guī)方法進行培養(yǎng)。例如，可在Hep-2細胞和Vero-E6細胞系上傳代培養(yǎng)。
抗體組合物、其片段及其它結合劑另一方面，本發(fā)明還提供結合劑，如抗體及其抗原結合片段，它們顯示與本發(fā)明公開的病毒或其蛋白免疫學結合(特異結合)。如果一種抗體或其抗原結合片段與本發(fā)明的病毒或其蛋白以可檢測的水平反應(例如ELISA測定)，而在類似條件下不與無關病毒或其蛋白可檢測地反應，則稱其可與該病毒或其蛋白“特異結合”、“免疫學結合”和/或是“免疫反應性的”。
抗體的“抗原結合位點”或“結合部分”是指免疫球蛋白分子參與抗原結合的部分。
抗體的制備是本領域熟知的，例如，可采用如下文獻中描述的方法《當代免疫學技術與應用》，巴德年等編，北京醫(yī)科大學中國協(xié)和醫(yī)科大學聯(lián)合出版社，1998。
本發(fā)明病毒特異的單克隆抗體可用Kohler和Milstein，Eur，J.Immunol.6511-519，1976的技術及其改進方法制備。簡言之，這些方法包括制備能產生具有希望特異性(即與目的抗原的反應性)的抗體的無限增殖化細胞系。例如，可以用本發(fā)明活病毒、修飾病毒、減毒病毒、或滅活病毒免疫動物(優(yōu)選哺乳動物，例如兔)，收集致敏淋巴細胞。然后通過例如與骨髓瘤細胞融合，優(yōu)選地與免疫動物同源的骨髓瘤細胞融合，使所述淋巴細胞無限增殖化?？梢允褂枚喾N融合技術，例如，致敏淋巴細胞和骨髓瘤細胞可以與非離子型去污劑結合幾分鐘，然后以低密度接種于支持雜種細胞生長但不支持骨髓瘤細胞生長的選擇性培養(yǎng)基中。一種優(yōu)選的篩選技術使用HAT(次黃嘌呤、氨喋呤、胸苷)篩選。經足夠的時間后，通常1至2周，觀察到雜種集落。選擇單集落，檢測其培養(yǎng)上清液對病毒或蛋白的結合活性。優(yōu)選具有高反應性和特異性的雜交瘤。
可從生長的雜交瘤集落的上清液中分離單克隆抗體。另外，也可以利用多種技術提高產量，如向合適的脊椎動物宿主(如小鼠)的腹膜腔中注射雜交瘤細胞系。然后從腹水或血液中收集單克隆抗體?？梢岳贸Ｒ?guī)技術，如層析、凝膠過濾、沉淀和抽提，從抗體中除去污染物。
疫苗和免疫接種本發(fā)明還提供一種用于保護哺乳動物免受呼腸病毒引起的病毒感染或SARS侵襲的疫苗，其含有生理可接受的載體和如下組中的至少一個成員(a)活的本發(fā)明的呼腸病毒；(b)修飾的活的本發(fā)明的呼腸病毒；(c)減毒的活的本發(fā)明的呼腸病毒；和(d)滅活的本發(fā)明的呼腸病毒。
優(yōu)選地，所述疫苗還含有佐劑。該佐劑可以是本領域已知的任何佐劑。
修飾的滅活病毒疫苗、亞單位疫苗的制備是本領域技術人員熟知的。
如白油佐劑滅活疫苗的制備按文獻(曾群輝，張冰，陳明勇，等。牦牛ETEC滅活疫苗的研制及免疫效力試驗[J]。中國預防獸醫(yī)學報，2001，23(3)197-199.)的方法制備油相；水相(即病毒液部分)的制備方法將BYD1和BLD1毒株分別在Hep-2上細胞培養(yǎng)72h，收集培養(yǎng)物，進行3次凍融，56℃滅活30min，超聲破碎3min，并以9000rpm/min離心30min，收集上清。在上清液中加入甲醛溶液，使其濃度達4ml/L，放入37℃搖床滅活48h。將油相和水相按1∶1放入勻漿機中勻漿，乳化5-10min，即成油佐劑疫苗。
蜂膠佐劑滅活疫苗的制備按文獻(曾群輝，張冰，陳明勇，等。牦牛ETEC滅活疫苗的研制及免疫效力試驗[J].中國預防獸醫(yī)學報，2001，23(3)197-199.)制備蜂膠乙醇浸液；水相部分按上述方法制備。取1份蜂膠佐劑加入1份水相滅活的BYD1和BLD1種毒株人工感染敏感動物組織懸液中，搖勻，4℃作用24h，即成蜂膠佐劑疫苗。
疫苗檢驗按常規(guī)方法檢查其物理性狀，并進行菌檢和安全性檢驗。
免疫接種接種白油佐劑滅活疫苗和蜂膠佐劑滅活疫苗0.5-1ml(敏感動物)，每只頸部皮下注射滅菌生理鹽水0.5-1ml，每隔7d耳靜脈采血，檢測抗體效價。
本發(fā)明還涉及保護哺乳動物免受呼腸病毒引起的病毒感染或SARS侵襲的方法，包括給有此需要的動物接種免疫有效量的本發(fā)明疫苗；優(yōu)選地，所述接種途徑是皮下、鼻內、口服、皮內、肌內、或腸胃外途徑。
診斷和治療SARS和相關疾病的方法本發(fā)明還涉及在動物中檢測呼腸病毒感染或診斷SARS的方法，包括將本發(fā)明的抗體或呼腸病毒與來自所述動物的生物樣品接觸，并檢測或觀察抗原-抗體復合物的存在。
上述檢測可以利用已知的任何方法，包括，但不限于，ELISA、免疫熒光技術、放射免疫技術等。
本發(fā)明還涉及治療呼腸病毒引起的病毒感染或SARS的方法，包括給動物施用治療有效量的中和性抗體或本發(fā)明的疫苗。
中和性抗體可以采用本領域已知的任何方法制備。
本發(fā)明的工業(yè)用途本發(fā)明病毒用途之一該病毒可用于免疫學診斷試劑的開發(fā)。
本發(fā)明病毒用途之二該病毒可用于制備診斷和治療性抗體的開發(fā)。
本發(fā)明病毒用途之三該病毒可用于減毒活疫苗和滅活疫苗的開發(fā)與研制。
本發(fā)明病毒用途之四該病毒可用于抗病毒藥物篩選的毒株和藥效考核的標準毒株。
本發(fā)明病毒用途之五該病毒可用于研究和開發(fā)基因診斷及基因治療等方法。
以下通過非限制性的實施例對本發(fā)明進行舉例說明。


圖1(A-F)電鏡(EM)觀察呼腸病毒在Hep-2細胞的胞漿中聚集的情況。電子顯微鏡證實該病毒為直徑60-80nm的呼腸病毒顆粒。圖1A-E顯示病毒BYD1在Hep-2細胞的胞漿中聚集的情況，可以觀察到呼腸病毒不同成熟階段和兩種類型的病毒粒子有致密核心的成熟粒子和有透明核心的空心粒子。這兩種類型的病毒粒子都有一個大約14nm厚的衣殼。大多數病毒顆粒都是成群分布的，呈晶格狀排列(圖1C-E)。用同樣方法從該患者母親的標本中也分離出病毒BLD1，電鏡觀察結果類似(圖1F)圖2-1L3(320bp)PCR產物瓊脂糖電泳結果(EB染色)。各泳道自上而下分別是BYD1株、BLD1株、DL2000分子量標準。
圖2-2S2(488bp)PCR產物瓊脂糖電泳結果(EB染色)。各泳道自上而下分別是BYD1株、BLD1株、DL2000分子量標準。
圖3病毒接種Balb/c小鼠后的肺組織切片照片?？梢姺伍g質增寬，肺泡融合(間質性肺炎)。
實施例實驗材料1.標本、細胞與培養(yǎng)基標本來源于2003年3月13日收到北京SARS患者痰漱液和咽拭子標本。分離用的細胞為Hep-2，由中國人民解放軍微生物檢驗研究中心細胞庫保存。培養(yǎng)基RPIM 1640為Gibco/BRL公司產品；青霉素、鏈霉素為華北制藥廠產品；2％小牛血清為美國HyClone公司產品。
2.血清收集正常人血清為本中心保存；SARS病人血清采自北京佑安醫(yī)院、309醫(yī)院及302醫(yī)院SARS初期及康復期患者。
3.RT-PCR和擴增產物純化試劑病毒RNA提取試劑盒(QIAamp Viral RNA Mini Kit)購自QIAGEN公司；反轉錄酶(SuperScriptII)和Taq DNA聚合酶購自寶生物公司；核酸凝膠回收試劑盒(QIAquick Gel Extraction Kit)購自QIAGEN公司。
4.儀器設備熒光顯微鏡OLYMPUS IX70日本產，PCR儀GENE AMP2400美國產，生物安全柜440-44E美國產，紫外分光光度計BACKMAN公司美國產，高速離心機BACKMAN公司美國產。
5.引物設計由軍事醫(yī)學科學院生物工程研究所合成以下兩對引物S2基因488+GTT GGA TTT GGT GGT CTG C(SEQ ID NO1)488-CCA CTC CAC ATA TCC TCG(SEQ ID NO2)L3基因320+CAG TCG ACA TTG TGG TC(SEQ ID NO3)320-GCG TAC TGA CGT GGA TCA TA(SEQ ID NO4)以上兩對引物分別位于呼腸病毒L3基因及S2基因區(qū)段內。
實施例1新病毒的分離和形態(tài)學表征本實施例采用如下方法分離本發(fā)明的新病毒。
細胞培養(yǎng)法將處理好的標本接種于長成單層細胞的Hep-2細胞培養(yǎng)瓶中，每份標本接種兩瓶，37℃吸附1h，吸出標本液、加含有2％小牛血清的1640細胞維持液，置37℃培養(yǎng)。每天觀察細胞病變(PEC)。
細胞超薄切片電鏡觀察單層細胞感染病毒后48h，取CPE(++)以上刮取細胞，800rpm離心5min，常規(guī)固定、脫水、包埋、超薄切片，染色后在Philip CM120透射電鏡下觀察并拍照。取未接種病毒的對照細胞，同步觀察。
結果用Hep-2傳代細胞接種北京SARS患者痰漱液和咽拭子標本處理液2份。提供含有所述病毒樣本的兩位SARS患者為母女關系，女兒患病后傳染給母親。從女兒和母親的標本中分離獲得2株病毒，分別稱為BYD1和BLD1。接種24小時后Hep-2細胞出現(xiàn)明顯的細胞病變，并且能夠穩(wěn)定傳11代。將分離的第11代毒株接種于Hep-2細胞培養(yǎng)液中，經負染觀察。
電鏡觀察所分離的病毒在第11代Hep-2細胞的胞質中聚集的情況，電子顯微鏡證實該病毒為直徑60-80nm的病毒顆粒。圖1A-E顯示BYD1株病毒在Hep-2細胞的胞漿中聚集的情況，可以觀察到病毒不同成熟階段和兩種類型的病毒粒子有致密核心的成熟粒子和有透明核心的不完全裝配的病毒粒子。這兩種類型的病毒粒子都有一個大約14nm厚的衣殼。大多數病毒顆粒都是成群分布的，呈晶格狀排列(圖1C-E)。用同樣方法從該患者母親的標本中也分離出病毒BLD1，電鏡觀察結果類似(圖1F)。
但是從這2例患者的咽拭子中未能分離出SARS相關的冠狀病毒(SCV)。這可能是因為從咽拭子中分離SCV的幾率比痰中要少得多，因此不適合于SCV的分離。
令人感興趣的是，在感染SCV BJ01株的Vero-E6細胞中發(fā)現(xiàn)的典型冠狀病毒粒子其粒子直徑為80-120nm，具有一個黑的中心核衣殼和包膜。更重要的是，BJ01感染的Vero-E6細胞中同時觀察到位于內質網內的冠狀病毒和分布在胞質中的呼腸病毒，而在作為對照的Vero-E6細胞中兩種病毒均未被發(fā)現(xiàn)。
由上述病毒形態(tài)學表征顯示，所分離的病毒是一種呼腸病毒科病毒。
實施例2新呼腸病毒分純及理化性質表征為了純化病毒僅保存呼腸病毒(為無包膜病毒)去除有膜冠狀病毒，采用乙醚處理病毒液的方法，連續(xù)處理三次，傳三代，每次處理后進行十倍遞增稀釋，并接種細胞培養(yǎng)，待出現(xiàn)明顯CPE后收獲10-3以上病毒稀釋度再進行下次處理。對處理1次和第3次后傳1代的病毒液，收獲后凍化一次，低速離心取上清液進行核酸型，耐酸(pH5.0和3.0)和耐熱(56℃30min)試驗，同時設病毒對照。
耐乙醚試驗——取病毒液0.8ml于管底，加入0.2ml(20％)乙醚，充分搖勻后置4℃冰箱過夜，次日倒于無菌平皿中待乙醚揮發(fā)后，用細胞生長液作十倍遞增稀釋，微量測定病毒的TCID50。
核酸型試驗——取0.1ml病毒液用含100μg/ml，5-IUDR(市售阿洛昔韋)細胞生長液作十倍稀釋，微量滴定TCID50，加入微量板時2滴(0.025ml/滴)病毒液加2滴細胞懸液。
耐酸試驗—取病毒液0.3ml加到管底用0.1N HCl調pH3.0，取另一支病毒液0.3ml調pH至5.0，37℃水浴1h后用7.5％NaHCO3調回pH至7.0，同上稀釋并滴定病毒TCID50。
耐熱試驗——取0.3ml病毒液于管底置56℃水浴滅活30min，取出后同上稀釋滴定TCID50。
病毒對照取取同樣的病毒液0.1ml，同上稀釋滴定TCID50.
表1BYD1株病毒液的理化試驗鑒定結果試驗組乙醚處理1次后滴度*乙醚處理3次后滴度*核酸型 6.57.5耐乙醚 6.57.5耐酸pH 5.0 6.5----pH 3.0 1.0＜1.0耐熱(56℃，30min)＜1.0 ＜1.0病毒對照組 6.57.5*-滴度以TCID50/0.05ml表示從表中的結果看，BYD1株病毒通過第一次乙醚處理與第三次乙醚處理后的病毒理化性質結果完成相同。該病毒為RNA病毒，無包膜，在pH5.0的環(huán)境下保持穩(wěn)定，對pH3.0時病毒滴度有很大下降，但仍保存了活性。對56℃，30min病毒迅速滅活。病毒經過連傳三代后病毒滴度有所提高，CPE出現(xiàn)也提早1天。該病毒通過乙醚處理1次后已完全純化。
從理化性質看，并結合電鏡形態(tài)學觀察，病毒的大小60-80nm，BYD1株屬呼腸病毒科呼吸病毒屬的成員。
實施例3新呼腸病毒部分基因的克隆及序列測定為進一步確證分離株(BYD1和BLD1)是否是呼腸病毒，我們針對呼腸病毒核酸序列中的保守區(qū)域設計了引物1)488+5’-GTTGGA TTT GGT GGT CTG C-3’；2)488-5’-CCA CTC CAC ATATCC TCG-3’，并用RT-PCR的方法擴增出一條488bp的核酸片段。3)320+CAG TCG ACA TTG TGG TC；4)320-GCG TAC TGA CGTGGA TCA TA，并用RT-PCR的方法擴增出一條320bp的核酸片段。大小與我們目的基因片段的理論值相等，見圖2。另外，用同樣方法我們也得到了其他幾個與預期結果相符的核酸片段。進一步DNA序列分析，獲得部分序列測定結果。
RT-PCR及PCR產物測序從細胞培養(yǎng)上清中按QIAamp Viral RNA Mini Kit說明書提取病毒RNA。首先進行反轉錄，在管中加入5ul總RNA，1μL SuperscriptII反轉錄酶(200u)，1ul隨機引物，4ul 5×反應緩沖液，1ul RNA酶抑制劑和1ul 10mM dNTP以及2ul 0.1M DTT，最后用不含RNase的水補足體積至20ul。于42℃反應60min后，95℃滅活5min。然后進行PCR擴增，反應系統(tǒng)包括5ul 10×PCR反應緩沖液，1ul10mMdNTP，2ul 25mM MgCl2，1ul TaqDNA聚合酶(2.5u)，上下游引物各1ul(10μM)，用水補足至50ul。分別擴增40個循環(huán)。反應完畢，將產物經1％瓊脂糖凝膠電泳觀察結果。
PCR產物切膠回收純化后由中國科學院北京基因組研究所及軍事醫(yī)學科學院生物工程研究所測序。所測序列如下(兩個病毒株BYD1和BLD1所測結果相同)。
1、L3區(qū)段部分基因序列(268bp)5’-TTIATGCGGATTCGCAATTCTCCCCTCTTGATCACGCATCGAACTGTTGATTAAAGTATCGTGTGTTCATTTGCCAAAGTGCCAGTGGGAAAATCCAATTTCCTTCAAAAGGCACCATCATCCCAGTCTCATCTCTAATCATTGGCGCGGCGCCATTCATTCCAAACGAIATACGGCAATCTCGTCCGAATATGTGAACGCCAGGAGTATCACGATCAAACACCAAGTCAGGTGGAGGAGCCAGAGGCGACCACAAATGTGTCGACTG-3’(SEQ ID NO5)2.S2區(qū)段部分基因序列(483bp)5’-CCACTCCACATATCCTCGTCCACCCGAACGTACGAAATTGGACCGAACCCCGTTAAGTTGAGTAAACGTTACGGCACTCAATTGCTGGTACACTCGGTGCTTAAATCTTGGATCACGTGCTAAGAATGGGTAATCGTCGCAATCATACACTCGATCTGCTTGCGCCTGCAAAGCGGGCTGTGCCAGAACTTGTGGTGGGGCTACAACTAAACCATCAAGCGTAGGAGCTGACCACACTAGGCGCAGGAACCTGATATCTCCCCATCGGTGGTTAGGCCGAAATGGTATCTGAAGAGTACCACTTAAAAGGCAACTCATTTGATAATATCTTGAACCAGCGGTTGGAACGAGAGCCGATGTAGCTAGACCTCGCCCTAGACTTATCCAATCCAGAAATTGAGTCAGCTGCCATGGTGAATTACCCGCTCGAAGAAGATGTGAAGACAACTCATCGTTAATTGGCACATTTTGCAGACCACCAAA-3’(SEQ ID NO6)經BLAST比對，483bp片段與呼腸病毒科的正呼腸病毒屬S2基因片段的同源性為87％，268bp片段與呼腸病毒科的正呼腸病毒屬L3基因同源性為93％，提示分離獲得2株病毒(BYD1和BLD1)是一種呼腸病毒科正呼腸病毒屬病毒(www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)。
實施例4新病毒的血清學檢驗培養(yǎng)的病毒(BYD1)上清凍融三次，56℃60min滅活，10,000rpm30min，上清用PEG6000 4℃沉淀過夜，12,000rpm 30min，沉淀用病毒裂解液(2％SDS PBS 0.01M Ph7.2)裂解，測定蛋白含量。
用250μg/ml病毒純化液包被酶聯(lián)板，100μl/孔包被酶聯(lián)板。37℃60min，PBS 0.01M pH7.2(2％BSA) 封閉30min，血清1∶10稀釋37℃水浴40min，加抗人酶標抗體(中國人民解放軍微生物檢驗研究中心制備)后按常規(guī)ELISA方法檢測。
ELISA結果如下

A1/ASARS患者OD值/正常人OD值ELISA法檢測的上述血清學結果，顯示該病毒與SARS發(fā)病相關。
實施例5間接免疫熒光染色分離物感染細胞片的制備將培養(yǎng)成單層的Hep-2細胞用Hank’s液洗一次，然后接種分離物(BYD1和BLD1)細胞培養(yǎng)懸液，放37℃孵箱中吸附1h，加入細胞維持液，1mL/瓶，放37℃繼續(xù)培養(yǎng)。待細胞剛剛出現(xiàn)病變時，取感染細胞滴片，將滴好的玻片放37℃ CO2孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)8h使細胞貼壁。取出玻片，放入0.005M pH7.2 PBS中漂洗，除去未貼壁的懸浮細胞，涼干。放入冷丙酮內，-30℃過夜固定，涼干，-20℃密封保存?zhèn)溆谩?br> 間接免疫熒光抗體染色方法將病人血清標本1∶10稀釋后，56℃作用30min，然后再適當稀釋后分別滴加到細胞抗原片上，置37℃濕盒中作用30min(若檢測IgM抗體則作用90min)，沖洗，PBS振蕩洗3次，涼干。然后加羊抗人FITC(Sigma公司產品)標記熒光抗體，置37℃濕盒中作用30min，沖洗同前，涼干，在熒光顯微鏡下觀察染色結果。
間接免疫熒光染色法檢測36份SARS患者和正常人血清，前者陽性檢測結果為36/36，后者陽性檢測結果為1/36。表明該病毒與SARS發(fā)病相關。
實施例6動物實驗Balb/c鼠接種法選擇健康的4周、雌性BALB/c鼠，在無菌條件下，腹腔內接種0.5ml/只病毒液(BYD1或BLD1)，每種樣品分別接種6只。每日觀測小鼠的發(fā)病情況，體溫變化情況。發(fā)現(xiàn)小鼠頻死前剖殺，將鼠解剖取肺組織，用戊二醛固定后進行電鏡觀察。
感染呼腸病毒的肺組織切片中，肺泡中隔顯著增厚，肺泡腔內有大量單核細胞和少數多形核白細胞浸入(圖3)。在感染肺組織的電鏡切片中，發(fā)現(xiàn)纖維組織明顯增生。正常Balb/C小鼠肺組織切片觀察顯示肺泡結構正常。
序列表<110>中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院微生物流行病學研究所<120>與SARS相關的新呼腸病毒、其抗體、疫苗及它們的用途<130>not yet<160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>19<212>DNA<213>引物<400>1gttggatttg gtggtctgc 19<210>2<211>18<212>DNA<213>引物
<400>2ccactccaca tatcctcg18<210>3<211>17<212>DNA<213>引物<400>3cagtcgacat tgtggtc 17<210>4<211>20<212>DNA<213>引物<400>4gcgtactgac gtggatcata 20<210>5<211>268<212>DNA<213>呼腸病毒
<400>
tttatgcgga ttcgcaattc tcccctcttg atcacgcatc gaactgttga ttaaagtatc 60gtgtgttcat ttgccaaagt gccagtggga aaatccaatt tccttcaaaa ggcaccatca120tcccagtctc atctctaatc attggcgcgg cgccattcat tccaaacgat atacggcaat180ctcgtccgaa tatgtgaacg ccaggagtat cacgatcaaa caccaagtca ggtggaggag240ccagaggcga ccacaaatgt gtcgactg 268<210>6<211>483<212>DNA<213>呼腸病毒<400>6ccactccaca tatcctcgtc cacccgaacg tacgaaattg gaccgaaccc cgttaagttg 60agtaaacgtt acggcactca attgctggta cactcggtgc ttaaatcttg gatcacgtgc120taagaatggg taatcgtcgc aatcatacac tcgatctgct tgcgcctgca aagcgggctg180tgccagaact tgtggtgggg ctacaactaa accatcaagc gtaggagctg accacactag240gcgcaggaac ctgatatctc cccatcggtg gttaggccga aatggtatct gaagagtacc300acttaaaagg caactcattt gataatatct tgaaccagcg gttggaacga gagccgatgt360agctagacct cgccctagac ttatccaatc cagaaattga gtcagctgcc atggtgaatt420acccgctcga agaagatgtg aagacaactc atcgttaatt ggcacatttt gcagaccacc480aaa 48權利要求
1.一種分離的呼腸病毒，其選自保藏號為CGMCC No.0950的病毒；或保藏號為CGMCC No.0951的病毒。
2.特異結合權利要求1的呼腸病毒或其蛋白的分離的多克隆抗體或單克隆抗體。
3.免疫原性組合物，含有生理可接受的載體和權利要求1的呼腸病毒。
4.一種用于保護哺乳動物免受呼腸病毒引起的病毒感染或SARS侵襲的疫苗，其含有生理可接受的載體和下組中的至少一個成員(a)活的權利要求1的呼腸病毒；(b)修飾的活的權利要求1的呼腸病毒；(c)減毒的活的權利要求1的呼腸病毒；和(d)滅活的權利要求1的呼腸病毒；優(yōu)選地，所述疫苗還含有佐劑。
5.在動物中檢測呼腸病毒感染或診斷SARS的方法，包括將權利要求2的抗體或權利要求1的呼腸病毒與來自所述動物的生物樣品接觸，并檢測或觀察抗原-抗體復合物的存在。
6.保護哺乳動物免受呼腸病毒引起的病毒感染或SARS侵襲的方法，包括給有此需要的動物接種免疫有效量的權利要求4的疫苗；優(yōu)選地，所述接種途徑是皮下、鼻內、口服、皮內、肌內、或腸胃外途徑。
7.一種單克隆抗體或多克隆抗體，其能中和權利要求1的病毒。
8.治療呼腸病毒引起的病毒感染或SARS的方法，包括給動物施用權利要求7的抗體或權利要求4的疫苗。
9.抗病毒藥物的篩選方法，包括將候選藥物與權利要求1的病毒接觸，并測定所述病毒的活力。
10.權利要求1的病毒在制備權利要求2的抗體、權利要求3的免疫原性組合物、權利要求4的疫苗、或權利要求7的抗體中的用途。
11.權利要求1的呼腸病毒在開發(fā)用于診斷、預防或治療SARS的試劑中的用途。
全文摘要
本發(fā)明公開了與SARS相關的新呼腸病毒，特異結合或中和該病毒的抗體，用該病毒制備的疫苗，預防、診斷、和治療動物呼腸病毒感染或SARS的方法等。
文檔編號G01N33/569GK1566334SQ03146590
公開日2005年1月19日 申請日期2003年7月8日 優(yōu)先權日2003年7月8日
發(fā)明者端青, 朱虹, 何君, 檀華, 張浩杰, 宋立華, 周育森, 甘永華, 左庭婷 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院微生物流行病研究所