專利名稱：早期檢測sars病毒感染的方法和試劑盒的制作方法
所屬領(lǐng)域本發(fā)明涉及檢測臨床樣品中嚴(yán)重急性呼吸綜合癥的病原體——SARS病毒存在的方法及試劑盒，特別是涉及以實(shí)時(shí)定量熒光聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)早期診斷SARS病毒感染的方法及所使用的試劑盒。
背景技術(shù)：
嚴(yán)重急性呼吸綜合癥(SARS)是因感染冠狀病毒的任何一種新型變異體而引起的致死性傳染病。2002年底在中國廣東省部分地區(qū)首先發(fā)現(xiàn)，3個(gè)月內(nèi)即很快傳播到世界二十五個(gè)國家和地區(qū)以及中國其他許多省市，累計(jì)報(bào)告病例數(shù)達(dá)8202人，其中725人死亡。該病毒傳染性強(qiáng)，嚴(yán)重危害人民群眾的健康和生命。病人起病急，抗生素治療往往無效。在人群中傳播率高，容易導(dǎo)致疫情爆發(fā)且死亡率較高。
目前，世界衛(wèi)生組織(WHO)認(rèn)可的SARS病毒實(shí)驗(yàn)室檢測技術(shù)主要有三種一是酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，該方法能夠可靠地檢出血清中抗體的存在，但需在發(fā)現(xiàn)癥狀21天后才能得到比較可靠的檢測結(jié)果，因此很難用于早期診斷。二是免疫熒光法(IFA)，此方法一般在感染后10天才能檢測到抗體，而且需要固定SARS病毒，并須由經(jīng)驗(yàn)豐富的技術(shù)人員使用免疫熒光顯微鏡完成。以上兩種方法均需測定并比較急性期和恢復(fù)期的血清抗體滴度，時(shí)間跨度長，不利于病人的早期診斷和治療。第三種是反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)方法(RT-PCR)，該方法通過檢測病人發(fā)病后10天內(nèi)的呼吸道分泌物或排泄物等樣本中SARS病毒的RNA片段來實(shí)現(xiàn)早期診斷。RT-PCR方法是目前所有應(yīng)用于SARS感染診斷的多種方法中最為早期、便捷和特異的方法，其對早期快速診斷SARS，挽救病人生命和防止疾病傳播起到了很大作用。
實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是上世紀(jì)90年代中期基于傳統(tǒng)的PCR技術(shù)發(fā)展起來的。與傳統(tǒng)的(終點(diǎn)檢測)PCR技術(shù)相比，實(shí)時(shí)定量監(jiān)測方法不僅實(shí)現(xiàn)了很小拷貝數(shù)靶多核苷酸的定量分析，而且還具有特異性和精確度更強(qiáng)、自動(dòng)化程度更高以及污染的可能性更小等優(yōu)點(diǎn)。因此，該技術(shù)在靶多核苷酸樣品的檢測和定量分析中，已逐漸取代傳統(tǒng)的PCR方法，得到十分廣泛的應(yīng)用。
眾所周知，在使用已知的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測和定量分析臨床樣品中某特定靶核酸的實(shí)踐中，為了減少和避免檢測結(jié)果的假陰性或假陽性，提高定量分析的準(zhǔn)確性，一個(gè)關(guān)鍵性的基本技術(shù)環(huán)節(jié)是如何基于已知的靶多核苷酸序列設(shè)計(jì)并制備適當(dāng)?shù)囊锖凸押塑账崽结?。本發(fā)明人在以往多年從事PCR技術(shù)特別是實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)研究的基礎(chǔ)上，將該技術(shù)應(yīng)用于SARS病毒的所有已知變異體之基因組多核苷酸的檢測和定量分析，成功地完成了本發(fā)明。
發(fā)明的目的本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)定量檢測樣品中SARS病毒的方法，該方法包括(1)提供包括樣品、核酸擴(kuò)增體系，和熒光監(jiān)測體系在內(nèi)的反應(yīng)與檢測混合物，(2)通過擴(kuò)增反應(yīng)循環(huán)擴(kuò)增所說的靶多聚核苷酸，(3)使所說的熒光發(fā)生基團(tuán)與被擴(kuò)增的靶多核苷酸間接結(jié)合，(4)確定熒光發(fā)生基團(tuán)所產(chǎn)生的熒光量，(5)分析擴(kuò)增循環(huán)后，根據(jù)循環(huán)反應(yīng)中產(chǎn)生的熒光量結(jié)合定量標(biāo)準(zhǔn)曲線確定靶多核苷酸的存在及其相對量(即靶核酸序列的拷貝數(shù))；其中核酸擴(kuò)增系統(tǒng)包括可與靶多核苷酸結(jié)合的寡核苷酸引物，并且熒光實(shí)時(shí)監(jiān)測系統(tǒng)包括一個(gè)可與靶多核苷酸特異性結(jié)合的寡核苷酸探針；特征在于所使用的正向和反向寡核苷酸引物分別是5’-gac gag ttc gtg gtg gtg ac-3’(SEQ IDNO1)和5’-aag ctt ctg ggc cag ttc ct-3’(SEQ ID NO2)，并且所使用的寡核苷酸探針是5’-caa aat gaa aga gct cag ccc cag atg-3’(SEQ IDNO3)。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的樣品是可疑SARS病毒感染者的臨床樣品。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的SARS病毒選自SARS病毒的任何一種已知的變異體。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的靶多核苷酸來自SARS病毒。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的核酸擴(kuò)增系統(tǒng)是聚合酶鏈反應(yīng)，并且所說的擴(kuò)增反應(yīng)循環(huán)是大約重復(fù)35次的聚合酶鏈反應(yīng)循環(huán)。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的核酸擴(kuò)增體系包括(a)耐熱DNA聚合酶、(b)2’-脫氧核苷三磷酸、(c)能夠與雙鏈靶多核苷酸的第一條鏈結(jié)合的正向引物，和(d)能夠與雙鏈靶多核苷酸的第二條鏈結(jié)合的反向引物。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中所說的熒光實(shí)時(shí)檢測體系包括能夠與靶多核苷酸結(jié)合并且兩末端分別結(jié)合的有熒光發(fā)生基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)的寡核苷酸探針。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，所說的方法進(jìn)一步包括(1)確定樣品中的靶多核苷酸經(jīng)擴(kuò)增后所產(chǎn)生的熒光達(dá)到基線以上的固定閾值時(shí)所需的閾循環(huán)次數(shù)；(2)將已確定的樣品中靶多核苷酸的閾循環(huán)次數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)溶液中已知量靶多核苷酸的閾循環(huán)次數(shù)相比較，以計(jì)算出樣品中靶多核苷酸的量。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)定量檢測臨床樣品中SARS病毒的試劑盒，該試劑盒包括(1)分別裝有濃縮液、RNA提取液A、RNA提取液B、逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)體系、經(jīng)焦碳酸乙二酯處理的純水(DEPC H2O)、PCR擴(kuò)增反應(yīng)液I、PCR擴(kuò)增反應(yīng)液II、稀釋液、陰性對照樣品、強(qiáng)陽性標(biāo)準(zhǔn)品和RNA陽性對照品并加蓋密封的多個(gè)試劑瓶或管，和(2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中濃縮液用于濃縮液態(tài)待檢樣品(使樣品中的病毒顆粒吸附在一起并快速沉淀)。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中稀釋液用于稀釋定量陽性標(biāo)準(zhǔn)品。
根據(jù)本發(fā)明的再一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中用于靶多核苷酸擴(kuò)增體系的正向和逆向引物分別是5’-gac gag ttc gtg gtg gtg ac-3’(SEQ ID NO1)和5’-aagctt ctg ggc cag ttc ct-3’(SEQ ID NO2)。
根據(jù)本發(fā)明的再一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中用于靶多核苷酸擴(kuò)增和監(jiān)測體系的寡核苷酸是5’-caa aat gaa aga gct cag ccc cag atg-3(SEQ ID NO3)’。


圖1顯示Std curve窗口下的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖2顯示強(qiáng)中弱三個(gè)陽性標(biāo)本曲線圖3顯示陰性標(biāo)本曲線發(fā)明的詳細(xì)內(nèi)容本發(fā)明涉及實(shí)時(shí)定量熒光PCR方法及試劑盒，特別是涉及實(shí)時(shí)定量熒光聚合酶鏈反應(yīng)方法及其試劑盒在SARS病毒感染的早期實(shí)驗(yàn)室診斷中的應(yīng)用。
本發(fā)明提供了一種使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)定量檢測臨床樣品中SARS病毒存在的方法，該方法包括(1)提供包括SARS病毒基因組核酸的樣品、核酸擴(kuò)增體系，和熒光監(jiān)測體系的反應(yīng)與檢測混合物，(2)通過擴(kuò)增反應(yīng)循環(huán)擴(kuò)增所說的靶多核苷酸，(3)使所說的熒光發(fā)生基團(tuán)與被擴(kuò)增的靶多核苷酸間接結(jié)合，(4)確定熒光發(fā)生基團(tuán)所產(chǎn)生的熒光量，(5)分析擴(kuò)增循環(huán)后產(chǎn)生的熒光量以確定靶多核苷酸的存在及其相對量；其中核酸擴(kuò)增體系包括可與靶多核苷酸結(jié)合的寡核苷酸引物，并且熒光檢測體系包括可與靶多核苷酸結(jié)合的寡核苷酸探針；特征在于所說的擴(kuò)增反應(yīng)中所使用的正向和反向寡核苷酸引物分別是5’-gacgag ttc gtg gtg gtg ac-3’(SEQ ID NO1)和5’-aag ctt ctg ggc cag ttcct-3’(SEQ ID NO2)，并且所使用的寡核苷酸探針是5’-caa aat gaa agagct cag ccc cag atg-3’(SEQ ID NO3)。
與基于擴(kuò)增反應(yīng)完成后進(jìn)行單一終點(diǎn)檢測的傳統(tǒng)PCR方法不同，實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)方法可以在擴(kuò)增反應(yīng)的進(jìn)程中隨時(shí)監(jiān)測擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)生，從而大大提高了定量檢測的準(zhǔn)確性和精密度。如眾所周知，實(shí)時(shí)熒光定量PCR是在PCR擴(kuò)增中，同時(shí)加入引物和5’、3’末端分別標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)(例如6-FAM amidite羧基熒光素6)和熒光淬滅基團(tuán)(例如6-羧基四甲基若丹明)的特異性寡核苷酸探針。如果探針沒有與靶序列互補(bǔ)結(jié)合，其序列保持完整，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號將被淬滅基團(tuán)吸收，所以沒有熒光信號產(chǎn)生；而當(dāng)PCR擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行時(shí)，DNA聚合酶的5’-3’外切酶活性將降解熒光探針，導(dǎo)致熒光報(bào)告基團(tuán)與熒光淬滅基團(tuán)分離，因而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收并記錄到熒光信號。每擴(kuò)增一條DNA鏈即有一個(gè)熒光分子產(chǎn)生，從而實(shí)現(xiàn)熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步，實(shí)時(shí)地監(jiān)測整個(gè)PCR反應(yīng)進(jìn)程，并可借助標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知靶多核苷酸(模板)進(jìn)行定量分析。
與通常的實(shí)時(shí)定量熒光PCR技術(shù)相似，本發(fā)明的檢測樣品中SARS病毒基因組雙鏈靶多核苷酸存在的方法中同樣包括(1)提供包括(a)待檢樣品(b)耐熱DNA聚合酶和(c)2′-脫氧核苷三磷酸(dNTP)的擴(kuò)增反應(yīng)體系，以及包括(a)能夠與待檢雙鏈靶多核苷酸的第一條互補(bǔ)鏈結(jié)合的正向引物，(b)能夠與待檢雙鏈靶多核苷酸的第二條互補(bǔ)鏈結(jié)合的反向引物，以及(c)能夠與雙鏈靶多核苷酸的任一條鏈結(jié)合并且兩末端分別標(biāo)記有熒光發(fā)生基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)的寡核苷酸探針的熒光檢測體系；(2)通過一次或多次聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增所說的靶多核苷酸；(3)退火后使所說的熒光發(fā)生基團(tuán)通過探針與靶多核苷酸結(jié)合并產(chǎn)生熒光信號；(4)檢測并確定熒光發(fā)生基團(tuán)所產(chǎn)生的熒光量；(5)分析一次或多次擴(kuò)增循環(huán)所發(fā)出的熒光量，以檢測靶多核苷酸的存在；特征在于其中所說的靶多核苷酸是SARS病毒基因組多核苷酸，所使用的正向和反向寡核苷酸引物分別是5’-gac gag ttc gtg gtg gtg ac-3’(SEQ ID NO1)和5’-aag ctt ctg ggccag ttc ct-3’(SEQ ID NO2)，并且所使用的寡核苷酸探針是5’-caa aatgaa aga gct cag ccc cag atg-3’(SEQ ID NO3)。
如前所述，為了檢測出臨床樣品中可能存在的所有SARS病毒變異體，并能夠準(zhǔn)確有效地將SARS病毒感染與甲型流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒等其他常見呼吸道病毒感染鑒別開，設(shè)計(jì)并制備實(shí)現(xiàn)這些目的的寡核苷酸引物和探針是一個(gè)非常重要的技術(shù)環(huán)節(jié)。為此，我們在使用適當(dāng)?shù)暮怂岱治鲕浖σ阎乃?6個(gè)SARS病毒變異體的基因組核苷酸序列進(jìn)行同源性比較并找出同源區(qū)段的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步使用適當(dāng)?shù)囊镌O(shè)計(jì)軟件(例如Primer Express 3)具有下示核苷酸序列的寡核苷酸引物15’-gac gag ttc gtg gtg gtg ac-3’(20mrs)(SEQ ID NO1)和引物25’-aag ctt ctg ggc cag ttc ct-3’(20mrs)(SEQ ID NO2)；以及具有下示序列的寡核苷酸探針5’-caa aat gaa agagct cag ccc cag atg-3’(SEQ ID NO3)。引物所對應(yīng)的擴(kuò)增區(qū)段相當(dāng)于SARS病毒變異株TOR2的RNA聚合酶編碼序列的保守區(qū)，長度為85bp。其中，引物1互補(bǔ)于病毒基因組的第28382-28400位核苷酸；引物2互補(bǔ)于病毒基因組的第28447-28466位核苷試劑盒酸。探針則互補(bǔ)與第28404-28432位核苷酸。由于所設(shè)計(jì)的這些引物和探針均具有互補(bǔ)于病毒基因組保守區(qū)的序列，而且與其他呼吸道病毒的核苷酸序列沒有同源性，也不包括任何常見的核酸內(nèi)切酶，所以大大減少甚至避免了SARS病毒檢測的假陰性和假陽性，提高了檢測的可靠性和準(zhǔn)確度。
可使用DNA合成裝置合成所需的寡核苷酸引物，用分子篩和FPLC層析法純化后進(jìn)行氨解處理。同樣合成所需的探針序列，氨解處理后分別在其5’端標(biāo)記作為熒光發(fā)生基團(tuán)(報(bào)道基團(tuán))的6-FAM amidite，并在其3’端標(biāo)記借助活性連接臂偶聯(lián)并作為熒光淬滅或抑制基團(tuán)的TAMRA。以FPLC層析法純化熒光標(biāo)記的探針。然后，可使用變性條件下的聚丙烯酰胺凝膠(20％)電泳法和分光光度法物理鑒定所合成的引物和探針。
使用常規(guī)RNA提取方法或市售的RNA提取試劑盒，從得自受試者的嗽口液樣品中提取RNA，然后使用逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系(在每微升由250mM Tris-HCL(pH8.0)、250mM KCL、20mM MgCL2和50mM DTT的緩沖液中含有50單位mMLV酶和1單位RNA酶)將所提取的RNA轉(zhuǎn)化成cDNA并將此逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用于繼后的PCR擴(kuò)增。
在含有引物1和2(各25pmol)、DNA模板(PCR擴(kuò)增靶序列)、dNTP(10mM)、耐熱DNA聚合酶(Taqman)、PCR緩沖液和水的反應(yīng)體系中，使用ABI 5700型或其他結(jié)構(gòu)類型的自動(dòng)熒光檢測熱循環(huán)儀上對如上得到的cDNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。所使用的反應(yīng)條件是93℃預(yù)變性2分鐘后，首先按93℃，15秒→55℃，15秒→72℃，20秒完成10次循環(huán)，然后再按93℃，15秒→58℃，30秒條件共進(jìn)行35次循環(huán)。
反應(yīng)完成后，借助裝置上配置的自動(dòng)分析系統(tǒng)分析結(jié)果。在本研究中，如果循環(huán)閾(Ct)值等于或大于35，結(jié)果即為陰性；如果Ct值小于35，結(jié)果則為陽性。其中以反應(yīng)的前15個(gè)循環(huán)所產(chǎn)生的熒光信號作為熒光本底信號，熒光域值的缺省設(shè)置是3-15個(gè)循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。一般說來，每個(gè)模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)呈線性關(guān)系。起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。因?yàn)樵跀U(kuò)增反應(yīng)的Ct值之前的階段，擴(kuò)增系統(tǒng)中的酶、引物、探針和dNTPs均大大過量，而且系統(tǒng)的p值和離子濃度等也相對穩(wěn)定，此時(shí)擴(kuò)增反應(yīng)的效率是一個(gè)與模板數(shù)無關(guān)的飽和定值。與Ct值相關(guān)的只有起始模板數(shù)(多聚核苷酸樣品的拷貝數(shù))和與樣品無關(guān)的PCR系統(tǒng)效率。
可利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中以靶多核苷酸起始拷貝數(shù)的對數(shù)為橫坐標(biāo)，以如上測得的Ct值為縱坐標(biāo)。獲得未知量靶多核苷酸的Ct值后，即可從基于平行實(shí)驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線上得知其起始拷貝數(shù)的對數(shù)，然后計(jì)算出該靶多核苷酸的起始拷貝數(shù)(當(dāng)擴(kuò)增循環(huán)達(dá)到Ct值即初始進(jìn)入指數(shù)擴(kuò)增期時(shí)，Ct值的重現(xiàn)性極好，即同一靶多核苷酸在不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間在不同管內(nèi)擴(kuò)增所得到的Ct值總是恒定的)。也就是說，為了基于上述的擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果推算出靶多核苷酸的量(起始拷貝數(shù))，本發(fā)明的方法還進(jìn)一步包括(1)確定樣品中的靶多核苷酸經(jīng)擴(kuò)增后所產(chǎn)生的熒光達(dá)到基線以上的固定閾值時(shí)所需的閾循環(huán)次數(shù)；(2)將已確定的樣品中靶多核苷酸的閾循環(huán)次數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)溶液中已知量靶多核苷酸的閾循環(huán)次數(shù)相比較，從而計(jì)算出樣品中靶多核苷酸的量。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)定量檢測臨床樣品中SARS病毒的試劑盒，該試劑盒包括(1)分別裝有濃縮液、RNA提取液A、RNA提取液B、逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)體系、經(jīng)焦碳酸乙二酯處理的純水(DEPC H2O)、PCR擴(kuò)增反應(yīng)液I、PCR擴(kuò)增反應(yīng)液II、稀釋液、陰性對照樣品、強(qiáng)陽性標(biāo)準(zhǔn)品和RNA陽性對照品并加蓋密封的多個(gè)試劑瓶或管，和(2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中濃縮液用于濃縮液態(tài)待檢樣品。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中稀釋液用于稀釋陽性定量標(biāo)準(zhǔn)品。
根據(jù)本發(fā)明的再一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中用于靶多核苷酸擴(kuò)增體系的正向和逆向引物分別是5’-gac gag ttc gtg gtg gtg ac-3’(SEQ ID NO1)和5’-aagctt ctg ggc cag ttc ct-3’(SEQ ID NO2)。
根據(jù)本發(fā)明的再一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中用于靶多核苷酸擴(kuò)增和監(jiān)測體系的寡核苷酸是5’-caa aat gaa aga gct cag ccc cag atg-3(SEQ ID NO3)’。
可按照如上所描述的和試劑盒中所附使用說明書中指出的方法使用本發(fā)明的試劑盒。
如前所述，為了檢測出臨床樣品中可能存在的所有16個(gè)SARS病毒變異體，并能夠準(zhǔn)確有效地將SARS病毒感染與甲型流感病毒、呼吸道合胞病毒、副流感病毒等其他常見呼吸道病毒感染鑒別開，本發(fā)明基于對這些變異體和相關(guān)病毒基因組核苷酸序列的同源性比較，特別設(shè)計(jì)了適用本發(fā)明試劑盒的寡核苷酸引物和探針。使用這些引物和探針完成的實(shí)時(shí)定量檢測，大大減小了SARS病毒多核苷酸檢測的假陽性和假陰性。我們的實(shí)驗(yàn)證明，檢測SARS病毒基因組核苷酸的精確度幾乎為100％，靈敏度達(dá)到8×102個(gè)拷貝/ml。
值得特別說明的是，為了確保本發(fā)明的SARS病毒檢測方法的準(zhǔn)確性，我們還使用了根據(jù)已知的SARS病毒RNA序列合成的，并且在PCR擴(kuò)增區(qū)域(83bp)以外向兩端延伸的RNA序列(108bp)作為RNA陽性標(biāo)準(zhǔn)品(A和B)。并且，還使用攜帶有SARS病毒核苷酸(cDNA)序列的重組質(zhì)粒作為DNA定量檢測標(biāo)準(zhǔn)品。借助這些額外標(biāo)準(zhǔn)品，使用本發(fā)明的試劑盒在相同條件下進(jìn)行平行檢測并制作所謂的外標(biāo)定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，以進(jìn)一步驗(yàn)證本發(fā)明試劑盒的檢測精確度和準(zhǔn)確性，并作為生產(chǎn)本發(fā)明試劑盒的附加的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。
另外，由于本發(fā)明試劑盒的擴(kuò)增反應(yīng)條件中所采用的退火溫度為58℃，距離預(yù)定的實(shí)際退火溫度66.2℃相差達(dá)8.2℃。所以，即使樣品中的靶核苷酸只有單個(gè)核苷酸的變異，也足以保證熒光探針與在靶核苷酸上的結(jié)合和熒光信號的產(chǎn)生和釋放。
實(shí)施例(1)制備包括下列組成成分的試劑盒濃縮液(5ml/1瓶)、RNA提取液A(100μl/管)、RNA提取液B(4ml/瓶)、逆轉(zhuǎn)錄酶系(20μl/1管)、DEPC H2O(2.0ml/管)、PCR反應(yīng)液I(180μl/管)、PCR反應(yīng)液II(10管)、稀釋液(0.5ml/管)、陰性對照標(biāo)本(50μl/管)、強(qiáng)陽性標(biāo)準(zhǔn)品(2×105基因拷貝/μl；10μl/管)、RNA陽性對照品。
(2)標(biāo)本采集、運(yùn)送和保存使用采樣液(約5ml無菌生理鹽水)充分漱口，然后將嗽口液通過漏斗樣紙杯收集到無菌塑料試管中并置于低溫冰箱(-70℃)中冷凍保存。如集中檢驗(yàn)，標(biāo)本需在0℃以下環(huán)境中運(yùn)送并于24小時(shí)內(nèi)送達(dá)實(shí)驗(yàn)室。
(3)檢測和結(jié)果首先處理標(biāo)本、RNA陽性對照品和陰性對照標(biāo)準(zhǔn)品。將每份RNA陽性對照品、標(biāo)本和陰性對照品分別加入到新的經(jīng)高壓滅菌處理過的1.5ml離心管中。向離心管加入500μl濃縮液，-20℃靜置10分鐘后，4℃ 12000離心10分鐘。離心后，棄去上清并留下殘液20～30ul。向殘留液體中加入10μl的RNA提取液A，再加入400μl的RNA提取液B并混合均勻。室溫放置5分鐘后低速離心1分鐘，小心吸去上清，用75％的預(yù)冷乙醇洗沉淀，共洗兩次。然后65℃干燥沉淀。
然后，在逆轉(zhuǎn)錄酶(2μl)的存在下將吸附在沉淀上的RNA逆轉(zhuǎn)錄成c-DNA。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后，吸取5μl逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物做PCR反應(yīng)。
將強(qiáng)陽性標(biāo)準(zhǔn)品6000rpm離心數(shù)秒，加入稀釋液90μl，充分混勻后標(biāo)示為105。然后另取3支滅菌新0.5ml離心管，對標(biāo)準(zhǔn)品依次進(jìn)行10倍梯度稀釋(分別標(biāo)示為104、103、102)，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 然后分別取標(biāo)本(每份5ul)和同體積的定量標(biāo)準(zhǔn)品及陰性對照，加樣進(jìn)PCR反應(yīng)體系中并進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR循環(huán)條件是93℃→2分鐘預(yù)變性，然后按93℃ 15秒→55℃ 15秒→72℃ 20秒，先做10個(gè)循環(huán)，最后按93℃15秒→58℃ 30秒，做35個(gè)循環(huán)。
反應(yīng)結(jié)束后保存檢測數(shù)據(jù)文件。根據(jù)分析后圖像調(diào)節(jié)分析參數(shù)使標(biāo)準(zhǔn)曲線(Std curve)窗口下的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖達(dá)到最佳(即相關(guān)性correlation數(shù)值＜-0.95)(參見圖1)。由圖2和圖3可分別看出，陽性標(biāo)本的熒光曲線與設(shè)定的閾值線有一交點(diǎn)，而陰性標(biāo)本的熒光曲線低于閾值。最后儀器自動(dòng)分析計(jì)算出的未知標(biāo)本數(shù)值(Qty)。標(biāo)本的SARS病毒RNA含量(基因拷貝數(shù)/ml)＝8×(Qty)。
序列表<110>中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司<120>早期檢測SARS病毒感染的方法和試劑盒<140>
<141>
<160>3<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的引物。
<400>1gacgagttcg tggtggtgac<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的引物。
<400>2aagcttctgg gccagttcct<210>3<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的探針。
<400>3caaaatgaaa gagctcagcc ccagatg
權(quán)利要求
1.一種使用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)定量檢測樣品中SARS病毒存在的方法，該方法包括(1)提供包括樣品、核酸擴(kuò)增體系，和熒光監(jiān)測體系的反應(yīng)與檢測混合物，(2)通過擴(kuò)增反應(yīng)循環(huán)擴(kuò)增所說的靶多核苷酸，(3)使所說的熒光發(fā)生基團(tuán)與被擴(kuò)增的靶多核苷酸間接結(jié)合，(4)確定熒光發(fā)生基團(tuán)所產(chǎn)生的熒光量，(5)分析擴(kuò)增循環(huán)后產(chǎn)生的熒光量以確定靶多核苷酸的存在及其相對量；其中核酸擴(kuò)增系統(tǒng)包括可與靶多核苷酸結(jié)合的寡核苷酸引物，并且熒光監(jiān)測系統(tǒng)包括可與靶多核苷酸結(jié)合的寡核苷酸探針；特征在于所使用的正向和反向寡核苷酸引物分別是5’-gac gag ttc gtg gtg gtg ac-3’(SEQ ID NO1)和5’-aag ctt ctgggc cag ttc ct-3’(SEQ ID NO2)，并且所使用的寡核苷酸探針是5’-caa aat gaaaga gct cag ccc cag atg-3’(SEQ ID NO3)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說的核酸擴(kuò)增體系包括(a)耐熱DNA聚合酶、(b)2’-脫氧核苷三磷酸、(c)能夠與雙鏈靶多核苷酸的第一條鏈結(jié)合的正向引物，和(d)能夠與雙鏈靶多核苷酸的第二條鏈結(jié)合的反向引物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說的熒光檢測體系包括能夠與靶多核苷酸結(jié)合并且兩末端分別結(jié)合的有熒光發(fā)生基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)的寡核苷酸探針。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，所說的方法進(jìn)一步包括(1)確定樣品中的靶多核苷酸經(jīng)擴(kuò)增后所產(chǎn)生的熒光達(dá)到基線以上的固定閾值時(shí)所需的閾循環(huán)次數(shù)；(2)將已確定的樣品中靶多核苷酸的閾循環(huán)次數(shù)與標(biāo)準(zhǔn)溶液中已知量靶多核苷酸的閾循環(huán)次數(shù)相比較，以計(jì)算出樣品中靶多核苷酸的量。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說的SARS病毒選自SARS病毒的任何一種已知的變異體。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所說的靶多核苷酸來自SARS病毒。
7.使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)定量檢測臨床樣品中SARS病毒的試劑盒，該試劑盒包括(1)分別裝有濃縮液、RNA提取液A、RNA提取液B、逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)體系、經(jīng)焦炭酸乙二脂處理的純水、PCR擴(kuò)增反應(yīng)液I、PCR擴(kuò)增反應(yīng)液II、稀釋液、陰性對照樣品、強(qiáng)陽性標(biāo)準(zhǔn)品和RNA陽性對照品并加蓋密封的多個(gè)試劑瓶或管，和(2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的試劑盒，其中用于靶多核苷酸擴(kuò)增體系的正向和反向引物分別是5’-gac gag ttc gtg gtg gtg ac-3’和5’-aag ctt ctg ggc cag ttc ct-3’。
9.根據(jù)權(quán)利要求7的試劑盒，其中用于靶多核苷酸擴(kuò)增和監(jiān)測體系的寡核苷酸是5’-caa aat gaa aga gct cag ccc cag atg-3’。
全文摘要
本發(fā)明涉及檢測臨床樣品中嚴(yán)重急性呼吸綜合癥的病原體——SARS病毒存在的方法及試劑盒，特別是涉及以實(shí)時(shí)定量熒光聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)早期診斷SARS病毒感染的方法及所使用的試劑盒。
文檔編號G01N33/68GK1598580SQ0314684
公開日2005年3月23日 申請日期2003年9月17日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月17日
發(fā)明者程鋼, 何蘊(yùn)韶, 周新宇 申請人:中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司