專利名稱：一種參比免疫層析檢測抗原濃度的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體地說是涉及一種參比免疫層析檢測抗原濃度的方法。
ELISA定量檢測抗原濃度的方法可分為夾心法和競爭法。雙抗體夾心法的原理為通過包被特異抗體-抗原(檢樣)-酶標(biāo)記特異抗體的模式檢測抗原。競爭法是通過酶標(biāo)記的抗原和抗原(檢樣)共同競爭包被抗體，或包被抗原和抗原(檢樣)共同競爭酶標(biāo)記的抗體來檢測抗原。放射免疫測定法和ELISA測定原理類似，只是標(biāo)記物不同。由于放射免疫測定法需要用同位素標(biāo)記，已有逐漸被ELISA取代的趨勢。
免疫層析是出現(xiàn)于80年代初期的一種獨(dú)特的免疫分析方式，它通常以條狀纖維層析材料為固相，通過毛細(xì)作用使樣品溶液在層析條上泳動(dòng)，并同時(shí)使樣品中的待測物與層析材料上針對(duì)待測物的受體(如抗體或抗原)發(fā)生高特異、高親和性的免疫反應(yīng)。層析過程中免疫復(fù)合物被富集或截留在層析材料的一定區(qū)域(檢測線)，通過酶反應(yīng)、或直接利用可目測的標(biāo)記物(如膠體金)所看到的直觀的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象(如顯色)而獲得測定結(jié)果。而游離標(biāo)記物(即未與待測物結(jié)合的標(biāo)記物)則越過檢測帶，達(dá)到與結(jié)合標(biāo)記物自動(dòng)分離之目的。免疫層析技術(shù)常見的示蹤粒子有膠體金、乳膠、膠體硒、明膠等，其中運(yùn)用最成功的標(biāo)記物為膠體金。
免疫層析一般用于抗原的定性檢測，也可用于定量檢測，主要通過以下途徑來實(shí)現(xiàn)①樣本中的抗原和層析膜上的抗體/示蹤粒子標(biāo)記的抗體形成雙抗體夾心的檢測模式。例如市面上大量使用的早早孕膠體金試紙。
②樣本中的抗原/層析膜上的抗原共同競爭示蹤粒子標(biāo)記的限量抗體，通過檢測條帶出現(xiàn)與否判斷結(jié)果。例如，我們先前公開的專利“一種免疫層析一步法檢測β-腎上腺素激動(dòng)劑類藥物的方法及試紙的制備”(申請(qǐng)?zhí)枺?2131321.0)。
③樣本中的抗原/示蹤粒子標(biāo)記的抗原共同競爭層析膜上的限量抗體，通過檢測條帶出現(xiàn)與否判斷結(jié)果。例如，公開的實(shí)用新型專利“鹽酸克倫特羅快速檢測試紙條(II)”(申請(qǐng)?zhí)枺?2228104.5)。
④樣本中的抗原/示蹤粒子標(biāo)記的抗原共同競爭層析膜上的限量抗體，通過檢測條帶出現(xiàn)的條數(shù)判斷結(jié)果。例如，公開的專利“半定量快速檢測鹽酸克倫特羅的膠體金試紙條及生產(chǎn)和使用方法”(申請(qǐng)?zhí)枺?2139704.X)。
ELISA定量檢測抗原濃度一般用于批量檢測，免疫層析法一般用于單個(gè)樣本檢測。為了方便檢測單個(gè)樣本，許多生產(chǎn)ELISA的公司推出了雙孔ELISA法，一個(gè)孔加入樣本，另一個(gè)孔加入標(biāo)準(zhǔn)品，根據(jù)顯色深淺來判斷結(jié)果。和經(jīng)典ELISA一樣，雙孔ELISA法需要加樣本(標(biāo)準(zhǔn)品)，加酶標(biāo)記物，洗滌，顯色和終止等數(shù)個(gè)步驟，檢測時(shí)間至少30分鐘以上。
上述4種免疫層析檢測模式有一個(gè)共同的特點(diǎn)，就是用于定量時(shí)沒有標(biāo)準(zhǔn)品作參照，必需通過檢測體系中加入抗原/抗體的量或選擇嚴(yán)格的檢測材料，通過控制檢測靈敏度的方法來定量。由此產(chǎn)生的缺點(diǎn)為生產(chǎn)工藝復(fù)雜化，或定量的準(zhǔn)確性隨著保存時(shí)間的延長而發(fā)生變化。而雙孔ELISA操作復(fù)雜，檢測步驟多，需要的試劑多，不能常溫保存。因此，迫切需要建立一種簡單、快速、準(zhǔn)確的適用于測定多個(gè)樣品的檢測抗原濃度的方法。
本發(fā)明的目的通過以下的方案來實(shí)現(xiàn)一種參比免疫層析檢測抗原濃度的方法，包括按以下順序進(jìn)行的步驟(1)單元試紙的制作，其中層析膜上的檢測線為1-8條；優(yōu)選為2-5條。
(2)參比免疫層析試紙的制作，其方法是把單元試紙條安裝在底卡上，2-10張成排即成為參比免疫層析試紙。
(3)檢測流程在參比免疫層析試紙上的單元試紙條上分別加入標(biāo)準(zhǔn)抗原和樣本，加入標(biāo)準(zhǔn)抗原與加入樣本的單元試紙條數(shù)為任意比例。根據(jù)檢測線出現(xiàn)時(shí)間，或一定時(shí)間內(nèi)檢測線的顏色差異來判斷結(jié)果。
單元試紙的制作包括以下步驟
(1)層析膜檢測線的制備，用以下的模式1或模式2制備檢測線①模式1用能與待測抗原特異性結(jié)合的抗體在層析膜上線狀點(diǎn)樣作為檢測線。將硝酸纖維素膜(NC膜)按10-35mm寬的尺寸剪裁?？贵w溶液用緩沖液充分透析后，將濃度調(diào)整為0.01-5mg/ml，在膜上分別線狀點(diǎn)樣作為檢測線，檢測線點(diǎn)樣位置離膜底邊4-16mm，兩條檢測線之間的距離為2-12mm。
②模式2用全抗原或人工抗原(半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物)在層析膜上線狀點(diǎn)樣作為檢測線。將NC膜按10-35mm寬的尺寸剪裁。全抗原或人工抗原溶液用緩沖液充分透析后，將濃度調(diào)整為0.01-5mg/ml，在膜上分別線狀點(diǎn)樣作為檢測線，檢測線點(diǎn)樣位置離膜底邊4-16mm，兩條檢測線之間的距離為2-12mm。
根據(jù)層析的原理，層析的距離離加樣孔越遠(yuǎn)，層析的速度越慢，分辨率越高。本發(fā)明利用了層析的原理，采用多條層析膜檢測線，以提高分辨率。本發(fā)明采用的層析膜檢測線為1-8條，優(yōu)選2-5條。
(2)示蹤粒子結(jié)合物墊的制備，用以下的模式3或模式4制備示蹤粒子結(jié)合物墊①模式3用示蹤粒子標(biāo)記全抗原或人工抗原(半抗原-載體蛋白偶聯(lián)物)，把標(biāo)記好的示蹤粒子-抗原結(jié)合物分散在玻璃纖維紙上，作為示蹤粒子結(jié)合物墊；②模式4用示蹤粒子標(biāo)記能與待測抗原特異性結(jié)合的抗體，把標(biāo)記好的示蹤粒子-抗體結(jié)合物分散在玻璃纖維紙上，作為示蹤粒子結(jié)合物墊。
制備示蹤粒子結(jié)合物墊的示蹤粒子選自膠體金顆粒、膠體硒顆粒、乳膠顆粒，其制備和標(biāo)記方法如下①膠體金顆粒膠體金溶膠制備取0.01％四氯化金水溶液200ml，加熱至沸騰，加入1-20ml1％檸檬酸鈉水溶液，煮沸5min，出現(xiàn)橙紅色，膠體金顆粒直徑由電鏡測定為10-80nm；膠體金標(biāo)記抗原/抗體取50ml膠體金，用0.1mol/L碳酸鉀調(diào)pH(可選擇待標(biāo)記抗原/抗體的等電點(diǎn)，也可略為偏堿)，攪拌下將膠體金溶膠和抗原/抗體混合，再加入聚乙二醇水溶液，使其終濃度為0.05％。將粗制品在4,000-20,000×g下離心45min，沉淀用生理鹽水混懸至1.5ml，4℃保存。
②膠體硒顆粒
膠體硒溶膠制備在1升容量的四頸圓底燒瓶內(nèi)加入去離子水550ml和聚丙烯酸5-20g，通氮室溫?cái)嚢璨⒓尤胨想?0-100ml，繼續(xù)攪拌10-30分鐘。將亞硒酸5-15g溶解于280ml水中，室溫?cái)嚢柘碌稳敕磻?yīng)混合液得到50-250nm紅色硒溶膠。
膠體硒標(biāo)記抗原/抗體抗原/抗體用20mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH可選擇待標(biāo)記抗原/抗體的等電點(diǎn)，也可略為偏堿)配成1-8mg/ml濃度溶液，取25μl加入25ml硒溶膠中，室溫?cái)嚢?0分鐘后加1ml 1％的PEG8000，混勻，于4℃以3,000-10,000rpm離心5分鐘，得到松軟的紅色沉淀，用含0.05％NaN3的磷酸鹽緩沖液配成1ml懸液。
③乳膠顆粒彩色乳膠顆粒購自Bangs Laboratories公司。
乳膠顆粒標(biāo)記抗原/抗體用磷酸鹽緩沖液將乳膠稀釋到1％濃度，攪拌下加入一定量的抗原/抗體溶液，室溫?cái)嚢?0分鐘后于37℃水浴保溫60分鐘，4℃放置4-5小時(shí)。15,000rpm離心30分鐘，用適量磷酸鹽緩沖液重懸。
(3)單元試紙的組裝，用以下的模式5或模式6組裝單元試紙，其中的襯墊為涂布粘膠的塑料板或紙板①模式5在襯墊上先加上用模式1制備檢測線的層析膜、然后向下依次加上用模式3制備的示蹤粒子結(jié)合物墊、樣品墊、最后在層析膜之上加上吸水墊；②模式6在襯墊上先加上用模式2制備檢測線的層析膜、然后向下依次加上用模式4制備的示蹤粒子結(jié)合物墊、樣品墊、最后在層析膜之上加上吸水墊。
(4)單元試紙的剪切，試紙組裝完成后剪切成適當(dāng)寬度，即為單元試紙條。
參比免疫層析試紙制作的方法如下把單元試紙條安裝在底卡上，2-10張成排即成為參比免疫層析試紙。底卡一般為塑料卡，它能使襯墊上的層析膜、示蹤粒子結(jié)合物墊、樣品墊和吸水墊緊密結(jié)合。根據(jù)本發(fā)明的參比免疫層析試紙適用于非批量、多個(gè)樣品測定的特征，選用2-10張單元試紙條為合適。
檢測流程是在參比免疫層析試紙的2-10張單元條試紙上分別加入標(biāo)準(zhǔn)抗原和樣本，根據(jù)檢測線出現(xiàn)時(shí)間，或一定時(shí)間內(nèi)檢測線的顏色差異來判斷結(jié)果。加入標(biāo)準(zhǔn)抗原與加入樣本的單元試紙條數(shù)為任意比例。檢測流程為以下的一種
(1)在參比免疫層析試紙的2-10張單元試紙條上分別加入標(biāo)準(zhǔn)抗原和樣本，樣本單元試紙條在相同位置出現(xiàn)條帶的時(shí)間比某標(biāo)準(zhǔn)單元試紙條出現(xiàn)的時(shí)間晚，則樣品內(nèi)抗原濃度大于某標(biāo)準(zhǔn)濃度。
(2)參比免疫層析試紙的2-10張單元試紙條上分別加入標(biāo)準(zhǔn)抗原和樣本，在相同時(shí)間內(nèi)，樣本單元試紙條在相同位置出現(xiàn)條帶的顏色比某標(biāo)準(zhǔn)單元試紙條出現(xiàn)的顏色淺，則樣本內(nèi)抗原濃度大于某標(biāo)準(zhǔn)濃度。
加入標(biāo)準(zhǔn)抗原與加入樣本的單元試紙條數(shù)的比例，以及標(biāo)準(zhǔn)抗原的濃度可以根據(jù)待測樣本的特征而定。
本發(fā)明同以往定量檢測抗原的方法，特別是ELISA相比有如下優(yōu)點(diǎn)①操作簡便，只需一個(gè)操作步驟；②檢測速度快，5-20分鐘即可得到結(jié)果；③可單份測定也可數(shù)份同時(shí)測定、室溫保存、保存時(shí)間長，并可隨身攜帶。
本發(fā)明同以往定量檢測抗原的方法，特別是免疫層析法相比有如下優(yōu)點(diǎn)①用標(biāo)準(zhǔn)單元試紙條作參照，不需要額外的質(zhì)控線抗體(抗示蹤粒子標(biāo)記物抗體)；②定量的準(zhǔn)確性隨著保存時(shí)間的增長不會(huì)發(fā)生變化；③檢測方式靈活，可根據(jù)檢測線出現(xiàn)時(shí)間或一定時(shí)間檢測線的顏色差異來判斷結(jié)果；④可加入一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)，也可同時(shí)作幾個(gè)標(biāo)準(zhǔn)；⑤可檢測一個(gè)樣本，也可同時(shí)檢測數(shù)個(gè)樣本。
本發(fā)明可應(yīng)用于免疫學(xué)檢測的所有方面，但主要用于檢測正常生物樣本中不存在的抗原性物質(zhì)(如診斷傳染病的抗原，糧食、飲料或動(dòng)物飼料中污染的真菌毒素，抗生素)；正常含量極低而在特殊情況下異常升高的物質(zhì)(如HCG、甲胎蛋白、C-反應(yīng)蛋白等)；以及違禁添加的物質(zhì)(如蔬菜、水果中的殘留農(nóng)藥，牛奶中的抗生素，肉類食品中的興奮劑類藥)。本發(fā)明的試紙條的使用單位主要為醫(yī)院、部隊(duì)、公檢法部門、運(yùn)動(dòng)員興奮劑檢測部門、防疫站等國家監(jiān)測部門等，個(gè)人也可使用。
參比免疫層析(模式5)試紙由兩條單獨(dú)并排的單元試紙條，即檢測單元試紙條1-1和參比單元試紙條1-2構(gòu)成。單元試紙條由樣品墊3、示蹤粒子結(jié)合物墊4、層析膜5和吸水墊6構(gòu)成。示蹤粒子結(jié)合物墊4上有示蹤粒子標(biāo)記抗原8所形成的結(jié)合物10，層析膜5上有檢測線7，檢測線7上有抗體9。
圖2.是參比免疫層析(模式6)試紙的結(jié)構(gòu)圖。
參比免疫層析(模式6)試紙由兩條單獨(dú)并排的單元試紙條，即檢測單元試紙條2-1和參比單元試紙條2-2構(gòu)成。單元試紙條由樣品墊3、示蹤粒子結(jié)合物墊4、層析膜5和吸水墊6構(gòu)成。示蹤粒子結(jié)合物墊4上有示蹤粒子標(biāo)記抗體9所形成的結(jié)合物11，層析膜5上有檢測線7，檢測線7上有抗原8。
參照

圖1，在樣品墊3上滴加樣本或標(biāo)準(zhǔn)品后，樣本或標(biāo)準(zhǔn)品向吸水墊6端擴(kuò)散，使示蹤粒子結(jié)合物墊4上的示蹤粒子結(jié)合物10進(jìn)入樣本或標(biāo)準(zhǔn)品的液相，并與其一起向吸水墊6端擴(kuò)散，在層析膜5上，樣本或標(biāo)準(zhǔn)品中的抗原與示蹤粒子結(jié)合物中的抗原競爭，阻止示蹤粒子結(jié)合物10和抗體9的反應(yīng)。由于擴(kuò)散速度較快，反應(yīng)是動(dòng)態(tài)且不完全的。在參比單元試紙條1-2的樣品墊3上加入標(biāo)準(zhǔn)品后，標(biāo)準(zhǔn)品抗原和示蹤粒子結(jié)合物10上的標(biāo)記抗原比例是一定的，因此，標(biāo)準(zhǔn)品阻止示蹤粒子結(jié)合物10和抗體9的反應(yīng)的速率一定，檢測線出現(xiàn)可見顏色所需的時(shí)間也就一定。在檢測單元試紙條1-1的樣品墊3上同時(shí)加入樣本，如果樣本中的抗原濃度大于標(biāo)準(zhǔn)，樣本抗原阻止示蹤粒子結(jié)合物10中的抗原和抗體9反應(yīng)的速率增大，檢測線7上的抗體9富集示蹤粒子結(jié)合物10至可見顏色所需的時(shí)間也增加?；蛘撸谝欢ǖ臅r(shí)間內(nèi)，檢測單元試紙條的檢測線條帶顏色比參比單元試紙條的淺。反之，如果樣本中的抗原濃度小于標(biāo)準(zhǔn)，檢測線7上的抗體9富集示蹤粒子結(jié)合物10至可見顏色所需的時(shí)間減少?；蛘?，在一定的時(shí)間內(nèi)，檢測單元試紙條的檢測線條帶顏色比參比單元試紙條的深。根據(jù)可見顏色出現(xiàn)的先后，或同一時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)的條帶的顏色深淺便可判斷樣本中的抗原濃度大于或小于標(biāo)準(zhǔn)。
參照?qǐng)D2，在樣品墊3上滴加樣本或標(biāo)準(zhǔn)品，樣本或標(biāo)準(zhǔn)品向吸水墊6端擴(kuò)散，使示蹤粒子結(jié)合物墊4上的示蹤粒子結(jié)合物11進(jìn)入樣本或標(biāo)準(zhǔn)品的液相，并與其一起向吸水墊6端擴(kuò)散，在層析膜5上，樣本或標(biāo)準(zhǔn)品中的抗原與檢測線7上的抗原8競爭，阻止檢測線7上的抗原8和示蹤粒子結(jié)合物11的反應(yīng)。由于擴(kuò)散速度較快，反應(yīng)是動(dòng)態(tài)且不完全的。在參比單元試紙條2-2的樣品墊3上加入標(biāo)準(zhǔn)品后，標(biāo)準(zhǔn)品中的抗原阻止檢測線7中的抗原和示蹤粒子結(jié)合物11反應(yīng)的速率是一定的，檢測線出現(xiàn)可見顏色所需的時(shí)間也就一定。在檢測單元試紙條2-1的樣品墊3上同時(shí)加入樣本，如果樣本中的抗原濃度大于標(biāo)準(zhǔn)，樣本抗原阻止檢測線7中的抗原和示蹤粒子結(jié)合物11中的抗體反應(yīng)的速率增大，檢測線7上抗原8富集示蹤粒子結(jié)合物11至可見顏色所需的時(shí)間增加?；蛘?，在一定的時(shí)間內(nèi)，檢測單元試紙條的檢測線條帶顏色比參比單元試紙條的淺。反之，如果樣本中的抗原濃度小于標(biāo)準(zhǔn)，檢測線7上抗原8富集示蹤粒子結(jié)合物11至可見顏色所需的時(shí)間減少?；蛘?，在一定的時(shí)間內(nèi)，檢測單元試紙條的檢測線條帶顏色比參比單元試紙條的深。根據(jù)可見顏色出現(xiàn)的先后，或同一時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)的條帶的顏色深淺便可判斷樣本中的抗原濃度大于或小于標(biāo)準(zhǔn)。
本發(fā)明方法用于生物樣品中抗原濃度的定量檢測。
權(quán)利要求
1.一種參比免疫層析檢測抗原濃度的方法，包括按以下順序進(jìn)行的步驟(1)單元試紙的制作(2)參比免疫層析試紙制作(3)檢測流程，其特征在于(1)單元試紙的制作中，層析膜上的檢測線為1-8條；(2)參比免疫層析試紙制作方法是把單元試紙條安裝在底卡上，數(shù)張成排即成為參比免疫層析試紙，單元紙條的數(shù)量為2-10張；(3)檢測流程是在參比免疫層析試紙條的單元試紙條上分別加入標(biāo)準(zhǔn)抗原和樣本，加入標(biāo)準(zhǔn)抗原與加入樣本的單元試紙條數(shù)為任意比例，根據(jù)檢測線出現(xiàn)的時(shí)間，或一定時(shí)間內(nèi)檢測線的顏色差異來判斷結(jié)果。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗原濃度的檢測方法，其特征在于層析膜上的檢測線為2-5條。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗原濃度的檢測方法，其特征在于檢測流程為以下的一種(1)參比免疫層析試紙的單元試紙條上分別加入標(biāo)準(zhǔn)抗原和樣本，加入標(biāo)準(zhǔn)抗原與加入樣本的單元試紙條數(shù)為任意比例，樣本單元試紙條在相同位置出現(xiàn)檢測線條帶的時(shí)間比某標(biāo)準(zhǔn)單元試紙條出現(xiàn)的時(shí)間晚，則樣本內(nèi)抗原濃度大于某標(biāo)準(zhǔn)濃度；(2)參比免疫層析試紙的單元試紙條上分別加入標(biāo)準(zhǔn)抗原和樣本，加入標(biāo)準(zhǔn)抗原與加入樣本的單元試紙條數(shù)為任意比例，在相同時(shí)間內(nèi)，樣本單元試紙條在相同位置出現(xiàn)檢測線條帶的顏色比某標(biāo)準(zhǔn)單元試紙條出現(xiàn)的顏色淡，則樣本內(nèi)抗原濃度大于某標(biāo)準(zhǔn)濃度。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種參比免疫層析檢測抗原濃度的方法。該方法的步驟包括單元試紙的制作；參比免疫試紙制作；檢測流程。本發(fā)明的詳細(xì)方法見說明書。本發(fā)明用2張－10張單元試紙條并排制成參比免疫層析試紙。在免疫層析試紙的單元試紙條上分別加入標(biāo)準(zhǔn)抗原和樣本，加入標(biāo)準(zhǔn)抗原與加入樣本的單元試紙條數(shù)為任意比例，根據(jù)檢測線出現(xiàn)顏色的時(shí)間，或一定時(shí)間內(nèi)檢測線的顏色差異來判斷結(jié)果。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是定量準(zhǔn)確，可選用一個(gè)或數(shù)個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品，也可同時(shí)檢測一個(gè)或數(shù)個(gè)樣本。本發(fā)明方法用于生物樣本中抗原濃度的定量檢測。
文檔編號(hào)G01N33/531GK1460858SQ03147860
公開日2003年12月10日 申請(qǐng)日期2003年6月27日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月27日
發(fā)明者陳高明, 李林 申請(qǐng)人:江西中德生物工程有限公司