專利名稱：重組蛋白a基因及其表達(dá)產(chǎn)物的制備與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及一種重組蛋白A基因、含有重組蛋白A基因的載體以及該載體轉(zhuǎn)化的菌株和重組蛋白A基因表達(dá)產(chǎn)物的制備與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
葡萄球菌蛋白A(Staphylococal Protein A，SPA)是一種從金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁分離的蛋白質(zhì)。早在1940年，Vevwey發(fā)現(xiàn)在某些金黃色葡萄球菌中，含有一種物質(zhì)，在雙向擴(kuò)散試驗(yàn)中能與正常人血清形成沉淀。Jensen(1959)也發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象，并將其命名為A抗原。直到1963年Lofkvist等分離了A抗原，并證明它是一種蛋白質(zhì)，且與糖有區(qū)別，Grov(1960)將其命名為葡萄球菌蛋白A，簡稱SPA或蛋白A(Protein A)。由于SPA的一些免疫特性，它已引起廣大免疫學(xué)者的興趣，并發(fā)展成為免疫學(xué)上一種有用的工具。
編碼SPA的基因于1983年被克隆并在E.coli中表達(dá)(Duggleby，C.J and Jones，SAcloning and expression of the Staphylococcus aureus protein A gene in Escherichiacoli.Nucl Acids Res.11(1983)3065-3076；Lofdahl，S.，Guss，B.，et al；Gene forStaphylococcal protein A.Proc.Natl.Acid.Sci.USA 80(1983)697-701)。對SPA結(jié)構(gòu)和功能的研究發(fā)現(xiàn)，SPA分子包含A、B、C、D、E五個同源結(jié)構(gòu)域，每個結(jié)構(gòu)域都有能與IgG自主結(jié)合的能力。SPA基因有1600bp，SPA基因序列及其編碼的氨基酸序列見序列表SEQ IDNo.3和SEQ ID No.4。
由于葡萄球菌蛋白A具有與大多數(shù)哺乳動物IgG的Fc段結(jié)合的能力，因此被廣泛應(yīng)用于單克隆抗體或多克隆抗體的分離純化和檢測，但使用葡萄球菌蛋白A進(jìn)行分離純化的抗體的純度有待提高。SPA的主要來源是從金黃色葡萄球菌蛋白中提取而來，SPA占菌體總蛋白的1.7％。由于金黃色葡萄球菌是一種致病菌，同時，其菌體蛋白的分離純化存在一定困難，因此，通過基因工程方法獲得重組蛋白A成為一種重要的備選方法，為大規(guī)模生產(chǎn)蛋白A提供了新的、安全的途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了1.重組蛋白A基因；2.構(gòu)建含有該基因的載體，特別是表達(dá)載體；3.提供由該基因轉(zhuǎn)化的微生物菌株；4.提供由這些轉(zhuǎn)化菌株高效表達(dá)、生產(chǎn)重組蛋白A的方法；5.表達(dá)產(chǎn)物的應(yīng)用。
發(fā)明的重組蛋白A基因是以3個人工合成的重組蛋白A基因單體串連而成，各重組蛋白A基因單體間以Acc I酶切位點(diǎn)相連，其中第一個重組蛋白A基因單體前端加入GAATTCATATGGTG，包括起始密碼子ATG和與表達(dá)載體pBV220(Zhang ZQ，Yao LH，HouYD.Construction and application of a high level expression vector containing P RP L promoter.BingduXuebao，1990；6111-116)相連的EcoR I酶切位點(diǎn)，最后一個重組蛋白A基因單體末端加入GTAGACTAAGGATCC，其中包括中止密碼子TAA和與表達(dá)載體pBV220相連的BamH I酶切位點(diǎn)。該基因的基本特征如下a.序列特征類型核酸鏈數(shù)雙鏈b.分子類型DNAc.來源人工合成的重組蛋白A基因單體串連而成d.該基因的結(jié)構(gòu)由3個重組蛋白A基因單體串連而成。該基因由551個核苷酸構(gòu)成，編碼178個氨基酸。該基因序列及其編碼的氨基酸序列見序列表SEQ ID No.1、SEQID No.2。
本發(fā)明還構(gòu)建了含有上述重組蛋白A基因的載體，這些載體的構(gòu)建方法是按照常規(guī)方法，將通過人工合成的重組蛋白A基因單體酶切后接入相應(yīng)載體的相應(yīng)酶切位點(diǎn)之間，再以Acc I內(nèi)切酶酶切，連接成包含多個串連重組蛋白A基因單體的重組蛋白A基因表達(dá)載體。
上述含重組蛋白A基因的大腸桿菌表達(dá)載體優(yōu)先由本發(fā)明合成的重組蛋白A基因與大腸桿菌表達(dá)載體pBV220構(gòu)建成的重組表達(dá)載體，命名為pBVA20，其構(gòu)建過程如圖1所示。
本發(fā)明還提供了利用上述含大腸桿菌重組表達(dá)載體的大腸桿菌重組株生產(chǎn)重組蛋白A的方法，該方法是將菌種進(jìn)行培養(yǎng)發(fā)酵并經(jīng)熱誘導(dǎo)使其高效表達(dá)重組蛋白A，再收集菌體，經(jīng)分離純化得到重組蛋白A產(chǎn)品。
本發(fā)明上述能表達(dá)重組蛋白A的大腸桿菌菌株優(yōu)先為由含有重組蛋白A基因的表達(dá)載體pBVA20轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α得到的菌株，命名為Escherichia coli DH5α/pBVA20，簡稱DH5α/pBVA20。
利用大腸桿菌重組菌株DH5α/pBVA20生產(chǎn)重組蛋白A的具體方法為1.種子液的制備將菌種接種于三角瓶，接種量1-2％V/V，于30℃培養(yǎng)過夜；當(dāng)O.D600達(dá)到3-3.5時即可接種發(fā)酵；上述所用種子培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基加100-200mg/l氨芐青霉素；2.發(fā)酵在無菌條件下將上述培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)基按1∶20-1∶5接種于發(fā)酵培養(yǎng)基上，30℃發(fā)酵至O.D600達(dá)到0.4-0.8時，升溫至42C誘導(dǎo)，誘導(dǎo)3～5小時后4℃8000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘收菌；3.重組蛋白A的分離純化1)粗提將上述收集菌體用NaCl+磷酸鹽緩沖液(7.0-8.0)懸浮，超聲破碎，4℃8000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，收集上清，得粗提液。
經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測表明，用本法提取表達(dá)于大腸桿菌胞周質(zhì)的重組蛋白A效果很好，粗提后大部分重組蛋白A被粗提，殘存于菌體的量極微；2)純化將粗提液進(jìn)行Sephacryl S200分子篩(法瑪西亞公司生產(chǎn))純化，以PBS(Ph 7.4)為緩沖液將粗提液上Sephacryl S200分子篩，收集特征峰(第二洗脫峰)即為純化的重組蛋白A，其純度可達(dá)90％以上。
本發(fā)明生產(chǎn)的重組蛋白A表達(dá)于大腸桿菌胞周質(zhì)中，有利于表達(dá)產(chǎn)物的分離純化。利用本發(fā)明表達(dá)生產(chǎn)重組蛋白A，具有表達(dá)量效率高，表達(dá)量大(占細(xì)菌可溶性蛋白總量的60-80％)，表達(dá)時間短(僅3-5小時)，易于純化等優(yōu)點(diǎn)，并且經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明所表達(dá)的重組蛋白A與野生型蛋白A結(jié)合活性相近，而與抗體間的結(jié)合力稍弱。
本發(fā)明采用溫控型大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn)重組蛋白A，還具有生產(chǎn)周期短(1天)，消耗低，能有效地降低成本，有利于基因工程重組蛋白A的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。
將本發(fā)明的重組蛋白A基因的表達(dá)產(chǎn)物重組蛋白A用于與各種不同的層析介質(zhì)載體如瓊脂糖凝膠、葡聚糖、纖維素、帶羥基的高分子聚合物、硅膠等偶聯(lián)成為親和層析介質(zhì)用于抗體的分離純化。
本發(fā)明生產(chǎn)的重組蛋白A與野生型的金黃色葡萄球菌蛋白A相比，其與抗體結(jié)合的親和力稍弱，使抗體結(jié)合后的洗脫條件更溫和，有利于保持抗體的活性，使抗體分離純化效果良好，抗體純度可一步大于95％。
上述親和層析介質(zhì)可以由以下步驟制備1.用環(huán)氧氯丙烷、氫氧化鈉與相應(yīng)介質(zhì)在水介質(zhì)中進(jìn)行反應(yīng)，在30-60℃的溫度下反應(yīng)2-4小時，反應(yīng)完后清洗至中性后抽干；2.再與本發(fā)明的重組蛋白A在4-25℃溫度下反應(yīng)16-20小時反應(yīng)完后清洗再抽干；清洗后得到上述親和層析介質(zhì)。
以上步驟所得親和層析介質(zhì)穩(wěn)定性好，基團(tuán)脫落少，使用壽命長，使用方便，可從腹水或培養(yǎng)液中直接分離純化抗體。上述親和層析介質(zhì)也可以用溴化氰活化方法以及其他方法制備。


圖1是重組表達(dá)載體pBVA20構(gòu)建的示意圖，其中，PR、PL為噬菌體啟動子，T1、T2為的轉(zhuǎn)錄終止序列。
圖2是重組蛋白A表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳圖。其中，M是標(biāo)準(zhǔn)分子量對照，泳道1是42℃誘導(dǎo)含pBV220空載體的DH5α/pBV220菌體，泳道2是42℃誘導(dǎo)表達(dá)的DH5α/pBVA20菌體，泳道3是42℃誘導(dǎo)表達(dá)的DH5α/pBVA20菌體培養(yǎng)上清。
圖3是重組蛋白A表達(dá)產(chǎn)物分步純化的SDS-PAGE電泳圖。其中，M是標(biāo)準(zhǔn)分子量對照，泳道1是誘導(dǎo)表達(dá)的DH5α(pBVA20)菌體，泳道2、泳道3是菌體粗提后初步純化的重組蛋白A，泳道4是菌體粗提后經(jīng)分子篩Sephacryl S200純化后的重組蛋白A。
圖4是重組蛋白A瓊脂糖凝膠6B FF分離腹水中的IgG2a的分離純化色譜圖；圖5是重組蛋白A瓊脂糖凝膠6B FF分離腹水中的IgG2a的SDS-PAGE電泳結(jié)果圖，其中泳道1mark；泳道2腹水；泳道3IgG2a；圖6是重組蛋白A葡聚糖凝膠分離腹水中的IgG2a的分離純化色譜圖；圖7是重組蛋白A葡聚糖凝膠分離腹水中的IgG2a的SDS-PAGE電泳結(jié)果圖，其中泳道1mark；泳道2腹水；泳道3IgG2a；圖8是重組蛋白A纖維素凝膠分離腹水中的IgG2a的分離純化色譜圖；圖9是重組蛋白A纖維素凝膠分離腹水中的IgG2a的SDS-PAGE電泳結(jié)果圖，其中泳道1mark；泳道2腹水；泳道3IgG2a；圖10是重組蛋白A聚乙烯醇凝膠分離腹水中的IgG2a的分離純化色譜圖；圖11是重組蛋白A聚乙烯醇凝膠分離腹水中的IgG2a的SDS-PAGE電泳結(jié)果圖，其中泳道1mark；泳道2腹水；泳道3IgG2a具體實(shí)施方式
以下通過實(shí)施例結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，這并不限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1 重組蛋白A基因單體的合成通過化學(xué)合成的方法，設(shè)計(jì)合成重組蛋白A基因單體的兩條鏈，退火獲得重組蛋白A基因單體序列。其序列包括長度為174bp，兩端是Acc I酶切位點(diǎn)，用于多個重組蛋白A基因單體構(gòu)建的重復(fù)序列區(qū)。另外，還包括起始密碼子ATG，第二密碼子GTG，終止密碼子TAA，及克隆用EcoR I及BamH I限制性內(nèi)切酶接頭共29bp。上述過程見說明書附1。
實(shí)施例2 含一個重組蛋白A基因單體的pBV220載體的構(gòu)建用限制型內(nèi)切酶EcoR I和BamH I將上述重組蛋白A基因單體切下，與經(jīng)EcoR I及BamHI酶切的載體pBV220連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選具有氨芐青霉素抗性的轉(zhuǎn)化子，經(jīng)質(zhì)粒提取，酶切鑒定后證明重組蛋白A基因單體已克隆至pBV220中。上述過程見說明書附圖之圖1。
實(shí)施例3 含有重組蛋白A基因的pBVA20載體的構(gòu)建將上述含一個重組蛋白A基因單體的pBV220載體及重組蛋白A基因單體以AccI酶切，回收相應(yīng)片段后連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選具有氨芐青霉素抗性的轉(zhuǎn)化子，經(jīng)質(zhì)粒提取，酶切篩選獲得含有重組蛋白A基因的pBVA20載體。上述過程見說明書附圖之圖1。
實(shí)施例4 能高效表達(dá)重組蛋白A的大腸桿菌菌株DH5α/pBVA20的構(gòu)建用CaCl2法將pBVA20轉(zhuǎn)化E.coli DH5α，在含有氨芐青霉素的LB平板上篩選轉(zhuǎn)化子，經(jīng)質(zhì)粒檢測和酶切分析獲得含有pBVA20的重組轉(zhuǎn)化子DH5α/pBVA20。上述過程見說明書附圖之圖1。
實(shí)施例5 利用大腸桿菌工程菌E.coli DH5α/pBVA20生產(chǎn)重組蛋白A1)菌種的培養(yǎng)發(fā)酵挑取大腸桿菌工程菌E.coli DH5α/pBVA20，接種于LB培養(yǎng)基中，接種量1-2％V/V，于30℃培養(yǎng)過夜；次日在無菌條件下將上述培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)基按1∶20-1∶5接種于發(fā)酵培養(yǎng)基上，30℃發(fā)酵至O.D600達(dá)到0.4-0.8時，升溫至42℃誘導(dǎo)，誘導(dǎo)3～5小時后離心收菌；取少量細(xì)胞加2×上樣緩沖液，煮沸5分鐘后按標(biāo)準(zhǔn)做SDS-PAGE凝膠電泳，結(jié)果如說明書附2，經(jīng)誘導(dǎo)的E.coli DH5α/pBVA20菌體及上清在20kD的位置出現(xiàn)一條新的蛋白帶(見圖2泳道1及泳道3)，DH5α/pBV220(DH5α/pBV220為轉(zhuǎn)化了pBV220空載體的DH5α菌，見圖2泳道1)不出現(xiàn)此帶，證明重組蛋白A已在E.coli DH5α/pBVA20中誘導(dǎo)表達(dá)。
2)表達(dá)的重組蛋白A的純化將上述收集菌體用NaCl+磷酸鹽緩沖液(pH7.0-8.0)懸浮，超聲破碎，4℃離心，收集上清，得粗提液。經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測表明，用本法提取表達(dá)于大腸桿菌胞周質(zhì)的重組蛋白A效果很好，粗提后大部分重組蛋白A被粗提，殘存于菌體的量極微；將粗提液進(jìn)行Sephacryl S200分子篩純化，收集特征峰(第二洗脫峰)即為純化的重組蛋白A，其純度可達(dá)90％以上。
實(shí)施例6 重組蛋白A用于抗體檢測，Elisa檢測表達(dá)的重組蛋白A與抗體結(jié)合的實(shí)驗(yàn)1)包被96孔板，每孔包被重組蛋白A樣品100μl，37℃，1小時。
2)封閉每孔以100μl 1％的BSA封閉，37℃，1小時。
3)加一抗每孔加入約100μg人抗體，37℃，1小時。
4)加二抗每孔加入約100μl 11000辣根標(biāo)記抗體，37℃，1小時。
5)顯色。
經(jīng)Elisa檢測表明本發(fā)明提取的重組蛋白A與人抗體有強(qiáng)結(jié)合活性，與野生型蛋白A結(jié)合活性相近，每孔包被5ng重組蛋白A即可獲得明顯檢測信號。結(jié)果顯示重組蛋白A可用于抗體的檢測。
實(shí)施例7 重組蛋白A瓊脂糖凝膠6B FF的制備1.用環(huán)氧氯丙烷、氫氧化鈉與瓊脂糖(6％的交聯(lián)瓊脂糖凝膠)在水介質(zhì)中進(jìn)行反應(yīng)，在30-60℃的溫度下反應(yīng)2-4小時，反應(yīng)完后用蒸餾水清洗至中性后抽干；2.再與本發(fā)明的重組蛋白A在4-25℃溫度下反應(yīng)16-20小時反應(yīng)完后清洗再抽干；重組蛋白A瓊脂糖凝膠6B FF具有以下特性1.特點(diǎn)基團(tuán)脫落少，結(jié)合特異性強(qiáng)2.基質(zhì)6％的交聯(lián)瓊脂糖凝膠3.配基重組蛋白A4.配基密度≈6mg重組蛋白A/ml5.吸附載量2-5mg鼠IgG2a/ml6.親和介質(zhì)的顆粒大小50-160μm7.最大流速200cm/h8.pH范圍3-10，在位清洗時pH范圍可到2-119.使用溫度常溫10.保存溫度+4～8℃11.保存液體20％乙醇如果待分離純化的抗體與親和層析介質(zhì)間的吸附力比較弱，則可適當(dāng)提高吸附緩沖液的pH值和鹽濃度，即可獲得較好的分離效果。
實(shí)施例8 重組蛋白A瓊脂糖凝膠6B FF從小鼠腹水中分離純化IgG2a1、重組蛋白A瓊脂糖凝膠6B FF裝柱，1.6×20cm，柱床體積為10ml；2、用緩沖液A平衡5-10個床體積，流速為1ml/min；3、將2ml小鼠腹水用緩沖液A稀釋到20ml，0.45μm濾膜過濾，上樣。流速為1ml/min；4、用緩沖液A再洗5-10個床體積，流速為1ml/min；5、用緩沖液B洗脫，流速為1ml/min，收集洗脫峰6、用純水流洗10個柱床體積，再用20％的乙醇流洗10個柱床體積，流速為2ml/min，柱子置于+4~8℃環(huán)境中保存7、將分離純化的IgG2a與對照品同時進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。
備注柱子每使用幾次后應(yīng)該用以緩沖液C流洗1次，以便將吸附更牢的蛋白去除。
緩沖液組成緩沖液A20mM磷酸鹽緩沖液，pH7.4，即pH7.4的PBS溶液。配制0.2M NaH2PO419ml，0.2M Na2HPO4 81ml，NaCl9g加水至1000ml。
緩沖液B20mM檸檬酸緩沖液，pH4.0。配制檸檬酸2.1g加水950ml，用5M NaOH調(diào)至pH 4.0，加水至1000ml。
緩沖液C0.5M醋酸緩沖液，pH3.0。配制0.5M醋酸溶液用固體NaOH調(diào)至pH 3.0。
緩沖液D1M Tris-HCl緩沖液，pH9.0。配制Tris鹽121.14g，加水至950ml，濃鹽酸調(diào)pH至9.0，加水至1000ml。
結(jié)果分離純化色譜圖見圖4；SDS-PAGE電泳分析結(jié)果見圖5，泳道1為標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker，泳道2為腹水，泳道3為本發(fā)明的重組蛋白A瓊脂糖凝膠6B FF親和介質(zhì)所裝的柱子的洗脫峰。泳道3中，上、下兩條帶分別是IgG2a的重鏈和輕鏈。試驗(yàn)結(jié)果表明了本發(fā)明的重組蛋白A瓊脂糖凝膠6B FF親和層析介質(zhì)一步就可以得到純度大于95％的IgG2a。
實(shí)施例9 重組蛋白A葡聚糖凝膠的制備1.用環(huán)氧氯丙烷、氫氧化鈉與葡聚糖在水介質(zhì)中進(jìn)行反應(yīng)，在30-55℃的溫度下反應(yīng)2-4小時，反應(yīng)完后用蒸餾水清洗至中性后抽干；2.再與本發(fā)明的重組蛋白A在4-25℃溫度下反應(yīng)16-20小時反應(yīng)完后清洗再抽干；3 蒸餾水清洗后得到重組蛋白A葡聚糖凝膠，它具有與重組蛋白A瓊脂糖凝膠6B FF相同的特性。
實(shí)施例10 重組蛋白A葡聚糖凝膠從小鼠腹水中分離純化IgG2a與實(shí)施例8中重組蛋白A瓊脂糖凝膠6B FF相同的步驟、應(yīng)用相同的緩沖液，用重組蛋白A葡聚糖凝膠從小鼠腹水中分離純化IgG2a；結(jié)果分離純化色譜圖見圖6；SDS-PAGE電泳分析結(jié)果見圖7，泳道1為標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker，泳道2為腹水，泳道3為本發(fā)明的重組蛋白A葡聚糖凝膠親和介質(zhì)所裝的柱子的洗脫峰。泳道3中，上、下兩條帶分別是IgG2a的重鏈和輕鏈。試驗(yàn)結(jié)果表明了本發(fā)明的重組蛋白A葡聚糖凝膠親和層析介質(zhì)一步就可以得到純度大于95％的IgG2a。
實(shí)施例11 重組蛋白A與纖維素偶聯(lián)的親和層析介質(zhì)重組蛋白A纖維素凝膠的制備1.用環(huán)氧氯丙烷、氫氧化鈉與纖維素在水介質(zhì)中進(jìn)行反應(yīng)，在30-60℃的溫度下反應(yīng)2-4小時，反應(yīng)完后用蒸餾水清洗至中性后抽干；2.再與本發(fā)明的重組蛋白A在4-25℃溫度下反應(yīng)16-20小時反應(yīng)完后清洗再抽干；3.蒸餾水清洗后得到重組蛋白A纖維素凝膠，它具有與重組蛋白A瓊脂糖凝膠6B FF相同的特性。
實(shí)施例12 重組蛋白A與纖維素偶聯(lián)的親和層析介質(zhì)重組蛋白A纖維素凝膠從小鼠腹水中分離純化IgG2a與實(shí)施例8中重組蛋白A瓊脂糖凝膠6B FF相同的步驟、相同的實(shí)驗(yàn)條件、應(yīng)用相同的緩沖液，用重組蛋白A纖維素凝膠從小鼠腹水中分離純化IgG2a；結(jié)果分離純化色譜圖見圖8；SDS-PAGE電泳分析結(jié)果見圖9，泳道1為標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker，泳道2為腹水，泳道3為本發(fā)明的重組蛋白A纖維素凝膠親和介質(zhì)所裝的柱子的洗脫峰。泳道3中，上、下兩條帶分別是IgG2a的重鏈和輕鏈。試驗(yàn)結(jié)果表明了本發(fā)明的重組蛋白A纖維素凝膠親和層析介質(zhì)一步就可以得到純度大于95％的IgG2a。
實(shí)施例13 重組蛋白A與帶羥基的高分子聚合物等載體偶聯(lián)的親和層析介質(zhì)的制備1.用環(huán)氧氯丙烷、氫氧化鈉與帶羥基的高分子聚合物聚乙烯醇在水介質(zhì)中進(jìn)行反應(yīng)，在30-60℃的溫度下反應(yīng)2-4小時，反應(yīng)完后用蒸餾水清洗至中性后抽干；2.再與本發(fā)明的重組蛋白A在4-25℃溫度下反應(yīng)16-20小時反應(yīng)完后清洗再抽干；3.蒸餾水清洗后得到重組蛋白A聚乙烯醇凝膠，它具有與重組蛋白A瓊脂糖凝膠6B FF相同的特性。
實(shí)施例14 重組蛋白A與帶羥基的高分子聚合物偶聯(lián)的親和層析介從小鼠腹水中分離純化IgG2a與實(shí)施例8中重組蛋白A瓊脂糖凝膠6B FF相同的步驟、相同的實(shí)驗(yàn)條件、應(yīng)用相同的緩沖液，用重組蛋白A聚乙烯醇凝膠從小鼠腹水中分離純化IgG2a；結(jié)果分離純化色譜圖見圖10；SDS-PAGE電泳分析結(jié)果見圖11，泳道1為標(biāo)準(zhǔn)蛋白Marker，泳道2為腹水，泳道3為本發(fā)明的重組蛋白A纖維素凝膠親和介質(zhì)所裝的柱子的洗脫峰。泳道3中，上、下兩條帶分別是IgG2a的重鏈和輕鏈。試驗(yàn)結(jié)果表明了本發(fā)明的重組蛋白A纖維素凝膠親和層析介質(zhì)一步就可以得到純度大于95％的IgG2a。對說明書中的名詞的解釋1.葡萄球菌蛋白A簡稱SPA或蛋白A(ProteinA)。
2.pBVA20為含有本發(fā)明專利所述的目的蛋白A的pBV220。
3.pBV220一種溫控型大腸桿菌表達(dá)載體。
4.E.coliDH5α大腸桿菌菌株DH5α。
5.DH5α/pBV220為轉(zhuǎn)化了pBV220的Escherichia coli DH5α菌；DH5α為Escherichia coli DH5α的簡稱。
6.BSA牛血清白蛋白。
7.重組蛋白A基因單體即構(gòu)成重組蛋白A基因的基因基本單位，有相對獨(dú)立的結(jié)構(gòu)。
序列表(1)一般信息發(fā)明名稱重組蛋白A基因及其表達(dá)產(chǎn)物的制備與應(yīng)用序列數(shù)目4(2)SEQ ID No1的信息(I)序列特征(A)類型核酸(B)長度551個堿基(C)鏈數(shù)雙鏈(II)分子類型DNA(III)序列描述GAATTCATAT GGTGGTAGAC AACAAATTCA ACAAAGAACA ACAAAACGCG TTCTATGAGATCTTACATTT ACCTAACTTA AACGAAGAAC AACGAAACGC CTTCATCCAA AGTTTAAAAGATGACCCAAG CCAAAGCGCT AACCTTTTAG CAGAAGCTAA AAAGCTAAAT GATGCTCAGGCGCCGAAAGT AGACAACAAA TTCAACAAAG AACAACAAAA CGCGTTCTAT GAGATCTTACATTTACCTAA CTTAAACGAA GAACAACGAA ACGCCTTCAT CCAAAGTTTA AAAGATGACCCAAGCCAAAG CGCTAACCTT TTAGCAGAAG CTAAAAAGCT AAATGATGCT CAGGCGCCGAAAGTAGACAA CAAATTCAAC AAAGAACAAC AAAACGCGTT CTATGAGATC TTACATTTACCTAACTTAAA CGAAGAACAA CGAAACGCCT TCATCCAAAG TTTAAAAGAT GACCCAAGCCAAAGCGCTAA CCTTTTAGCA GAAGCTAAAA AGCTAAATGA TGCTCAGGCG CCGAAAGTAGACTAAGGATC C
(3)SEQ ID No2的信息(I)序列特征(A)類型氨基酸(B)長度178個氨基酸(II)分子類型蛋白質(zhì)(III)序列描述Met Val Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr GluIle Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile GlnSer Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala LysLys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp Asn Lys Phe Asn Lys GluGln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu His Leu Pro Asn Leu Asn Glu GluGln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu Lys Asp Asp Pro Ser Gln Ser AlaAsn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu Asn Asp Ala Gln Ala Pro Lys ValAsp Asn Lys Phe Asn Lys Glu Gln Gln Asn Ala Phe Tyr Glu Ile Leu HisLeu Pro Asn Leu Asn Glu Glu Gln Arg Asn Ala Phe Ile Gln Ser Leu LysAsp Asp Pro Ser Gln Ser Ala Asn Leu Leu Ala Glu Ala Lys Lys Leu AsnAsp Ala Gln Ala Pro Lys Val Asp(4)SEQ ID No3的信息(I)序列特征(A)類型核酸(B)長度1600個堿基(C)鏈數(shù)雙鏈(II)分子類型DNA
(III)序列描述tgattttgcg gttttaagcc ttttacttcc tgaataaatc tttcagcaaa atatttattttataagttgt aaaacttaca tttaaattta attataaata tagattttag tattgcaatacataattcgt tatattatga tgactttaca aatacataca gggggtatta atttgaaaaagaaaaacatt tattcaattc gtaaactagg tgtaggtatt gcatctgtaa ctttaggtacattacttata tctggtggcg taacacctgc tgcaaatgct gcgcaacacg atgaagctcaacaaaatgct ttttatcaag tgttaaatat gcctaactta aacgctgatc aacgtaatggttttatccaa agccttaaag atgatccaag ccaaagtgct aacgttttag gtgaagctcaaaaacttaat gactctcaag ctccaaaagc tgatgcgcaa caaaataact tcaacaaagatcaacaaagc gccttctatg aaatcttgaa catgcctaac ttaaacgaag cgcaacgtaacggcttcatt caaagtctta aagacgaccc aagccaaagc actaatgttt taggtgaagctaaaaaatta aacgaatctc aagcaccgaa agctgataac aatttcaaca aagaacaacaaaatgctttc tatgaaatct tgaatatgcc taacttaaac gaagaacaac gcaatggtttcatccaaagc ttaaaagatg acccaagcca aagtgctaac ctattgtcag aagctaaaaagttaaatgaa tctcaagcac cgaaagcgga taacaaattc aacaaagaac aacaaaatgctttctatgaa atcttacatt tacctaactt aaacgaagaa caacgtaacg gcttcatccaaagccttaaa gacgatcctt cagtgagcaa agaaatttta gcagaagcta aaaagctaaacgatgctcaa gcaccaaaag aggaagacaa caaaaaacct ggtaaagaag acggcaacaaacctggcaaa gaagacggca acaagcctgg taaagaagac aacaaaaaac ctggtaaagaagacggcaac aagcctggta aagaagacaa caacaaacct ggcaaagaag acggcaacaagcctggtaaa gaagacaaca acaagcctgg taaagaagac ggcaacaagc ctggtaaagaagacggcaac aaacctggta aagaagacgg caacggagta catgtcgtta aacctggtgatacagtaaat gacattgcaa aagcaaacgg cactactgct gacaaaattg ctgcagataacaaattagct gataaaaaca tgatcaaacc tggtcaagaa cttgttgttg ataagaagca
accagcaaac catgcagatg ctaacaaagc tcaagcatta ccagaaactg gtgaagaaaatccattcatc ggtacaactg tatttggtgg attatcatta gccttaggtg cagcgttattagctggacgt cgtcgcgaac tataaaaaca aacaatacac aacgatagat atcattttatccaaaccaat tttaacttat atacgttgat taacacattc(5)SEQ ID No4的信息(I)序列特征(A)類型氨基酸(B)長度450個氨基酸(II)分子類型蛋白質(zhì)(III)序列描述MKKKNIYSIRKLGVGIASVTLGTLLISGGVTPAANAAQHDEAQQNAFYQVLNMPNLNADQRNGFIQSLKDDPSQSANVLGEAQKLNDSQAPKADAQQNNFNKDQQSAFYEILNMPNLNEAQRNGFIQSLKDDPSQSTNVLGEAKKLNESQAPKADNNFNKEQQNAFYEILNMPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSQSANLLSEAKKLNESQAPKADNKFNKEQQNAFYEILHLPNLNEEQRNGFIQSLKDDPSVSKEILAEAKKLNDAQAPKEEDNKKPGKEDGNKPGKEDGNKPGKEDNKKPGKEDGNKPGKEDNNKPGKEDGNKPGKEDNNKPGKEDGNKPGKEDGNKPGKEDGNGVHVVKPGDTVNDIAKANGTTADKIAADNKLADKNMIKPGQELVVDKKQPANHADANKAQALPETGEENPFIGTTVFGGLSLALGAALLAGRRREL
權(quán)利要求
1.一種重組蛋白A基因，它具有序列表中SEQ ID No.1所述的堿基序列。
2.一種重組蛋白A，由序列表中SEQ ID No.2所述的氨基酸序列組成。
3.一種重組載體，它含有權(quán)利要求1所述的重組蛋白A基因。
4.含有權(quán)利要求1所述的重組蛋白A基因的重組載體pBVA20。
5.含有權(quán)利要求3所述的重組載體的轉(zhuǎn)化微生物，其中該重組載體含有權(quán)利要求1所述的重組蛋白A基因。
6.一種制備重組蛋白A基因的表達(dá)產(chǎn)物的方法，其特征是，制備所述的重組蛋白A基因的表達(dá)產(chǎn)物的過程是先構(gòu)建含有重組蛋白A基因的表達(dá)載體；再將含有重組蛋白A基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α中形成大腸桿菌重組株；經(jīng)菌株培養(yǎng)，誘導(dǎo)使其高效表達(dá)重組蛋白A，再經(jīng)分離純化得到重組蛋白A。
7.一種親和層析介質(zhì)，其特征為，它由重組蛋白A和層析介質(zhì)載體組成。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組蛋白A基因，其特征是，所述的重組蛋白A基因編碼的重組蛋白A用于抗體檢測、分離、純化。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的重組蛋白A，其與抗體結(jié)合的親和力稍弱，使抗體結(jié)合后的洗脫條件更溫和，有利于保持抗體的活性，從而達(dá)到良好的抗體分離純化效果。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的親和層析介質(zhì)，其特征為，所述的層析介質(zhì)載體可以是瓊脂糖凝膠或葡聚糖或纖維素或硅膠或帶羥基的高分子聚合物。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明是將設(shè)計(jì)的化學(xué)合成重組蛋白A(rPA)結(jié)構(gòu)單元基因集團(tuán)串連重復(fù)插入熱誘導(dǎo)型大腸桿菌載體，構(gòu)建了含有該基因的大腸桿菌表達(dá)載體pBVA20及其轉(zhuǎn)化的大腸桿菌DH5α(pBVA20)重組株和利用此菌株生產(chǎn)重組蛋白A的方法。此菌株所產(chǎn)生的可溶性重組蛋白A濃集于細(xì)菌胞間質(zhì)中，達(dá)到細(xì)菌可溶性蛋白總量的60－80％，以后只經(jīng)一步分子篩柱層析即可將rPA純化到90％以上純度，該菌株具有表達(dá)量高、成本低、表達(dá)產(chǎn)物易純化等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明將為獲得來源穩(wěn)定，價格便宜的重組蛋白A并用其制備多種抗體分離裝置提供一條切實(shí)可行的途徑。
文檔編號G01N33/577GK1524957SQ0314998
公開日2004年9月1日 申請日期2003年8月1日 優(yōu)先權(quán)日2003年2月26日
發(fā)明者吳小兵, 楊宇, 韋新桂 申請人:本元正陽基因技術(shù)股份有限公司