專利名稱：一種穩(wěn)定的新型即用型底物－dab顯色液的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于免疫組織化學(xué)領(lǐng)域，主要產(chǎn)品為穩(wěn)定的即用型底物-DAB顯色液。此底物-DAB溶液包含緩沖液(首推咪唑緩沖液)，過(guò)氧化氫底物，顯色的有機(jī)電子供體以及作為穩(wěn)定劑的碳水化合物電子供體。底物-DAB溶液具有完全的過(guò)氧化物活性。
背景技術(shù)：
過(guò)氧化物活性的檢測(cè)已被廣泛應(yīng)用于分析化學(xué)、生物化學(xué)和臨床化學(xué)中。在多數(shù)檢測(cè)中，過(guò)氧化物和顯色的電子供體與樣品中分析物反應(yīng)，此分析物可能是催化劑(如法醫(yī)樣品或糞便、尿液、血漿、血清中的亞鐵血紅素、血色素等)或與催化劑相關(guān)的物質(zhì)(酶標(biāo)過(guò)氧化物酶)。如果樣品中含有此分析物，則會(huì)發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)，并在幾秒到幾小時(shí)內(nèi)發(fā)生可見的顯色反應(yīng)。過(guò)氧化活性檢測(cè)也適用于固定在濾膜、細(xì)胞或組織切片、電泳凝膠、雜交斑點(diǎn)上分析物的定位分析。
免疫學(xué)或核酸檢測(cè)系統(tǒng)中常用的酶標(biāo)記為辣根過(guò)氧化物酶(HRP)，在過(guò)氧化氫(H2O2)存在情況下，HRP催化苯酚、萘酚、胺、二胺或其它可以產(chǎn)生在光學(xué)和電子顯微鏡及比色法或肉眼下可見顯色底物的化合物。HRP可以將2個(gè)過(guò)氧化氫分子分解成氧氣和水，在這一反應(yīng)中，首先HRP將一對(duì)電子供給過(guò)氧化氫分子，接著HRP從合適的有機(jī)供體中得到電子，反應(yīng)完成時(shí)HRP-有機(jī)供體復(fù)合體可以在反應(yīng)部位形成可溶性的或不可溶沉淀。

發(fā)明內(nèi)容
(一)發(fā)明目的目前常規(guī)分析方法的不足之處是自動(dòng)化的氧化反應(yīng)，即檢測(cè)到的過(guò)氧化物活性可能是過(guò)氧化物與有機(jī)電子供體在加入催化酶之前就直接反應(yīng)造成的“背景”，使指示劑的有效時(shí)間限制在幾小時(shí)內(nèi)；這種氧化反應(yīng)還可能是染色液和痕量氧化劑如過(guò)渡態(tài)金屬造成的污染。因此本發(fā)明的目的就是提供穩(wěn)定的底物—顯色液復(fù)合物，以適于可見、熱計(jì)量、分光光度、反射計(jì)分析；并且還提供了這些穩(wěn)定底物—顯色液復(fù)合物的使用方法。
(二)發(fā)明優(yōu)勢(shì)常規(guī)方法的顯色液與底物分開存放，測(cè)試時(shí)要將底物—顯色液預(yù)先混合。與之相比，本發(fā)明為穩(wěn)定的底物—顯色液復(fù)合物，既節(jié)省儲(chǔ)存空間，又縮短檢測(cè)時(shí)間，同時(shí)提高檢測(cè)的靈敏度及可靠性；而且DAB為誘癌物質(zhì)，本發(fā)明的產(chǎn)品避免了操作人員與DAB的直接接觸，降低了危害性。

發(fā)明內(nèi)容詳述本發(fā)明包括緩沖體系(pH3-8)、顯色電子供體以及作為穩(wěn)定劑的碳水化合物形式電子供體以及一個(gè)聚合物。
碳水化合物電子供體可以從下列物質(zhì)中挑選單糖、二糖、多糖，它們可以抑制顯色電子供體的自動(dòng)氧化活性。
底物緩沖液的pH在3-8之間，采用咪唑或者含咪唑的其它緩沖液混合物；盡管不同的過(guò)氧化物分析可在較寬的pH范圍內(nèi)進(jìn)行，但大部分HRP分析的最佳pH值在4-6之間。在聚合物存在時(shí)，咪唑-HCl由于對(duì)顯色電子供體的溶解能力強(qiáng)以及在pH5.0-7.8之間的強(qiáng)緩沖能力而成為理想的緩沖液；而且咪唑能提高DAB的氧化能力，它的終濃度在1-500mM尤其是50mM時(shí)效果最佳。
聚合物是一類由重復(fù)的簡(jiǎn)單分子形成的高分子量分子，大多聚合物分子在加成聚合化反應(yīng)中形成碳碳間烯鍵。在底物溶液中加入聚合物可以提高顯色電子供體的溶解性并降低其自發(fā)氧化反應(yīng)。首推聚合物是聚乙烯乙二醇PEG或丙烯乙二醇PG，終濃度在1-1000mM.之間。
由于強(qiáng)溶解力及無(wú)毒性，本發(fā)明建議采用過(guò)氧化氫和脲過(guò)氧化氫作為過(guò)氧化物，終濃度在0.1-10mM之間，它們的靈敏度高于烷基過(guò)氧化氫。
具體實(shí)施例方式
(一)底物-DAB復(fù)合物配方工作濃度50mM咪唑，pH6.0，含有7.5mM PEG(分子量3350)，2.94mM H2O2和2.77mMDAB-4HCl以及10mM木糖。
一般配制儲(chǔ)備液(20×，100mL的pH7.5、0.5M Tris-HCl溶液)6.8g咪唑，終濃度1M2.51g PEG(分子量3350)，終濃度7.5mM2g DAB-4HCl，終濃度55.4mM150mg木糖，終濃度10mMH2O2(20×)儲(chǔ)備液0.45％H2O2溶液(二)免疫組化檢測(cè)免疫組化檢測(cè)時(shí)，完成樣品的HRP試劑孵育并沖洗樣品后，即可用本發(fā)明產(chǎn)品進(jìn)行顯色1.H2O2與底物—DAB復(fù)合物等比例混勻。該溶液避光保存，30分鐘內(nèi)有效。
2.第一步制備的溶液覆蓋樣品，孵育4-10分鐘，顯微鏡下觀察染色結(jié)果，為棕黃色。
(三)結(jié)果免疫組化分析結(jié)果顯示，基于底物—DAB復(fù)合物的顯色法比傳統(tǒng)的DAB顯色法簡(jiǎn)捷、快速、具有更高的檢測(cè)靈敏度及可靠性。
權(quán)利要求
1.本發(fā)明涉及到免疫組化分析的顯色反應(yīng)，可以用于免疫組織化學(xué)分析以及Western雜交分析。此底物-DAB溶液包含緩沖液(首推咪唑緩沖液，pH3-8)，過(guò)氧化氫底物，顯色的有機(jī)電子供體，作為穩(wěn)定劑的碳水化合物電子供體以及一個(gè)聚合物。其特色為碳水化合物電子供體及聚合物的加入，降低了顯色電子供體的自動(dòng)氧化活性，提高顯色電子供體的溶解性。
全文摘要
本發(fā)明屬于免疫組織化學(xué)領(lǐng)域，鑒于目前顯色溶液不穩(wěn)定且易污染、對(duì)人體有傷害，本發(fā)明采用新型底物－DAB顯色液。此顯色液包含緩沖液(首推咪唑緩沖液)，過(guò)氧化氫底物，顯色的有機(jī)電子供體，作為穩(wěn)定劑的碳水化合物電子供體以及一個(gè)聚合物。其中聚合物用于提高顯色電子供體的溶解性并降低其自發(fā)氧化反應(yīng)。本發(fā)明可以用于免疫組化分析或核酸雜交分析。基于底物－DAB復(fù)合物的顯色法與傳統(tǒng)的DAB顯色法相比，具有穩(wěn)定簡(jiǎn)捷、高靈敏度及可靠性。
文檔編號(hào)G01N33/535GK1595150SQ0315089
公開日2005年3月16日 申請(qǐng)日期2003年9月10日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月10日
發(fā)明者肖國(guó)偉 申請(qǐng)人:上海長(zhǎng)島生物技術(shù)有限公司