專利名稱：跨膜型和分泌型HIV Gag 抗原編碼基因及包含其的艾滋病疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及跨膜型和分泌型HIV Gag抗原編碼基因，包含其的艾滋病疫苗及免疫試劑盒。本發(fā)明的DNA疫苗能夠誘導(dǎo)高水平的抗人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。
背景技術(shù)：
盡管人類與艾滋病的斗爭(zhēng)已經(jīng)持續(xù)了20多年，但艾滋病仍然在全世界，尤其是發(fā)展中國(guó)家蔓延，對(duì)社會(huì)和經(jīng)濟(jì)產(chǎn)生了很大的負(fù)面影響。艾滋病是非洲的首要死因，也是全世界的第四大死因。WHO估計(jì)全世界每天會(huì)增加16000個(gè)新病例，未來10年將會(huì)有1億人感染HIV(AIDS epidemic update.GenevaUNAIDS，December 2002.Http//www.unaids.org/epidemic_update/)。
雖然雞尾酒療法在發(fā)達(dá)國(guó)家取得了較好的效果，但其副作用很大，且價(jià)格昂貴，無法在發(fā)展中國(guó)家普及?？刂瓢滩×餍械淖詈貌呗匀匀皇茄兄瞥霭踩行Я畠r(jià)的疫苗。
盡管在1981年第一例艾滋病報(bào)告以后的4年內(nèi)，人們就成功地對(duì)其進(jìn)行了組織培養(yǎng)(Barre-Sinoussi，F(xiàn).et al.Science 220，868-871，1983；Popovic，M.et al.Science 224，497-500，1984)和全基因測(cè)序(Ratner，L.et al.Nature 313，277-284，1985)，但是20多年來，艾滋病疫苗的研究卻是進(jìn)展遲緩。這是因?yàn)槿祟惷庖呷毕莶《?HIV)的一些不利于疫苗研制的特點(diǎn)，給疫苗研制提出了新的挑戰(zhàn)。這些特點(diǎn)包括機(jī)體難以產(chǎn)生針對(duì)HIV的具有廣泛交叉反應(yīng)的有效中和抗體(Kwong，P.D.etal.Nature 393，648-659，1998；Parren，P.W.et al.AIDS 13，S137-S162，1999)；HIV可以在感染早期形成前病毒DNA而逃避免疫系統(tǒng)；HIV具有高變異性(Finzi，D.et al.Cell 93，665-671，1998；McCutchan，F(xiàn).E.AIDS 14，S31-S44，2000)等。而且到目前為止，對(duì)HIV感染的免疫保護(hù)機(jī)理仍不是太清楚，也阻礙了對(duì)艾滋病疫苗的合理設(shè)計(jì)。
HIV雖然不在B細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制，卻可以通過病毒蛋白的毒性和細(xì)胞因子失調(diào)而使B細(xì)胞功能紊亂(Patke CL，et al.J Allergy ClinImmunol，105975-82，2000)，降低B細(xì)胞的數(shù)量，多克隆激活B細(xì)胞，增加非特異性免疫球蛋白G、A和M的產(chǎn)生，喪失特異性抗體反應(yīng)功能(Shirai A，et al.J Clin Invest，89561-6，1992；Yarchoan R，et al.JClin Inv，78439-47，1986)。
盡管減毒活疫苗可以誘導(dǎo)高水平的細(xì)胞免疫和體液免疫應(yīng)答，是過去最成功的疫苗形式，但減毒HIV疫苗安全性問題尚未解決，所以目前的研究主要集中在尋找其他形式的替代疫苗。病毒活載體疫苗和DNA疫苗都既可以誘導(dǎo)細(xì)胞免疫，又可以誘導(dǎo)體液免疫反應(yīng)，成為近年來研究的焦點(diǎn)。而DNA疫苗由于具有更好的安全性、構(gòu)建周期更短、生產(chǎn)更簡(jiǎn)單、成本更低、無載體免疫原性、儲(chǔ)存更簡(jiǎn)單、無需冷鏈等諸多優(yōu)點(diǎn)而更被人們看好(Lai WC，et al.Crit Rev Immunol，18449-84，1998)。
雖然DNA疫苗具備了優(yōu)秀的潛質(zhì)，但目前大多數(shù)DNA疫苗誘導(dǎo)免疫反應(yīng)(尤其在人類和靈長(zhǎng)類動(dòng)物)的能力較低，限制了它發(fā)揮更大的作用。所以，對(duì)DNA疫苗進(jìn)行優(yōu)化，使其能夠誘導(dǎo)足夠強(qiáng)大的免疫反應(yīng)，是尤為迫切的重要課題。
HIV-1 Gag是最保守的病毒蛋白之一。在HIV-1感染者身上檢測(cè)到了識(shí)別Gag表位的廣泛交叉反應(yīng)性的CTL反應(yīng)(Durali，D.et al.J.Virol.723547-3553，1998.McAdam，S.et al AIDS 12571-579，1998.)，而研制安全有效的疫苗也有賴于誘導(dǎo)出針對(duì)象Gag一樣保守的HIV-1蛋白的CTL反應(yīng)和/或T輔助細(xì)胞反應(yīng)。所以針對(duì)性的優(yōu)化表達(dá)Gag的疫苗就顯得非常重要。本發(fā)明人從抗原基因修飾和免疫策略兩個(gè)方面對(duì)HIVgag DNA疫苗進(jìn)行了系統(tǒng)優(yōu)化，通過在天然Gag N端融合信號(hào)肽，使Gag蛋白得以分泌表達(dá)；再以分泌型Gag為基礎(chǔ)，在其C端融合膜錨肽，使其以跨膜形式表達(dá)，經(jīng)測(cè)試本發(fā)明取得了很好的結(jié)果。

發(fā)明內(nèi)容
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種經(jīng)修飾的編碼跨膜型HIV Gag抗原的基因，所述的基因由HIV gag基因和融合在其5’末端的信號(hào)肽編碼序列以及融合在其3’末端的膜錨編碼序列組成。在本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選實(shí)施方案中，所述的修飾基因具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種經(jīng)修飾的編碼分泌型HIV Gag抗原的基因，所述的基因由HIV gag基因和在其5’末端融合的信號(hào)肽編碼序列組成。在本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選實(shí)施方案中，所述的修飾基因具有SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。
根據(jù)本發(fā)明的又一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種包含編碼跨膜型HIVGag抗原的基因的DNA疫苗。在本發(fā)明這一方面的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述的DNA疫苗是質(zhì)粒形式的pDRVISV1.0-gagtm，其于2003年9月11日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏號(hào)CGMCC No.1002。
根據(jù)本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明涉及包含編碼分泌型HIV Gag抗原的基因的DNA疫苗。在本發(fā)明這一方面的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述的DNA疫苗是如圖2所示的質(zhì)粒形式的pDRVISV1.0-gags，其編碼序列也可以從保藏號(hào)CGMCC No.1002的培養(yǎng)物中得到。
根據(jù)本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的編碼跨膜型或分泌型HIV Gag抗原的基因的活病毒載體疫苗，所述的活病毒載體疫苗基于痘苗病毒、腺病毒或腺相關(guān)病毒。
根據(jù)本發(fā)明的再一方面，本發(fā)明還涉及一種免疫試劑盒，所述試劑盒包含多個(gè)容器和指示免疫程序的說明書，其中一個(gè)容器含有本發(fā)明的DNA疫苗，另一個(gè)容器含有編碼Gag抗原的痘苗病毒疫苗。


圖1示出分泌/跨膜基因修飾載體pBS-SK-Sig-TM的構(gòu)建圖。TM表示編碼流感病毒血凝素膜錨序列的DNA片段，Sig表示編碼免疫球蛋白信號(hào)肽的DNA片段。
圖2示出DNA疫苗載體pDRVISV1.0的結(jié)構(gòu)和DNA疫苗pDRVISV1.0-gagwt、pDRVISV1.0-gags和pDRVISV1.0-gagtm的構(gòu)建示意圖。其中，SV40 ELS表示SV40增強(qiáng)子序列，CMV E/P表示人巨細(xì)胞病毒立刻早期基因增強(qiáng)子/啟動(dòng)子，Exon1表示人巨細(xì)胞病毒立刻早期基因第1外顯子，Intron1表示人巨細(xì)胞病毒立刻早期基因第1內(nèi)含子，MCS表示供外源基因插入的多克隆位點(diǎn)，BGH Poly A表示牛生長(zhǎng)激素基因的多聚腺苷酸添加信號(hào)，colE1表示質(zhì)粒的colE1復(fù)制起始位點(diǎn)，Kan表示卡那霉素抗性基因。
圖3示出實(shí)施例1制備的四種DNA疫苗的酶切確認(rèn)分析結(jié)果，圖中泳道1為pDRVISV1.0-gagtm(NdeI)；泳道2為pDRVISV1.0-gags(NdeI)；泳道5為pDRVISV1.0-gagwt(EcoRI)。
圖4示出pDRVISV1.0-gagwt雙酶切鑒定分析，其中泳道1分子量標(biāo)記DL15000(購自大連寶生物工程有限公司)，泳道2pDRVISV1.0-gagwt(EcoRV+SalI)。
圖5示出pDRVISV1.0-gags雙酶切鑒定分析，其中泳道1分子量標(biāo)記DL15000+DGL2000(購自大連寶生物工程有限公司)；泳道2pDRVISV1.0-gags(EcoRV+SalI)。
圖6示出示出pDRVISV1.0-gagtm雙酶切鑒定分析，其中泳道1分子量標(biāo)記DL15000(購自大連寶生物工程有限公司)，泳道2pDRVISV1.0-gagtm(EcoRV+SalI)。
圖7示出流式細(xì)胞儀檢測(cè)跨膜型DNA疫苗抗原表達(dá)的結(jié)果。
圖8示出pDRVISV1.0-gagwt、pDRVISV1.0-gags和pDRVISV1.0-gagtm所誘導(dǎo)的小鼠血清中Gag特異性IgG抗體水平。
圖9示出痘苗病毒疫苗加強(qiáng)前后小鼠血清Gag特異性抗體滴度比較分析。
圖10示出DNA疫苗免疫后小鼠脾淋巴細(xì)胞細(xì)胞因子分泌水平。
圖11示出重組痘苗病毒加強(qiáng)免疫前后小鼠脾淋巴細(xì)胞細(xì)胞因子分泌水平。
圖12示出流式細(xì)胞儀檢測(cè)得到的本發(fā)明DNA疫苗免疫后分離小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞，在體外經(jīng)Gag表位肽刺激后，分泌IFN-γ的CD8+T淋巴細(xì)胞占脾臟總CD8+T淋巴細(xì)胞的比例。
具體實(shí)施例方式
為了更清楚地理解本發(fā)明，說明書中所使用的一些術(shù)語定義如下分泌型本發(fā)明所稱的分泌型HIV Gag抗原蛋白及其編碼基因是指該基因在天然HIV Gag抗原編碼區(qū)的上游有一段信號(hào)肽編碼序列，該信號(hào)肽序列可以引導(dǎo)Gag抗原分泌到胞外。
跨膜型本發(fā)明所稱的跨膜型HIV Gag抗原蛋白及其編碼基因是指該基因在天然Gag抗原編碼區(qū)的上游有一段信號(hào)肽編碼序列，在天然Gag抗原編碼區(qū)的下游有一段膜錨編碼序列，該信號(hào)肽序列和膜錨序列可以引導(dǎo)Gag抗原以跨膜蛋白的形式錨定于細(xì)胞膜表面。
DNA疫苗DNA疫苗又稱DNA免疫、基因疫苗、核酸疫苗或裸露的DNA，是指把攜帶抗原基因的DNA分子導(dǎo)入體內(nèi)，通過抗原基因體內(nèi)表達(dá)產(chǎn)物誘導(dǎo)抗原特異性免疫反應(yīng)的一類疫苗的總稱。
膜錨序列主要由疏水性氨基酸組成的跨膜蛋白特有的特征性序列，該序列與細(xì)胞膜通過疏水性相互作用，把含有該序列的膜蛋白錨定于細(xì)胞膜上。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，本發(fā)明特別涉及一種編碼跨膜型HIVGag抗原的基因，所述的基因由HIV gag基因和融合在其5’末端的信號(hào)肽編碼序列以及融合在其3’末端的膜錨編碼序列組成。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明特別涉及一種編碼分泌型HIVGag抗原的基因，所述的基因由HIV gag基因和在其5’末端融合的信號(hào)肽編碼序列組成。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)方面，本發(fā)明特別涉及一種包含本發(fā)明的編碼跨膜型HIV Gag抗原的基因的DNA疫苗。
根據(jù)本發(fā)明的再一個(gè)方面，本發(fā)明特別涉及一種包含本發(fā)明的編碼分泌型HIV Gag抗原的基因的DNA疫苗。
本發(fā)明的DNA疫苗中包含的gag基因可以是天然gag基因，但優(yōu)選地是一種合成基因，其蛋白質(zhì)產(chǎn)物的氨基酸序列與在中國(guó)很多地區(qū)流行的B’/C重組毒株CN54的Gag氨基酸序列一致，但是該gag基因序列根據(jù)哺乳動(dòng)物遺傳密碼使用頻率的偏愛性進(jìn)行優(yōu)化，并且在其起始密碼子前引入優(yōu)化的Cozak序列，使其在真核細(xì)胞內(nèi)的翻譯表達(dá)效率大大提高，所述合成gag基因序列可在保藏克隆CGMCCNo.1003中獲得。
本發(fā)明DNA疫苗中包含的如上所述信號(hào)肽編碼序列可以是本領(lǐng)域已知的任何合適的信號(hào)肽編碼序列，包括例如但不限于免疫球蛋白基因家族、細(xì)胞因子基因家族、人組織相容性復(fù)合物基因家族、白細(xì)胞分化抗原基因家族和病毒膜蛋白基因的信號(hào)肽。優(yōu)選地，所述信號(hào)肽編碼序列是全長(zhǎng)免疫球蛋白信號(hào)肽編碼序列(氨基酸序列為MVLQTQVFISLLLWISGAYG(SEQ ID NO12)。
根據(jù)本發(fā)明，本發(fā)明DNA疫苗中包含的編碼跨膜型Gag抗原的基因中的膜錨序列可以是本領(lǐng)域已知的任何合適的膜錨編碼序列，包括例如但不限于流感病毒血凝素基因、免疫球蛋白基因家族、人組織相容性復(fù)合物基因家族、白細(xì)胞分化抗原基因家族和其它病毒膜蛋白基因的膜錨編碼序列。優(yōu)選地，所述膜錨編碼序列是流感病毒血凝素蛋白的膜錨編碼序列(氨基酸序列為ILWSFAISCFLLCVVLLGFIMWACQRGNIRCNICI(SEQ ID NO13))。
在本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的編碼跨膜型Gag抗原的基因由合成的gag基因和在其5’末端融合的免疫球蛋白信號(hào)肽編碼序列以及在其3’末端融合的流感病毒血凝素膜錨編碼序列組成，稱為gagtm，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。
在本發(fā)明的另一個(gè)特別優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的編碼分泌型Gag抗原的基因由合成的gag基因和在其5’末端融合的免疫球蛋白信號(hào)肽編碼序列組成，稱為gags，其核苷酸序列如SEQ ID NO2所示。
本發(fā)明的DNA疫苗可以基于本領(lǐng)域已知的任何合適的DNA疫苗載體而構(gòu)建。所述的載體包括但不限于pcDNA系列(Invitrogen)、pVAX系列(Invitrogen)優(yōu)選地，所述載體為本發(fā)明人構(gòu)建的pDRVISV1.0，其結(jié)構(gòu)示意圖如圖2中所示。
根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選的DNA疫苗為pDRVISV1.0-gagtm，其以在大腸埃希氏菌菌株Top10中的形式于2003年9月11日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏號(hào)為CGMCC No.1002。經(jīng)測(cè)試，其誘導(dǎo)細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答的能力較包含天然形式gag基因的DNA疫苗大大增強(qiáng)。另外，本發(fā)明的DNA疫苗pDRVISV1.0-gagtm免疫的小鼠的脾細(xì)胞經(jīng)Gag P55抗原體外刺激后分泌γ-干擾素的水平也顯著高于pDRVISV1.0-gagwt。如下文實(shí)施例中所證實(shí)的，在用痘苗病毒加強(qiáng)免疫后，DNA疫苗pDRVISV1.0-gagtm免疫的小鼠的脾臟CD8+T細(xì)胞中產(chǎn)生γ-干擾素的細(xì)胞的比例顯著高于DNA疫苗pDRVISV1.0-gagwt所免疫的小鼠。pDRVISV1.0-gagtm所誘導(dǎo)的Gag特異的IgG滴度顯著高于pDRVISV1.0-gagwt所誘導(dǎo)的Gag特異的IgG滴度。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)特別優(yōu)選的DNA疫苗為pDRVISV1.0-gags，如圖2所示。經(jīng)測(cè)試，其誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答的能力較包含天然形式gag基因gagwt的DNA疫苗大大增強(qiáng)，pDRVISV1.0-gags所誘導(dǎo)的Gag特異的IgG滴度顯著高于pDRVISV1.0-gagwt所誘導(dǎo)的Gag特異的IgG滴度。
本發(fā)明的DNA疫苗可以配制成適于各種免疫接種方式的免疫組合物形式，包括適于比較傳統(tǒng)的注射免疫(肌肉注射、皮內(nèi)注射)、粘膜免疫(口服或鼻內(nèi)接種)等的免疫組合物；以及適于比較新的接種方式有肌肉注射加瞬時(shí)電擊、基因槍粒子轟擊等的免疫組合物。
還應(yīng)理解的是，本發(fā)明的分泌型或跨膜型HIV Gag抗原基因可以不僅包含在DNA疫苗中，它們也能夠被應(yīng)用于任何合適的活病毒載體疫苗，例如包括但不限于痘苗病毒、腺病毒或腺相關(guān)病毒中。這種應(yīng)用方式屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員的技術(shù)范疇。
另外，如下文實(shí)施例所證實(shí)的，本發(fā)明的DNA疫苗可以與表達(dá)Gag抗原的重組痘苗病毒聯(lián)合用于所謂的初始免疫—加強(qiáng)策略(prime-boost)中，即本發(fā)明的DNA疫苗用于初始免疫，之后用所述重組痘苗病毒進(jìn)行加強(qiáng)，如此免疫后獲得了更為優(yōu)異的效果。因此，本發(fā)明還包括一種免疫試劑盒，其包含本發(fā)明的DNA疫苗和重組痘苗病毒，以及免疫程序說明書。
以下將參照實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)的描述，應(yīng)理解的是所述實(shí)施例僅僅是舉例示出本發(fā)明，并非限制本發(fā)明。
實(shí)施例1編碼野生型、分泌型和跨膜型Gag抗原的DNA疫苗pDRVISV1.0-gagwt、pDRVISV1.0-gags和pDRVISV1.0-gagtm的構(gòu)建題述DNA疫苗的構(gòu)建示意圖如圖2所示，以下詳細(xì)闡明了構(gòu)建步驟。
1、免疫球蛋白信號(hào)肽序列的獲得設(shè)計(jì)合成一條全長(zhǎng)負(fù)鏈引物和一條正向引物，延伸得到全長(zhǎng)免疫球蛋白信號(hào)肽編碼序列。所述全長(zhǎng)負(fù)鏈引物為synIgSigPep，其序列為5’-ACGTGATATCATGGAATTCCATATGCTCCGGAGATCCACAGCAGGAGGCTGATGAACACCTGGGTCTGGAGCACCATGGTGGCGGCGTCGACGCGTAC-3’(第一處下劃線表示限制性內(nèi)切酶EcoRV識(shí)別位點(diǎn)，第二處下劃線表示限制性內(nèi)切酶NdeI識(shí)別位點(diǎn))(SEQ IDNO4)；所述正向引物為Ig-sigpep5，其序列為5’-GTACGCGTCGACGCCGCCACCATG-3’(下劃線處表示限制性內(nèi)切酶SalI識(shí)別位點(diǎn))(SEQ ID NO5)。
PCR反應(yīng)采用大連寶生物工程有限公司的試劑盒，反應(yīng)體系如下synIgSigPep(50μM) 10μlIg-sigpep5 (50μM) 10μl10×Pyrobest緩沖液 5μldNTP混合物(各2.5mM) 5μlPyrobest DNA聚合酶(5U/ml) 0.5μlddH2O 19.5μlPCR反應(yīng)條件94℃預(yù)變性2min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，共10個(gè)循環(huán)；72℃7min；4℃。
延伸產(chǎn)物用Omega公司的E.Z.N.A Cycle-Pure Kit進(jìn)行純化回收，回收產(chǎn)物用Takara公司EcoR V+SalI共酶切。用Omega公司E.Z.N.A.Gel Extraction Kit進(jìn)行電泳純化回收，-20℃保存待用。
2、流感病毒血凝素膜錨編碼序列的獲得從質(zhì)粒pcDNA3-VP7TM(劉勇等，白求恩醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，26(4)440-4，2000)通過PCR獲取流感病毒血凝素蛋白的膜錨編碼序列。PCR所用引物如下正向引物HATM55’-CGGGATCCgccatcctgtggatatccttcgc-3’(下劃線表示限制性內(nèi)切酶BamHI識(shí)別位點(diǎn))(SEQ ID NO6)反向引物HATM3；5’-gctctagaAtcagatgcagatattacagcggatg-3’(下劃線表示限制性內(nèi)切酶XbaI識(shí)別位點(diǎn))(SEQ ID NO7)PCR反應(yīng)體系10×Pyrobest緩沖液 5μldNTP混合物(各2.5mM) 5μlHATM5(50μM) 0.5μlHATM3(50μM) 0.5μlpcDNA3-VP7TM 0.5μlPyrobest DNA聚合酶(5U/ml)0.5μlddH2O38μlPCR反應(yīng)條件94℃預(yù)變性2min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，共4個(gè)循環(huán)；94℃30s，68℃30s，共35個(gè)循環(huán)；72℃7min；4℃。
延伸產(chǎn)物用Omega公司的E.Z.N.A Cycle-Pure Kit進(jìn)行純化回收，回收產(chǎn)物用Takara公司XbaI+BamHI共酶切。用Omega公司E.Z.N.A.Gel Extraction Kit進(jìn)行電泳純化回收，-20℃保存待用。
3、分泌/跨膜基因修飾載體pBS-SK-Sig-TM的構(gòu)建將上述1和2節(jié)獲得的免疫球蛋白信號(hào)肽編碼序列和流感病毒血凝素膜錨編碼序列分別以SalI-EcoRV和BamHI-XbaI片段的形式插入克隆載體pBluescript-SK(Stratagene公司產(chǎn)品)的相應(yīng)酶切位點(diǎn)，得到分泌/跨膜基因修飾載體pBS-SK-Sig-TM(圖1)。
4、gag基因的克隆和修飾以HIV-1 B’/C重組亞型中國(guó)流行毒株的全基因合成克隆pCRScript-gpnef(CGMCC保藏克隆No.1003)為模板，從中直接擴(kuò)增gag基因。pCRScript-gpnef由本發(fā)明人與德國(guó)雷根斯堡大學(xué)微生物研究所共同構(gòu)建，其遺傳密碼根據(jù)哺乳動(dòng)物的偏愛密碼進(jìn)行了優(yōu)化。PCR擴(kuò)增所用引物為gagwt5SalI5’-ACGCGTCGACGCCGCCACCATGGCCGCCAGGGCCAGCATC-3’(SEQ ID NO8)(下劃線為限制性內(nèi)切酶SalI識(shí)別位點(diǎn))gag5-Igsigpep5’-GGAATTCCATATGGAGCCGCCAGGGCCAGCATCCTG-3’(SEQ ID NO9)(下劃線為限制性內(nèi)切酶NdeI識(shí)別位點(diǎn))gags3 EcoRV5’-ACGTGATATCTCACTGGCTGCTGGGGTCGTTGCC-3’(SEQ ID NO10)(下劃線為限制性內(nèi)切酶EcoRV識(shí)別位點(diǎn))gagtm3BamHI5’-CGGGATCCCTGGCTGCTGGGGTCGTTGCC-3’(SEQ IDNO11)(下劃線為限制性內(nèi)切酶BamHI識(shí)別位點(diǎn))5、野生型Gag蛋白編碼基因gagwt的PCR擴(kuò)增以pCRScript-gpnef為模板，上述gagwt5SalI和gags3EcoRV為引物PCR擴(kuò)增野生型Gag蛋白編碼基因gagwt。用Omega公司的E.Z.N.A Cycle-Pure Kit進(jìn)行純化回收，EcoRV和SalI進(jìn)行共酶切，酶切產(chǎn)物用OMEGA公司E.Z.N.A.GEL EXTRACTION KIT進(jìn)行電泳純化回收，-20℃保存待用。
6、跨膜型Gag的編碼基因gagtm的構(gòu)建以pCRScript-gpnef為模板，上述gag5-Igsigpep和gagtm3BamHI為引物PCR擴(kuò)增gag-NdeI-BamHI。
PCR反應(yīng)體系10×Pyrobest緩沖液5μldNTP混合物(各2.5mM) 5μlgag5-Igsigpep(50μM) 0.5μlgagtm3BamHI(50μM)0.5μlpCRScript-gpnef 0.5μlPyrobest DNA聚合酶(5U/ml) 0.5μlddH2O 38μlPCR反應(yīng)條件94℃預(yù)變性5min；94℃30s，60℃30s，72℃2min，共4個(gè)循環(huán)；94℃30s，68℃2min，共35個(gè)循環(huán)；72℃7min；4℃。
PCR擴(kuò)增所得目的片段gag-NdeI-BamHI，用Omega公司的E.Z.N.A Cycle-Pure Kit進(jìn)行純化回收，BamHI和NdeI進(jìn)行共酶切。酶切產(chǎn)物用OMEGA公司E.Z.N.A.GEL EXTRACTION KIT進(jìn)行電泳純化回收，-20℃保存待用。
用BamHI+NdeI酶切質(zhì)粒pBS-SK-Sig-TM，回收以后與上述酶切回收產(chǎn)物gag-NdeI-BamHI連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10(Invitrogen公司)，涂布于含氨芐青霉素的LB平板篩選獲得陽性克隆，用限制性內(nèi)切酶NdeI+NotI酶切分析鑒定。該陽性克隆命名為pBS-SK-Sig-TM-gag-NdeI-BamHI。XbaI+SalI酶切質(zhì)粒pBS-SK-Sig-TM-gag-NdeI-BamHI，回收小片段得到gagtm基因，-20℃保存待用。
7、分泌型Gag的編碼基因gags的構(gòu)建以pCRScript-gpnef為模板，以上述gag5-Igsigpep和gags3EcoRV為引物擴(kuò)增得到gag-NdeI-EcoRV。
PCR反應(yīng)體系10×Pyrobest緩沖液 5μldNTP混合物(各2.5mM) 5μlgag5-Igsigpep(50μM)0.5μlgags3EcoRV(50μM) 0.5μlpCRScript-gpnef 0.5μlPyrobest DNA聚合酶(5U/ml) 0.5μlddH2O 38μlPCR反應(yīng)條件94℃預(yù)變性5min；94℃30s，60℃30s，72℃2min，共4個(gè)循環(huán)；94℃30s，68℃2min，共35個(gè)循環(huán)；72℃7min；4℃。
擴(kuò)增產(chǎn)物用Omega公司的E.Z.N.A Cycle-Pure K進(jìn)行純化回收，-20℃保存待用。
分別用NdeI單酶切g(shù)ag-NdeI-EcoRV和pBS-SK-Sig-TM，經(jīng)E.Z.N.A Cycle-Pure Kit進(jìn)行純化回收。將回收產(chǎn)物gag-NdeI-EcoRV和pBS-SK-Sig-TM用T4 DNA連接酶(New England Biolabs公司)連接過夜。之后以Ig-sigpep5和gags3EcoRV為引物，以連接產(chǎn)物為模板PCR擴(kuò)增得到gags基因。用OMEGA公司E.Z.N.A.GELEXTRACTION KIT進(jìn)行電泳純化回收擴(kuò)增產(chǎn)物后，用EcoRV+SalI酶切，純化回收后-20℃保存待用。
8、DNA疫苗質(zhì)粒pDRVISV1.0-gagwt、pDRVISV1.0-gags和pDRVISV1.0-gagtm的獲得對(duì)真核表達(dá)質(zhì)粒載體pDRVISV1.0做如下酶切pDRVISV1.0 EcoRV+SalI
pDRVISV1.0 XbaI+SalI電泳純化回收酶切產(chǎn)物，-20℃保存待用。
用New England Biolabs公司的T4 DNA連接酶對(duì)上面得到的酶切片段做如下連接pDRVISV1.0+gagwtpDRVISV1.0+gagspDRVISV1.0+gagtm連接產(chǎn)物分別轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌Top10，涂含氨芐青霉素的LB平板，37℃培養(yǎng)12-16小時(shí)。提取質(zhì)粒，用相應(yīng)限制性內(nèi)切酶酶切分析鑒定，陽性克隆分別命名為pDRVISV1.0-gagwt，pDRVISV1.0-gagtm，pDRVISV1.0-gags，酶切鑒定結(jié)果分別參見圖3至圖6。測(cè)序證實(shí)所述DNA疫苗相應(yīng)含有基因gagwt、gagtm或gags，沒有引入突變。這三個(gè)基因的序列分別如SEQ ID NO1(gagtm基因)、SEQ ID NO2(gags基因)和SEQ ID NO3(gagwt基因)所示。
實(shí)施例2 DNA疫苗pDRVISV1.0-gagwt、pDRVISV1.0-gags和pDRVISV1.0-gagtm在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)Gag抗原的檢測(cè)1、在293T細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)和檢測(cè)所用方法參見分子克隆實(shí)驗(yàn)手冊(cè)第2版所述，具體地，用所述四種DNA疫苗質(zhì)粒轉(zhuǎn)染(轉(zhuǎn)染試劑為Invitrogen公司的Lipofectamine2000，轉(zhuǎn)染方法參照試劑盒說明書)哺乳動(dòng)物細(xì)胞293T(美國(guó)典型培養(yǎng)物中心，ATCC)，48小時(shí)后收獲細(xì)胞和上清，用抗Gag蛋白的鼠源單抗AG3.0(美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院艾滋病研究和參比試劑項(xiàng)目提供)進(jìn)行Western Blot分析，在P55的分子量處出現(xiàn)了特異的反應(yīng)條帶，說明所構(gòu)建的DNA疫苗質(zhì)粒都可以在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)正確的表達(dá)目的基因。另外，pDRVISV1.0-gagtm在細(xì)胞沉淀檢測(cè)到了大量的目的蛋白，而在上清中沒有檢測(cè)到；而pDRVISV1.0-gags只在上清中檢測(cè)到了目的蛋白，在細(xì)胞沉淀中沒有檢測(cè)到，說明對(duì)它們進(jìn)行的分泌修飾是成功的。
2、跨膜表達(dá)形式質(zhì)粒pDRVISV1.0-gagtm在Hela細(xì)胞中的瞬時(shí)表達(dá)、細(xì)胞表面Gag特異性染色和流式細(xì)胞儀檢測(cè)為了進(jìn)一步驗(yàn)證跨膜表達(dá)方式的DNA疫苗質(zhì)粒在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的正確性，我們將DNA疫苗質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，48小時(shí)后進(jìn)行細(xì)胞表面Gag特異性熒光染色，并用流式細(xì)胞儀進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果沒有轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞檢測(cè)陽性率基本為0，而轉(zhuǎn)染了跨膜表達(dá)方式DNA疫苗質(zhì)粒的細(xì)胞陽性率為15.6％，說明跨膜表達(dá)方式DNA疫苗質(zhì)粒也在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中得到了正確表達(dá)。如圖7所示。實(shí)施例3動(dòng)物免疫檢測(cè)DNA疫苗及DNA疫苗初始免疫與重組痘苗病毒加強(qiáng)免疫的效力本例中使用無菌飼養(yǎng)的6-8周齡BALB/c(H-2d)雌性小鼠(體重19-25克，購自中國(guó)藥品生物制品檢定所)檢測(cè)本發(fā)明DNA疫苗的效力。實(shí)施例1制備的各DNA疫苗用1×PBS制備成1mg/ml的注射液。每種免疫組含10只小鼠。免疫前24小時(shí)每只小鼠左右后肢脛骨前肌各注射50ul 25％(w/v)蔗糖高滲溶液以增加肌肉細(xì)胞的通透性，提高攝取質(zhì)粒效率，同時(shí)，蔗糖還有一定的佐劑的作用。蔗糖處理24小時(shí)后，脛骨前肌注射DNA 100ug/只(每后肢50ug)。每間隔2周以同樣劑量加強(qiáng)免疫3次。第8周時(shí)每組取5只鼠，取血清及脾淋巴細(xì)胞檢測(cè)抗體以及細(xì)胞因子。每組剩下的5只小鼠用表達(dá)Gag的重組痘苗病毒rVV-RL42gag(劉錦彥等，病毒學(xué)報(bào)，18(1)9-14，2002)加強(qiáng)，107pfu/鼠。在第12周時(shí)取血清及脾淋巴細(xì)胞檢測(cè)抗體以及細(xì)胞因子。對(duì)照使用pDRVISV1.0空載體、不插入目的基因的痘苗病毒天壇株(天花疫苗，由北京生物制品所惠贈(zèng))以及空白鼠對(duì)照。
相關(guān)實(shí)驗(yàn)及結(jié)果如下1、血清Gag特異性抗體IgG水平的檢測(cè)為檢測(cè)不同DNA疫苗單獨(dú)免疫及重組痘苗病毒加強(qiáng)免疫所誘導(dǎo)的特異性體液免疫水平，在第四次DNA加強(qiáng)免疫后兩周及重組痘苗病毒加強(qiáng)免取小鼠血清，用Gag P55抗原(美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院艾滋病研究和參比試劑項(xiàng)目惠贈(zèng))包被酶標(biāo)板，間接ELISA法進(jìn)行Gag特異性IgG抗體水平的檢測(cè)。各免疫組Gag特異性IgG抗體滴度列于表1。
表1各免疫組Gag特異性IgG抗體滴度

*表中數(shù)值均為幾何均值在上述pDRVISV1.0-gagwt、pDRVISV1.0-gags和pDRVISV1.0-gagtm的比較分析中，這三種DNA疫苗所誘導(dǎo)的IgG的抗體滴度從高至低依次為pDRVISV1.0-gags，pDRVISV1.0-gagtm和pDRVISV1.0-gagwt，其中pDRVISV1.0-gags所誘導(dǎo)的IgG的抗體滴度約為后兩者的3-4倍(P＜0.05)，說明Gag蛋白分泌表達(dá)使其誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答的能力大大增強(qiáng)，跨膜表達(dá)形式也增強(qiáng)了體液免疫應(yīng)答，但增強(qiáng)幅度較分泌表達(dá)形式小，詳見圖8。
為了確定痘苗加強(qiáng)對(duì)不同DNA疫苗的體液免疫應(yīng)答所產(chǎn)生的影響，檢測(cè)了免疫小鼠血清總IgG抗體水平。在痘苗加強(qiáng)免疫后4周取小鼠血清，用Gag P55抗原(美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院艾滋病研究和參比試劑項(xiàng)目惠贈(zèng))包被酶標(biāo)板，間接ELISA法進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明痘苗加強(qiáng)后對(duì)所有的DNA疫苗的體液免疫應(yīng)答都有明顯的增強(qiáng)作用，尤以跨膜型表達(dá)方式最為顯著，抗體滴度大約增強(qiáng)了5倍，如圖9所示。
2、血清Gag特異性IgG1、IgG2a亞類抗體水平的檢測(cè)為了確定所誘發(fā)的免疫應(yīng)答的類型，檢測(cè)了免疫小鼠血清中的Gag特異性IgG1和IgG2a亞類抗體的水平。在第四次DNA加強(qiáng)免疫后兩周及重組痘苗病毒加強(qiáng)后兩周取小鼠血清，用Gag P55抗原(美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院艾滋病研究和參比試劑項(xiàng)目惠贈(zèng))包被酶標(biāo)板，間接ELISA法進(jìn)行Gag特異性IgG1和IgG2a抗體水平的檢測(cè)。
在pDRVISV1.0-gagwt、pDRVISV1.0-gags和pDRVISV1.0-gagtm的比較分析中，分泌型表達(dá)方式(pDRVISV1.0-gags)誘導(dǎo)產(chǎn)生的IgG1、IgG2a水平相當(dāng)，IgG1稍高于IgG2a，說明分泌表達(dá)誘導(dǎo)的Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答和Th2型體液免疫應(yīng)答水平大體相當(dāng)；跨膜表達(dá)方式(pDRVISV1.0-gagtm)誘導(dǎo)產(chǎn)生的IgG2a遠(yuǎn)高于IgG1，IgG2a約為IgG1的4倍，說明跨膜表達(dá)方式誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答明顯傾向于Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答；未加修飾的Gag基因形成假病毒顆粒，誘導(dǎo)的IgG2a高于IgG1，IgG2a約為IgG1的2倍，說明其誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答傾向于Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答，但不如跨膜表達(dá)方式的傾向性強(qiáng)，見表2。
表2pDRVISV1.0-gags、pDRVISV1.0-gags和pDRVISV1.0-gags血清Gag特異性IgG亞類抗體水平及比值pDRVISV1.0-gagspDRVISV1.0-gagtmpDRVISV1.0-gagwtIgG1 1∶111430.5 1∶9189.6 1∶13928.8IgG2a 1∶97005.81∶42224.3 1∶21112.1IgG2a/IgG10.8 4.61.5另外，重組痘苗病毒加強(qiáng)免疫對(duì)分泌表達(dá)方式DNA疫苗的免疫應(yīng)答類型有較明顯的影響，IgG2a/IgG1由大約為1變?yōu)榇蠹s為2，既由Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答和Th2型體液免疫應(yīng)答大體相當(dāng)，轉(zhuǎn)變?yōu)閮A向于Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答，除此之外，對(duì)其它DNA疫苗的IgG2a和IgG1的比值，即免疫應(yīng)答類型沒有明顯的影響，見表3。
表3重組痘苗加強(qiáng)后血清Gag特異性IgG亞類抗體水平及比值pDRVISV1.0-pDRVISV1.0-gagtmpDRVISV1.0-gagwt/RVV /RVV/RVVIgG1 1∶84448.51∶55715.2 1∶32000IgG2a 1∶168897 1∶222860.9 1∶64000IgG2a/IgG12(0.8)4(4.6) 2(1.7)注表3括號(hào)內(nèi)數(shù)據(jù)表示痘苗病毒加強(qiáng)免疫之前的數(shù)據(jù)3、細(xì)胞因子的檢測(cè)為了確定所誘發(fā)的免疫應(yīng)答的類型，還對(duì)免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞所分泌產(chǎn)生的細(xì)胞因子IFN-γ和IL-4進(jìn)行了檢測(cè)。在第四次DNA加強(qiáng)免疫后兩周取小鼠脾淋巴細(xì)胞，用Gag P55抗原(美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院艾滋病研究和參比試劑項(xiàng)目惠贈(zèng))(10μg/ml)刺激脾淋巴細(xì)胞，72小時(shí)后取細(xì)胞培養(yǎng)上清，用ELISA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞因子分泌水平。
IL-4均低于檢測(cè)水平(10pg/ml)，對(duì)IFN-γ的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析表明DNA疫苗中，HIV gag基因不同表達(dá)方式誘導(dǎo)Th1型細(xì)胞因子的能力有很大的差異，跨膜表達(dá)方式(pDRVISV1.0-gagtm)誘導(dǎo)了最高水平的IFN-γ(518.9pg/ml)，野生型基因(pDRVISV1.0-gagwt)稍弱(375.6pg/ml)，分泌表達(dá)方式(pDRVISV1.0-gags)最弱(98.9pg/ml)，與預(yù)期結(jié)果一致(兩兩比較均有顯著性差異，P＜0.05)，如圖10所示。
在重組痘苗病毒加強(qiáng)免疫組中，IL-4仍然低于試劑盒檢測(cè)水平(10pg/ml)，對(duì)IFN-γ的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析表明痘苗疫苗對(duì)DNA疫苗Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答都有明顯的增強(qiáng)作用，但各組DNA疫苗間強(qiáng)度的比較沒有明顯的改變。分泌水平分別為pDRVISV1.0-gags(663.5pg/ml)；pDRVISV1.0-gagtm(1358.4pg/ml)；pDRVISV1.0-gagwt(1022.8pg/ml)，見圖11所示。
4、流式細(xì)胞儀檢測(cè)體外抗原表位肽刺激后分泌IFN-γ的CD8+T淋巴細(xì)胞CD8+T淋巴細(xì)胞是一種最重要的抗病毒效應(yīng)細(xì)胞，所以檢測(cè)了加強(qiáng)免疫后脾淋巴細(xì)胞中分泌IFN-γ的HIV-1 Gag特異性CD8+T淋巴細(xì)胞。脾淋巴細(xì)胞用MHC-I限制性HIV P55表位多肽(AMQILKDTI，由北京賽百盛公司合成)刺激12小時(shí)后，對(duì)細(xì)胞內(nèi)IFN-γ和CD8，CD3分子進(jìn)行染色，流式細(xì)胞儀(貝克曼·庫爾特公司產(chǎn)品)進(jìn)行分析。在用重組痘苗病毒加強(qiáng)免疫后，各組均檢測(cè)到了分泌IFN-γ的HIV-1 Gag特異性CD8+T淋巴細(xì)胞。在pDRVISV1.0-gagwt、pDRVISV1.0-gags和pDRVISV1.0-gagtm的比較分析中，pDRVISV1.0-gagtm初免組小鼠檢測(cè)到了最高水平的Gag特異性CD8+T淋巴細(xì)胞，pDRVISV1.0-gagwt初免組次之，而pDRVISV1.0-gags初免組最低，說明跨膜表達(dá)形式誘導(dǎo)了最強(qiáng)的CTL反應(yīng)，而分泌表達(dá)方式誘導(dǎo)的CTL反應(yīng)最弱，如圖12所示。
序列表<110>中國(guó)疾病預(yù)防控制中心性病艾滋病預(yù)防控制中心<120>分泌型和跨膜型HIV Gag抗原編碼基因及包含其的艾滋病疫苗<130>I20031333CB<160>13<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1670<212>DNA<213>人工序列<400>1atggtgctgc agacccaggt gttcatcagc ctcctgctgt ggatctccgg agcatatgga 60gccgccaggg ccagcatcct gaggggcggc aagctggaca agtgggagaa gatcaggctg 120aggcccggcg gcaagaagca ctacatgctg aagcacctgg tgtgggccag cagggagctg 180gagaggttcg ccctgaaccc cggcctgctg gagaccagcg agggctgcaa gcagatcatg 240aagcagctgc agagcgccct gcagaccggc accgaggagc tgaggagcct gttcaacacc 300gtggccaccc cctactgcgt gcacaccgag atcgacgtga gggacaccag ggaggccctg 360gacaagatcg aggaggagca gaacaagatc cagcagaaga cccagcaggc caaggaggcc 420gacggcaagg tgagccagaa ctaccccatc gtgcagaacc tgcagggcca gatggtgcac 480cagcccatca gccccaggac cctgaatgca tgggtgaagg tggtggagga gaaggccttc 540agccccgagg tgatccccat gttcagcgcc ctgagcgagg gcgccacccc tcaggacctg 600aacaccatgc tgaacaccgt gggcggccac caggccgcca tgcagatcct gaaggacacc 660atcaacgagg aggccgccga gtgggacagg ctgcaccccg tgcacgccgg ccccatcgcc 720cccggccaga tgagggagcc caggggcagc gacatcgccg gcaccaccag caacctgcag 780gagcagatcg cctggatgac cagcaaccca cccgtgcccg tgggcgacat ctacaagagg 840tggatcatcc tgggtttaaa caagatcgtg aggatgtaca gccccaccag catcctggac 900atcaagcagg gccccaagga gcccttcagg gactacgtgg acaggttctt caagaccctg 960agggccgagc aggccaccca gggcgtgaag aactggatga ccgacaccct gctggtgcag 1020aacgccaacc ccgactgcaa gaccatcctg agggccctgg gccccggcgc cagcatcgag 1080gagatgatga ccgcctgcca gggcgtgggc ggccccagcc acaaggccaa ggtgctggcc 1140gaggccatga gccagaccaa cagcgccatc ctgatgcaga ggagcaactt caagggcagc 1200aagaggatcg tgaagtgctt caactgcggc aaggagggcc acatcgccag gaatctcagg 1260gcccccagga agaagggctg ctggaagtgc ggcaaggagg gccaccagat gaaggactgc 1320
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ggaattccat atggagccgc cagggccagc atcctg 36<210>10<211>34<212>DNA<213>人工序列<400>10acgtgatatc tcactggctg ctggggtcgt tgcc34<210>11<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>11cgggatccct ggctgctggg gtcgttgcc 29<210>12<211>20<212>PRT<213>Homo sapiens<400>12Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser1 5 10 15Gly Ala Tyr Gly20<210>13<211>35<212>PRT<213>流感病毒<400>13Ile Leu Trp Ser Phe Ala Ile Ser Cys Phe Leu Leu Cys Val Val Leu1 5 10 15Leu Gly Phe Ile Met Trp Ala Cys Gln Arg Gly Asn Ile Arg Cys Asn20 25 30Ile Cys Ile3權(quán)利要求
1.一種編碼跨膜型HIV Gag抗原的基因，所述基因由gag基因和融合在其5’末端的信號(hào)肽編碼序列和融合在其3’末端的膜錨編碼序列組成。
2.如權(quán)利要求1所述的基因，其中所述的膜錨編碼序列選自流感病毒血凝素基因、免疫球蛋白基因家族、人組織相容性復(fù)合物基因家族、白細(xì)胞分化抗原基因家族和其它病毒膜蛋白基因。
3.如權(quán)利要求1所述的基因，其中所述的信號(hào)肽編碼序列選自免疫球蛋白基因家族、細(xì)胞因子基因家族、人組織相容性復(fù)合物基因家族、白細(xì)胞分化抗原基因家族和病毒膜蛋白基因。
4.如權(quán)利要求1所述的基因，其為具有如SEQ ID NO1所示核苷酸序列的基因gagtm。
5.一種艾滋病DNA疫苗，其包含權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的基因。
6.如權(quán)利要求5所述的艾滋病DNA疫苗，其為質(zhì)粒形式的pDRVISV1.0-gagtm，其保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏號(hào)CGMCC No.1002。
7.一種活病毒載體疫苗，其包含權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)的基因。
8.權(quán)利要求7的活病毒載體疫苗，其基于腺病毒、痘苗病毒或腺相關(guān)病毒。
9.一種艾滋病疫苗配制品，其包含權(quán)利要求5或6的DNA疫苗或權(quán)利要求7或8的活病毒載體疫苗和合適的佐劑或載體。
10.一種艾滋病免疫試劑盒，所述試劑盒包含多個(gè)容器和指示免疫程序的說明書，其中一個(gè)容器含有權(quán)利要求5或6的DNA疫苗，另一個(gè)容器含有編碼Gag抗原的重組痘苗病毒。
11.一種編碼分泌型HIV Gag抗原的基因，所述基因由gag基因和融合在其5’末端的信號(hào)肽編碼序列組成。
12.如權(quán)利要求11所述的基因，其中所述的信號(hào)肽編碼序列選自免疫球蛋白基因家族、細(xì)胞因子基因家族、人組織相容性復(fù)合物基因家族、白細(xì)胞分化抗原基因家族和病毒膜蛋白基因。
13.如權(quán)利要求11所述的基因，其為具有如SEQ ID NO2所示核苷酸序列的基因gags。
14.一種艾滋病DNA疫苗，其包含權(quán)利要求11-13任一項(xiàng)所述的基因。
15.如權(quán)利要求14所述的艾滋病DNA疫苗，其為如圖2所示的質(zhì)粒形式的pDRVISV1.0-gags，其包含權(quán)利要求13所述的基因。
16.一種活病毒載體疫苗，其包含權(quán)利要求11-13任一項(xiàng)的基因。
17.權(quán)利要求16的活病毒載體疫苗，其基于腺病毒、痘苗病毒或腺相關(guān)病毒。
18.一種艾滋病疫苗配制品，其包含權(quán)利要求14或15的DNA疫苗或權(quán)利要求16或17的活病毒載體疫苗和合適的佐劑或載體。
19.一種艾滋病免疫試劑盒，所述試劑盒包含多個(gè)容器和指示免疫程序的說明書，其中一個(gè)容器含有權(quán)利要求14或15的DNA疫苗，另一個(gè)容器含有編碼Gag抗原的重組痘苗病毒。
全文摘要
本發(fā)明涉及跨膜型和分泌型HIV Gag抗原編碼基因，包含其的艾滋病疫苗及免疫試劑盒。本發(fā)明的DNA疫苗能夠誘導(dǎo)高水平的抗人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus，HIV)的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。
文檔編號(hào)G01N33/569GK1597956SQ03158538
公開日2005年3月23日 申請(qǐng)日期2003年9月18日 優(yōu)先權(quán)日2003年9月18日
發(fā)明者邵一鳴, 李海山, 劉勇 申請(qǐng)人:中國(guó)疾病預(yù)防控制中心性病艾滋病預(yù)防控制中心