專利名稱：滅活的貓免疫缺陷病毒編碼的糖蛋白的表位的特異性單克隆抗體的制作方法
背景技術(shù)：
貓免疫缺陷病毒(FIV)，原來稱之為貓嗜T-淋巴細(xì)胞的慢病毒，是首先由Pederson等(Science，(1987)235790-793)報(bào)道的，并已經(jīng)在家貓和印度豹中被鑒定。世界范圍的貓都會(huì)感染。如同HIV，F(xiàn)IV也備受國際關(guān)注。根據(jù)美國貓從業(yè)者協(xié)會(huì)(American Association of Feline Practitioners)，多達(dá)十二分之一的貓可能FIV檢驗(yàn)呈陽性。感染之后，有一個(gè)短暫的發(fā)熱、淋巴結(jié)病和嗜中性白血球減少癥階段。多數(shù)貓?jiān)谶@一階段復(fù)原，并在免疫缺陷發(fā)生之前數(shù)月或數(shù)年內(nèi)表現(xiàn)正常。由于這種免疫缺陷的潛伏表現(xiàn)，利用活病毒疫苗治療或預(yù)防FIV是相當(dāng)危險(xiǎn)的。雖然FIV-編碼的抗原或抗原蛋白的表位的特異性單克隆抗體是已知的，例如US 5,117,014和US 5,219,725，但是這些抗體不能識(shí)別滅活的FIV。這意味著對(duì)于現(xiàn)在商品化的FIV疫苗(它們均利用滅活的FIV)，還沒有已知的、可用于疫苗組合物中的病毒量或滅活的FIV成分的效價(jià)的測(cè)定的單克隆抗體。
因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種對(duì)失活的FIV糖蛋白的表位特異的單克隆抗體。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種用于失活的FIV的量的測(cè)定方法。
本發(fā)明的更進(jìn)一步目的是提供一種測(cè)定失活的FIV疫苗效價(jià)的方法。
本發(fā)明的特征是，本發(fā)明的單克隆抗體對(duì)失活的FIV糖蛋白的表位是特異的，但不識(shí)別活FIV糖蛋白、蛋白質(zhì)或抗原的表位。
根據(jù)下面的詳細(xì)描述，本發(fā)明的目的和特征是顯而易見的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種滅活的貓免疫缺陷病毒編碼的糖蛋白獨(dú)特表位的特異性單克隆抗體。
本發(fā)明進(jìn)一步提供一種檢測(cè)樣品中滅活的貓免疫缺陷病毒編碼的糖蛋白獨(dú)特表位的方法，該方法包括使樣品和滅活的貓免疫缺陷病毒編碼的糖蛋白獨(dú)特表位的特異性單克隆抗體相互接觸以形成復(fù)合物；并檢測(cè)該復(fù)合物。


圖1是單克隆抗體mAb 1D9的蛋白質(zhì)免疫印跡分析照片，該抗體被鑒定為對(duì)滅活的貓免疫缺陷病毒編碼的糖蛋白獨(dú)特表位是特異的。
對(duì)圖1的進(jìn)一步描述如下FIV被膜糖蛋白與單克隆抗體1D9的免疫沉淀。用硫代-NHS-LC-生物素(sulfo-NHS-LC-biotin)生物素化富含福爾馬林滅活的FIV病毒原液，并用Triton X-100萃取。通過將萃取物和Mab 1D9或H5332一起溫育，完成免疫沉淀。在固定化蛋白G上收集免疫復(fù)合物，洗滌，并進(jìn)行SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡。使用過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉抗生物素蛋白檢測(cè)印跡上的蛋白質(zhì)。泳道1和5，為生物素化的分子量標(biāo)記物；泳道2，20微升用于免疫沉淀的Mab 1D9；泳道3，為100微升用于免疫沉淀的1D9；泳道4，為100微升用于免疫沉淀的不相關(guān)單克隆抗體H5332?？贵w的H鏈(50Kd)和L鏈(25Kd)以及一些BSA(67Kd)被過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉抗生物素蛋白非特異性地染色。
具體實(shí)施例方式
貓免疫缺陷病毒(FIV)被膜糖蛋白參與受體與細(xì)胞的相互作用，而此相互作用決定細(xì)胞對(duì)該病毒的易感性。FIV被膜糖蛋白也參與病毒滲透和合胞體形成，并且是體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答的主要靶(Bendinelli，M.，et al.，ClinicalMicrobiology Review，(1995)887-112)。該被膜糖蛋白由在病毒粒中非共價(jià)連接的兩成分組成，其中兩成分為表面(SU)蛋白，它被高度糖基化，其表觀分子量為95,000-100,000，和跨膜(TM)蛋白，它糖基化較少，其表觀分子量為35,000-40,000(Pacino，G.et al.，Virology，(1995)206796-806)。各種研究已經(jīng)顯示FIV被膜蛋白能夠在貓中誘導(dǎo)保護(hù)性FIV免疫性。因此，測(cè)量FIV被膜蛋白的相對(duì)數(shù)量或純度的酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)對(duì)于測(cè)定FIV疫苗的效價(jià)會(huì)非常有用。然而，所有當(dāng)前商品化的FIV疫苗都利用滅活的或被殺死的病毒，而已知的識(shí)別或與FIV或FIV糖蛋白反應(yīng)的單克隆抗體不識(shí)別或不與失活的FIV或FIV糖蛋白發(fā)生反應(yīng)。估計(jì)該病毒的滅活可能改變了FIV被膜蛋白的構(gòu)象。
現(xiàn)在令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，命名為mAb 1D9的單克隆抗體，只特異性地識(shí)別失活的FIV，不識(shí)別活FIV。而且，ELISA和免疫沉淀實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明的單克隆抗體與FIV被膜糖蛋白的表面蛋白成分特異性地發(fā)生反應(yīng)。
術(shù)語單克隆抗體，如在說明書和權(quán)利要求中所使用的，是指從已經(jīng)被克隆而產(chǎn)生抗體產(chǎn)生細(xì)胞系的單個(gè)抗體產(chǎn)生細(xì)胞獲得的抗體。表位表示被抗體識(shí)別的一個(gè)特定氨基酸序列、被修飾的氨基酸序列或蛋白質(zhì)二級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)。術(shù)語滅活的病毒表示“不存活的”或“被殺死的”病毒。
可以使用本領(lǐng)域已知的傳統(tǒng)技術(shù)制備本發(fā)明的單克隆抗體。例如，可以用部分純化的滅活病毒如FIV-Shiz、FIV-Petaluma或其他類似的病毒，優(yōu)選FIV-Shiz，免疫接種小鼠；然后篩選小鼠尾血的抗體應(yīng)答和選定用于融合；挑選克隆的雜交瘤細(xì)胞并篩選其與失活的FIV的特異反應(yīng)性?？梢栽谏锓磻?yīng)器中使這樣所獲得的單一穩(wěn)定克隆的雜交瘤生長(zhǎng)，并合并多次收獲的抗體，以生產(chǎn)所要的單克隆抗體mAb 1D9。
可以通過保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心的、給予的保藏號(hào)為ATCC號(hào)PTA-4837的細(xì)胞系生產(chǎn)該抗體。
可以通過傳統(tǒng)的滅活方法實(shí)現(xiàn)病毒滅活，例如，使用化學(xué)滅活劑如二元吖丙啶、苯酚、α-丙內(nèi)酯(α-lactopropianate)、β-丙內(nèi)酯、福爾馬林、硫柳汞、戊二醛、十二烷基硫酸鈉等，或其混合物，優(yōu)選福爾馬林的化學(xué)滅活法。也可以通過加熱或在紫外線存在情況下的補(bǔ)骨脂素滅活該病毒。
本發(fā)明的單克隆抗體對(duì)于滅活的FIV是特異的，并且與失活的FIV被膜糖蛋白(例如gp 95或gp 130)的獨(dú)特表位形成足夠強(qiáng)烈的相互作用，在用于滅活的病毒數(shù)量或失活的FIV疫苗效價(jià)測(cè)定的分析中是有用的。因此，本發(fā)明提供一種用于檢測(cè)樣品中滅活的FIV編碼的糖蛋白獨(dú)特表位的方法，此方法包括將該樣品與滅活的FIV編碼的糖蛋白獨(dú)特表位的特異性單克隆抗體相接觸，以形成復(fù)合物；并檢測(cè)該復(fù)合物。
在本發(fā)明的方法中適用的樣品包括那些在培養(yǎng)基中或在疫苗組合物中含有滅活病毒或滅活病毒感染細(xì)胞的樣品。
在本發(fā)明的方法中適用的檢測(cè)復(fù)合物的方法包括任何普遍用于檢測(cè)單克隆抗體蛋白質(zhì)復(fù)合物的手段，例如通過酶標(biāo)記、熒光標(biāo)記、或生物素標(biāo)記的抗-小鼠抗體的檢測(cè)，通過蛋白A的檢測(cè)，等等。在實(shí)際操作中，可以具有單克隆抗體mAb 1D9作為檢測(cè)抗體的ELISA或免疫沉淀分析的形式實(shí)施本發(fā)明的方法。
為了更清楚的理解本發(fā)明，列舉下列實(shí)施例。這些實(shí)施例僅僅用于舉例，不能被理解為是對(duì)本發(fā)明范圍或潛在原理的限制。的確，除了在此顯示和描述的以外，通過下文列出的實(shí)施例和前面的描述，本發(fā)明的各種修改對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說將變得顯而易見。這樣的修改也在本發(fā)明權(quán)利要求的范圍之內(nèi)。
除另有注明外，所有份均為重量份。
實(shí)施例1滅活的FIV編碼的糖蛋白的表位的特異性單克隆抗體的制備細(xì)胞和病毒FIV-Shizuoka(FIV-Shiz，D FIV亞型)是在持續(xù)感染的淋巴細(xì)胞系中繁殖的，該細(xì)胞系得自FIV-Shizuoka和Fet-J(ATCC保藏號(hào)CRL 11967)，是一種不依賴IL-2的細(xì)胞系，被稱為Shiz。FIV-Shizuoka持續(xù)感染的細(xì)胞系也被保藏在ATCC，保藏號(hào)為CRL 11976。為了產(chǎn)生抗原原液，使用福爾馬林滅活該病毒液并用超濾法濃縮。
也可以類似的方法從各種其他FIV株和亞型制備抗原原液，例如野生分離株、FIV株NCSU 1(ATCC保藏號(hào)VR-2333)、FIV株UC24818(ATCC保藏號(hào)VR-2619)、FIV-Petaluma(亞型A，TCC保藏號(hào)VR-2186)、FIV-Dixon(亞型A)、FIV-UK8(亞型A)、FIV-Bangston(亞型B)、FIV-Amori-1(亞型B)、F1V-Amori-2(亞型B)，它們?cè)谶m當(dāng)?shù)囊赘屑?xì)胞系和依賴或不依賴IL-2的貓T細(xì)胞系上繁殖，例如，PMBCs、CRFK、NYA-1(ATCC保藏號(hào)CRL-2417)、FeT-1M(ATCC保藏號(hào)CRL-10775)、FeT-2D(ATCC保藏號(hào)10774)、Fet-1C(ATCC保藏號(hào)CRL-11968)、FL-4(ATCC保藏號(hào)10772)、FL-6(ATCC保藏號(hào)10773)，或在其衍生的FIV持續(xù)感染的細(xì)胞系上繁殖，例如具有ATCC保藏號(hào)VR-1 312的FIV-CRFK細(xì)胞系、具有ATCC保藏號(hào)11975的FIV-Bangston感染細(xì)胞系，和其他類似的細(xì)胞系，例如在美國專利6,254,872公開的細(xì)胞系。
單克隆抗體的產(chǎn)生用使用甘油梯度技術(shù)純化的經(jīng)福爾馬林處理的FIV-Shiz病毒免疫接種Balb/c小鼠兩次。兩次注射的注射部位均為皮下。篩選小鼠尾血的抗體應(yīng)答。選擇一個(gè)顯示高FIV特異抗體滴度的小鼠用于融合。從這只小鼠收集的脾細(xì)胞與SP2/0骨髓瘤細(xì)胞融合。如在“抗體實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)”(Ed Harlow和David Lane著，冷泉港出版社)(“AntibodiesA Laboratory Manual”by Ed Harlow and David Lanefor Cold Spring Harbor Press)中描述的那樣挑選雜交瘤細(xì)胞。篩選原代雜交瘤克隆與經(jīng)福爾馬林處理的FIV-Shiz的特異反應(yīng)性。獲得一個(gè)穩(wěn)定克隆mAb1D9。將mAb 1D9的雜交瘤生長(zhǎng)在Heraeus miniPERM生物反應(yīng)器中。獲得并合并多次收獲的抗體以產(chǎn)生大量mAb 1D9。
實(shí)施例2單克隆抗體mAb 1D9在酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定中作為檢測(cè)抗體的應(yīng)用在此評(píng)價(jià)中，使用Galanthus Nivalis凝集素(GNA)捕獲糖蛋白。此GNAELISA將GNA結(jié)合的高選擇性和其與HIV-1、HIV-2、SIV和FIV糖蛋白的廣譜反應(yīng)性結(jié)合起來。首先，用pH9.6 10pg/mLGNA(溶于50mM碳酸鹽中)包被96微孔板，溫度37℃，時(shí)間1小時(shí)。用PBS-10％FBS，在37℃，2小時(shí)，封閉孔之后，加入經(jīng)過1％Empigen BB(Calbiochem)在37℃ 1小時(shí)處理的樣品，并在37℃溫育2小時(shí)。通過含0.1％吐溫20的PBS洗滌3次，除去未結(jié)合抗原。將按1∶8000稀釋后的實(shí)施例1的單克隆抗體mAb 1D9添加到每一個(gè)孔中，并將該板在37℃溫育1小時(shí)。洗滌之后，添加按1∶1000稀釋的過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgGKirkegaard & Perry Laboratories(KPL)，并將該板在37℃溫育1小時(shí)，然后洗滌并用TMB過氧化物酶底物(KPL)顯色。5分鐘反應(yīng)階段之后，在650nm-490nm讀對(duì)板讀數(shù)。
實(shí)施例3單克隆抗體mAb 1D9在免疫沉淀測(cè)定中作為檢測(cè)抗體的應(yīng)用在此評(píng)價(jià)中，富含福爾馬林滅活的FTV-Petaluma病毒的病毒原液(0.38mg總蛋白中FIV蛋白少于5％)和溶于2mL PBS中的5mg硫代-NHS-LC-生物素(Pierce)在冰上溫育1小時(shí)。通過透析除去未摻入的生物素試劑之后，用溶于12mL PBS中的1％Triton X-100萃取含病毒樣品1小時(shí)，并以100,000g離心2小時(shí)?；厥丈锨逡翰⒂糜诿庖叱恋?。通過在4℃將600微升萃取物和80微升mAb1D9或mAbH5332一起溫育1小時(shí)實(shí)現(xiàn)免疫沉淀。用mAB H5332(對(duì)于Borrelia OspA蛋白具有特異性)作為不相關(guān)抗體對(duì)照。免疫復(fù)合物被收集于固定化蛋白G(Pierce)，用冷PBS-1％NP-40洗滌4次，再懸浮在Laemmli緩沖液中，并進(jìn)行SDS-PAGE和蛋白質(zhì)印跡。用SuperBlock(Pierce)封閉印跡60分鐘，然后和按1∶400,000稀釋的過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉抗物生素蛋白(KPL)一起溫育45分鐘。用PBS-0.05％吐溫-20將膜洗滌4次，并用SuperSignal化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒(Pierce)隨后通過曝光于X-光膠片檢測(cè)生物素-鏈霉抗物生素蛋白復(fù)合物。
實(shí)施例4單克隆抗體mAb 1D9特異性的評(píng)價(jià)細(xì)胞和病毒FIV-Shizuoka(FIV-Shiz)和FIV-Petaluma是在持續(xù)感染的被分別稱為Shiz和FL-6的淋巴細(xì)胞系中繁殖的。貓白血病病毒(FeLV)是在慢性感染的細(xì)胞系中繁殖的。貓杯狀病毒(FCV)、貓病毒性鼻氣管炎病毒(FVR)和貓粒細(xì)胞缺乏癥病毒(FPV)是在Crandell貓腎細(xì)胞上生長(zhǎng)的。為產(chǎn)生抗原原液，用福爾馬林滅活病毒液，并用超濾法濃縮。
評(píng)價(jià)在此評(píng)價(jià)中，mAb 1D9的特異性是用在上述實(shí)施例2和3中所描述的ELISA和免疫沉淀技術(shù)測(cè)定的。
A-GNAELISA使用在實(shí)施例2中描述的測(cè)定法對(duì)各種抗原樣品進(jìn)行檢驗(yàn)。結(jié)果顯示在下面的表1中。
表1抗原樣品 抗原樣品濃度光密度A650-A492值FIV-Shiz病毒，滅活的 1x 0.572FIV-Petaluma病毒，滅活 1x 0.385的FIV-Shiz病毒，活的 1x0.006FIV-Petaluma病毒，活的 1x0.006FetJ TCS，滅活的 1x 0.027FeLV，滅活的 1x 0.020FCV，滅活的1x 0.027FVR，滅活的1x 0.027FPV，滅括的1x 0.026FeLV，活的 106.63TCID50/mL0.039FCV，活的 107.67TCID50/mL0.035FVR，活的 107.46TCID50/mL0.039FPV，活的 106.75TCID50/mL0.051無抗原對(duì)照 0 0.033觀察當(dāng)使用1∶8000稀釋度時(shí)，mAb 1D9與滅活的F1V-Shiz和滅活的FIV-Petaluma樣品發(fā)生良好反應(yīng)。相反，當(dāng)用活FeLV、FCV、FVR和FPV樣品，或用各種病毒的滅活抗原原液樣品進(jìn)行測(cè)定時(shí)，mAb 1D9不顯示反應(yīng)性。有益地，mAb1D9不與活FIV-Petaluma或活FIV-Shizuoka樣品發(fā)生反應(yīng)，即使它與滅活的FIV-Shiz和滅活的FIV-Shiz的樣品都反應(yīng)良好。表1中的ELISA數(shù)據(jù)顯示，基于單克隆抗體mAb 1 D9的GNA ELISA可以用于特異性地檢測(cè)FIV糖蛋白。mAb1D9與福爾馬林滅活的FIV反應(yīng)，而不與活FIV反應(yīng)的觀察表明，mAb 1D9識(shí)別的表位是由福爾馬林對(duì)FIV處理產(chǎn)生的獨(dú)特表位。
B-免疫沉淀為了進(jìn)一步證實(shí)mAb 1D9對(duì)滅活的FIV被膜糖蛋白的特異性，將滅活的FIV富集的原液生物素化并按實(shí)施例3所述用mAb 1D9或mAb H5332(一種不相關(guān)單克隆抗體)進(jìn)行免疫沉淀。如圖1所示，mAb 1D9特異性地與SU蛋白反應(yīng)，由寬的95-100Kd帶所顯示。具有較高分子量(約160Kd)的帶可能是SU與另一通過福爾馬林處理而交聯(lián)的蛋白形成的復(fù)合物。
結(jié)論ELISA和免疫沉淀實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，單克隆抗體mA 1 D9特異性地與FIV被膜糖蛋白的表面蛋白成分發(fā)生反應(yīng)，并且適用于滅活的FIV疫苗的效價(jià)測(cè)定，或適用于滅活的病毒樣品或滅活的病毒感染細(xì)胞樣品的定量測(cè)定。
權(quán)利要求
1.滅活的FIV編碼的糖蛋白獨(dú)特表位的特異性單克隆抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單克隆抗體，其中滅活的FIV是FIV-Shiz或FIV-Petaluma。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的單克隆抗體，其中所述糖蛋白是gp95或gp130。
4.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的單克隆抗體，該抗體產(chǎn)自保藏為ATCC號(hào)PTA-4837的細(xì)胞系。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的單克隆抗體，其中單克隆抗體為mAb1D9。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的單克隆抗體，其中所述糖蛋白為gp95。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的單克隆抗體，其中所述FIV為FIV-Shiz。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的單克隆抗體，其中所述FIV已通過福爾馬林處理滅活。
9.檢測(cè)樣品中滅活的FIV編碼糖的蛋白獨(dú)特表位的方法，該方法包括將該樣品與滅活的FIV編碼的糖蛋白獨(dú)特表位的特異性單克隆抗體相接觸，以形成復(fù)合物；并且檢測(cè)所述復(fù)合物。
10.測(cè)定樣品中滅活的FIV量的方法，該方法包括將所述樣品與滅活的FIV編碼的糖蛋白獨(dú)特表位的特異性單克隆抗體相接觸，以形成復(fù)合物；并且檢測(cè)所述復(fù)合物。
11.測(cè)定樣品中滅活的FIV效價(jià)的方法，該方法包括將所述樣品與滅活的FIV編碼的糖蛋白獨(dú)特表位的特異性單克隆抗體相接觸，以形成復(fù)合物；并且檢測(cè)所述復(fù)合物。
12.根據(jù)權(quán)利要求9至11任一項(xiàng)所述的方法，其中單克隆抗體是權(quán)利要求1至8之一中所定義的單克隆抗體。
13.一種制備滅活的FIV編碼的糖蛋白獨(dú)特表位的特異性單克隆抗體的方法，該方法包括用部分純化的滅活的FIV免疫接種適宜的宿主，篩選高FIV特異性抗體應(yīng)答的宿主，將來自該宿主的脾細(xì)胞與適宜的骨髓瘤細(xì)胞系融合形成雜交瘤細(xì)胞，篩選該雜交瘤細(xì)胞與滅活的FIV的特異反應(yīng)性，然后挑選穩(wěn)定的克隆，使該穩(wěn)定克隆生長(zhǎng)并收獲想要的單克隆抗體。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中滅活的FIV為FIV-Shiz或FIV-Petaluma。
15.根據(jù)權(quán)利要求13或14所述的方法，其中該FIV是FIV-Shiz。
16.根據(jù)權(quán)利要求13至15任一項(xiàng)所述的方法，其中細(xì)胞系保藏為ATCC號(hào)PTA-4837。
17.根據(jù)權(quán)利要求13至16任一項(xiàng)所述的方法，其中該FIV已用福爾馬林處理而滅活。
18.一種適于獲得滅活的FIV編碼的糖蛋白獨(dú)特表位的特異性單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞系，該雜交瘤細(xì)胞系是通過用部分純化的滅活的FIV免疫接種適宜的宿主，篩選高FIV特異性抗體應(yīng)答的宿主，將來自該宿主的脾細(xì)胞與適宜的骨髓瘤細(xì)胞系融合，并篩選雜交瘤與滅活的FIV的特異反應(yīng)性而制備的。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的細(xì)胞系，該細(xì)胞系適于獲得選自gp95和gp130的滅活的FIV編碼的糖蛋白獨(dú)特表位的特異性單克隆抗體。
20.以保藏號(hào)PTA-4837保藏在美國典型培養(yǎng)物保藏中心的細(xì)胞系。
全文摘要
本發(fā)明提供一種對(duì)對(duì)于滅活貓免疫缺陷病毒(FIV)被膜糖蛋白的表面蛋白成分獨(dú)特表位有特異性的單克隆抗體。該抗體可用于滅活的FIV的定量或滅活的FIV疫苗的效價(jià)的測(cè)定。
文檔編號(hào)G01N33/577GK1528791SQ03164909
公開日2004年9月15日 申請(qǐng)日期2003年9月11日 優(yōu)先權(quán)日2002年9月12日
發(fā)明者C·M·黃, C M 黃 申請(qǐng)人:惠氏公司