專利名稱：熒光偏振法、其中使用的試劑盒以及生物傳感器的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種對樣品中的被檢測物質進行分析的方法。
背景技術：
免疫測定方法是利用抗原抗體反應進行測定的方法。到目前為止，已報道了源于各種各樣測定原理的免疫測定方法。例如，酶免疫測定法、熒光測定法、發(fā)光測定法等需要將免疫復合物和未反應物質進行分離(BF分離BF是Binding/Free的縮寫)的測定方法，以及比濁法、散射測濁法、膠乳凝集法等不需要進行BF分離的測定法。無論哪一種方法都是要對抗原抗體反應進行光學檢測的測定法。
免疫測定方法中象酶免疫測定法、熒光測定法、發(fā)光測定法等需要進行BF分離的測定方法，為了除去沒有參與抗原抗體反應的游離的抗原和抗體，需要清洗操作。而通過將該清洗操作整合到裝置的系統中進行自動化操作，可以提高操作性，但裝置價格高。
免疫測定方法中象比濁法、散射測濁法、膠乳凝集法等不需要進行BF分離的測定法，與上述需要進行BF分離的測定法相比，其操作性好。然而，由于要利用散射光或透射光對通過抗原抗體反應生成的由抗原抗體構成的復合物進行檢測，所以不適宜用于需要高靈敏度的測定項目。
近年來，利用熒光偏振對抗原抗體反應進行檢測的免疫測定方法(以下稱之為熒光偏振法)受到人們的關注。熒光偏振法由于不需要進行BF分離，所以省去了清洗操作。另外由于基本上是進行熒光測定，靈敏度也高。因此與上述測定法相比有優(yōu)點。
稱之為熒光偏振(也稱之為熒光偏振消除)的現象在1950年以后開始應用于生物體高分子的研究，而從1970年代后半個年代開始真正已經涉及到生物化學或生物學等范圍廣泛的領域的應用研究。
用于測定熒光偏振的專用的測定裝置(以下稱之為熒光偏振測定裝置)，簡單地講，是在與以往的熒光光度計同樣的構成的基礎上，再追加2片偏振板的裝置。熒光偏振測定裝置，作為檢測部的杯子可以使用與通常熒光測定同樣的四面透明的石英杯。在進行可見光區(qū)域的測定時可以使用用玻璃制造的杯子。
在熒光偏振測定裝置中，利用濾片或狹縫可以得到從來自光源發(fā)出的光中的單色波(單色光)，利用偏振器使該單色光偏振，可以得到激發(fā)光。當通過該偏振器的激發(fā)光接觸到杯子時，溶液中只有帶有熒光色素的分子吸收該激發(fā)光。在熒光偏振測定裝置中，如果能夠檢測到在熒光色素的特性熒光弛豫時間內發(fā)出的熒光的垂直成分和平行成分時，可以通過Perrin公式算出熒光偏振度。熒光偏振度值從原理上講，依賴于與分子大小有關的分子旋轉運動的速度的差。因此，盡管存在著妨礙熒光檢測的雜質等的影響，但熒光強度的數值并不是直接由抗原濃度決定的。所以，除了完全不能檢測熒光的狀況以外，對樣品不進行前處理就可以進行測定，而且也沒有進行BF分離的必要性。就象上述所了解的那樣，熒光偏振法是簡易的免疫測定方法。
到目前為止，作為利用熒光偏振的免疫測定技術有特開平11-813332號公報記載的方法。在這些方法中，使用可與被檢測物質結合的用熒光色素標記的抗體。通常在臨床檢查中，可以利用上述那樣的各種各樣的免疫測定方法。
然而，上述以往的熒光偏振法，由于是算出分子量在抗原抗體反應前后的變化量的方法，當在抗原抗體反應前后分子量變化小時，或當熒光色素的熒光弛豫時間過短或過長時，以高靈敏度進行測定比較困難。

發(fā)明內容
本發(fā)明是是借鑒上述事情而做成的發(fā)明，可以提供能夠高靈敏度進行測定的熒光偏振法、以及方法中使用的試劑盒和生物傳感器。
本發(fā)明的熒光偏振法是測定被檢測物質的熒光偏振法，包括準備固定了與上述被檢測物質特異結合的結合物質的第一個固體支持體，和與上述被檢測物質特異結合的用熒光色素標記的熒光標記物質的工序(a)；使上述熒光標記物質和上述結合物質與上述被檢測物質接觸的工序(b)以及對起因于上述熒光標記物質的熒光偏振度進行測定的工序(c)。
在上述的以往的方法中，與上述被檢測物質特異結合的結合物質沒有固定在固體支持體上。因此，在由被檢測物質和熒光標記物質構成的復合物中產生旋轉運動。由于這一原因，盡管照射熒光偏振光，熒光偏振光也會被消除。因此有時熒光偏振度沒怎么變化。就是說，在測定中，有時S/N比增大，靈敏度降低。而在本發(fā)明的熒光偏振法中，當樣品中存在被檢測物質時，在工序(b)中，熒光標記物質和被檢測物質特異結合，形成由被檢測物質和熒光標記物質和結合物質構成的復合物。因此，熒光標記物質的旋轉運動被抑制或被靜止。這樣一來，熒光偏振度變大，其變化的量可以以大的測定值表示。
上述被檢測物質即使包含在溶液中也可以。
上述工序(c)可以作為對上述工序(b)前后的起因于上述熒光標記物質的熒光偏振度進行測定的構成。
其構成也可以為在上述工序(b)前，可以還含有使不含有上述被檢測物質的溶液與上述熒光標記物質和上述結合物質接觸的工序(f)，其中，在上述工序(c)對上述工序(b)和上述工序(f)后的起因于上述熒光標記物質的熒光偏振度進行測定。
最好是還包括求出上述工序(b)和上述工序(f)后的起因于上述熒光標記物質的各熒光偏振度與上述被檢測物質的濃度之間的相關性的工序(g)。
其構成也可以還包括準備沒有固定上述結合物質的第2個固體支持體，和與上述被檢測物質特異結合用熒光色素標記的熒光標記物質的工序(d)；使上述熒光標記物質與上述被檢測物質接觸的工序(e)，其中，上述第2個固體支持體是用與除去上述結合物質的上述第1個固體支持體同樣的材料做成的，在上述工序(c)中可以對上述工序(b)和上述工序(e)后的起因于上述熒光標記物質的熒光偏振度進行測定。
上述第1個固體支持體可以是微量滴定板。
上述第1個固體支持體可以是微粒子。
上述熒光標記物質最好是用熒光弛豫時間為1毫微秒以上的熒光色素標記的物質。
上述熒光色素可以是與上述結合物質的一級～三級氨基、羧基、巰基、苯基、酚基或羥基結合的色素。
上述結合物質可以是抗體、受體、核酸或抑制劑中的任一種。
上述結合物質也可以是多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、Fab抗體、F(ab2)抗體、或Fv抗體中的任一個。
上述被檢測物質可以是生物體內物質、微生物、或病毒。
其構成可以為上述結合物質是第1個抗體，上述熒光標記物質是熒光色素標記的第2個抗體，上述第1個抗體和上述第2個抗體分別識別不同抗原決定簇。
本發(fā)明的試劑盒是在對被檢測物質進行測定的熒光偏振法中使用的試劑盒，備有固定了與上述被檢測物質特異結合的結合物質的固體支持體，和與上述被檢測物質特異結合的用熒光色素標記的熒光標記物質。
利用本發(fā)明的試劑盒，當樣品中存在被檢測物質時，熒光標記物質和被檢測物質特異結合，進而被檢測物質和固定在固體支持體上的結合物質特異結合，從而形成由被檢測物質和熒光物質以及結合物質構成的復合物。因此，熒光標記物質的旋轉運動被抑制或被靜止。這樣一來，熒光偏振度變大，其變化的量可以以大的測定值表示。
本發(fā)明的生物傳感器備有含有被檢測物質的溶液移動的流路，上述流路備有用于導入含有被檢測物質的溶液的樣品導入部；以及連接在上述樣品導入部的、與上述被檢測物質特異結合的用熒光色素標記的熒光標記物質以可洗脫到上述溶液中的狀態(tài)而填充的熒光標記物質保持部；與上述熒光標記物質保持部連接的、與上述被檢測物質特異結合的結合物質被固定在固體支持體上的結合物質保持部。
利用本發(fā)明的生物傳感器，當樣品中存在被檢測物質時，在熒光標記保持部中熒光標記物質和被檢測物質特異結合，而在結合物質保持部中被檢測物質和固定在固體支持體上的結合物質特異結合，形成由被檢測物質和熒光標記物質以及結合物質構成的復合物。因此，熒光標記物質的旋轉運動被抑制或被靜止。這樣一來，熒光偏振度變大，其變化的量可以以大的測定值表示。
上述溶液可以作為利用毛細管力、離心力、或電位差驅動通過上述流路內的構成。
上述流路在上述固體支持體中形成，上述固體支持體可以是毛細管。
上述毛細管可以作為充填了載體的構成。
上述毛細管可以作為溶液自由流過內部的構成。
上述固體支持體可以作為浸有含有上述被檢測物質的溶液的溶劑的材料。
可以作為至少備有兩個流路的構成。


圖1(a)～(c)是表示本發(fā)明原理的模式示意圖。
圖2是本發(fā)明的熒光偏振法的流程圖。
圖3是表示本發(fā)明一個實施方式的生物傳感器示意圖。
圖4表示本發(fā)明的生物傳感器以及使用該傳感器的熒光偏振測定裝置的一構成例。
圖5(a)和(b)是表示圖4表示的構成例中的熒光偏振測定裝置的檢測部的模式圖。
圖6是表示基于本發(fā)明的人絨毛性性腺刺激激素的測定結果的圖。
具體實施例方式
本發(fā)明涉及為了對樣品中的被檢測物質進行測定而在固定了與被測定物質特異結合的物質的固相上進行的熒光偏振法。以下邊參照圖1和圖2邊對本發(fā)明的實施方式進行說明。圖1是表示本發(fā)明原理的模式示意圖。圖2是本發(fā)明的熒光偏振法的流程圖。
一般來說，熒光偏振法利用由于溶液中的分子旋轉運動而熒光偏振消除的現象。即，由于分子越小，在溶液中的旋轉運動越快，所以熒光偏振被大大地消除，熒光偏振度的值自然就變小了。相反，分子越大，在溶液中的旋轉運動越慢，所以熒光偏振基本沒有被消除，熒光偏振度的值自然就變大了。
就象圖1所表示的那樣，在本實施方式中，使用固定了與被檢測物質14特異結合的結合物質12的固體支持體11，和與被檢測物質14特異結合的用熒光色素標記的熒光標記物質13。通過固定于固體支持體11上的結合物質12捕捉結合了熒光標記物質13的被檢測物質14，抑制熒光標記物質13和被檢測物質14的復合物的旋轉運動，或使其靜止。這樣做意味著通過特異結合反應將溶液中的熒光標記物質13和被檢測物質14的復合物的「動」的狀態(tài)捕捉到固相上，使其處于「靜」的狀態(tài)，可以使熒光偏振度變大。熒光偏振度的變化量成為表示通過特異結合反應，結合于被固定的結合物質12的被檢測物質14的濃度的值。
本實施方式的熒光偏振法是測定被測定物質14的方法，就象圖2所表示的那樣，包括準備固定了與被檢測物質14特異結合的結合物質12(代表性的物質是抗體)的固體支持體11，和與被檢測物質14特異結合的用熒光色素標記的熒光標記物質13的工序St1；使熒光標記物質13和結合物質12與被檢測物質14接觸的工序St2以及對起因于熒光標記物質13的熒光偏振度進行測定的工序St3。
以下對各個工序進行詳細地說明。
在工序St1中，就象圖1(a)所表示的那樣，在不存在被檢測物質14的狀態(tài)下，熒光標記物質13以沒有被結合物質12(代表性的物質是抗體)捕捉的狀態(tài)存在于溶液中。此時，由于熒光標記物質13在溶液中進行旋轉運動，所以即使照射熒光偏振光，熒光偏振光也會被消除。所以熒光偏振度值小。
在工序St2中，就象圖1(b)所表示的那樣，添加含有被檢測物質14的樣品。由于添加樣品，由被檢測物質14和熒光標記物質13以及結合物質12形成夾層型的復合物。而該工序也可以在上述工序St1以前進行。
在工序St3中，就象圖1(c)所表示的那樣，樣品中存在被檢測物質14時，在工序St1中準備的熒光標記物質13和被檢測物質14特異結合，而被檢測物質14再與固定于固體支持體固體支持體11上的結合物質12特異結合，形成由被檢測物質14和熒光標記物質13以及結合物質12構成夾層型的復合物。由于形成復合物，熒光偏振度變大，可以將其變化的量以大的測定值表示。這里，樣品中的被檢測物質14的濃度，與被檢測物質14不存在時的熒光偏振度的值以及被檢測物質14存在時的熒光偏振度的值的差有關。
象上述那樣，在以往方法(例如特開平11-813332號公報記載的方法)中，與被檢測物質特異結合的結合物質不固定在固體支持體上。因此，在由被檢測物質和熒光標記物質形成的復合物中會產生旋轉運動。因此熒光偏振度往往沒怎么變化。就是說，在測定中，有時S/N比增大，而靈敏度降低。
然而，在本發(fā)明的熒光偏振法中，就象圖1(c)所表示的那樣，樣品中存在被檢測物質14時，在工序St1中準備的熒光標記物質13和被檢測物質14特異結合，而被檢測物質14再與固定于固體支持體固體支持體11上的結合物質12特異結合，形成由被檢測物質14和熒光標記物質13以及結合物質12構成夾層型的復合物。因此，熒光標記物質13的旋轉運動被抑制或被靜止。由此，熒光偏振度變大，可以將其變化的量以大的測定值表示。
本實施方式雖然可以作為工序St2前后的對起因于熒光標記物質13的熒光偏振度進行測定的構成，但本發(fā)明并不限定于此構成。例如，在工序St2之前，再含有使不含有被檢測物質14的溶液與熒光標記物質13和結合物質12接觸的前工序，所以工序St3也可以作為對工序St2以及前工序后的起因于熒光標記物質13的熒光偏振度進行測定的構成。
另外，例如，準備固定了結合物質12的固體支持體11以及與被檢測物質14特異結合的用熒光色素標記的熒光標記物質13，開始對起因于上述熒光物質的熒光偏振度進行測定。然后一邊繼續(xù)進行熒光偏振度的測定，一邊在熒光偏振度的測定開始的任意時間后使含有被檢測物質14的樣品溶液與熒光標記物質13和結合物質12接觸。此時，可以監(jiān)測從熒光偏振度測定開始后的熒光偏振度隨時間的變化。
另外，準備沒有固定結合物質12的固體支持體11(沒有圖示)以及與被檢測物質14特異結合的用熒光色素標記的熒光標記物質13，使沒有固定了結合物質12的固體支持體和熒光標記物質與含有被檢測物質的樣品溶液接觸后，對起因于熒光標記物質13的熒光偏振度進行測定，也可以作為對工序St2后的起因于熒光標記物質13的熒光偏振度進行測定的構成。
在本實施方式的熒光偏振法中，使用備有固定有與被檢測物質14特異結合的結合物質12的固體支持體11和與被檢測物質14特異結合的熒光標記物質13的試劑盒。
固體支持體11具體來說是測定杯。作為測定杯可以是預先含有熒光標記物質13的杯。通過使用該試劑盒，在測定時，將測定杯放置在熒光偏振測定裝置內，只是向測定杯內導入樣品就可以很簡易地進行測定。
作為本實施方式的熒光測定法以及試劑盒中使用的固體支持體，適合使用浸漬含有被檢測物質樣品溶液的溶劑的材料。例如可以使用硝酸纖維素膜、醋酸纖維素膜、玻璃纖維濾紙等。
另外作為本發(fā)明使用的固體支持體，適合使用微量滴定板。作為微量滴定板可以使用由聚苯乙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、聚丙烯、硅系、玻璃系、葡聚糖系材料形成的微量滴定板。
另外作為本發(fā)明使用的固體支持體，也可以使用微粒子。作為微粒子，如無機膠體、膠乳粒子、磁性粒子等。
利用本領域公知的手法通過物理吸附或化學結合使與被檢測物質特異結合的結合物質固定在本發(fā)明中使用的固體支持體上。將本領域公知的襯墊(spacer)等配體導入到固體支持體上，也可以固定上述物質。作為襯墊可以使用具有任意長度碳鏈的化合物。另外，與抗生物素蛋白形成復合物的生物素等配體在本領域是公知的。
在本實施方式中，作為固定在固體支持體上的物質(結合物質)，只要是與被檢測物質特異結合的，可以使用任意的抗體、受體、核酸、抑制劑等。另外作為被熒光色素標記的物質只要是與被檢測物質特異結合的，也可以使用任意的抗體、受體、核酸、抑制劑等。
作為本實施方式中使用的抗體可以是多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、Fab抗體、F(ab)2抗體、Fv抗體。
在本實施方式中，可測定的被檢測物質可以是生物體內物質、微生物、病毒等。生物體內物質指的是例如肽、蛋白質、脂質、糖類或核酸類物質等。微生物包括大腸桿菌、沙門氏(桿)菌、腸炎弧菌、衣原體、幽門螺桿菌等細菌。病毒包括流感病毒、C型肝炎病毒、HIV病毒等。
在本實施方式中使用的熒光標記物質只要是能與被檢測物質特異結合，而且被熒光色素標記的物質，無論什么樣的物質都可以使用。在本實施方式中，在結合物質中雖然可以使用用熒光色素標記的物質，但并不限定于這樣的物質?？梢愿鶕枰獪蕚渥R別各個不同抗原決定簇的第1抗體和第2抗體，用熒光色素對其中的任一個進行標記，而分別作為結合物質和熒光標記物質使用。
另外，在本實施方式的熒光偏振法中，熒光標記物質的濃度很重要。假如，測定體系內存在高濃度的熒光標記物質，與通過被固定在固體支持體上的結合物質借助于被檢測物質捕捉的熒光標記物質相比，沒有被捕捉的(游離的)熒光標記物質的量變多。在這樣狀態(tài)下，進行熒光偏振測定時，由于游離的熒光標記物質的量多，所以不能獲得熒光偏振度的大的變化。因此通過本實施方式的熒光偏振法在測定被檢測物質上，最好是對熒光標記物質的濃度進行最適化。
作為最適化的方法，例如將任意量的被檢測物質固定于微量滴定板，分別添加針對上述量制作稀釋系列的熒光標記物質溶液，測定熒光偏振度。一般來說，熒光標記物質濃度越高，熒光偏振度變得越小。而如果被固定的被檢測物質的量變多，熒光偏振度開始減少的熒光標記物質的濃度變大。假如在必須保證測定的被檢測物質濃度的范圍內，可以得到如圖3所表示的那樣結果，此時如果將熒光標記物質的濃度設定在圖中線41表示的濃度以下和線43表示的濃度以上，就看不到熒光偏振度的變化。因此最好是將熒光標記物質的濃度設定在圖中線42表示的濃度附近，這樣可以使熒光偏振度隨著被檢測物質的量而變化。
標記本實施方式中使用的熒光標記物質的熒光色素是以熒光偏振法為原理進行測定上的重要的材料。熒光色素一般用激發(fā)波長、熒光波長、斯托克斯漂移(stoke’s shift)、熒光弛豫時間等參數表示其特性。在本實施方式中使用的熒光色素，具有代表性的是其特性用熒光弛豫時間規(guī)定的，通常具有約0.1毫微秒到約1,000毫微秒范圍的熒光弛豫時間的熒光色素比較好。最好使用具有約1毫微秒以上熒光壽命的熒光色素。在本實施方式中使用的熒光色素，是考慮了通過與被檢測物質結合引起變化的熒光標記物質的分子量之后選擇的。由與被檢測物質結合的熒光標記物質放出的熒光的偏振度與分子的大小、即分子的旋轉運動速度成比例關系。在本實施方式中，適合使用能夠得到分子量小、即在溶液中旋轉運動速度大的熒光標記物質的那樣的熒光色素，利用該熒光色素可以增大捕捉前后的熒光偏振度的變化。作為這樣的熒光色素的例子如熒光素衍生物、丹酰衍生物、芘衍生物、金屬螯合物。
另外在本實施方式使用的熒光色素，代表的是與被檢測物質特異結合的物質中含有的一級～三級氨基、羧基、巰基、苯基、酚基或羥基反應，對上述物質進行標記。為此目的，例如可以使用通過公知的方法向上述列舉的熒光色素中導入異硫氰基、琥珀酰亞胺基、磺酰氯基、迭氮基、硫代基、馬來酸酐縮亞胺基等官能團的色素。
以下一邊參照圖4，一邊對使用上述本實施方式的熒光偏振法的生物傳感器進行說明。圖4是表示本實施方式的生物傳感器和使用該傳感器的熒光偏振測定裝置的一構成例。
本實施方式的生物傳感器20就象圖4所表示的那樣，是由被固定的固體支持體21(本實施方式中是毛細管)構成的。固體支持體21含有樣品導入部22；充填了熒光標記物質13的熒光標記物質保持部23a以及固定了結合物質12的結合物質保持部23b。樣品導入部22、熒光標記物質保持部23a和結合物質保持部23b成了含有被檢測物質的樣品溶液流通的流路。
對生物傳感器20中熒光偏振度的變化進行計算的熒光偏振測定裝置30備有收容生物傳感器20的收容部(沒有圖示)，而且備有激發(fā)光26一側的偏振板24、以及熒光27一側的偏振板25，在對熒光偏振度的變化進行測定時，具有使熒光27一側的偏振板25旋轉的功能。
圖5(a)和圖5(b)是表示圖4所示構成例子中的熒光偏振測定裝置的檢測部的模式圖。在圖5(a)和圖5(b)是將生物傳感器20的結合物質保持部23b表示為杯28的模式圖。就象圖5(a)所示那樣，熒光27一側的第2偏振板25在對偏振度的變化進行測定時，象箭頭指示那樣旋轉，在旋轉期間，由杯子發(fā)出的熒光的平行成分和垂直成分依次被監(jiān)測，以此為基礎算出熒光偏振度。也可以取而代之，就象圖5(b)所示那樣，作為算出熒光偏振度的變化的裝置，使用不備有使偏振板旋轉功能的檢測器。此時，由杯子28發(fā)出的熒光，其平行成分30以及垂直成分31通過使用配置在熒光一側的2個偏振板25、25’可以同時分別進行監(jiān)測，以此為基礎算出熒光偏振度。另外，圖5中用20、24和26表示的參照號與圖4一樣分別表示入射光、激發(fā)一側的偏振板和激發(fā)光。
在本實施方式的熒光偏振測定裝置30內，還可以集聚用于調整進行抗原抗體反應的溫度條件的反應部、向熒光標記物質保持部23a供給熒光標記物質13的機構以及算出熒光偏振度變化的機構。不用說，其構成可以為熒光偏振測定裝置30備有多個反應部，測定熒光偏振度的機構同時對發(fā)自多個反應部的熒光偏振度進行測定。其構成可以為還備有算出同時測定的熒光偏振度的差的機構。
另外，在集聚了反應部、供給熒光標記物質13的機構以及算出熒光偏振度變化的機構熒光偏振測定裝置30內，通過進一步集聚生物傳感器20，也可以做成生物芯片。
由樣品導入部導入的樣品中含有的被檢測物質，通過熒光標記物質保持部23a后，與熒光標記物質13結合，再與固定于固體支持體21(圖4中的毛細管)上的結合物質12(本實施方式中為抗體)結合。熒光偏振測定裝置30檢測發(fā)自結合物質保持部23b的熒光偏振度的變化。
以往，作為簡易的檢查法，有利用干式化學的檢查法。所謂干式化學是指對以干燥狀態(tài)保存在濾紙或試紙那樣的展開層基質的試劑，點上液體狀的樣品，對樣品中被檢測物質進行測定的方法。作為裝置，有使試劑負載到單層的展開層基質上的單層式，以及作為展開層基質使展開層、反應層、試劑層等層狀疊起來的多層式。作為利用干式化學的檢查法的特征，例如由于試劑已經負載到展開層基質上，因此有不需要進行試劑的調配、可以保存在小的空間內、被檢測樣品量少等優(yōu)點。
作為代表性的通過干式化學的檢查法有免疫層析法(例如，專利號2890384號公報報道)。所謂免疫層析法是利用抗原抗體反應和毛細管現象的檢查法，在裝置中，將固定后的第1抗體和作為檢測試劑的被標記的第2抗體分別以干燥的狀態(tài)負載到以膜濾片為代表的載體上。進行檢查時，向上述裝置上添加含有被檢測物質(抗原)的檢體樣品，通過毛細管現象使其展開，通過利用夾層型的抗原抗體反應使反應部位發(fā)色，進行抗原的鑒定、確認有無抗原或對抗原量進行測定。
免疫層析法通過一個操作可以進行反應、清洗清洗、檢測工序。因此存在著操作簡便的優(yōu)點，另外還可以進行迅速地判定。就象妊娠診斷藥所代表的那樣，由于其簡便，也成了可適用于在臨床檢查領域近年來引入注目的即時檢驗(POCT)中的檢查法。
作為臨床檢查的簡易測定法已為人們了解的免疫層析法有通過一個操作進行反應、清洗、檢測工序的優(yōu)點。然而，進行抗原抗體反應需要時間，由于將液體樣品在固相上展開需要的時間加長，只能使用由膜那樣的多孔質構成的材料。而且，在免疫層析法中使用的由膜等多孔質構成的材料價格高，裝置的費用高。
而在本實施方式的生物傳感器20中，用作固體支持體21的材料并不限定于由膜那樣的多孔質構成的材料。因此以低成本制造本實施方式的生物傳感器是可能的，適用于臨床檢查，特別適用于POCT。
在本實施方式的生物傳感器中作為固體支持體21可以使用毛細管。在本實施方式中，在毛細管內備有熒光標記物質保持部23a和結合物質保持部23b，結合物質保持部23b用例如可進行熒光偏振測定的石英玻璃、塑料那樣的透明的材料制成。而作為在毛細管內展開液體樣品的驅動力，可以利用毛細管力、離心力、電位差等物理力。另外根據需要，也可以將載體充填到毛細管內。作為可利用的載體如玻璃棉、聚丙烯酰胺凝膠、微粒子等。不用說，也可以將毛細管內做成無載體的溶液自由流動的狀態(tài)。
另外，作為本實施方式的生物傳感器20的固體支持體21使用的材料，可以是以硝酸纖維素膜、醋酸纖維素膜、玻璃濾紙等多孔質材料為基礎的矩形形態(tài)(即，試驗片)。在由這樣的多孔質構成的材料中，作為使液體樣品展開的驅動力利用毛細管力。其展開方向無論是矩形形態(tài)的縱方向，還是向橫方向都可以。
而在本實施方式中雖然對備有一個流路的生物傳感器進行了說明，但不用說，也可以作成備有多個流路，同時進行多個測定的構成。
實施例以下，用實施例對本發(fā)明進行詳細地說明。以下實施例是說明本發(fā)明的例子，對本發(fā)明并沒有限制。
按照以下順序對作為被檢測物質的尿中物質人絨毛膜促性腺素(hcg分子量37,000)進行測定。
1.芘標記抗hcg-β單克隆抗體的制備使用抗hcg-β單克隆抗體和芘丁酸琥珀酰亞胺基酯(SPB)(無論哪一種都是購自Molecular Sieve公司)象以下所示那樣制備芘標記抗hcg-β單克隆抗體。
將含有2.0mg/ml的抗hcg-β單克隆抗體的磷酸緩沖生理鹽水(PBS)(pH7.4)溶液(1000μl)和使終濃度為1.00mg/ml的芘丁酸琥珀酰亞胺基酯(SPB)(是抗體量的10倍)溶解在DMSO中后的溶液(20μl)進行混合。通過一邊使該混合液攪拌4小時，一邊于25℃下進行溫育，使抗hcg-β單克隆抗體和芘丁酸琥珀酰亞胺基酯(SPB)反應。將得到的反應液通過SephadexG-25凝膠過濾柱(Pharmacia)(柱子大小10×60mm、流速約2ml/分)，除去未反應的SPB，回收含有芘標記抗hcg-β單克隆抗體。
首先就回收的級分對制備的芘標記抗hcg-β單克隆抗體的標記量以及熒光特性進行評價。
當使用紫外和可見分光光度計(島津制造，RF-1600PC)進行測定時，回收的級分由于1ml含有約0.8mg的抗體，而且從芘330nm的吸光度可知其濃度為0.88mg/ml，所以可以確認每一分子抗hcg-β單克隆抗體標記了大約1.1個芘。另外使用熒光分光光度計(島津制造，RF-5300PC)對回收的級分發(fā)出的熒光特性進行測定，結果結合抗hcg-β單克隆抗體的芘在用330nm的波長光激發(fā)后發(fā)出397nm波長的熒光，該熒光的壽命為100毫微秒。
2.抗hcg-α單克隆抗體固定化杯的制備作為測定杯使用用聚苯乙烯制造的杯。向該杯中加入700μl的抗hcg-α單克隆抗體1mg/ml溶液，放置過夜。然后，將杯內的溶液通過抽濾除去后，將杯清洗。再向杯內添加1％BSA溶液，通過放置過夜，用BSA對杯內壁進行封閉。抗體被固定在杯內壁可通過向杯內添加酶標記hcg，通過發(fā)色進行確認。
3.熒光偏振度的測定作為熒光偏振度測定裝置使用日本分光制造的FP715(測定條件測定溫度35℃，激發(fā)波長330nm，熒光波長397nm，Gfactor0.942)。
將象上述2那樣制備的抗hcg-α單克隆抗體固定化杯放置在熒光偏振裝置內，作為樣品，分別制備含有的hcg分別為0、50、100、200、300、500、600、800和1000IU/l的溶液。將上述的hcg溶液上述芘標記抗hcg-β單克隆抗體的混合液(700μl)與上述各個濃度的hcg溶液(60μl)進行混合，于35℃下攪拌0.5分鐘后，在上述測定條件下，對0.5分鐘內，上述各個濃度的hcg溶液進行熒光偏振度的測定。結果如圖6所示。就象圖6所示的那樣，熒光偏振度大致與hcg的濃度成比例。
本發(fā)明在環(huán)境測定、食品管理和醫(yī)療診斷領域中是有用的。
權利要求
1.一種熒光偏振法，是測定被檢測物質的熒光偏振法，包括準備固定了與上述被檢測物質特異結合的結合物質的第1固體支持體，和與上述被檢測物質特異結合的用熒光色素標記的熒光標記物質的工序(a)；使上述熒光標記物質和上述結合物質與上述被檢測物質接觸的工序(b)；以及對起因于上述熒光標記物質的熒光偏振度進行測定的工序(c)。
2.根據權利要求1所述的熒光偏振法，其中，上述被檢測物質包含在溶液中。
3.根據權利要求1所述的熒光偏振法，其中，在上述工序(c)中測定上述工序(b)前后的起因于上述熒光標記物質的熒光偏振度。
4.根據權利要求1所述的熒光偏振法，其中，在上述工序(b)前，還含有使不含有上述被檢測物質的溶液與上述熒光標記物質和上述結合物質接觸的工序(f)，在工序(c)中，測定上述工序(b)和上述工序(f)后的起因于上述熒光標記物質的熒光偏振度。
5.根據權利要求4所述的熒光偏振法，其中，還包括求出上述工序(b)和上述工序(f)后的起因于上述熒光標記物質的各熒光偏振度和上述被檢測物質的濃度之間相關性的工序(g)。
6.根據權利要求1所述的熒光偏振法，其中，還包括準備沒有固定上述結合物質的第2固體支持體以及與上述被檢測物質特異結合的用熒光色素標記的熒光標記物質的工序(d)；以及使上述第2固體支持體和上述熒光標記物質與上述被檢測物質接觸的工序(e)，上述第2固體支持體是用與除去了上述結合物質的上述第1固體支持體同樣的材料做成，在上述工序(c)中，對上述工序(b)和上述工序(e)后的起因于上述熒光標記物質的熒光偏振度進行測定。
7.根據權利要求1所述的熒光偏振法，其中，上述第1固體支持體可以是微量滴定板。
8.根據權利要求1所述的熒光偏振法，其中，上述第1固體支持體可以是微粒子。
9.根據權利要求1所述的熒光偏振法，其中，上述熒光標記物質用熒光弛豫時間為1毫微秒以上的熒光色素標記。
10.根據權利要求9所述的熒光偏振法，其中，上述熒光色素與上述結合物質的一級～三級氨基、羧基、巰基、苯基、酚基或羥基結合。
11.根據權利要求1所述的熒光偏振法，其中，上述結合物質是抗體、受體、核酸或抑制劑中的任一種。
12.根據權利要求1所述的熒光偏振法，其中，上述結合物質是多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、Fab抗體、F(ab2)抗體、或Fv抗體中的任一個。
13.根據權利要求1所述的熒光偏振法，其中，上述被檢測物質是生物體內物質、微生物、或病毒。
14.根據權利要求1所述的熒光偏振法，其中，上述結合物質是第1抗體，上述熒光標記物質是用熒光色素標記的第2抗體，上述第1抗體和上述第2抗體分別識別不同抗原決定簇。
15.一種試劑盒，是在對被檢測物質進行測定的熒光偏振法中使用的試劑盒，備有固定了與上述被檢測物質特異結合的結合物質的固體支持體以及與上述被檢測物質特異結合的用熒光色素標記的熒光標記物質。
16.一種生物傳感器，備有含有被檢測物質的溶液移動的流路，上述流路備有用于導入含有被檢測物質的溶液的樣品導入部；連接在上述樣品導入部的、與上述被檢測物質特異結合的用熒光色素標記的熒光標記物質以可洗脫到上述溶液中的狀態(tài)填充的熒光標記物質保持部；以及與上述熒光標記物質保持部連接的、與上述被檢測物質特異結合的結合物質被固定在固體支持體上的結合物質保持部。
17.根據權利要求16所述的生物傳感器，其中，上述溶液通過毛細管力、離心力、或電位差驅動而在上述流路內流動。
18.根據權利要求16所述的生物傳感器，其中，上述流路在上述固體支持體中形成，上述固體支持體是毛細管。
19.根據權利權利要求18所述的生物傳感器，其中，上述毛細管充填了載體。
20.根據權利要求18所述的生物傳感器，其中，對于上述毛細管，溶液可以在內部自由流動。
21.根據權利要求16所述的生物傳感器，其中，上述固體支持體是浸漬含有上述被檢測物質的溶液的溶劑的材料。
22.根據權利要求16所述的生物傳感器，其中，至少備有兩個流路。
全文摘要
本發(fā)明的熒光偏振法是測定被檢測物質的熒光偏振法，包括準備固定了與上述被檢測物質特異結合的結合物質的第1固體支持體以及與上述被檢測物質特異結合的用熒光色素標記的熒光標記物質的工序(a)；使上述熒光標記物質和上述結合物質與上述被檢測物質接觸的工序(b)以及對起因于上述熒光標記物質的熒光偏振度進行測定的工序(c)。
文檔編號G01N33/536GK1522367SQ03800590
公開日2004年8月18日 申請日期2003年3月27日 優(yōu)先權日2002年3月27日
發(fā)明者北脅文久, 河村達朗, 朗 申請人:松下電器產業(yè)株式會社