專利名稱：毒性測試的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種使用球狀體(spheroid)的體外毒性分析方法。
球狀體具有用作體外模型的潛力以測試不同濃度的化合物的毒性。在體外模型中應(yīng)用球狀體作為可重復(fù)的和可靠的毒性指示劑是使用活體動(dòng)物的合意的替代物。
本發(fā)明人開發(fā)了細(xì)胞散布抑制測試(cell spreading inhibition test)，其基于當(dāng)球狀體生長于適當(dāng)?shù)谋砻娌⑻幱陟o態(tài)即沒有搖動(dòng)時(shí)所觀察到的球狀體細(xì)胞生長或球狀體中細(xì)胞的“散布”。如圖1所示，細(xì)胞從球狀體表面生長。發(fā)現(xiàn)當(dāng)球狀體暴露于一定濃度的毒藥時(shí)，細(xì)胞散布被抑制。細(xì)胞散布的抑制提供了毒性的一種指示劑。
本發(fā)明的第一個(gè)方面提供了一種體外毒性分析方法，其包含a)將球狀體樣品暴露于一種選定濃度的待分析的化合物；b)孵育所述球狀體樣品一段適當(dāng)?shù)臅r(shí)間；和c)觀察是否發(fā)生了細(xì)胞散布抑制。
在選定的濃度，如果相對(duì)于沒有暴露于待分析的化合物的對(duì)照球狀體時(shí)，在樣品中觀察到所有球狀體沒有細(xì)胞散布，或只有非常有限的散布，則認(rèn)為散布抑制是陽性(+)結(jié)果。然而，如果在樣品中一或多個(gè)球狀體中有可觀察到的細(xì)胞散布，這個(gè)細(xì)胞散布抑制是陰性(-)結(jié)果。
當(dāng)觀察到部分散布，即樣品中有一些可觀察到的細(xì)胞散布，但不像對(duì)照中那樣廣泛，則在較高化合物濃度下重復(fù)分析以保證可以獲得確定性的結(jié)果，即散布抑制陽性(+)結(jié)果。
當(dāng)發(fā)生了球狀體細(xì)胞散布抑制，這表明在選定的濃度，所述化合物對(duì)衍生了球狀體樣品的細(xì)胞類型具有毒性影響。
此處所有術(shù)語“球狀體”指一種三維結(jié)構(gòu)，典型地，其基本上是球形，其不是天然產(chǎn)生的，其組成為組織的或器官的或從細(xì)胞系形成的再聚集(re-aggregate)細(xì)胞——典型地含有103或更多的細(xì)胞——或是其組合。
此處的術(shù)語“組織”指具有共同功能的有組織的細(xì)胞的集合。術(shù)語“器官”指具有共同功能的有組織的“組織”的集合。術(shù)語“細(xì)胞系”指衍生自經(jīng)過轉(zhuǎn)化的或者是已經(jīng)獲得了連續(xù)分裂能力的細(xì)胞的連續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)物。
“組織”或“器官”不需要十分完整以用于本發(fā)明，因?yàn)榭蓪⑼暾慕M織或器官的部分(可以通過活組織切片獲得)分解為單個(gè)細(xì)胞/小群的細(xì)胞，然后進(jìn)行再聚集以形成用于本發(fā)明的球狀體。
用于生產(chǎn)本發(fā)明所使用的球狀體的細(xì)胞可以衍生自任何合適的組織來源，包括被感染的組織。對(duì)包含神經(jīng)細(xì)胞的球狀體(例如，腦球狀體)，優(yōu)選胎組織。對(duì)于包含其它細(xì)胞的球狀體一般可以使用來自胚胎/胎和非胎的(例如成人來源的)組織。肝細(xì)胞是特別有用的，因?yàn)樗鼈兛梢杂糜谏a(chǎn)保留了某些肝臟特征例如白蛋白分泌、尿素分泌、葡萄糖分泌的球狀體，因而可以在體外模擬肝中物質(zhì)的代謝并用于研究一般的細(xì)胞毒性和特異的肝毒性作用。這是有用的，例如在確定特定的物質(zhì)被肝代謝后是否可能是有毒性的和/或?qū)Ω渭?xì)胞是有直接毒性的(即肝毒素)或影響一般的細(xì)胞功能性。
球狀體可以，大體上從任何動(dòng)物的任何所需的組織或器官通過分解組織或器官樣品，優(yōu)選分解為單個(gè)細(xì)胞或小群的細(xì)胞而產(chǎn)生。例如，對(duì)視網(wǎng)膜和腦組織而言，可以使用如用巴斯德吸液管(Pasteur pipette)通過溫和研碎的機(jī)械分解?；蛘撸梢允褂妹赶?，例如，使肝細(xì)胞分離。
優(yōu)選地，本發(fā)明的球狀體衍生自哺乳動(dòng)物組織或器官，如來自人、非人靈長類動(dòng)物、犬類、嚙齒類(包括大鼠和小鼠)或豬的組織或器官。或者，本發(fā)明的球狀體可以衍生自魚類的組織或器官。
也可以使用來自細(xì)胞系的細(xì)胞。這些可以最初培養(yǎng)為單層以產(chǎn)生更多的細(xì)胞；胰蛋白酶化可以用于單層細(xì)胞培養(yǎng)物的細(xì)胞分離。
本發(fā)明所用的球狀體可以包含兩種或多種不同的細(xì)胞類型，因而細(xì)胞散布抑制表明待測試的毒劑對(duì)組成球狀體的所有的細(xì)胞類型都顯示出了毒性影響。
本發(fā)明所用的球狀體可以是新鮮制備的或可以通過解凍低溫貯藏的球狀體獲得?？梢允褂萌鏦O 98/35021所描述的方法低溫貯藏球狀體。
本發(fā)明的體外分析可以使用一系列不同的選定濃度的待分析化合物來進(jìn)行，以提供估計(jì)的閾值濃度，在該濃度所述化合物對(duì)所述球狀體細(xì)胞類型具有毒性。
通過使用相同的化合物和不同的球狀體細(xì)胞類型進(jìn)行本發(fā)明的分析，可以確定在什么濃度所述化合物對(duì)一種細(xì)胞類型有毒性，但對(duì)其它沒有毒性。


圖1A到1C顯示了當(dāng)生長在靜止?fàn)顟B(tài)的表面時(shí)球狀體細(xì)胞的散布；圖2A到2C顯示了在存在和不存在特異濃度的半乳糖胺時(shí)球狀體的散布；圖3A到3C顯示了在存在和不存在特定濃度的心得安時(shí)球狀體的散布；圖4A到4C顯示了在存在特定濃度的雙氯芬酸(diclofenac)時(shí)球狀體的散布；和圖5A和5B顯示了在存在特定濃度的撲熱息痛時(shí)球狀體的散布。
以下實(shí)施例中，使用了新鮮的肝或HepG2球狀體。重復(fù)每個(gè)測試，以保證獲得相同的結(jié)果，因而保證球狀體細(xì)胞散布抑制測試是毒性的可信賴的指標(biāo)。
制備肝球狀體通過Seglen P.O.((1976)Preparation of isolated rat liver cells.MethodsCell Biol.13，29-38)中描述的并被Lazar，A.；Peshwa，M.V.，Wu，F(xiàn).J.，Chi，C.M.，Cerra，F(xiàn).B.，和Hu，W.S.((1995)在Extended liver-specificfunctions of procine hepatocyte spheroids entrapped in collagen gel.In VitroCell Biol Anim.31，340-346)改良的兩步膠原酶灌注法從雄性Wistar大鼠的肝制備肝球狀體。分離的肝細(xì)胞的存活率通過臺(tái)盼藍(lán)(trypan blue)染料排除法確定，即一份分離的肝細(xì)胞和等體積的臺(tái)盼藍(lán)染料(1.0％w/v的等張鹽溶液)混合并在室溫孵育最少5分鐘。只有存活率高于80％的分離的肝細(xì)胞制備物用于制備肝球狀體。細(xì)胞懸浮液用培養(yǎng)基(補(bǔ)充了5％FCS，200mM L-谷氨酰胺，2ng/ml的胰島素，100U/ml青霉素和100μg/ml硫酸鏈霉素)稀釋以達(dá)到5×105細(xì)胞/ml的細(xì)胞密度。稀釋的細(xì)胞懸浮液分散在6孔板，3ml/孔。該板在37℃，5％CO2孵箱中的旋轉(zhuǎn)搖床(New Brunswick)上孵育，開始以85rpm的速度搖24小時(shí)，隨后是77rpm。在研究過程中(最多45天，但典型地為2-10天)，該板以此速度旋轉(zhuǎn)。每隔一天，將每個(gè)孔的1.5ml舊的培養(yǎng)基用2.0ml新鮮的培養(yǎng)基置換。在研究的過程中一直進(jìn)行培養(yǎng)基換液(最多45天，但典型地為2-10天)。
用這個(gè)方法制備的球狀體具有統(tǒng)一的大小，典型地為170μm，其中超過80％在160-180μm的范圍內(nèi)。
制備HepG2球狀體HepG2細(xì)胞系(白種人肝細(xì)胞癌細(xì)胞，得自ECACC)在75cm2的培養(yǎng)瓶中，在含有補(bǔ)充了10％FBS，200nM L-谷氨酰胺，100U/ml青霉素和100μg/ml的鏈霉素(GibcoBrill)的MEM(Sigma)的培養(yǎng)基中，以102個(gè)細(xì)胞/ml的初始密度培養(yǎng)為單層細(xì)胞。鋪滿培養(yǎng)瓶的HepG2細(xì)胞通過胰蛋白酶分離并收集在一起以用臺(tái)盼藍(lán)染料排除法進(jìn)行計(jì)數(shù)。細(xì)胞懸浮液用培養(yǎng)基(補(bǔ)充了5％FBS，200nM L-谷氨酰胺，100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素)稀釋到1×106個(gè)細(xì)胞/ml細(xì)胞懸浮液。該細(xì)胞懸浮液鋪在6孔板中，3ml/孔。該板在開始的24小時(shí)置于在37℃的CO2的孵箱中的83rpm的旋轉(zhuǎn)搖床(New Brunswick)，然后旋轉(zhuǎn)速度降至77rpm。體外培養(yǎng)6天(6 DIV culture)后，球狀體準(zhǔn)備待用。
實(shí)施例1將3到5個(gè)新鮮制備的球狀體轉(zhuǎn)移至24孔板的每個(gè)孔中，并暴露于不同濃度的半乳糖胺，詳見表1和2。每個(gè)半乳糖胺濃度使用2個(gè)孔。球狀體在補(bǔ)充了10-15％的FCS，200nM L-谷氨酰胺，100U/ml青霉素和100μg/ml硫酸鏈霉素的肝細(xì)胞培養(yǎng)基(Sigma)中，并在37℃置于5％CO2條件下孵育，而將所述細(xì)胞暴露于半乳糖胺48小時(shí)后觀察對(duì)球狀體細(xì)胞散布抑制的作用。
表1使用新鮮肝球狀體的SCSIT結(jié)果

表2使用新鮮的HepG2球狀體的SCSIT結(jié)果

-表示沒有觀察到球狀體細(xì)胞散布抑制；
+表示球狀體細(xì)胞散布被抑制。
圖2A顯示旋轉(zhuǎn)停止后48小時(shí)的一個(gè)對(duì)照肝球狀體(沒有暴露于半乳糖胺)。沒有觀察到球狀體細(xì)胞散布抑制。圖2B顯示將肝球狀體暴露于16mM濃度的半乳糖胺后48小時(shí)，沒有觀察到球狀體細(xì)胞散布抑制。然而，圖2C顯示將肝球狀體暴露于40mM濃度的半乳糖胺后48小時(shí)，球狀體細(xì)胞散布被抑制。
從表1，可見半乳糖胺在20mM和更高的濃度抑制肝球狀體細(xì)胞散布。
從表2，可見半乳糖胺在16mM和更高的濃度抑制HepG2球狀體細(xì)胞散布。
實(shí)施例2新鮮制備的球狀體暴露于不同濃度的心得安，詳見表3和4，觀察其對(duì)球狀體細(xì)胞散布抑制的作用。
表3使用新鮮的肝球狀體的SCSIT結(jié)果

表4使用新鮮的HepG2球狀體的SCSIT結(jié)果


圖4A顯示肝球狀體暴露于100μM濃度的雙氯芬酸后48小時(shí)，沒有觀察到球狀體細(xì)胞散布抑制。然而，圖4B顯示肝球狀體暴露于1000μM濃度的雙氯芬酸后48小時(shí)，球狀體細(xì)胞散布被抑制。
從表5和6，可見1000μM和更高濃度的雙氯芬酸抑制肝球狀體和HepG2球狀體細(xì)胞散布。
實(shí)施例4新鮮制備的球狀體暴露于不同濃度的撲熱息痛，詳見表3和4，觀察對(duì)球狀體細(xì)胞散布抑制的作用表7使用新鮮的肝球狀體的SCSIT結(jié)果

表8使用新鮮的HepG2球狀體的SCSIT結(jié)果

-表示沒有觀察到球狀體細(xì)胞散布抑制；+表示球狀體細(xì)胞散布被抑制。
圖5A肝球狀體暴露于5mM濃度的撲熱息痛后48小時(shí)，沒有觀察到球狀體細(xì)胞散布抑制。然而，圖5B顯示肝球狀體暴露于50mM濃度的撲熱息痛后48小時(shí)，球狀體細(xì)胞散布被抑制。
從表7和8，可見50mM和更高濃度的撲熱息痛抑制肝球狀體和HepG2球狀體細(xì)胞散布。
總結(jié)從上述的實(shí)施例，清楚可見當(dāng)球狀體暴露于某種濃度的毒素時(shí)，細(xì)胞散布被抑制。這個(gè)作用使用新鮮的肝和HepG2球狀體用所有4個(gè)選擇的毒素都觀察到了。因此，球狀體細(xì)胞散布抑制是可靠的、可重復(fù)的和穩(wěn)定的毒性指標(biāo)。
權(quán)利要求
1.一種體外毒性分析方法，包含a)將一種球狀體樣品暴露于選定濃度的待分析的化合物；b)孵育所述球狀體樣品一段合適的時(shí)間；和c)觀察是否發(fā)生球狀體細(xì)胞散布抑制。
2.權(quán)利要求1的體外毒性分析方法，其中球狀體細(xì)胞散布抑制表示，使用該選定的濃度時(shí)，所述化合物對(duì)所述球狀體細(xì)胞具有毒性作用。
3.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2的體外毒性分析方法，其中所述球狀體細(xì)胞衍生自神經(jīng)元細(xì)胞、肝細(xì)胞或視網(wǎng)膜細(xì)胞。
4.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的體外分析方法，其中所述球狀體樣品衍生自哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
5.權(quán)利要求4的體外毒性分析方法，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞是人類的細(xì)胞、嚙齒類的細(xì)胞或豬的細(xì)胞。
6.權(quán)利要求4的體外毒性分析方法，其中所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞是非人類靈長類的細(xì)胞或犬類的細(xì)胞。
7.權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的體外毒性分析方法，其中所述球狀體樣品衍生自魚類的細(xì)胞。
8.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的體外毒性分析方法，其中所述球狀體細(xì)胞衍生自培養(yǎng)的細(xì)胞系。
9.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的體外毒性分析方法，其中所述球狀體樣品包含一種以上的細(xì)胞類型。
全文摘要
一種體外毒性分析方法，其包含a)將一種球狀體樣品暴露于選定濃度的待分析的化合物；b)孵育所述球狀體樣品一段適當(dāng)?shù)臅r(shí)間；和c)觀察是否發(fā)生了球狀體細(xì)胞散布抑制。
文檔編號(hào)G01N33/50GK1615438SQ03802197
公開日2005年5月11日 申請(qǐng)日期2003年1月14日 優(yōu)先權(quán)日2002年1月14日
發(fā)明者溫迪·珀塞爾, 許晉升 申請(qǐng)人:西英格蘭布里斯脫大學(xué)