專利名稱：針對HCV E2糖蛋白并賦予了體外中和活性的人單克隆抗體Fab片段的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及針對HCV E2糖蛋白并賦有體外中和活性的人單克隆抗體Fab片段。丙型肝炎病毒(HCV)感染了大約4％的世界人口(世界衛(wèi)生組織，1999)。由于宿主的免疫應(yīng)答不能根除感染，超過80％的接觸過這種病原體的個體發(fā)展成了慢性感染，并伴隨著嚴重肝病諸如慢性肝炎、肝硬化和肝細胞癌的風(fēng)險[1，2]。
慢性感染的治療基于干擾素和病毒唑的聯(lián)合療法，極其昂貴，并引起嚴重的副作用，而且效果中等(4名患者中只有1位獲得了長期效果)[3，4]。病毒感染不提供免疫保護。這一事實，以及病毒在免疫系統(tǒng)識別的抗原結(jié)構(gòu)中的高度易變性，阻礙了保護個體免于HCV感染的有效血清療法和疫苗的發(fā)展。因此顯然強烈需要新的抗病毒策略。
作者克隆了編碼針對HCV蛋白質(zhì)之一，即外部E2糖蛋白的大量人Fab抗體片段的基因，E2糖蛋白被認為是免疫保護應(yīng)答最重要的靶標的[5]。然而，要評定這些抗體片段的生物學(xué)活性并不簡單，因為尚無可靠的體外系統(tǒng)可用于測定針對HCV的中和活性。由此，作者只是評定和描述了不同F(xiàn)ab抑制蛋白質(zhì)E2與靶細胞結(jié)合的易變能力，而沒有論證這種活性與血清中和活性之間的相互關(guān)系[5]。
在先前的工作中，Burioni等人(2001)[6]顯示了由HCV感染患者生成的某些抗E2抗體具有消極作用，使得病毒對宿主的免疫應(yīng)答不太敏感，可能是由于其與E2抗原結(jié)合以及其構(gòu)象的修飾[6]。這能夠解釋為什么高滴度抗E2抗體與針對HCV感染的保護沒有直接相關(guān)性。
Bugli等人(2001)[7]繪制了能夠在體外結(jié)合抗E2人Fab板的E2蛋白質(zhì)表位圖譜，顯示了免疫應(yīng)答所針對的四個離散區(qū)域(圖2)[7]。慢性感染患者血清中針對一或多個這些區(qū)域的抗體的存在可能與并發(fā)癥、治療效果降低和不同預(yù)后有關(guān)。因而顯然需要測定生物學(xué)液體中針對HCV E2蛋白質(zhì)不同表位的抗體的方法。本發(fā)明的一個實施方案提供了這種方法。
本發(fā)明的作者還評定了各種抗E2抗體在病毒假型系統(tǒng)中的中和活性，所謂假型即與HCV在外表上相同但在進入靶細胞后能夠生成產(chǎn)生熒光的蛋白質(zhì)的病毒[8]。通過顯示細胞中熒光的存在與否，該方法提供了針對不同表位的抗E2抗體的體內(nèi)中和活性的直接測量。
出乎意料的是，作者發(fā)現(xiàn)兩種鑒定的抗體，即e137和e301能夠以一次腸胃外施用抗體試劑后可達到的濃度中和病毒；另兩種抗體沒有中和活性而且有一種甚至能夠促進病毒感染。
患者體內(nèi)不同抗體群的滴定方法的開發(fā)代表了有價值的診斷和預(yù)后手段，有潛力在有風(fēng)險形成嚴重并發(fā)癥的受感染患者與具有更有利預(yù)后的患者之間進行辨別。在后一組中，這種方法將消除施用還與嚴重副作用有關(guān)的基本無效的治療需要，同時使得花費顯著降低。
由于如此鑒定的E2表位不能通過合成合成肽而重現(xiàn)[5]，因此該方法僅代表確定針對蛋白質(zhì)E2不同部分的抗體的量同相關(guān)臨床和流行病學(xué)數(shù)據(jù)的一種途徑。
人Fab形式的，具有優(yōu)良中和能力的抗E2抗體的鑒定容許對其進行大規(guī)模生產(chǎn)并用作抗HCV治療的藥療法，或作為局部形式的預(yù)防劑用于抑制病毒傳播給處于危險之中的受試者(具有疾病HCV狀態(tài)的人、受到職業(yè)性暴露的個體等)。
本發(fā)明的抗體可以有利的在體外評估用于抗HCV疫苗的候選分子，即能夠刺激中和性抗體而非無效或消極抗體。
能夠識別廣譜病毒的人中和性抗體的可獲得性對于人工疫苗生產(chǎn)可能是至關(guān)重要的。本文件中描述的中和性抗體可用作模板，用于開發(fā)能刺激中和性交叉反應(yīng)性應(yīng)答的疫苗(得自肽或抗獨特型抗體)。
本發(fā)明的目標是針對HCV E2蛋白質(zhì)且賦有體內(nèi)中和活性的人抗體或其功能片段。
在一個具體的實施方案中，本發(fā)明的抗體是表征為下列重鏈和輕鏈可變部分的氨基酸序列的抗體e137
e137重鏈(HC)LLEQSGSEVKVPGSSLKVSCKTSGGTFSTYTFSWVRQAPGQGLEWMGGITPIIGIANYARNFQDRVTITADESTSTVYMEVRRLRSEDTAVYYCAKTSEVTATRGRTFFYSAMDVWGQGTe137輕鏈(LC)MAELTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSWTEFTLTISRLQPEDFATYYCQHLNTYPWTFGQGT在另一個實施方案中，本發(fā)明的抗體是表征為下列重鏈和輕鏈可變部分氨基酸序列的抗體e301e301重鏈(HC)LLEQSGSEVKKPGSSVRVSCTTSGGTLSDYGFNWLRQAPGQGPEWMGGIIPLFRRTTYGQKFQGRLTITADESTGATYMELSSLRSDDTAVYYCAREKVSVLTGGKSLHYFEYWGKGTe301輕鏈(LC)MAELTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSRLAWYQQKRGQAPSLLIYDTSSRATGVPARFSASGSGTQFTLTISSLQSEDFALYYCQQYNDWPSTFGQGT本發(fā)明的另一個目標是抗HCV治療組合物，其包含治療有效量的至少一種本發(fā)明抗體。優(yōu)選，組合物以用于腸胃外用途的純化形式提供，或是用于局部用途的包含本領(lǐng)域?qū)＜抑赖馁x形劑的另一種制劑，如凝膠、乳劑、軟膏、小珠。
本發(fā)明的另一個目標是編碼本發(fā)明每一種抗體的核酸。有利的是，核酸可以包含于能夠在原核或也在真核細胞中有效表達本發(fā)明抗體的表達載體中。在一種優(yōu)選形式中，重組載體還包含基本上鄰近本發(fā)明抗體編碼序列的編碼信號肽的核苷酸序列，所述信號肽能夠?qū)⒋丝贵w輸出到細胞環(huán)境以外。
本發(fā)明的另一個目標是重組載體的用途，正如基因療法中所述。
附圖簡述下文通過參考下列附圖在試驗性實施例中描述了本發(fā)明，而非限制本發(fā)明自身。


圖1FIT理論基礎(chǔ)。圖A顯示了Fab-FLAG與其表位在不存在競爭劑時的結(jié)合。使用(A)中存在的相同F(xiàn)ab濃度，將抗原與患者血清預(yù)保溫能夠定量分析血清中針對Fab所識別的表位的抗體。在圖B和C中，所結(jié)合的抗體由于與Fab競爭而與圖A相比成比例的減少結(jié)合量。在圖D和E中，不針對特定表位的抗體的存在毫不影響Fab結(jié)合。
圖2A和B含已知濃度e8-IgG1和e509-IgG1(針對Fab所識別表位的完整抗體)的血清對e8-FLAG(A)和e509-FLAG(B)結(jié)合HCV/E2的抑制。顯然，只有在存在具有相同特異性的完整抗體時才能夠觀察到對Fab結(jié)合的抑制，而且這還取決于抗體濃度。
圖3A、B、和C經(jīng)純化的抗HCV/E2人重組Fab在不同濃度對VSV/HCV和VSV/G假型感染的抑制。被Fab處理的假型感染的HepG2細胞溫育16小時，并通過熒光顯微鏡檢術(shù)測定表達綠色熒光蛋白的細胞數(shù)目。將數(shù)據(jù)表述成相對于在對照孔(不加Fab)中檢測到的感染的百分比。所示結(jié)果是雙份進行的三個獨立測定的平均值。
圖4HCV/E2表面上存在的、由本研究中所用單克隆抗體識別的人B細胞表位的二維表面樣圖譜。重疊圈指示交互抑制。賦有VSV/HCV假型中和活性的Fab標有下劃線。介導(dǎo)HCV/E2與細胞靶相互作用的推定區(qū)以虛線指示。由中和性抗體識別的推定區(qū)以黑色實線圈指示。由于能夠由抗原-抗體相互作用誘導(dǎo)的改變，此圖不符合真實的物理圖譜。
實施例1材料和方法抗HCV Fab和完整IgG1的生成別處已經(jīng)描述了抗HCV/E2 Fab的生成、純化、和鑒定[5]。如別處所述構(gòu)建和純化FLAG-Fab(用FLAG表位標記的Fab，標記通過五肽橋融合于重鏈片段的羧基末端)[6]。使用構(gòu)建完整人單克隆抗體(HuMab)的Fab編碼基因進行了測定法的確認和標準化，所述基因插入合適的隨后轉(zhuǎn)染細胞的真核載體中生產(chǎn)[9]。如[10]所述通過免疫親和純化培養(yǎng)物上清液中存在的HuMab，并通過PAGE檢查純度。通過三明治免疫測定法測定了人抗體的量。所有抗體和Fab保存于-70℃直至使用。
血清和標本使用商品診斷試劑盒(Ortho，Raritan，新澤西州)遵循標準程序分析由健康供體和HCV陽性患者獲得的血清。為了制備包含已知量的針對指定表位的抗體的模擬標本，向HCV陰性血清中摻入溶于PBS中的濃的純HuMab，并完全像陽性和陰性血清那樣進行處理。
Fab抑制滴度(FIT)測定法的設(shè)計此測定法的目的是評估血清抑制經(jīng)標記的Fab結(jié)合其表位的能力，從而間接測量血清中表位結(jié)合抗體的量(圖1)。
純化FLAG-Fab[10]，并在FLAG-Fab特異性ELISA中測定以確定抑制試驗中使用的正確濃度。簡而言之，通過ELISA滴定已知濃度的FLAG-Fab制劑[11]，其中用PBS/1％BSA將抗原包被板于37℃封閉1小時。除去封閉液后，向孔中加入50μl以PBS/1％BSA連續(xù)稀釋的FLAG-Fab，并于37℃保溫2小時。在自動洗板儀(DiaSorin，Saluggia，意大利)中將板用PBS/0.05％吐溫-20清洗10次，然后加入50μl抗FLAG小鼠單克隆抗體M2(Sigma，圣路易斯，密蘇里州)的10μg/ml PBS/1％BSA溶液。于37℃保溫1小時后，如上所述用PBS/吐溫-20將孔清洗10次，并用辣根過氧化物酶綴合的山羊抗小鼠IgG(Pierce，1∶8,000溶于PBS)顯現(xiàn)小鼠單克隆抗體結(jié)合。加入底物，并于室溫暗保溫30分鐘后在自動讀板儀中于OD450讀板。所有測定至少進行兩份。始終包括陰性對照抗原(BSA)，并減去OD讀數(shù)作為背景。
為了測定血清的Fab抑制滴度(FIT)，將在標準條件下產(chǎn)生的OD450讀數(shù)等于最大讀數(shù)50％的純化FLAG-Fab濃度用于Fab抑制ELISA的進一步試驗。對于這些試驗，如上文所述包被和封閉板。每個ELISA孔加入50μl的血清在PBS/1％BSA中的1∶4連續(xù)稀釋度。于37℃保溫2小時后，向血清稀釋液中直接加入純化的FLAG-Fab以達到目的終濃度。將板另外保溫30分鐘，然后如上文關(guān)于FLAG-Fab ELISA所述進行處理。包括陽性對照樣品，即包含20∶1過量的純化的未標記Fab，相當(dāng)于100％抑制。也包括陰性對照樣品，即包含過量的對照無關(guān)的Fab[12]，相當(dāng)于0％抑制。最終結(jié)果測定為抑制百分比，公式如下抑制百分比＝100×(探針FLAG-Fab獨自的OD450-探針FLAG-Fab及競爭血清的OD450)/探針FLAG-Fab獨自的OD450。
將產(chǎn)生高于70％的FLAG-Fab結(jié)合抑制的最高血清稀釋度看成是該表位與該血清的Fab抑制滴度(FIT)。
結(jié)果對每種FLAG-Fab確定在測定法中采用的合適的FLAG-Fab濃度，且范圍由10μg/ml(e8、e20、e137、e301、e509)至0.1μg/ml(e10-B)。下文給出了各種抗體的輕鏈和重鏈氨基酸序列
e8HCLLEQSGAEVKMPGATVKVSCQSSRYTFTSYGIGWVRQAPGQGLEWMGWISGYTHETKYAQSFQGRVTMTAETSTGTAYMELRSLRSDDTATYYCARDGGGRVVVPPTHLRAFDVWGQGTe8LCMAELTQSPGTLSLSPGERATLSCRASHRVNNNFLAWYQQKPGQAPRLLISGASTRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPDDFAVYYCQQYGDSPLYSFGQGTe10HCLLESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGVSISYGGRGVSYWGWVRQSPGKGLEWIGHIYYFGDTFYNPSLNNRATISIDSSKNQFSLKLKSVTASDTALYFCARSTLQYFDWLLTREAAYSIDFWGQGIe10LCMAELTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQGVTILLAWYQQKPGKPPKALIYAASSLQSGVPSRFSGSGSDTDFTLTISSLQPEDSATYYCQQLNTYPWTFGQGTe20HCLLEQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGDHYGINWVRQAPGQGLEWMGGIIPVFGTTTYAQKFQGRATITADDSTGTAFLELTRLTFDDTAVYFCATPHQLHVLRGGKALSPWDYWGQGTe20LCMAELTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKRGQAPSLLIYGTSTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNDWPSTFGQGTe137HCLLEQSGSEVKVPGSSLKVSCKTSGGTFSTYTFSWVRQAPGQGLEWMGGITPIIGIANYARNFQDRVTITADESTSTVYMEVRRLRSEDTAVYYCAKTSEVTATRGRTFFYSAMDVWGQGTe137LC
MAELTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSWTEFTLTISRLQPEDFATYYCQHLNTYPWTFGQGTe301HCLLEQSGSEVKKPGSSVRVSCTTSGGTLSDYGFNWLRQAPGQGPEWMGGIIPLFRRTTYGQKFQGRLTITADESTGATYMELSSLRSDDTAVYYCAREKVSVLTGGKSLHYFEYWGKGTe301LCMAELTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSRLAWYQQKRGQAPSLLIYDTSSRATGVPARFSASGSGTQFTLTISSLQSEDFALYYCQQYNDWPSTFGQGTe509HCLLEESGAEVKKPGSSVKVSCKTSGDTFRYGITWVRQAPGQGLEWMGQIMPTFATATYAQRFQGRVTISADESTSTAYLEVRSLRSEDTAVYYCATPRQVTILRGPKALSPWDYWGQGTe509LCMAELTQSPATLSASPGERASLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLISGASTRATGVPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYNNWPPHFGQGT下文給出了編碼上文所列Fab片段的核苷酸序列e8HCCTGCTCGAGCAGTCTGGAGCTGAGGTGAAGATGCCTGGGGCCACAGTGAAGGTCTCCTGCCAGTCTTCCCGTTACACCTTCACCAGTTACGGTATCGGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAGGGGCTTGAGTGGATGGGATGGATCAGCGGATACACCCATGAGACAAAATATGCACAGAGTTTCCAGGGCAGAGTCACCATGACCGCAGAGACATCCACGGGCACAGCGTATATGGAGTTGAGGAGCCTGCGGTCTGACGACACGGCCACATATTACTGCGCGAGAGATGGAGGAGGGAGGGTGGTAGTGCCGCCTACTCATCTACGTGCTTTTGATGTCTGGGGTCAAGGGACGe8LC
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為了證明FIT能夠有效測量針對由我們的FLAG-Fab識別的表位的抗體，通過混合陰性血清和具有指定特異性的人單克隆抗體，獲得包含已知量的針對由我們的Fab限定的HCV E2表位的IgG的假樣品而制備模擬標本，然后進行相同分析。結(jié)果(圖2A和B)顯示FIT與抗體量之間存在很好的相關(guān)性，這指示FIT能夠?qū)颊哐逯斜砦惶禺惖目贵w的量提供可靠信息。
最后，F(xiàn)IT在HCV陽性血清中始終是陽性的，數(shù)值圍繞廣泛的稀釋度。對于相同血清樣品中的不同F(xiàn)ab，F(xiàn)IT非常多樣，同時患者之間的異質(zhì)性顯著。
實施例2材料和方法人抗體片段此實施例中的人重組抗體片段在Bugli等人(2001)[7]中有完整描述，且對應(yīng)于實施例1中所用的那些。簡而言之，由包含一位58歲女性的IgG1/κ全集的噬菌體展示組合文庫獲得編碼Fab的基因，所述女性患有慢性肝炎，且血液中持續(xù)存在基因型1b的HCV RNA。將所選基因插入合適的細菌表達載體[13]，并且然后將轉(zhuǎn)化的細胞用作重組Fab來源，如[14]所述生成并純化Fab。已經(jīng)描述了這些分子的中和E2結(jié)合細胞(NOB)活性[5，15]及交互相互作用[7]。通過抑制ELISA測定HCV感染患者血清中類似抗體的存在[7]。
假型和中和測定此處所用假型在Matsuura等人(2001)[8]中已經(jīng)完整鑒定和描述。簡而言之，VSVΔG*/HCVE1-E2假型(VSV/HCV)由水泡性口膜炎病毒組成，其中G包膜蛋白由嵌合E1和E2HCV包膜糖蛋白取代，后者由1b型HCV cDNA克隆(NIH-J1)的E1和E2蛋白質(zhì)的外結(jié)構(gòu)域融合N端信號序列以及VSV G蛋白的跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域組成[8]。構(gòu)建質(zhì)粒[16]以及真核表達載體已有描述[8，17]。通過用其中G蛋白編碼區(qū)已被綠色熒光蛋白基因(GFP)取代的重組VSV感染組成性表達嵌合E1和E2 cDNA的CHO細胞來制備VSV/HCV[18]。通過用VSVΔG*感染瞬時表達G蛋白的細胞系來生成用作對照(并用于生成VSV/HCV假型)的VSVΔG*/HCVE1-E2(VSV/G)假型。如[8]所述進行中和測定法。將純化的人重組Fab的稀釋物與2.4×103個感染單位(IU)的假型VSV/HCV或VSV/G于37℃保溫30分鐘，并接種在96孔板中準備好的HepG2細胞(4×104個細胞)。于37℃吸附60分鐘后，用含10％FBS的DMEM將細胞清洗3次，并于37℃保溫16小時。通過熒光顯微鏡檢術(shù)對GFP表達細胞計數(shù)以測定病毒IU。數(shù)據(jù)表述成相對于不加抗體的對照孔的抑制百分比。數(shù)據(jù)是雙份進行的三個試驗的平均值。
結(jié)果抗HCV/E2人單克隆抗體組的生成和序列鑒定人單克隆抗體Fab片段組代表了持續(xù)感染基因型1b HCV的患者的抗HCV/E2免疫全集[5，19]。使用CHO細胞表達的純化重組基因型1a HCV/E2(H株)選擇的抗體片段已經(jīng)完整鑒定，并相應(yīng)于慢性感染患者血清中存在的克隆[7]，且共享相等的HCV/E2親合力。五種抗體的每一種都代表了五個家族之一，其中將該患者的整個抗E2抗體全集分組。屬于相同家族的Fab共享類似的生物學(xué)活性并具有強DNA序列同源性[5]。五種Fab的每一種都識別E2表面的不同表位[7]。相關(guān)種系序列的分歧一般具有抗原驅(qū)動的親合成熟(表1a和1b)，這提示長時間暴露于抗原。
表1A、B抗HCVE2人單克隆抗體可變區(qū)的種系和V基因突變。
如Burioni等人(1998)[5]所述測定序列，并與IMGT數(shù)據(jù)庫的種系序列一起比對[21]。根據(jù)Kabat和Wu比對方法[22]計算核苷酸和氨基酸突變百分比，考慮重鏈和輕鏈的構(gòu)架區(qū)(FR)1、FR2和FR3、重鏈的互補決定簇(CDR)1和CDR2、輕鏈的CDR1、CDR2和CDR3。
表1a重鏈
表2氧化鋅粉末的物理化學(xué)數(shù)據(jù)
*n.d.＝未檢測；
表2抗HCV/E2抗體特征在濃度(以μg/ml計)達到中和純HCV/E2制劑結(jié)合細胞靶的50％時計算NOB活性。
對照抗體[23]對假型系統(tǒng)不發(fā)揮作用，正如它不能中和VSV/HCV和VSV/G假型。VSV/G假型受到在這些試驗中作為中和對照的多克隆抗VSV抗血清的高至1∶1000稀釋度的適度中和[8]，而后者對VSV/HCV沒有效果。在幾名宿主中產(chǎn)生的多克隆和單克隆抗E1和抗E2抗體顯示對VSV/HCV假型都沒有效果。
單價Fab的中和活性顯示可以抑制HCV進入而無需病毒體聚集或交聯(lián)；此外，病毒與其細胞靶之間相互作用的阻斷似乎不太可能是HCV中和的關(guān)鍵因素。這些資料能夠在分子水平解釋血清中NOB活性與針對疾病的保護作用之間缺乏相關(guān)性。
抗HCV抗體提供了一定程度的交叉保護作用，因為用基因型1a的E2選擇的抗E2抗體能夠中和攜帶基因型1b的E2的假型。
結(jié)果顯示Fab 509能夠增強VSV/HCV假型病毒的傳染性，盡管對VSV/G構(gòu)建物沒有明顯效果。e509特異且非常有效地結(jié)合E2中結(jié)合CD81(一種參與病毒吸附細胞的細胞結(jié)構(gòu))的區(qū)域，可能解釋關(guān)于此抗體促進病毒的進入能力[24]。e509與E2的結(jié)合能夠模擬E2與其細胞靶之一的結(jié)合，并模擬與CD81所誘導(dǎo)的類似的E2構(gòu)象改變。E2存在至少兩種構(gòu)象狀態(tài)，而且結(jié)合此蛋白質(zhì)的抗體能夠通過調(diào)控人Fab的NOB活性來改變蛋白質(zhì)空間狀態(tài)，無需結(jié)合競爭[6]。因此，F(xiàn)ab 509似乎是研究HCV與細胞表面之間相互作用的關(guān)鍵工具，而且能夠用于評估作為疫苗的分子的體外模型中。
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序列表<110>Burioni，Roberto<120>針對HCV E2糖蛋白并賦予了體外中和活性的人單克隆抗體Fab片段<130>30068<150>IT RM2002A/000049<151>2002-01-30<160>24<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>119<212>PRT<213>人(Homo sapiens)<400>1Leu Leu Glu Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Met Pro Gly Ala Thr Val1 5 10 15Lys Val Ser Cys Gln Ser Ser Arg Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Gly Ile20 25 30Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp35 40 45Tle Ser Gly Tyr Thr His Glu Thr Lys Tyr Ala Gln Ser Phe Gln Gly50 55 60Arg Val Thr Met Thr Ala Glu Thr Ser Thr Gly Thr Ala Tyr Met Glu65 70 75 80Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg85 90 95Asp Gly Gly Gly Arg Val Val Val Pro Pro Thr His Leu Arg Ala Phe
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35 40 45Trp Ile Gly His Ile Tyr Tyr Phe Gly Asp Thr Phe Tyr Asn Pro Ser50 55 60Leu Asn Asn Arg Ala Thr Ile Ser Tle Asp Ser Ser Lys Asn Gln Phe65 70 75 80Ser Leu Lys Leu Lys Ser Val Thr Ala Ser Asp Thr Ala Leu Tyr Phe85 90 95Cys Ala Arg Ser Thr Leu Gln Tyr Phe Asp Trp Leu Leu Thr Arg Glu100 105 110Ala Ala Tyr Ser Tle Asp Phe Trp Gly Gln Gly Ile115 120<210>4<211>102<212>PRT<213>人<400>4Met Ala Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Val Thr Ile Leu20 25 30Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Pro Pro Lys Ala Leu Ile35 40 45Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Asp Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Asn Thr Tyr Pro Trp85 90 95Thr Phe Gly Gln Gly Thr100<210>5<211>116<212>PRT
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1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr20 25 30Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Trp Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Leu Asn Thr Tyr Pro Trp85 90 95Thr Phe Gly Gln Gly Thr100<210>9<211>118<212>PRT<213>人<400>9Leu Leu Glu Gln Ser Gly Ser Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val1 5 10 15Arg Val Ser Cys Thr Thr Ser Gly Gly Thr Leu Ser Asp Tyr Gly Phe20 25 30Asn Trp Leu Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Pro Glu Trp Met Gly Gly35 40 45Ile Ile Pro Leu Phe Arg Arg Thr Thr Tyr Gly Gln Lys Phe Gln Gly50 55 60Arg Leu Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Gly Ala Thr Tyr Met Glu65 70 75 80Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg85 90 95Glu Lys Val Ser Val Leu Thr Gly Gly Lys Ser Leu His Tyr Phe Glu100 105 110Tyr Trp Gly Lys Gly Thr
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<400>13ctgctcgagc agtctggagc tgaggtgaag atgcctgggg ccacagtgaa ggtctcctgc 60cagtcttccc gttacacctt caccagttac ggtatcggct gggtgcgaca ggcccctgga120caggggcttg agtggatggg atggatcagc ggatacaccc atgagacaaa atatgcacag180agtttccagg gcagagtcac catgaccgca gagacatcca cgggcacagc gtatatggag240ttgaggagcc tgcggtctga cgacacggcc acatattact gcgcgagaga tggaggaggg300agggtggtag tgccgcctac tcatctacgt gcttttgatg tctggggtca agggacg 357<210>14<211>312<212>DNA<213>人<400>14atggccgagc tcacccagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60ctctcctgca gggccagtca cagagtcaat aacaacttct tagcctggta tcagcagaaa120cctggccagg ctcccaggct cctcatctct ggtgcatcta ccagggccac tggcatccca180gacaggttca gtggcagtgg gtctggaaca gacttcactc tcaccatcag cagactggag240cctgatgatt ttgcagttta ttattgtcag cagtatggtg actcacctct ttattctttt300ggccagggga cc312<210>15<211>372<212>DNA<213>人<400>15ctgctcgagt ctggcccagg actggtgaag ccttcacaga ccctgtccct cacctgcacc 60gtctccggtg tctccatcag ttacggtggt cgtggcgttt cctactgggg ttgggtccgc120cagtccccag ggaagggcct ggagtggatt ggccacatct actactttgg agacaccttc180tacaacccgt ccctcaacaa tcgagctacc atatcaatag actcatccaa aaaccagttc240tccctcaagc tcaagtctgt gactgcctca gacacggccc tgtatttctg tgccaggagc300accctacagt attttgactg gttattgaca cgggaggctg cctactccat tgacttctgg360ggccagggaa ta372<210>16<211>306
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1.針對HCV E2蛋白質(zhì)的人抗體或其功能性片段，其特征為具有體內(nèi)中和活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的抗體，即抗體e137，其特征為具有下列的重鏈和輕鏈可變部分序列e137重鏈(HC)LLEQSGSEVKVPGSSLKVSCKTSGGTFSTYTFSWVRQAPGQGLEWMGGITPIIGIANYARNFQDRVTITADESTSTVYMEVRRLRSEDTAVYYCAKTSEVTATRGRTFFYSAMDVWGQGTe137輕鏈(LC)MAELTQSPSFLSASVGDRVTITCRASQGISNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSWTEFTLTISRLQPEDFATYYCQHLNTYPWTFGQGT
3.根據(jù)權(quán)利要求1的抗體，即抗體e301，其特征為具有下列的重鏈和輕鏈可變部分序列e301重鏈(HC)LLEQSGSEVKKPGSSVFVSCTTSGGTLSDYGFNWLRQAPGQGPEWMGGIIPLFRRTTYGQKFQGRLTITADESTGATYMELSSLRSDDTAVYYCAREKVSVLTGGKSLHYFEYWGKGTe301輕鏈(LC)MAELTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSRLAWYQQKRGQAPSLLIYDTSSRATGVPARFSASGSGTQFTLTISSLQSEDFALYYCQQYNDWPSTFGQGT
4.抗HCV治療組合物，包含治療有效量的至少一種根據(jù)上述權(quán)利要求的抗體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的組合物，以凝膠、乳劑、軟膏和小珠制劑局部使用。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-3之任一的抗體用于使抗HCV疫苗有效的用途。
7.編碼根據(jù)權(quán)利要求1-3之任一的抗體的核酸。
8.包含根據(jù)權(quán)利要求7的核酸的重組表達載體，其能夠在原核或真核細胞中有效表達權(quán)利要求1-3的抗體。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的重組載體，其還包含基本上鄰接編碼權(quán)利要求1-3的抗體序列的編碼信號肽的核苷酸序列，所述信號肽能夠?qū)⒋丝贵w輸出到細胞環(huán)境以外。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的重組載體在基因療法中的用途。
11.用于確定生物液體中存在針對HCV E2蛋白質(zhì)不同表位的抗體的方法，包括下列步驟a)確定所述液體中存在能夠抑制針對蛋白質(zhì)E2不同表位的特異性人Fab結(jié)合的抗體；b)將如此滴定的抗體的存在與患者諸如預(yù)后、對治療的響應(yīng)、傳染性的臨床特征相聯(lián)系起來。
全文摘要
本發(fā)明涉及針對HCV E2糖蛋白、在體內(nèi)能夠具有中和活性的人抗體或其功能性片段；本發(fā)明涉及包含治療有效量抗體的用于抗HCV治療的組合物；用于在凝膠、乳劑、軟膏和小珠(ovule)中局部使用的組合物；抗體用于使抗HCV疫苗有效的用途。
文檔編號G01N33/576GK1856508SQ03803092
公開日2006年11月1日 申請日期2003年1月29日 優(yōu)先權(quán)日2002年1月30日
發(fā)明者羅伯托·布里奧尼 申請人:羅伯托·布里奧尼