專利名稱：細胞能力檢驗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及確定受試者造血的細胞能力的方法，該方法包括以下步驟(a)確定從受試者得到的血樣中存在的白細胞量，其中所述受試者已經(jīng)被施與單劑量G-CSF并且已維持了一定時間，該時間足夠允許白細胞從造血和貯藏組織以及邊集(margination)部位動員或釋放到血液；和(b)通過用對照受試者動員或釋放的白細胞的量對步驟(a)中確定的白細胞量進行評估來確定造血的細胞能力，其中所述對照受試者選自具有(i)與高劑量細胞毒性化學治療和/或造血細胞移植相關(guān)的疾病、失調(diào)或并發(fā)癥的高危性，(ii)與高劑量細胞毒性化學治療和/或造血細胞移植相關(guān)的疾病、失調(diào)或并發(fā)癥的中危性或(iii)與高劑量細胞毒性化學治療和/或造血細胞移植相關(guān)的疾病、失調(diào)或并發(fā)癥的低危性的受試者。本發(fā)明還涉及選擇抗微生物適宜的預防或治療、嗜中性粒細胞減少性發(fā)熱的適宜的預防或治療、移植CD34+細胞的適宜量、受試者造血生長因子的適宜量或支持治療的適宜水平的方法。最后，本發(fā)明所包括的是從受試者得到的白細胞的用途，用于制備診斷與高劑量細胞毒性療法和/或造血細胞移植相關(guān)的疾病、失調(diào)或并發(fā)癥的易感性的診斷組合物，其中所述受試者已經(jīng)被施用單劑量G-CSF并且已維持了一定時間，該時間足夠允許白細胞從造血和貯藏組織以及邊集部位動員或釋放到血液中。
惡性腫瘤的細胞毒性化學治療后骨髓抑制和造血恢復是治療相關(guān)的發(fā)病和死亡的主要決定因素(Bodey 1966；Link 1994)。從骨髓或外周血收獲的自體造血干細胞和祖細胞的移植可挽救高劑量治療后宿主的造血功能。高劑量療法顯示出淋巴瘤或多發(fā)性骨髓瘤患者中有利的疾病控制和存活(Philip 1995；Attal 1996；Barlogie 1997；Lenhoff 2000)。動員的外周血干細胞(PBSCs)由于是更快移入的移植而幾乎完全代替了自體骨髓作為移植物的使用(Beyer 1995；Schmitz 1996)。PBSC移植物中CD34+細胞的數(shù)目是干細胞和祖細胞數(shù)量的標記并且和造血恢復相關(guān)。盡管可精確確定CD34+細胞的數(shù)目，但是在造血恢復的預測中仍然存在大的易變性(Bensinger1995；Tricot 1995；Weaver 1995；Ketterer 1998)。對細胞毒性療法后在造血恢復中起作用的宿主因素的定義不充分(Tricot 1995；Bolwell 1997)。
使用動員的PBSC通常使高劑量療法后的中性白細胞減少癥減少，雖然該癥在一些天都是嚴重的。大多數(shù)患者發(fā)生表明感染的嗜中性粒細胞減少性發(fā)熱(Kolbe 1997；Reich 2001)。感染的臨床發(fā)病病程是可變的并且許多患者并發(fā)癥可以成為致命的。
粒細胞集落刺激因子(G-CSF)是對嗜中性粒細胞產(chǎn)生和發(fā)揮功能特異的造血生長因子。其增加骨髓中嗜中性粒細胞祖細胞的增殖速率并加速嗜中性粒細胞的成熟(Lord 1989)?，F(xiàn)今G-CSF的主要應用是降低嗜中性粒細胞減少性發(fā)熱的危險并動員PBSCs(Ozer 2000)。
骨髓抑制患者的危險評估，如果可能的話，可用于明確支持治療的不同水平，可用于將造血生長因子的應用和劑量以及抗微生物預防和治療的強度和持續(xù)時間分級。
從而，本發(fā)明根本的技術(shù)問題是提供與高劑量化學治療和/或造血細胞移植相關(guān)的疾病、失調(diào)或并發(fā)癥的預測、診斷、預后和治療的手段和方法，從而上述不希望的副作用可以被避免、改善或充分治療。
通過權(quán)利要求書表征的實施方案解決了本發(fā)明根本的技術(shù)問題。
因此，本發(fā)明涉及確定受試者造血的細胞能力的方法，其包括下述步驟(a)確定從受試者得到的血樣中存在的白細胞量，其中所述受試者已經(jīng)被施與單劑量G-CSF并且已經(jīng)維持了一定時間，該時間足夠允許白細胞從造血和貯藏組織以及邊集部位動員或釋放到血液；和(b)通過用對照受試者動員或釋放的白細胞量評估步驟(a)中確定的白細胞量來確定造血的細胞能力，其中所述對照受試者選自具有(i)與高劑量細胞毒性化學治療和/或造血細胞移植相關(guān)的疾病、失調(diào)或并發(fā)癥的高危性，(ii)與高劑量細胞毒性化學治療和/或造血細胞移植相關(guān)的疾病、失調(diào)或并發(fā)癥的中危性或(iii)與高劑量細胞毒性化學治療和/或造血細胞移植相關(guān)的疾病、失調(diào)或并發(fā)癥的低危性或者為此的易感性的受試者。
在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明涉及上述方法，其中在步驟(b)中，對照受試者是健康受試者。在本發(fā)明的進一步優(yōu)選的實施方案中，通過將在步驟(a)中確定的白細胞數(shù)與一個或多個對照受試者的白細胞數(shù)的存儲數(shù)字或范圍比較來進行評估，其中一個或多個對照受試者優(yōu)選為健康受試者。
此外，本發(fā)明設(shè)想在步驟(b)中，白細胞的量存在于來自對照受試者的血樣中，其中所述白細胞已經(jīng)被動員或釋放。
術(shù)語“造血的細胞能力”指預測與高劑量細胞毒性化學治療和/或造血細胞移植相關(guān)的疾病、失調(diào)或并發(fā)癥的診斷、預后和治療的值。所述值可如下述和相關(guān)的實施例中確定。其代表在細胞毒性療法，如高劑量化學治療后受試者中由于施用單劑G-CSF所誘導的白細胞。造血的細胞能力表示所誘導的白細胞峰對相對尺度和/或類別的影響。通過將白細胞峰歸類成＜25個百分點、＞25個百分點、＜50個百分點、＞50個百分點、＜75個百分點、＞75個百分點，或者轉(zhuǎn)化成關(guān)于分布的中位數(shù)(其可設(shè)為1.0)的相對值可以計算造血細胞能力；也見相伴的實施例。
術(shù)語“白細胞”包括B淋巴細胞和T淋巴細胞、粒細胞(嗜酸性粒細胞、嗜中性粒細胞、嗜堿性粒細胞)、單核細胞和巨噬細胞以及它們的前體或衍生自它們的細胞。
如按照本發(fā)明所用的術(shù)語“受試者”涉及動物，優(yōu)選脊椎動物，和人類。
如此處所用的術(shù)語“施用”指蛋白質(zhì)或多肽，如G-CSF的所有適宜的施用模式。這些施用模式包括G-CSF的靜脈內(nèi)和皮下施用。而且，該物質(zhì)還可與其他物質(zhì)組合以共同的藥物組合物施用或者作為分別的藥物組合物施用。
術(shù)語“單劑”指在測定造血的細胞能力前以特定的時間間隔將G-CSF施用于患者并進行醫(yī)學治療的其他步驟，如PBSCs或造血生長因子的移植或?qū)κ茉囌叩目刮⑸镏委煛Ｈ欢?，所述術(shù)語不必需要G-CSF僅僅施用一次，相反，單劑G-CSF也可以在幾步中獨立地施用。按照本發(fā)明的方法施用的單劑G-CSF可以在細胞毒性治療之前、之中或之后給予。優(yōu)選地，所述單劑在給予細胞毒性治療之后施用。當細胞毒性治療包括為了這種細胞毒性治療施用幾次一種或多種治療劑時，優(yōu)選期望在細胞毒性治療中施用所述G-CSF單劑，從而當為這種細胞毒性治療已經(jīng)第一次施用了一劑治療劑時，但是在為這種細胞毒性治療而施與最后一劑相同的或另一種治療劑之前施用了所述G-CSF單劑。更優(yōu)選地，所述時間間隔為約1到約120小時。更優(yōu)選地，所述時間間隔為約1小時、約2小時、約6小時、約10小時、約12小時、約14小時或約18小時。
在本發(fā)明的另一個實施方案中，單劑G-CSF可獨立于細胞毒性治療和/或造血細胞移植施用。從而術(shù)語“造血的細胞能力”也可以指疾病、失調(diào)或與感染相關(guān)的并發(fā)癥的診斷、預后和治療的預測的值。所述值可如下面和相伴的實施例所描述的確定，獨立于具有細胞毒性治療和/或造血細胞移植的病人的先前治療。其代表由于在受試者中施用單劑G-CSF而誘導的白細胞。造血的細胞能力表示所誘導的白細胞峰對相對尺度的影響。通過將白細胞峰歸類成＜25個百分點、＞25個百分點、＜50個百分點、＞50個百分點、＜75個百分點、＞75個百分點，或者轉(zhuǎn)化成關(guān)于分布的中位數(shù)(其可設(shè)為1.0)的相對值可以計算造血細胞能力；也見相伴的實施例。此外，術(shù)語“單劑”也可以指在測定造血的細胞能力前G-CSF被以特定的時間間隔施用，獨立于醫(yī)學治療的其他步驟，如對受試者的造血生長因子或抗微生物治療或造血移植。所述術(shù)語不必要求G-CSF僅僅被施用一次，相反，單劑G-CSF也可以在幾步中均施用。按照本發(fā)明的方法施用的單劑G-CSF可獨立于細胞毒性治療施用，和/或沒有任何細胞毒性治療。
術(shù)語“G-CSF”指具有粒細胞集落刺激因子的生物學活性的多肽或蛋白質(zhì)，其描述如Filgrastim(h-metHu G-CSF)in clinical practice，Eds.George Morstyn，第二版1998，Marcel Dekker Inc，紐約；Kubota 1990；Asano 1991；Welte 1996。術(shù)語多肽和蛋白質(zhì)在此處為同義詞。優(yōu)選地，所述G-CSF蛋白或多肽具有如Genbank登記號CAA27291(SEQ ID No1)或CAA27290(SEQ ID No2)所示的G-CSF的至少為成熟序列的氨基酸序列，其中氨基酸1到30位對應于信號序列，氨基酸31到207位對應于負責G-CSF生物學活性的成熟多肽。此外，如Genbank登記號CAA01330(SEQ ID No3)或CAA01319(SEQ ID No4)所示的氨基酸序列也對應于成熟G-CSF多肽。治療適宜的G-CSF組合物可通過商業(yè)途徑得到并且在下面詳細描述。G-CSF多肽或蛋白質(zhì)還包括與上面提到的任一序列具有至少70％，至少80％，至少85％，至少90％，至少92％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％或至少99％同一的氨基酸序列的分子變體。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，可以使用具有EP0459630中提供的任一序列的G-CSF變體。同樣，G-CSF的修飾序列可以按照EP0459630的教導制備，并且如此制備的G-CSF可以按照本發(fā)明使用。優(yōu)選地，具有如上描述的G-CSF生物學活性的所述分子變體，而且，具有如上述G-CSF的生物學活性的G-CSF片段也按照根據(jù)本發(fā)明的方法被包括。那些片段可含有成熟G-CSF多肽的N-和C-末端缺失。最后，還位于本發(fā)明方法的范圍內(nèi)的是上述G-CSF蛋白的融合蛋白、其分子變體或片段。所述融合蛋白除了含有所述G-CSF蛋白、其分子變體或其片段之外還含有可從與G-CSF不相關(guān)的蛋白如抗體衍生的氨基酸序列。然而，所示融合蛋白必須顯示出此處提及的G-CSF的生物學活性。本發(fā)明還包括上面提到的蛋白和多肽的所有適宜的化學修飾，象PEG化。PEG化方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。US 6,166,183教導了PEG化的人G-CSF、其生產(chǎn)和用途。
上面提及的蛋白或多肽可在適宜的稀釋劑中施用。選擇稀釋劑使得不影響組合的生物學活性。這些稀釋劑的實例為蒸餾水、生理鹽水、林格溶液、葡萄糖溶液和Hank’s溶液。此外，藥物組合物或制劑也可以含有其他載體、佐劑或非毒性、非治療性、非免疫原性穩(wěn)定劑，等等。而且，所述蛋白或多肽可與其他治療劑，如標準藥物、抗微生物劑、單克隆抗體和其他重組生長或發(fā)育因子共同施用。
術(shù)語“抗微生物劑”旨在包括預防或治療與細菌、真菌、病毒、原生動物或寄生蟲感染相關(guān)的疾病、失調(diào)和/或并發(fā)癥的治療劑。
術(shù)語“足以允許白細胞動員或釋放的時間”指白細胞被G-CSF激活所需要的時間和它們需要被動員并進入血液中的時間。所述時間窗口值可在不同的受試者類別和同一類受試者不同的個體之間變化。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員可容易地采用本發(fā)明的方法而不用進一步的創(chuàng)造性勞動。
術(shù)語“造血和貯藏組織以及邊集部位”包括能夠產(chǎn)生、貯藏或容納白細胞的組織和器官。所述組織或器官或位置包括肝臟、骨髓、脾、淋巴器官、肺、皮膚、血管內(nèi)皮或微循環(huán)。
術(shù)語“評估”包括將本發(fā)明方法的步驟(a)中確定的白細胞的量與在對照受試者中動員或釋放的白細胞的量相關(guān)聯(lián)，其中已知所述對照受試者具有與高劑量細胞毒性化學治療和/或造血細胞移植相關(guān)的疾病、失調(diào)或并發(fā)癥的明確的危險或易感性。優(yōu)選地，通過比較所述白細胞的量或由此得到的統(tǒng)計值實現(xiàn)所述評估。適宜的統(tǒng)計值及其計算是本領(lǐng)域中熟知的并且包括中位值和分布。此外，在相伴的實施例中描述了怎樣進行本發(fā)明的評估的詳細方法。最優(yōu)選地，如在相關(guān)的實施例中所示的，通過比較確定的白細胞量和具有上面提到的疾病、失調(diào)或并發(fā)癥或易感性危險的經(jīng)分類對照組來進行評估。術(shù)語“對照受試者”指已經(jīng)通過本發(fā)明的方法建立了造血的細胞能力并且疾病、失調(diào)、并發(fā)癥或因此的易感性的危險已經(jīng)從基于實驗進行危險評估的以前資料中知道的受試者。術(shù)語“對照組”指與本發(fā)明所提及的疾病、失調(diào)、并發(fā)癥或因此的易感性的危險分類的屬于相同組的對照受試者。
術(shù)語“高度危險”、“中度危險”和“低度危險”指優(yōu)選在受試者被下面的一種療法，如高劑量化學治療治療后，患有疾病、失調(diào)、并發(fā)癥或因此的易感性的個體素質(zhì)的差異。所述高、中或低危險可通過統(tǒng)計學分析。優(yōu)選地，具有高度、中度或低度危險的受試者或一組受試者之間的差異是統(tǒng)計學顯著的。這可通過熟知的統(tǒng)計學技術(shù)包括Student’s t-檢驗、卡方檢驗、Wilcoxon-Mann-Whitney檢驗、Kurskal-Wallis檢驗或Fisher’s精確檢驗、log-rank檢驗、邏輯回歸分析或Cox模型。最優(yōu)選地，如相伴的實施例中所描述的分析危險組，由此進行探索性數(shù)據(jù)分析并關(guān)于中位值、25％和75％百分位數(shù)形成危險組?；谠摲治?，可定義危險組形成的相對取舍點值。在具有接收的相似或相同的化學治療的組內(nèi)，絕對白細胞值也可用作取舍點。術(shù)語“相似的或相同的化學治療”優(yōu)選指這些化學治療其中在基本相同的時間點達到基本相同程度的骨髓抑制。取決于比較的組數(shù)，通過Wilcoxon-Mann-Whitney檢驗或Kurskal-Wallis檢驗來檢驗組的連續(xù)變量中的差異。對于命名類別或規(guī)則類別，對趨勢應用Fisher’s精確檢驗或卡方檢驗。不用進一步的勞動，本領(lǐng)域技術(shù)人員可進行上述檢驗或Cox模型的多層次多變量分析以便檢查預測性因子的獨立影響并建立不同的危險組。
術(shù)語“與高劑量細胞毒性化學治療和/或造血細胞移植相關(guān)的疾病、失調(diào)或并發(fā)癥或因此的易感性”包括已經(jīng)被報導的由該方法導致或與該方法相關(guān)的那些疾病、失調(diào)或并發(fā)癥。優(yōu)選地，這些疾病、失調(diào)或并發(fā)癥包括那些在下面清楚地提出的。有利地，按照本發(fā)明的方法已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過確定已經(jīng)被細胞毒性化學治療治療的受試者中G-CSF所產(chǎn)生的白細胞峰，可以產(chǎn)生用于與高劑量細胞毒性化學治療和/或造血細胞移植相關(guān)的疾病、失調(diào)或并發(fā)癥的危險進行評估的預測性值。在G-CSF施用后的幾小時內(nèi)，白細胞進入循環(huán)。按照本發(fā)明的方法，已經(jīng)觀察了在高劑量治療后給予單劑G-CSF和自體移植與造血恢復相關(guān)的外周血干細胞(PBSCs)后的白細胞峰。性別不匹配的同種異體造血移植接受者中血白細胞XY染色體的熒光原位雜交(FISH)表明移植后早期且在G-CSF施用下的外周血白細胞主要是宿主而不是移植物來源的(Arseniev 1997)。為了進一步排除自體移植對該現(xiàn)象的任何貢獻，在自體移植前施用G-CSF并且調(diào)查是否誘導的短暫白細胞峰是宿主造血能力的功能性度量并且將預測高劑量細胞毒性化學治療后的造血恢復和相關(guān)的變量。
高劑量化學治療后施用單劑G-CSF，由循環(huán)中早期白細胞峰的值預測中性粒細胞減少和白細胞減少的持續(xù)時間和嚴重性以及宿主造血作用的恢復速率。細胞能力檢驗后評估的血液學參數(shù)優(yōu)選為一個或多個以下參數(shù)嗜中性粒細胞和血小板恢復的時間和白細胞減少＜1000/μl的持續(xù)時間、中性粒細胞減少＜500/μl的持續(xù)時間和骨髓抑制時血液中殘余的嗜中性粒細胞/白細胞水平。令人驚奇地，細胞能力檢驗和已知與骨髓移植導致的發(fā)病和死亡相關(guān)的這些血液學參數(shù)之間的相關(guān)性高度顯著。因此，細胞能力檢驗似乎提供了宿主造血作用從而克服細胞毒性治療影響的能力的一種量度。優(yōu)選地，在細胞能力檢驗的時間點，血細胞數(shù)仍然是正常的或者接近正常，檢驗結(jié)果可有利地被認為用于處理骨髓抑制和/或移植物的時間期間。細胞能力檢驗可在細胞毒性治療之前、之中或之后的時間點使用。細胞能力檢驗產(chǎn)生了關(guān)于評估失調(diào)、并發(fā)癥和/或疾病可能性的預測。該預測可被有利地使用以確定療法的中止和/或治療的改變。從而，測量出非常低的細胞能力檢驗值后，可以決定不再(進一步)施用細胞毒性療法和/或移植。備選地，優(yōu)選當測量出低到中等的細胞能力檢驗值時，可決定應該改變療法。例如，可通過例如減少一種或多種其中使用的細胞毒性劑的劑量，和/或通過省略這些細胞毒性劑的至少一種，和/或通過將選擇細胞毒性劑和/或劑量和施用它們的方案改變成另一種方案來改變細胞毒性療法，從而細胞毒性療法對病人的造血系統(tǒng)具有較小的抑制效果。此外，當施用移植術(shù)時，可以考慮更高數(shù)目的CD34+細胞以便重構(gòu)患者的造血系統(tǒng)。備選地或額外地，可以考慮同種異體的或自體造血干細胞的移植，以便(更快)重構(gòu)患者的造血系統(tǒng)。另外，可以改變通常給予的標準抗生素治療以便包括其他抗生素、不同的抗生素和/或更高劑量的抗生素治療，以便更有效地防止和/或治療感染和相關(guān)的并發(fā)癥、失調(diào)、疾病和/或病癥。術(shù)語“抗生素”此處應該被理解為包括有效抵抗細菌、寄生蟲、原生動物、真菌和/或病毒的物質(zhì)。
當比較從不同患者或患者組得到的白細胞數(shù)時，可以進行值的正態(tài)化。為此，可以使用相對尺度，從而僅僅比較數(shù)目的相對增加。備選地，或者組合地，可以使用歸類，例如，如在下面的實施例中使用的歸類，其中值被以四分位數(shù)歸類。在本發(fā)明的另一個實施方案中，基于通過細胞毒性化學治療達到的骨髓抑制的程度和/或存在于患者和/或?qū)φ帐茉囌咧械墓撬枰种频某潭冗M行正態(tài)化。使用這種正態(tài)化，可以有利地比較在評估細胞能力的時間點時具有不同程度的骨髓抑制的不同患者組。
當增加細胞毒性化學治療的開始到單劑G-CSF之間的時間間隔時，試驗誘導的白細胞峰的中位值將因為可得到的成熟血細胞減少而較低。然而，這對造血恢復的速率沒有影響?？紤]到這一點，可以分別地對類似方案組在相對尺度上評估白細胞峰。這些關(guān)于分布中位值的相對值構(gòu)成了如上面討論的連續(xù)的細胞能力檢驗結(jié)果。
細胞能力檢驗自身獨立于外周血干細胞(PBSC)移植，因為檢驗在輸入冷凍保藏的PBSCs之前進行。自體PBSCs的移植補充了化學治療耗盡的祖細胞庫。在多變量分析中，細胞能力檢驗獨立于預測造血恢復中PBSCCD34+細胞的劑量效應。
高劑量化學治療后動員PBSCs的使用導致的快速造血恢復(Beyer1995；Schmitz 1996)和相關(guān)的良好耐受性和低于5％的低治療相關(guān)死亡率已經(jīng)在基于門診病人的基礎(chǔ)上進行自體移植方面激起了興趣(Meisenberg1997；Herrmann 1999；Palumbo 1999)。細胞能力檢驗＞1.0并且當至少標準劑量的CD34+細胞(＞2.5×106/kg)被移植時，作為可能性建議門診病人治療(也見下面的實施例3-5)。在該有利的組中，有最優(yōu)的嗜中性粒細胞和血小板恢復，該恢復分別在10和12天完成。因此，在該組中，造血恢復的發(fā)生沒有延遲并且顯著降低了感染的危險和對抗微生物治療的需要減少。有利地，由于可以進行細胞能力檢驗，可以確定實現(xiàn)有利的造血恢復所進行的移植所需要的閾值CD34+細胞數(shù)。嗜中性粒細胞減少性發(fā)熱經(jīng)常是細胞毒性化學治療后癌癥病人感染的最初跡象和標志。其與顯著的并發(fā)癥率相關(guān)并且通常導致住院和進行作為標準治療的經(jīng)驗性的廣譜靜脈內(nèi)抗微生物治療(Pizzo 1993)。已經(jīng)開發(fā)了包括各種臨床特征的危險模型以限定具有嗜中性粒細胞減少性發(fā)熱的病人的并發(fā)癥危險(Talcott 1992；Klastersky2000)。低危險患者是經(jīng)驗性口服抗微生物療法(Kern 1999；Freifeld 1999)或門診病人治療(Talcott 1994；Rubenstein 1993)的候選者。明顯地，化學治療的強度是嗜中性粒細胞減少性發(fā)熱的一個重要的危險因素而且也是個體容易感染的一個重要的危險因素?；瘜W治療后低白細胞數(shù)可預測嗜中性粒細胞減少性發(fā)熱的發(fā)生(Blay，1996)。第一周期化學治療后嗜中性粒細胞最低點預示隨后在下面的周期中發(fā)生嗜中性粒細胞過低、化學治療劑量減少或治療延遲(Silber，1998)。然而，細胞能力檢驗是發(fā)生嗜中性粒細胞減少性發(fā)熱、有記載的感染和需要的靜脈內(nèi)抗微生物療法的主要預測方法。即使當接受≤2.5×106CD34+個細胞/kg并因此構(gòu)成不利組的病例被排除于分析之外，觀察到的細胞能力檢驗和嗜中性粒細胞減少性發(fā)熱的缺乏和/或有記載的感染之間的連續(xù)的直接聯(lián)系和需要抗微生物療法的相反聯(lián)系并沒有改變。細胞能力檢驗為臨床醫(yī)生提供關(guān)于個體患者感染危險性的額外的信息。細胞能力檢驗還提供了危險層次化的手段。
基于本發(fā)明的研究，已經(jīng)建立了本發(fā)明的方法，該方法可預測獨立于移植的CD34+細胞的劑量效應的造血恢復和預測高劑量細胞毒性化學治療后感染的危險。而且，本發(fā)明的細胞能力檢驗可將造血生長因子的應用和劑量、將要移植的CD34+細胞數(shù)、抗微生物預防和治療的強度和持續(xù)時間和骨髓抑制病人的治療水平分成不同層次。本發(fā)明還包括由于醫(yī)學治療、感染或原發(fā)和繼發(fā)性骨髓疾病或失調(diào)導致的骨髓抑制或免疫抑制的不同形式中的細胞能力檢驗。因此，根據(jù)本發(fā)明，考慮通過應用細胞能力檢驗和根據(jù)細胞能力檢驗的結(jié)果確定適宜的抗微生物、抗真菌和/或抗病毒療法，任選通過考慮其他關(guān)于患者和任選地，他的親戚的總體健康或疾病狀態(tài)的數(shù)據(jù)，來預防通常在骨髓抑制受試者中感染的方法?？拐婢?、抗微生物和/或抗病毒療法可以作為預防性和/或治療性治療施用。例如，對于慢性感染，可基于細胞能力檢驗的結(jié)果和任選地，關(guān)于患者和任選地，他的親戚的總體健康或疾病狀態(tài)的數(shù)據(jù)，決定患者不能夠有效抵抗感染。因此，可以啟動治療性治療。
此外，基于來自細胞能力檢驗的低結(jié)果，可決定治療患者的造血和/或免疫系統(tǒng)，而不是治療感染或通過預防來防止感染。為此，可考慮作為單劑或作為連續(xù)劑或作為長期治療的造血干細胞抑制，或者施用造血生長因子。一種造血生長因子是G-CSF。其他因子包括血栓形成素、GM-CSF、干細胞因子、Fit3配體、紅細胞生成素、KGF。
本發(fā)明還涉及為受試者選擇適宜的抗微生物預防或治療的方法，其中所述方法包括上面提到方法中的步驟和下面的步驟(c)基于步驟(b)中得到的結(jié)果為所述受試者選擇適宜的抗微生物預防法或療法。上面所作的術(shù)語的定義和解釋已作必要的改動而應用。術(shù)語“適宜的抗微生物預防法或療法”包括有效防止微生物感染或允許對其有效治療的醫(yī)學治療。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，所述預防法或療法為治療、防止或改善感染的預防法或療法。
在本發(fā)明的一個更優(yōu)選的實施方案中，所述感染選自真菌、病毒、原生動物、寄生蟲和細菌感染。
在本發(fā)明的一個更優(yōu)選的實施方案中，感染選自肺炎、侵入性真菌感染、小腸結(jié)腸炎、軟組織感染和膿毒癥。
所述醫(yī)學治療可包括施用抗微生物劑或其他物質(zhì)，如卷須霉素、兩性霉素B、氟康唑、三甲氧芐二氨嘧啶-磺胺甲基異噁唑、無環(huán)鳥苷、氧哌嗪青霉素/唑巴克坦、慶大霉素、美羅培南、萬古霉素或所述抗微生物或物質(zhì)同時或相繼施用的任何組合?？梢允┯迷S多其他抗微生物劑或物質(zhì)。同樣，可以給予細胞制劑，象粒細胞注入或其他制劑。這些抗微生物或其他醫(yī)學治療的劑量和方案取決于要實施的是預防還是治療微生物感染。此外，臨床醫(yī)生還必須考慮他/她預計的是什么感染物以及自該患者分離了什么感染物。適宜的抗微生物預防法或治療法的臨界值是受試者造血恢復的能力。這些考慮到目前為止還是基于經(jīng)驗數(shù)據(jù)做出的。由于本發(fā)明，將造血的細胞能力作為受試者中造血恢復和感染危險的關(guān)鍵標志，這一標志可以被確定并允許選擇適宜的預防法或治療法而不用僅僅依賴于經(jīng)驗和平均數(shù)據(jù)。
此外，本發(fā)明涉及為受試者的嗜中性粒細胞減少性發(fā)熱選擇適宜的預防法或療法，其中所述方法包括上面提到的方法的步驟和另一步驟(c)基于在步驟(b)中得到的結(jié)果為嗜中性粒細胞減少性發(fā)熱選擇適宜的預防法或治療法。
上面作出的定義和解釋已作必要的修正后應用。
術(shù)語“嗜中性粒細胞減少性發(fā)熱的預防法或治療法”包括有效防止嗜中性粒細胞減少性發(fā)熱或允許其有效治療的醫(yī)學治療。所述醫(yī)學治療可經(jīng)口或靜脈內(nèi)施用抗微生物劑或生物學體液或細胞療法的一種或其組合。優(yōu)選地，嗜中性粒細胞減少性發(fā)熱的有效預防法或治療法包括施用重組生長和發(fā)育因子或細胞因子象G-CSF以及其他藥物，以不同劑量和方案進行單一或組合治療。最優(yōu)選地，所述重組生長和發(fā)育因子或細胞因子被預防性地施用。嗜中性粒細胞減少性發(fā)熱適宜的預防或治療的臨界值是受試者造血恢復的能力。這些考慮到現(xiàn)在為止都是基于經(jīng)驗數(shù)據(jù)作出的。由于本發(fā)明，造血細胞能力，作為受試者中造血恢復和感染危險的關(guān)鍵標志，可以被確定并允許選擇適宜的預防法或治療法而不用僅僅依賴于經(jīng)驗和平均數(shù)據(jù)。
此外，本發(fā)明涉及為進行受試者的治療而注入的造血干細胞，優(yōu)選CD34+細胞的適宜量的選擇方法，其中所述方法包括上面提到的方法的步驟和另一步驟(c)基于在步驟(b)中得到的結(jié)果選擇為受試者的治療而被注入的所述細胞的量。
上面作出的定義和解釋已作必要的修正后應用。
術(shù)語“用于治療的造血干細胞，優(yōu)選CD34+細胞的適宜的量”指使得有效的造血恢復的所述細胞的量。
本發(fā)明還涉及為受試者的治療選擇造血生長因子或細胞因子的適宜量的方法，其中所述方法包括上面提到的方法的步驟和另一步驟(c)基于在步驟(b)中得到的結(jié)果為所述受試者的治療選擇造血生長因子或細胞因子的適宜量。
上面作出的定義和解釋已作必要的修正后應用。
術(shù)語“造血生長因子或細胞因子的適宜量”指支持有效的造血恢復的造血生長因子的量。優(yōu)選地，所述造血生長因子為G-CSF，或其他因子，象GM-CSF、紅細胞生成素、干細胞因子、血栓生成素或KGF，更優(yōu)選地，G-CSF的適宜的劑量為皮下應用每天約5μg/kg。
本發(fā)明的方法包括體外應用。
本發(fā)明還包括確定受試者造血細胞的能力的方法，該方法包括以下步驟(a)確定參數(shù)，優(yōu)選樣品參數(shù)，其中所述樣品優(yōu)選體液，優(yōu)選血液或來自血樣的樣品，其中該參數(shù)優(yōu)選為在所述來自哺乳動物的樣品中優(yōu)選造血細胞的細胞群體或亞群的標記，其中所述哺乳動物已經(jīng)被施用單劑造血生長因子，優(yōu)選G-CSF，并且已經(jīng)維持了一定時間，該時間足以允許白細胞從造血以及貯藏組織和邊集部位動員或釋放到血樣中，和(b)通過用以類似方式在對照哺乳動物中測量的參數(shù)的值評估步驟(a)中確定的參數(shù)的值來確定造血細胞能力，其中所述對照哺乳動物選自具有(i)與高劑量細胞毒性化學治療和/或造血細胞移植相關(guān)的疾病、失調(diào)或并發(fā)癥的高危性，(ii)與高劑量細胞毒性化學治療和/或造血細胞移植相關(guān)的疾病、失調(diào)或并發(fā)癥的中危性或(iii)與高劑量細胞毒性化學治療和/或造血細胞移植相關(guān)的疾病、失調(diào)或并發(fā)癥的低危性的哺乳動物。
甚至更優(yōu)選地，所述哺乳動物為人。更優(yōu)選地，所述標記為T細胞相關(guān)標記，或者B細胞相關(guān)標記。在本發(fā)明范圍內(nèi)的標記在例如實施例7中詳細說明。
最后，本發(fā)明包括治療如此處特定的受試者中與高劑量細胞毒性化學治療和/或造血細胞移植或因此的易感性相關(guān)的疾病、失調(diào)或并發(fā)癥的方法，該方法包括此處特定的方法的步驟和其他步驟對所述患者施用(i)有效量的適宜的抗微生物預防或治療劑，(ii)有效量的預防或治療嗜中性粒細胞減少性發(fā)熱的預防或治療的適宜的藥劑，(iii)有效量的造血干細胞，優(yōu)選CD34+細胞，或(iv)有效量的造血生長因子。
上面作出的定義和解釋已作必要的修正后應用。
所述施用的藥劑、細胞或生長因子的劑量方案將由主治醫(yī)生和其他臨床因素決定優(yōu)選地按照上述方法的任一種。如在醫(yī)學領(lǐng)域中熟知的，任一病人的劑量取決于許多因素，包括病人的身體大小、身體表面面積、年齡、施用的特定化合物、施用時間和途徑、總體健康狀況以及同時施用的其他藥物?？赏ㄟ^定期評估監(jiān)控進展。
本發(fā)明包括從受試者得到的淋巴細胞的用途，用于制備診斷在所述受試者中高劑量細胞毒性化學治療和/或造血細胞移植相關(guān)的疾病、失調(diào)或并發(fā)癥的易感性的診斷組合物，其中所述受試者已經(jīng)被施用一劑G-CSF并且已維持一定時間，該時間足以允許白細胞從造血和貯藏組織以及邊集部位動員或釋放到血液。
上面作出的定義和解釋已作必要的修正后應用。
如根據(jù)本發(fā)明所用的術(shù)語“診斷組合物”指從所述受試者得到的白細胞實體，這些白細胞可用于確定所述白細胞的治療或診斷值，優(yōu)選地為在血樣的給定體積中白細胞的絕對或相對數(shù)。根據(jù)白細胞數(shù)的確定方法，所述細胞可以被預處理，例如用于熒光激活的細胞分選(FACS)分析或可被應用于適宜的計數(shù)設(shè)備，如計數(shù)載玻片。這些預處理方法是本領(lǐng)域中公知的。
根據(jù)前面所述，在本發(fā)明方法或用途的一個優(yōu)選實施方案中，所述與高劑量化學治療和/或造血細胞移植相關(guān)的疾病、失調(diào)或并發(fā)癥為嗜中性粒細胞減少性發(fā)熱、微生物感染、延遲的造血細胞恢復、出血、免疫抑制、針對宿主的免疫學影響、支持治療的高水平、發(fā)病和死亡。
在本發(fā)明方法和用途的另一個優(yōu)選的實施方案中，所述受試者為人。
在本發(fā)明方法和用途的另一個優(yōu)選的實施方案中，所述受試者已經(jīng)受到高劑量化學治療。
術(shù)語“高劑量化學治療”指當顯著的骨髓抑制伴隨著顯著減少的外周血白細胞和血小板數(shù)以及增加的感染危險時被認為是“高劑量”的化學治療劑量和強度。取決于化學治療物質(zhì)的劑量，可需要或不需要PBSC的移植。經(jīng)常，在高劑量化學治療后應用G-CSF或GM-CSF并且需要血紅細胞或血小板的輸入。
最優(yōu)選地，所述高劑量化學治療包括施用美法侖、白消安、環(huán)磷酰胺、卡氯芥、依托泊苷(etoposide)和阿糖胞苷或者其他化學治療物質(zhì)。在高劑量化學治療中，可以應用逐步上升的劑量。高劑量方案可由逐步上升劑量的物質(zhì)和常規(guī)劑量的物質(zhì)組合組成。對于高劑量化學治療中的額外的免疫抑制，在方案中可包括抗胸腺細胞球蛋白(ATG)或抗淋巴細胞球蛋白(ALG)。
在本發(fā)明的方法或用途的另一個更優(yōu)選的實施方案中，所述受試者已經(jīng)受到骨髓抑制化學治療。
術(shù)語“骨髓抑制化學治療”指化學治療對骨髓功能的效果。當外周血白細胞數(shù)和可能的血小板數(shù)在一定時間內(nèi)減少并且之后自發(fā)恢復或者在造血生長因子刺激下恢復時，化學治療是骨髓抑制的。根據(jù)骨髓抑制的程度，感染的危險可以增加。
更優(yōu)選地，所述骨髓抑制療法包括施用環(huán)磷酰胺、依托泊苷、卡氯芥、阿糖胞苷、美法侖、白消安、阿霉素、表阿霉素、紫杉醇、多西他塞、噻替呱、氟達拉濱、長春新堿、賓達氮芥、順鉑、碳鉑、柔紅霉素、氟尿嘧啶、吉西他濱、去甲柔毛霉素、異環(huán)磷酰胺、伊立替康、氨甲蝶呤、米托蒽醌、草酸鉑、蘇消安、長春堿或長春烯堿。也可以施用其他化學治療物質(zhì)。
在本發(fā)明的方法或用途更加優(yōu)選的實施方案中，所述受試者已經(jīng)受到放射治療，患者患有原發(fā)或繼發(fā)性骨髓疾病、自身免疫疾病、遺傳疾病或失調(diào)或者感染。
術(shù)語“放射治療”指離子放射的任何治療應用。所述放射可以是放射活性放射，包括快電子、中子、質(zhì)子或Pi-介子、微波、IR和UV輻射。優(yōu)選地，所述放射被用于治療癌癥或惡性造血疾病。
術(shù)語“原發(fā)性骨髓疾病”包括原發(fā)性影響骨髓細胞的那些疾病或失調(diào)。所述疾病或失調(diào)的實例為急性或慢性白血病、脊髓發(fā)育不良、再生障礙性貧血、先天性嗜中性白血球減少癥、周期性嗜中性白血球減少癥、先天性和自身免疫嗜中性白血球減少癥。
術(shù)語“繼發(fā)性骨髓疾病”包括其中骨髓繼發(fā)性被牽涉到，如在癌癥的骨髓轉(zhuǎn)移的那些疾病和失調(diào)。
術(shù)語“自身免疫疾病”指與病人中自身抗體的存在相關(guān)的那些疾病。所述疾病或失調(diào)的實例為類風濕性關(guān)節(jié)炎或紅斑狼瘡。
術(shù)語“遺傳疾病或失調(diào)”包括通過遺傳缺陷導致的所有疾病或失調(diào)，這些遺傳缺陷將通過種系遺傳。最優(yōu)選地，本發(fā)明范圍內(nèi)的所述遺傳疾病或失調(diào)為周期性嗜中性白血球減少癥、Kostmann綜合癥、Shwachman綜合癥和高歇病。
術(shù)語“感染”優(yōu)選包括可導致受試者生命危險狀況的感染。感染可導致骨髓抑制的宿主中嚴重的器官功能失調(diào)和器官衰竭。這些感染可由細菌、病毒、真菌、原生動物和寄生蟲像葡萄球菌、鏈球菌、腸球菌、大腸桿菌、克雷伯菌屬、綠膿假單胞菌、假絲酵母屬、曲霉菌屬、肺炎肺囊蟲、巨細胞病毒、皰疹病毒、呼吸道病毒和許多其他微生物引起。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解對于骨髓抑制的患者，任何感染都可以是潛在的威脅生命的。然而，應該進一步理解通過本發(fā)明也有相關(guān)的實施方案，當將要治療、改善和/或防止的感染可能不是生命威脅的或者不導致生命威脅的情況時。然而，在受試者中細胞能力檢驗的應用可使得主治醫(yī)生考慮任何這種感染的治療、防止和/或改善。
按照上面所說的，本發(fā)明提供了確定受試者造血的細胞能力的方法，該方法包括步驟(a)確定從受試者得到的血樣中存在的白細胞的量，其中所述受試者已經(jīng)被施用單劑量G-CSF并且已維持了一定時間，該時間足以允許白細胞從造血和貯藏組織以及邊集部位動員或釋放到血液；和(b)通過用對照受試者動員或釋放的白細胞的量評估步驟(a)中確定的白細胞的量來確定造血的細胞能力。
本發(fā)明優(yōu)選提供了還包括步驟(c)的上面的方法，其中(c)包括基于步驟(b)所得結(jié)果為所述受試者選擇適宜的抗微生物預防或治療或造血生長因子治療。
上面的對照受試者可以是健康的對照受試者。優(yōu)選地，對照受試者選自具有(i)與高劑量細胞毒性化學治療和/或造血細胞移植相關(guān)的疾病、失調(diào)或并發(fā)癥的高危性，(ii)與高劑量細胞毒性化學治療和/或造血細胞移植相關(guān)的疾病、失調(diào)或并發(fā)癥的中危性或(iii)與高劑量細胞毒性化學治療和/或造血細胞移植相關(guān)的疾病、失調(diào)或并發(fā)癥的低危性的受試者。
在本發(fā)明的方法或用途的另一個更優(yōu)選的實施方案中，所述G-CSF為非格司亭(filgrastim)(NeupogenTM；Amgen Inc.，Thousand Oaks，CA，USA)或雷諾司替(lenograstim)(GranocyteTM；Chugai，日本)。
所述G-CSF制品是商業(yè)途徑可得到的并且得到藥物管理局的批準用于醫(yī)學治療的目的。從而，本發(fā)明的方法和用途優(yōu)選應用所述制劑。
優(yōu)選地，G-CSF的所述劑量選自約1到約100μg/kg所述受試者的體重。更優(yōu)選地，G-CSF的劑量選自約1到約20μg/kg所述受試者的體重。
同樣更優(yōu)選地，G-CSF的所述劑量為1.0、2.5、5、7.5、10或15μg/kg所述受試者的體重。
更優(yōu)選地，G-CSF的劑量選自約15到約30、60和約100μg/kg所述受試者的體重。仍然更優(yōu)選地，G-CSF的劑量選自約20到約30、60和約100μg/kg所述受試者的體重。不被理論所束縛，本發(fā)明人認為較高劑量的G-CSF(約15μg/kg所述受試者的體重)導致病人更顯著的區(qū)別從而可提高細胞能力檢驗的預測值。這對于沒有經(jīng)歷高劑量治療的患者或者對于健康受試者尤其正確。如果施用備選的劑量例如基于身體表面面積給藥，打算使用G-CSP的相似絕對量。
在本發(fā)明的方法和用途的更優(yōu)選的實施方案中，所述足以允許白細胞動員或釋放的時間為1到120小時。
同樣更優(yōu)選地，所述足以允許白細胞動員或釋放的時間為至少1小時、至少2小時、至少6小時、至少10小時、至少12小時、至少14小時或至少18小時。
在本說明書的正文中引用了一些文獻。在說明書末尾和權(quán)利要求書前面可發(fā)現(xiàn)完整的文獻目錄引用。此處應用的每篇文獻(包括任何生產(chǎn)商的說明書、用法指導等)在此處被引用作為參考。


圖1單劑量G-CSF施用后白細胞峰和白細胞時程。在受到高劑量美法侖治療的患有多發(fā)性骨髓瘤系列的患者中觀察到(第0天)G-CSF誘導的白細胞峰。在白細胞峰測定后約1小時進行自體PBSC移植。
HDT，高劑量化學治療圖2在嗜中性粒細胞和血小板恢復的預測中細胞能力檢驗相對于CD34+細胞數(shù)的獨立性。為分別的CD34+細胞水平顯示了嗜中性粒細胞(絕對嗜中性粒細胞數(shù)，ANC)(左)和血小板(PLT)恢復(右)的動力學。在各自的CD34+細胞水平中，進行了細胞能力檢驗的分層(≤中位值，＞中位值)。使用分層的log-rank檢驗在三個所指的CD34+細胞水平上通過細胞能力檢驗研究而獨立性預測造血恢復。
圖3通過細胞能力檢驗對＞38.0℃的發(fā)熱和抗微生物治療的預測。細胞能力檢驗的分類基于已建立的相對尺度，其中白細胞峰分布的中位數(shù)設(shè)為1.0。給出了類別中沒有＞38.0℃發(fā)熱(A)的病例和相應的靜脈內(nèi)抗微生物治療(B)的天數(shù)的中位數(shù)的比例。在左邊，顯示數(shù)據(jù)為病例的全部數(shù)目，在右邊為接受CD34+細胞數(shù)≤2.5×106/kg的病例被排除。
圖4G-CSF反應的釋放。高劑量化學治療完成后約30小時給予高劑量G-CSF(5μg/kg)。12-14小時后測定5個不同患者顯示的誘導白細胞峰。之后進行自體血干細胞移植。
圖5根據(jù)幅度(A)以及G-CSF反應與記載的感染率(B)的相關(guān)性排列的代表G-CSF反應的WBC峰的分布。
通過參考下面的生物學實施例闡明本發(fā)明，這些實施例僅僅是闡明性的而不應被理解為對本發(fā)明范圍的限制。
實施例1細胞能力檢驗患者患有多發(fā)性骨髓瘤(MM)和復發(fā)的非-何杰金淋巴瘤(NHL)或何杰金病(HD)的87名患者，他們在一個研究所中受到標準方案的高劑量治療(Philip1995；Barlogie 1997；Weaver 1998；Linch 1993，Palumbo 1999)，然后是單劑量G-CSF，之后是自體外周血干細胞(PBSC)移植?；颊呓o予知情同意。患者的特征在表1中給出。
PBSC動員、收獲、處理和冷凍保存在大多數(shù)患者中，使用G-CSF的IEV方案被用于動員。IEV方案由1-3天靜脈內(nèi)2500mg/m2異環(huán)磷酰胺、1天靜脈內(nèi)100mg/m2表阿霉素、1-3天靜脈內(nèi)150mg/m2依托泊苷之后從第5天起每天皮下5μg/kg G-CSF(非格司亭；Amgen，Thousand Oaks，CA，USA)直到PBSC收獲完成組成。除了個體劑量減少，年齡≥60歲的MM患者從2000年開始接受75％劑量的IEV。當最低點后G-CSF刺激的白細胞數(shù)上升到5000-10000/μL或以上，使用COBE Spectra(COBE，Heimstetten，德國)或AS104(Fresenius，St.Wendel，德國)細胞分離器和標準程序收獲PBSCs。在患有MM或低等級NHL的20名患者(23％)中，從單個白細胞除去法得到的經(jīng)收獲PBSC在收集后立即進行免疫磁性B細胞清洗(MaxSep，Baxter Immunotherapy，Unterschleissheim，德國)。將PBSCs與等體積的用5％HSA和100％DMSO(Cryoserv，Tera Pharmaceuticals，Midvale，UT，USA)(4∶1)制備的冰凍溶液混合。最終DMSO濃度為10％。以計算機控制速率的冰凍后，含有PBSCs的包被保存在液氮的蒸汽相中。
CD34+細胞計數(shù)和PBSC劑量根據(jù)ISHAGE(Sutherland 1993)的方法，使用裝備用氬激光的FACScan(BD，Mountain View，CA，USA)或EPICS XL-MCL(Electronics，Miami，F(xiàn)L，USA)進行CD34+細胞的確定。全血在4℃黑暗中與PE偶聯(lián)的單克隆抗-CD34抗體和FITC偶聯(lián)的單克隆抗-CD45抗體孵育30分鐘，然后洗滌并進行血紅細胞裂解(BD)。在1998年以前，分析了20000個細胞，之后分析了75000個細胞。為排除細胞碎片、血小板、剩余的紅細胞和所有CD45陰性細胞，使用向前散射對CD45熒光點圖。然后定義雙陽性CD34+/CD45+細胞群體并保留(backgate)低CD45表達和低側(cè)向散射性質(zhì)。如此定義的CD34+細胞的百分數(shù)與血液凈化(apheresis)產(chǎn)物的總有核細胞含量相乘得到收獲的CD34+細胞的絕對數(shù)目。使用Coulter STKS(Coulter，Miami，F(xiàn)L，USA)通過自動化細胞計數(shù)確定有核細胞含量。所用的抗-CD34抗體(HPCA-2)、抗-CD45抗體(2D1)和同種型對照來自BD。
高劑量治療和自體移植或者根據(jù)Barlogie的“總治療”概念(Barlogie 1997)對患有MM的58個患者(67％)進行治療并且這些患者將受到3-6個月內(nèi)的一前一后的美法侖200mg/m2(MEL200)治療，或者根據(jù)Palumbo(Palumbo 1999)，對年齡在60到70歲的患者用一前一后的美法侖100mg/m2(MEL100)治療。第一輪美法侖200mg/m2后達不到部分好轉(zhuǎn)的較年輕MM患者將接受白消安12-16mg/kg和環(huán)磷酰胺120mg/kg作為第二輪高劑量治療(BUCY)。具有復發(fā)的NHL或HD的29個患者(33％)或者被用白消安16mg/kg和環(huán)磷酰胺120mg/k(BUCY)治療或者被用卡氯芥300mg/m2、依托泊苷800mg/m2、阿糖胞苷800mg/m2和環(huán)磷酰胺140mg/kg(BEAC)(Philip 1995)或者用卡氯芥300mg/m2、依托泊苷800mg/m2、阿糖胞苷1600mg/m2和美法侖140mg/m2(BEAM)(Linch 1993)治療。高劑量方案的分布在表1中顯示。最后一劑化學治療后48-60小時進行自體PBSC移植。PBSC產(chǎn)物在床邊的37℃水浴融化并在加入20mL ACD-A后通過中央靜脈導管回灌注。
G-CSF的應用和血細胞計數(shù)如所推薦的(Ozer 2000)，總是在最后化學治療灌注后24小時以上給予G-CSF。高劑量化學治療后皮下施用的重組人G-CSF在113例中為非格司亭(Amgen，Thousand Oaks，CA，USA)，在9例中為雷諾司替(Chugai，日本)。在PBSC自體移植前的晚上以5μg/kg的劑量給予評估的單一G-CSF注射。在第二天早上，單G-CSF劑后約14小時用常規(guī)血試驗檢測誘導的白細胞峰。常規(guī)血試驗后約1小時進行自體PBSCs的移植。從PBSC移植后的那天開始，每天以5μg/kg的劑量給予G-CSF直到白細胞數(shù)在發(fā)育不全后達到5000/μL到10000/μL。包括差別的常規(guī)血細胞計數(shù)每天在Coulter STKS(Coulter，Miami，F(xiàn)L，USA)上進行，從高劑量治療開始直到患者離開醫(yī)院。
支持治療在高劑量治療、自體移植和移植后期間所有患者都住院?？刮⑸镱A防由下面方案組成從自體移植到嗜中性粒細胞恢復每天給予卷須霉素2×250mg。在整個醫(yī)院停留期間給予口服兩性霉素B懸浮劑4×1mL，或者備選地，對于口服兩性霉素不耐受時，每天給予氟康唑1×100mg。在用一天兩次的甲氧芐氨嘧啶/磺胺甲基異噁唑160mg/800mg的高劑量化學治療期間開始卡氏肺囊蟲(Pneumocystis carini)局限性肺炎的預防，并且以每周連續(xù)2天一天2次繼續(xù)治療6個月直到嗜中性粒細胞恢復。對于甲氧芐氨嘧啶/磺胺甲基異噁唑不耐受時，備選地從自體移植開始每4周進行300mg噴他脒吸入治療6個月。從高劑量治療開始以2×500mg劑量給予靜脈內(nèi)無環(huán)鳥苷直到嗜中性粒細胞恢復。血紅細胞產(chǎn)物和單供體血小板被代替以保持血紅蛋白水平高于80g/L和血小板數(shù)高于10000/μL。所有血細胞產(chǎn)物都是CMV陰性的，用30Gy輻射并通過白細胞減少過濾器注入。在中性白細胞減少期間單次口服治療中溫度＞38.5℃或者當發(fā)熱＞38.0℃存在至少一小時后開始經(jīng)驗性的靜脈內(nèi)抗微生物治療，并且該治療根據(jù)以前出版的方針(Hughes 1997)進行。最初的治療用氧哌嗪青霉素/唑巴克坦加慶大霉素進行。用美羅培南/萬古霉素進行逐步增加。如果在第5-7天發(fā)熱持續(xù)，那么加入靜脈內(nèi)兩性霉素B。繼續(xù)抗微生物治療直到嗜中性粒細胞恢復和發(fā)熱消退后至少24小時。嗜中性粒細胞和血小板恢復后抗微生物治療停止時病人出院。
造血恢復、發(fā)熱和支持治療的評估嗜中性粒細胞恢復被定義為從自體移植當天開始嗜中性粒細胞數(shù)高于500/μL的第一天。血小板恢復被定義為從自體移植當天開始未被代替的血小板數(shù)高于20000/μL的第一天。記錄發(fā)熱＞38.0℃的發(fā)生率、發(fā)熱＞38.0℃的天數(shù)和靜脈內(nèi)抗微生物治療的天數(shù)直到患者出院。
目的和統(tǒng)計分析本研究的目的是將G-CSF誘導的白細胞峰和嗜中性粒細胞和血小板恢復、嗜中性粒細胞減少性發(fā)熱的發(fā)生率和靜脈內(nèi)抗微生物治療的持續(xù)時間相關(guān)聯(lián)并將這些相關(guān)性和為PBSC自體移植的CD34+細胞含量所得值的相關(guān)性相比較。給出的所有分析(除了人口統(tǒng)計學和疾病基線特征之外)都基于作為觀察單位的移植過程。
使用根據(jù)Kaplan和Meier(1958)的產(chǎn)物-極限方法評估隨時間嗜中性粒細胞和血小板的恢復速率，并且使用log-rank檢驗(Peto 1972)比較預后小組。根據(jù)組數(shù)，通過Wilcoxon-Mann-Whitney或Kruskal-Wallis分析檢驗預后組之間的連續(xù)變量中的差異。對于命名類別或規(guī)則類別，應用對趨勢的Fisher’s精確檢驗或卡方檢驗。用各自的檢驗或Cox模型(Cox 1972)的多層次進行多變量分析以便檢查預測因子對不同末點的獨立影響。所有報道的p-值來自雙側(cè)檢驗。
細胞能力檢驗的執(zhí)行在患有多發(fā)性骨髓瘤或淋巴瘤的87個患者中122高劑量化學治療過程后研究單一皮下G-CSF注射(5μg/kg)。約14小時后用常規(guī)血試驗檢測誘導的外周血淋巴細胞峰。這些淋巴細胞峰(圖1)由約90％嗜中性粒細胞組成?；颊吆椭委熖卣髟诒?中給出，誘導的白細胞峰、嗜中性粒細胞和血細胞恢復、發(fā)熱＞38℃的缺乏和對靜脈內(nèi)抗微生物治療的需要在表2中給出。開始靜脈內(nèi)化學治療和單G-CSF注射之間的時間間隔對誘導的白細胞峰的中位值有影響。然而，在環(huán)磷酰胺的2天靜脈內(nèi)施用之前的BUCY方案中為期4天的白消安的經(jīng)口施用與為期2天的美法侖的靜脈內(nèi)施用的MEL方案相比并不減小白細胞峰。
對于BUCY和MEL高劑量治療(在靜脈內(nèi)化學治療的開始和高劑量G-CSF之間有2.5天的間隔)，中位值白細胞峰為16200/μL。對于BEAM和BEAC高劑量治療(6.5天的間隔)，中位值白細胞峰為4100/μL，是前者的1/4。然而，該分析的觀察到的目標在BUCY/MEL和BEAC/BEAM組之間是可比較的表2)。這建議在相對尺度上評價白細胞峰，該相對尺度通過分布的中位值(設(shè)為1.0)定義并且應用于BUCY/MEL和BEAC/BEAM組。為了統(tǒng)計分析，使用低于(≤50.百分位數(shù))和高于(＞50百分位數(shù))中位值和隨后使用的≤25.百分位數(shù)、＞25.-≤50.百分位數(shù)和＞50.百分位數(shù)的白細胞峰的分類。相應于最小值、25.百分位數(shù)、50.百分位數(shù)和最大值的相對尺度上的全部的相對中位值分別為0.15、0.77、1.0和3.66。該檢驗被稱作細胞能力檢驗。
實施例2造血恢復的預測嗜中性粒細胞(＞500/μL)和血小板(＞20000/μL)恢復的中位值時間分別是9天和10天。細胞能力檢驗預測了嗜中性粒細胞(p＝0.001)和血小板恢復(p＜0.0001)(表3)。有趣的是，對于檢驗前的白細胞數(shù)，發(fā)現(xiàn)與嗜中性粒細胞恢復具有邊界顯著相關(guān)性(p＝0.06)，而與血小板恢復無相關(guān)性(p＝0.4)。自體PBSC移植中CD34+的數(shù)目也預測了嗜中性粒細胞恢復(p＜0.0001)和血小板恢復(p＜0.0001)(表3)，如所預期的那樣。
細胞能力檢驗自身獨立于PBSC自體移植，因為檢驗在冷凍保藏的自體PBSCs被注入之前進行。誘導的白細胞峰和CD34+細胞數(shù)之間的相關(guān)性較弱(r＝0.226；p＝0.01)。在多元分析(以分層次的log-rank檢驗進行)中，在嗜中性粒細胞恢復(p＝0.03)和血小板恢復(p＝0.01)的預測中細胞能力檢驗的獨立影響(＜＝中位值，＞中位值)可以通過不同CD34水平(隨著較低的CD34+細胞數(shù)增加并改變PBSC自體移植物的CD34+細胞劑量效應)跟蹤。在Cox模型(其中自體移植物的CD34+細胞數(shù)被作為數(shù)量變量包括)中，確證了細胞能力檢驗對嗜中性粒細胞恢復(p＝0.05)和血小板恢復(p＝0.0007)的獨立影響。
實施例3移植有利的CD34+細胞閾值的確定細胞能力檢驗自身獨立于PBSC移植，因為檢驗在冷凍保藏的PBSCs注入之前進行。在多元分析中，獨立于PBSC CD34+細胞劑量效應的細胞能力檢驗預測了造血恢復。這對為移植選擇CD34+細胞的閾值劑量具有實際的結(jié)果。由于細胞能力檢驗＞1.0，＞2.5×106CD34+細胞/kg的移植足以達到有利的嗜中性粒細胞和血小板恢復，分別在10天和12天內(nèi)完成。對于細胞能力檢驗＜1.0，延遲的造血恢復的危險增加將建議使用更多數(shù)量的CD34+細胞。
實施例4嗜中性粒細胞減少性發(fā)熱和靜脈內(nèi)抗微生物治療的預測在122個操作中有55個(45％)無發(fā)熱＞38℃。具有發(fā)熱＞38℃的天數(shù)的中位值為1天，靜脈內(nèi)抗微生物治療的中位值為4天。細胞能力檢驗與發(fā)熱的缺乏(p＝0.03)和靜脈內(nèi)抗微生物治療(p＝0.03)持續(xù)時間的中位值相關(guān)。尋找PBSC自體移植中CD34+細胞數(shù)和缺乏發(fā)熱＞38.0℃的相關(guān)性顯示了趨勢(p＝0.07)但是沒有發(fā)現(xiàn)與靜脈內(nèi)抗微生物治療的相關(guān)性(p＝0.3)。細胞能力檢驗和CD34+細胞數(shù)都與白細胞減少＜1000/μL的持續(xù)時間相關(guān)(p＜0.0001)而僅僅細胞能力檢驗和白細胞減少的嚴重性相關(guān)(p＝0.02)。觀察到細胞能力檢驗和發(fā)熱缺乏之間的連續(xù)直接關(guān)系和細胞能力檢驗與需要靜脈內(nèi)抗微生物治療之間的相反關(guān)系(圖3)。對于具有低細胞能力檢驗＜0.6的小組，發(fā)熱的缺乏僅僅為21％，而對于具有高細胞能力檢驗＞2.0的小組，發(fā)熱的缺乏為80％。接受具有低CD34+細胞數(shù)(＜＝2.5×106/kg)的自體移植并因此通過分析代表不利組的病例的排除不改變該相關(guān)性(圖3)。發(fā)生三例與治療相關(guān)的死亡。這些死亡由膿毒癥導致。三例治療相關(guān)的死亡中的細胞能力檢驗為0.15、0.77和1.0。
實施例5門診病人治療的可能性高劑量化學治療后使用動員的PBSCs的快速造血恢復和相關(guān)的良好耐受性和低于5％的低治療相關(guān)的死亡率已經(jīng)激起了對門診病人進行自體移植的興趣。細胞能力檢驗＞1.0聯(lián)合CD34+細胞的標準劑量(＞2.5×106/kg)，建議可能進行門診病人的治療。該格局和最佳的造血恢復(圖2)和感染的降低危險(圖3)相關(guān)。
實施例6影響細胞能力檢驗和CD34+細胞數(shù)的因素發(fā)現(xiàn)細胞能力檢驗或PBSC自體移植中CD34+細胞數(shù)與年齡、性別、診斷和用化學治療和放療的預治療沒有顯著相關(guān)性。

表1患者的特征以及高劑量化學治療和外周血干細胞(PBSC)自體移植的說明


表2單劑G-CSF之前和之后血中的白細胞數(shù)、白細胞減少＜1000/μL的持續(xù)時間和研究的目標。絕對嗜中性粒細胞數(shù)(ANC)的恢復和血小板(PLT)恢復、發(fā)熱＞38℃的缺乏和靜脈內(nèi)(i.v.)抗微生物治療的持續(xù)是本研究的目標。


表3細胞能力檢驗和PBSC自體移植中CD34+細胞數(shù)與本發(fā)明目標的相關(guān)性實施例7與造血恢復相關(guān)的因素根據(jù)上面所描述的細胞能力檢驗包括哺乳動物的參數(shù)或來自哺乳動物的樣品的參數(shù)的測量，這些參數(shù)與造血恢復相關(guān)，其中哺乳動物已經(jīng)被施用造血生長因子。這些參數(shù)優(yōu)選白血細胞數(shù)，或白細胞數(shù)。所測量的參數(shù)的絕對值如上述優(yōu)選在相對尺度上評估，該相對尺度通過治療組內(nèi)—即接受相似或相同治療的哺乳動物的組內(nèi)—的分布的中位值(設(shè)為1.0)定義。術(shù)語“相似或相同的治療”優(yōu)選涉及包括放療和化學治療劑量、施用時間和其中所用藥物的種類的治療方案。參數(shù)優(yōu)選在來自哺乳動物的樣品，如體液或活組織中測量?；罱M織優(yōu)選取自健康哺乳動物含有免疫活性細胞的位置。細胞優(yōu)選T細胞、B細胞、粒細胞、血小板、單核細胞、NK細胞，等等。細胞可來自細胞發(fā)育和/或分化的早期或晚期。體液優(yōu)選為血或來自血。哺乳動物優(yōu)選為人。生長因子優(yōu)選G-CSF或在刺激造血系統(tǒng)中具有類似活性的生長因子。例如，血管緊張肽和/或衍生自血管緊張肽的肽(Rodgers等，Cancer Chemother Pharmacol 49(5)403-11，2002)、白介素-1β(Lebedev等，Radiats Biol Radioecol 42(1)60-4，2002)、白介素-8(Terashima等，Blood 92(3)1062-69，1998；Laterveer等，Blood85(8)2269-75，1995；Laterveer等，Blood 87(2)781-88，1996)和白介素-11(Saitoh等，Cytokine 13(5)287-94 2001)可顯示出這種活性。對造血系統(tǒng)的刺激活性可隨不同因子而不同。例如，白介素-11優(yōu)選作用于巨核生成(megakaryopoiesis)。非肽因子，如PGG-葡聚糖，可通過刺激造血作用而發(fā)揮作用(Turnbull等，Acta Haematol 102(2)66-71，1999)。
可測量的因素包括細胞數(shù)。這優(yōu)選在來自哺乳動物，優(yōu)選人的樣品中測量，樣品優(yōu)選為血樣或來自血的樣品。來自血的樣品優(yōu)選含有血細胞，還優(yōu)選含有白細胞。計數(shù)的細胞優(yōu)選為T細胞、NK細胞、粒細胞、嗜酸性粒細胞、單核細胞、嗜中性粒細胞、凝血細胞、淋巴細胞、B細胞，等等。計數(shù)的細胞優(yōu)選為造血來源，更優(yōu)選為來自前體和/或干細胞的細胞。
參數(shù)也可能來自標記，優(yōu)選細胞表面標記的測量。這些標記包括CD3、CD4、CD8、CD20、B7、CD45、CD34、CD36、CD56、CD19、CD20-24、CD25、CD 37、CD79α和/或β、CD2、CD5、CD7、CD43、CD45(白細胞共同抗原LAK)CD45R0、CD56、流式細胞儀側(cè)向散射、流式細胞儀前向散射、與所有淋巴樣細胞反應的S-100標記、CD30、CD45RA、CD74、CDw75、CDw76、CD79、κ輕鏈、λ輕鏈。其他的標記為與細胞增殖相關(guān)的標記，例如Ki-67標記。其他標記與細胞死亡，優(yōu)選與凋亡或壞死相關(guān)。用于檢測凋亡的許多標記或方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。例如，annexin V、DNA梯形帶、核凝聚、核碎裂、單鏈DNA標記、細胞色素c釋放和通過caspase的底物(例如PARP)的切割是與凋亡相關(guān)的標記。優(yōu)選地，可以使用annexin V-標記或caspase3/7活性試驗。
上面參數(shù)的確定和/或測量是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。例如，上面提到的表面和細胞內(nèi)部蛋白標記的測定法可通過商業(yè)途徑從Dako Cytomation丹麥A/S，Produktionsvej 42，2600 Glostrup，丹麥，或其子公司得到。
因此，通過進行如上面的實施例1中所描述的細胞能力檢驗，上面標記的任何一種參數(shù)都可相關(guān)，并將如上述的標記用作額外參數(shù)。然后所述額外參數(shù)以與白細胞數(shù)類似的方式與造血恢復相關(guān)，白細胞數(shù)與造血恢復的相關(guān)性在上面的實施例1中描述。優(yōu)選比白細胞數(shù)與造血恢復具更好的相關(guān)性，和/或比白細胞數(shù)與如在此處的實施例中描述的治療-和結(jié)果-相關(guān)的因子的相關(guān)性更好。
實施例8患有多發(fā)性骨髓瘤或復發(fā)的淋巴瘤的患者組中的細胞能力檢驗患者和方法患者研究在86個多發(fā)性骨髓瘤(MM)患者或復發(fā)的淋巴瘤(LYM)患者中進行。49名患者(57％)為男性，37名患者(43％)為女性。中位值年齡為53歲(從18-68歲)。高劑量治療前，患者已經(jīng)受到中位值為6輪的化學治療(范圍為0-25輪)。對29名患者(34％)給予放療。患者對他們的治療給予知情同意。這一群患者部分與實施例1-6中的患者部分重疊。
血干細胞動員、收獲、處理和冷凍保存在大多數(shù)患者中，使用G-CSF的IEV方案用于干細胞動員。IEV方案由1-3天靜脈內(nèi)2500mg/m2異環(huán)磷酰胺、1天靜脈內(nèi)100mg/m2表阿霉素、1-3天靜脈內(nèi)150mg/m2依托泊苷之后從第5天起每天皮下5μg/kgG-CSF(非格司亭；Amgen，Thousand Oaks，CA，USA)直到血干細胞收獲完成組成。除了個體劑量減少，年齡≥60歲的MM患者從2000年開始接受75％劑量的IEV。當最低點后，G-CSF刺激的白細胞數(shù)上升到5000-10000/μL或以上，使用COBE Spectra(COBE，Heimstetten，德國)或AS104(Fresenius，St.Wendel，德國)細胞分離器和標準程序收獲PBSCs。在一些病例中，從單個白細胞除去法收獲的血干細胞在收集后立即進行免疫磁性B細胞清洗(MaxSep，Baxter Immunotherapy，Unterschleissheim，德國)。將血干細胞與等體積的用5％HSA和100％DMSO(Cryoserv，Tera Pharmaceuticals，Midvale，UT，USA)(4∶1)制備的冰凍溶液混合。最終DMSO濃度為10％。計算機控制速率的冰凍后，含有血干細胞的包被保存在液氮的蒸汽相中。
血干細胞自體移植中CD34+細胞計數(shù)根據(jù)ISHAGE(Sutherland等，1996)的方法，使用裝備有氬激光的FACScan(BD，Mountain View，CA，USA)或EPICS XL-MCL(Electronics，Miami，F(xiàn)L，USA)進行CD34+細胞的確定。全血在4℃黑暗中與PE偶聯(lián)的單克隆抗-CD34抗體和FITC偶聯(lián)的單克隆抗-CD45抗體孵育30分鐘，然后洗滌并進行血紅細胞裂解(BD)。在1998年以前，分析了20000個細胞，之后分析了75000個細胞。為排除細胞碎片、血小板、剩余的紅細胞和所有CD45陰性細胞，使用向前散射對CD45熒光點圖。然后限定雙陽性CD34+/CD45+細胞群體并保留(backgate)低45CD表達和低側(cè)向散射性質(zhì)。如此限定的CD34+細胞的百分數(shù)與脫落(apheresis)產(chǎn)物的總的有核細胞含量相乘得到收獲的CD34+細胞的絕對數(shù)目。使用Coulter STKS(Coulter，Miami，F(xiàn)L，USA)通過自動化細胞計數(shù)確定有核細胞含量。所用的抗-CD34抗體(HPCA-2)、抗-CD45抗體(2D1)和同種型對照來自BD。
高劑量治療和血干細胞移植研究了86名患者中128個高劑量化學治療過程。在88個過程(69％)中應用美法侖200mg/m2(MEL200)(Barlogie等1997)，18個過程(14％)中應用美法侖100mg/m2(MEL100)(Palumbo等1999)，22個過程(17％)中使用BUCY(Schiller等1994；Weaver等1999)。最后一劑化學治療后48小時進行自體血干細胞移植。
G-CSF的應用和血細胞計數(shù)高劑量化學治療后皮下施用的重組人G-CSF在121例中為非格司亭(Amgen，Thousand Oaks，CA，USA)，在7例中為雷諾司替(Chugai，日本)。在自體血干細胞移植前的晚上——最后的化學治療輸注后約30小時——以5μg/kg的劑量給予評估的單劑G-CSF注射。在第二天早上，單劑G-CSF后12-14小時用常規(guī)血試驗檢測誘導的WBC峰。常規(guī)血試驗后約2小時進行自體血干細胞的移植。從移植后的當天開始，每天以5μg/kg的劑量給予G-CSF直到最低點后白細胞數(shù)在5000/μL到10000/μL之間。包括差別的常規(guī)血細胞計數(shù)每天在Coulter STKS(Coulter，Miami，F(xiàn)L，USA)上進行，從高劑量治療開始直到患者離開醫(yī)院。
支持治療在高劑量治療、自體移植和移植后期間所有患者都住院并接受相同的支持治療?？刮⑸镱A防由下面的方案組成從自體移植到嗜中性粒細胞恢復每天給予卷須霉素2×250mg。在整個醫(yī)院停留期間給予口服兩性霉素B懸浮劑4×1mL，或者備選地，對于口服兩性霉素不耐性，每天給予氟康唑1×100mg。在用一天兩次的甲氧芐氨嘧啶/磺胺甲基異噁唑160mg/800mg的高劑量化學治療期間開始卡氏肺囊蟲局限性肺炎的預防，在移植前中止并且以每周連續(xù)2天，一天2次繼續(xù)治療6個月直到嗜中性粒細胞恢復。對于甲氧芐氨嘧啶/磺胺甲基異噁唑不耐受時，備選地從自體移植開始每4周進行300mg噴他脒吸入治療6個月。從高劑量治療開始以2×500mg劑量給予靜脈內(nèi)無環(huán)鳥苷直到嗜中性粒細胞恢復。血紅細胞產(chǎn)物和單供體血小板被代替以保持血紅蛋白水平高于80g/L和血小板數(shù)高于10000/μL。所有血細胞產(chǎn)物都是CMV陰性的，用30Gy輻射并通過白細胞減少過濾器注入。在中性白細胞減少期間單次口服治療中溫度＞38.5℃或者當發(fā)熱＞38.0℃存在至少一小時后開始經(jīng)驗性的靜脈內(nèi)抗微生物治療，并且該治療根據(jù)以前出版的方針(Hughes等1997)進行。最初的治療用氧哌嗪青霉素/唑巴克坦加慶大霉素進行。用美羅培南/萬古霉素進行逐步增加。如果在第5-7天發(fā)熱持續(xù)，那么加入靜脈內(nèi)兩性霉素B。繼續(xù)抗微生物治療直到嗜中性粒細胞恢復和發(fā)熱消退后至少24小時。嗜中性粒細胞和血小板恢復后和抗微生物治療停止后病人出院。
造血恢復和感染的評估嗜中性粒細胞恢復被定義為從自體移植那天開始嗜中性粒細胞數(shù)高于500/μL為第一天。血小板恢復被定義為從自體移植當天開始未被代替的血小板數(shù)高于20000/μL的第一天。觀察期間為從高劑量治療直到患者出院。感染的評估根據(jù)以前出版的標準(Link等，1994)進行。
目的和統(tǒng)計分析本研究的目的是將作為G-CSF反應的指示劑的白細胞峰和嗜中性粒細胞和血小板恢復和感染率和感染類型向關(guān)聯(lián)并將這些相關(guān)性和為自體血干細胞移植中CD34+細胞數(shù)所得值的相關(guān)性相比較。給出的所有分析(除了人口統(tǒng)計學和疾病基線特征之外)都基于作為觀察單位的移植過程。
使用根據(jù)Kaplan和Meier(Kaplan和Meier，1958)的產(chǎn)物-極限方法評估隨時間嗜中性粒細胞和血小板的恢復速率，并且使用log-rank檢驗(Peto和Peto 1972)比較預后小組。根據(jù)組數(shù)，通過Wilcoxon-Mann-Whitney或Kruskal-Wallis分析檢驗預后組之間的連續(xù)變量中的差異。對于命名類別或規(guī)則類別，應用對趨勢的Fisher’s精確檢驗或卡方檢驗。為了檢查預測因子對不同末點的獨立影響，根據(jù)結(jié)果變量的性質(zhì)，用各自檢驗的多層次、Cox模型(Cox 1972)或邏輯回歸模型進行多元分析。所有報道的p-值來自雙側(cè)檢驗。
宿主G-CSF反應在患有多發(fā)性骨髓瘤或淋巴瘤的86名患者中的128個高劑量化學治療過程后較早地施用皮下單一G-CSF注射(5μg/kg)。在該時間點，中位值WBC為4100/μL(范圍1800-10700/μL)，中位值血小板數(shù)為197000/μL(范圍24000-640000/μL)。12-14小時后測量G-CSF誘導的WBC峰。這些短暫的WBC峰具有不同幅度(圖4)并且由約90％嗜中性粒細胞組成。中位值WBC峰為17400/μL(范圍3300-60600/μL)。WBC峰的分布在圖5A中顯示。在這些WBC峰中沒有檢測到集落形成細胞或CD34+細胞。WBC峰后，在所有病例中WBC數(shù)減少并出現(xiàn)嚴重嗜中性粒細胞減少(＜200/μL)。
造血恢復的預測在測量G-CSF反應(中位值3.92×106CD34+細胞/kg(范圍0.9-21.2))后進行自體血干細胞移植。嗜中性粒細胞移植(＞500/μL)的時間中位值為9天(范圍8-12)，血小板移植(＞20000/μL)的時間中位值是10天(范圍8-25)。G-CSF反應預測了嗜中性粒細胞(p＜0.0001)和血小板移植(p＜0.0001)(表4)。移植的CD34+細胞數(shù)也預測了嗜中性粒細胞移植(p＜0.0001)和血小板移植(p＜0.0001)，如所預期的那樣。其他患者或治療特征和G-CSF前的WBC數(shù)不與造血恢復相關(guān)(表4)。G-CSF反應和CD34+細胞數(shù)的相關(guān)性是弱的(r＝0.21；p＝0.02)。在Cox模型中的多元分析中，通過G-CSF反應的造血恢復的預測獨立于移植的CD34+細胞的影響(表5)。
感染的預測發(fā)熱＞38℃在128例中存在69例(54％)。在29例(23％)中記載有感染。G-CSF反應高度顯著地預測了記載的感染率(p＜0.0001)。嗜中性粒細胞減少＜1000/μL持續(xù)了5天的中位值(范圍3-11)。如可以預料的那樣，嗜中性粒細胞減少也和記載的感染率相關(guān)(p＝0.003)。在如邏輯回歸進行的多元分析中，G-CSF獨立于感染預測中嗜中性粒細胞減少的持續(xù)時間并且作為主要的預后因子出現(xiàn)(p＜0.0001)(表5)。在記載的感染率和移植的CD34+細胞數(shù)或其他患者或治療特征之間沒有相關(guān)性(表4)。許多因素與發(fā)熱的發(fā)生相關(guān)，但是這些因素沒有一個在多元分析中保持獨立的顯著性。
大多數(shù)記載的感染(86％)在低G-CSF反應中發(fā)生(圖5和表6)。從血流中分離的細菌分離物主要是凝固酶陰性葡萄球菌。多數(shù)肺炎(83％)和所有侵入性真菌感染和治療相關(guān)的死亡與低G-CSF反應相關(guān)。
在39名患者(其中分析了第一和第二次高劑量化學治療過程)中，G-CSF反應從第一次后WBC的中位值21700/μL(范圍6400-59300/μL)降到第二次高劑量化學治療后WBC的中位值15600/μL(范圍3300-24800/μL)。同時，記載的感染的比例增加了38％。
移植感染ANC PLT記載的感染＞500/μL＞20.000/μL年齡 0.19 0.400.53(≤53vs.＞53歲)性別 0.96 0.530.68(男性vs.女性)診斷 0.96 0.830.76(MM vs.LYM)以前的化學治療 0.14 0.810.40(≤6vs.＞6個周期)以前的放療 0.52 1.000.65(是vs.否)移植的CD34+細胞＜0.0001 ＜0.00010.79(＜2.5vs.2.5-5.0vs.＞5.0)G-CSF反應 ＜0.0001 ＜0.0001＜0.0001(1.vs.2.vs.3./4.四分位)
G-CSF前的WBC計數(shù) 0.060.540.20(＜4000/μL vs.≥4000/μL)白細胞＜1000/μL的天- - 0.003數(shù)(≤5天vs.＞5天)p-值表4因素與干細胞移植和感染的危險相關(guān)的單變量分析。ANC＝絕對嗜中性粒細胞計數(shù)；PLT＝血小板計數(shù)；MM＝多發(fā)性骨髓瘤；LYM＝淋巴瘤。
移植ANC＞500/μlPLT＞20.000/μl移植的CD34+細胞＜0.0001＜0.0001G-CSF反應0.020.0006p-值記載的感染G-CSF反應＜0.0001白細胞＜1.000/μL的天＞0.2數(shù)p-值表5干細胞移植和記載的感染的相關(guān)因素的多變量分析。
G-CSF反應 四分位1 四分位2 四分位3 分位4N 3232 3232％％ ％％血流感染 2212 3 0·Coag.-neg.Staphyl. 199 3·鏈球菌 3·丙酸菌3肺炎 256 6 0侵入性真菌感染6 0 0 0嚴重小腸結(jié)腸炎3 6 0 0其他感染 126 6 0·竇炎 3 3·膽囊炎 3·軟組織感染 6·脊髓炎 3·導管進入出感染3·Port-膿毒癥 3總發(fā)生率 治療相關(guān)的死亡率 6 0 0 0表6G-CSF反應和記載的感染類型的相關(guān)性。
在該研究中，我們發(fā)現(xiàn)宿主對骨髓抑制前的單劑量藥物G-CSF的反應可以是過程中關(guān)鍵造血功能的預測者并且可用于克服骨髓抑制。這突出了G-CSF的潛力并表明G-CSF可被用于診斷性方法中。評估和預測宿主防御機制抗感染和在骨髓抑制顯現(xiàn)前彌補血細胞減少的能力到目前還是不可能的。G-CSF反應通過靶向骨髓微環(huán)境而引起了白細胞動員并且直接代表效應細胞應答。這和測量細胞因子水平有概念上的不同。我們的研究表明宿主防御的微環(huán)境能力，其可被靶定并通過體內(nèi)藥理學G-CSF檢驗。
移植的CD34+細胞數(shù)是高劑量化學治療后干細胞移植的主要相關(guān)因子(Bensinger等1995；Tricot等1995；Weaver等1995；Ketterer等1988)。這在我們的研究中被證實。然而，G-CSF反應預測了獨立于所移植CD34+細胞數(shù)的干細胞移植。因此G-CSF反應代表造血恢復的重要獨立的因素，造血恢復在自體干細胞移植后的功能性造血微環(huán)境重新形成中得到維持。
白細胞減少的持續(xù)時間是骨髓抑制的宿主中感染危險的主要公知的因素(Bodey等1966)。這可以在我們的研究中扼要重述。然而，G-CSF反應獨立于感染預測中的白細胞減少的持續(xù)時間并作為主要的預后因子出現(xiàn)(p＜0.0001)。G-CSF是對嗜中性粒細胞減少和感染的宿主應答中的中心調(diào)節(jié)子(Watari等1989；Kawakami等1990)。被藥學G-CSF激起的宿主白細胞應答可能是骨髓抑制中該G-CSF-可誘導的“緊急反應”潛能的早熟反映。對于移植的CD34+細胞數(shù)，沒有發(fā)現(xiàn)與記載的感染率的相關(guān)性(p＝0.79)。只要常規(guī)嗜中性粒細胞移植發(fā)生，似乎CD34+細胞數(shù)對感染率就不再有影響。小鼠中的實驗揭示了G-CSF對微環(huán)境功能性的影響。在組成性高水平表達人G-CSF的轉(zhuǎn)基因小鼠中，骨髓中的巨核細胞生成(megakaryocytopoeisis)得以提高，盡管G-CSF在巨核細胞生成中還沒有被賦予特定角色(Fujita等2001)。在移植實驗中，表明這種巨核細胞生成的提高取決于轉(zhuǎn)基因人G-CSF誘導的微環(huán)境改變。該質(zhì)變的微環(huán)境允許造血移植后更快的血小板恢復。這符合我們的發(fā)現(xiàn)G-CSF反應是血小板恢復的獨立預測子。在不表達G-CSF的G-CSF敲除小鼠中，發(fā)現(xiàn)了慢性嗜中性粒細胞減少、祖細胞減少、單藥學劑量G-CSF導致的快速白細胞動員的減慢和對實驗性感染的更高易感性(Lieschke等1994)。這些發(fā)現(xiàn)部分相對于我們在具有低G-CSF反應的病人中所觀察到的。可以推測G-CSF對微環(huán)境的發(fā)育影響在G-CSF反應中反映。
高劑量化學治療的設(shè)置因為高度骨髓抑制、相關(guān)的更高次數(shù)的感染事件和對醫(yī)院中患者的密切監(jiān)控而很可能有利于對G-CSF反應的預測潛力的鑒定。與化學治療后骨髓抑制期間嗜中性粒細胞最低點的被動觀察以對治療的進一步過程中的嗜中性粒細胞減少癥作出結(jié)論(Silber等1998)相反，G-CSF反應可在正常WBC數(shù)時評估并明顯依賴于骨髓中可動員白細胞的存在。我們的研究中部分非常高的白細胞峰和它們的高度變化性暗示動員效果的最大值，其允許識別患者間的差異。稍前給予的高劑量化學治療可能發(fā)揮對用G-CSF的動員的引發(fā)作用，因為在G-CSF劑量為5μg/kg時通常觀察不到前面所觀察到的強動員效果。藥學G-CSF效果是劑量-依賴的。僅僅在G-CSF劑量為10μg/kg或以上時才觀察到穩(wěn)定狀態(tài)造血作用期間或常規(guī)化學治療后的強動員效果(Morstyn等1988；Morstyn等1989)。
世界上約三分之一自體血干細胞移植在多發(fā)性骨髓瘤中進行。在移植前大多數(shù)這些患者接受美法侖或白消安/環(huán)磷酰胺高劑量化學治療，如在我們的研究中所應用的。在這些患者中，G-CSF反應可以提供基礎(chǔ)以在受控的臨床試驗中施用危險-分層次的支持治療(Meisenberg等1997；Herrmann等1999；Kern等1999；Freifeld等1999)。而且，G-CSF反應可以在其他領(lǐng)域像對實體瘤不進行干細胞移植的化學治療中起作用。研究是否對藥學G-CSF的實際需要可以在G-CSF反應的基礎(chǔ)上確定是令人感興趣的。G-CSF反應也可以對開發(fā)抗感染的新型預防策略作出貢獻(Noursadeghi等2002)。
實施例9細胞能力檢驗預測白細胞缺少和嗜中性粒細胞缺少的持續(xù)時間下面的分析在實施例8的病例上進行。細胞能力檢驗(WBC峰)預測白細胞減少和嗜中性粒細胞減少的持續(xù)時間(表7)。
WBC峰 CD34+細胞×106/kg四分位 1 234＜2.52.5-5.0＞5.0白細胞減少p＜0.00 1 p＜0.001＜1.000/μL(天數(shù))最小值 4 433 54 325.百分位數(shù)6 555 65 450.百分位數(shù)6 655 66 575.百分位數(shù)7 665 76 5最大值 11978 11 8 8嗜中性粒細胞 減 少 p＜0.001 p＜0.001＜500/μL(天數(shù))最小值 4 433 43 325.百分位數(shù)5 544 65 450.百分位數(shù)6 555 65 575.百分位數(shù)7 665 76 5最大值 9 977 98 7表7白細胞減少和嗜中性粒細胞減少的持續(xù)時間與細胞能力檢驗(WBC峰)和移植的CD34+細胞數(shù)的相關(guān)性。
實施例10作為細胞能力檢驗結(jié)果的白細胞或白血細胞(WBC)峰與各自的嗜中性粒細胞峰非常相似。
下面的數(shù)據(jù)(表8)基于實施例8的病例。
WBC峰(/μL)嗜中性粒細胞峰(/μL)最小值 3.3003.10025.百分位數(shù) 12.800 12.10050.百分位數(shù) 17.400 16.70075.百分位數(shù) 23.300 22.400最大值60.600 56.300r＝0.998表8誘導的WBC和嗜中性粒細胞峰的相關(guān)性。
實施例11不進行造血干細胞移植的骨髓抑制化學治療后細胞能力檢驗患有淋巴瘤或多發(fā)性骨髓瘤的48名患者受到IEV化學治療，之后是用于腫瘤減少的G-CSF和如在實施例8中指述的干細胞動員。第一次G-CSF注射在方案的第五天給予并且將第6天誘導的白細胞峰用作細胞能力檢驗。白細胞數(shù)從中位值5.000/μL(范圍1.500-8.200/μL)升高到中位值10.100/μl(范圍300-46.700/μL)。白細胞峰的分級排列預示了接下來的骨髓抑制期發(fā)熱和感染的危險性(p＜0.05)(表9)。沒有進行造血移植。
白細胞峰(＝細胞檢驗)N 發(fā)熱和感染＜＝中位值237(30％)p＜0.05＞中位值 231(4％)表9使用IEV方案的骨髓抑制化學治療后細胞能力檢驗與發(fā)熱和感染之間的相關(guān)性。
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Cys Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His100 105 110Ser Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile115 120 125Ser Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala130 135 140Asp Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala145 150 155 160Pro Ala Leu Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala165 170 175Phe Gln Arg Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser180 185 190Phe Leu Glu Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro195 200 205<210>2<211>204<212>PRT<213>人<400>2Met Ala Gly Pro Ala Thr Gln Ser Pro Met Lys Leu Met Ala Leu Gln1 5 10 15
Leu Leu Leu Trp His Ser Ala Leu Trp Thr Val Gln Glu Ala Thr Pro20 25 30Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys Cys Leu35 40 45Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln Glu Lys50 55 60Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val Leu Leu65 70 75 80Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys Pro Ser85 90 95Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser Gly Leu100 105 110Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser Pro Glu115 120 125Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp Phe Ala130 135 140Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro Ala Leu145 150 155 160Gln Pro Thr Gln Gly Ala Met Pro Ala Phe Ala Ser Ala Phe Gln Arg165 170 175Arg Ala Gly Gly Val Leu Val Ala Ser His Leu Gln Ser Phe Leu Glu180 185 190
Val Ser Tyr Arg Val Leu Arg His Leu Ala Gln Pro195 200<210>3<211>174<212>PRT<213>人<400>3Thr Pro Leu Gly Pro Ala Ser Ser Leu Pro Gln Ser Phe Leu Leu Lys1 5 10 15Cys Leu Glu Gln Val Arg Lys Ile Gln Gly Asp Gly Ala Ala Leu Gln20 25 30Glu Lys Leu Cys Ala Thr Tyr Lys Leu Cys His Pro Glu Glu Leu Val35 40 45Leu Leu Gly His Ser Leu Gly Ile Pro Trp Ala Pro Leu Ser Ser Cys50 55 60Pro Ser Gln Ala Leu Gln Leu Ala Gly Cys Leu Ser Gln Leu His Ser65 70 75 80Gly Leu Phe Leu Tyr Gln Gly Leu Leu Gln Ala Leu Glu Gly Ile Ser85 90 95Pro Glu Leu Gly Pro Thr Leu Asp Thr Leu Gln Leu Asp Val Ala Asp100 105 110Phe Ala Thr Thr Ile Trp Gln Gln Met Glu Glu Leu Gly Met Ala Pro115 120 125
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權(quán)利要求
1.確定受試者造血的細胞能力的方法，該方法包括以下步驟(a)確定從受試者得到的血樣中存在的白細胞量，其中所述受試者已經(jīng)被施與單劑量G-CSF并且已經(jīng)維持了一定時間，該時間足夠允許白細胞從造血和貯藏組織以及邊集部位動員或釋放到血液；和(b)通過用對照受試者動員或釋放的白細胞量評估在步驟(a)中確定的白細胞量來確定造血的細胞能力，其中所述對照受試者選自具有(i)與高劑量細胞毒性化學治療和/或造血細胞移植相關(guān)的疾病、失調(diào)或并發(fā)癥的高危性，(ii)與高劑量細胞毒性化學治療和/或造血細胞移植相關(guān)的疾病、失調(diào)或并發(fā)癥的中危性或(iii)與高劑量細胞毒性化學治療和/或造血細胞移植相關(guān)的疾病、失調(diào)或并發(fā)癥的低危性的受試者。
2.為受試者選擇適宜的抗微生物預防或治療的方法，其中所述方法包括權(quán)利要求1的方法的步驟和另一步驟(c)基于步驟(b)中得到的結(jié)果為所述受試者選擇適宜的抗微生物預防或治療。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述預防或治療是用于治療、防止或改善感染的預防或治療。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述感染選自真菌、病毒、原生動物、寄生蟲和細菌感染。
5.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述感染選自肺炎、侵入性真菌感染、小腸結(jié)腸炎、軟組織感染和膿毒癥。
6.為受試者發(fā)生的嗜中性粒細胞減少性發(fā)熱選擇適宜的預防或治療的方法，其中所述方法包括權(quán)利要求1的方法的步驟和另一步驟(c)基于步驟(b)中得到的結(jié)果為所述受試者選擇對嗜中性粒細胞減少性發(fā)熱適宜的預防或治療。
7.選擇適宜量的用于治療受試者而欲輸入的造血干細胞優(yōu)選CD34+細胞的方法，其中所述方法包括權(quán)利要求1的方法的步驟和另一步驟(c)基于步驟(b)中得到的結(jié)果選擇將為所述受試者的治療而欲輸入的所述細胞的適宜量。
8.選擇用于治療受試者的造血生長因子或細胞因子的適宜量的方法，其中所述方法包括權(quán)利要求1的方法中的步驟和另一步驟(c)基于步驟(b)中得到的結(jié)果為所述受試者的治療選擇適宜量的造血生長因子或細胞因子。
9.從受試者得到的白細胞用于制備診斷組合物的用途，其中所述診斷組合物用于診斷所述受試者中的與高劑量細胞毒性化學治療和/或造血細胞移植相關(guān)的疾病、失調(diào)或并發(fā)癥的易感性，其中所述受試者已經(jīng)被施與單劑量G-CSF并且維持了一定時間，該時間足以允許白細胞從造血和貯藏組織以及邊集部位動員或釋放到血液中。
10.權(quán)利要求1的方法或權(quán)利要求9的用途，其中所述與高劑量細胞毒性化學治療和/或造血細胞移植相關(guān)的疾病、失調(diào)或并發(fā)癥為嗜中性粒細胞減少性發(fā)熱、微生物感染、延遲的造血細胞恢復、出血、免疫抑制、針對宿主的免疫學效應、支持治療的高水平、發(fā)病和死亡。
11.權(quán)利要求1到8中任一項的方法或權(quán)利要求9或10的用途，其中所述受試者為人。
12.權(quán)利要求1到8中任一項的方法、權(quán)利要求9或10的用途或權(quán)利要求11的方法或用途，其中所述受試者已接受高劑量化學治療。
13.權(quán)利要求12的方法或用途，其中所示高劑量化學治療包括施用美法侖、白消安、環(huán)磷酰胺、卡氯芥、依托泊苷或阿糖胞苷。
14.權(quán)利要求1到8中任一項的方法、權(quán)利要求9或10的用途或權(quán)利要求11的方法或用途，其中所述受試者已接受骨髓抑制性化學治療。
15.權(quán)利要求14的方法或用途，其中所述骨髓抑制性化學治療包括施用環(huán)磷酰胺、依托泊苷、卡氯芥、阿糖胞苷、美法侖、白消安、阿霉素、表阿霉素、紫杉醇、多西他塞、噻替呱、氟達拉濱、長春新堿、賓達氮芥、順鉑、碳鉑、柔紅霉素、氟尿嘧啶、吉西他濱、去甲柔毛霉素、異環(huán)磷酰胺、伊立替康、氨甲蝶呤、米托蒽醌、草酸鉑、蘇消安、長春堿或長春烯堿。
16.權(quán)利要求1到8中任一項的方法、權(quán)利要求9或10的用途或權(quán)利要求11的方法或用途，其中所述受試者已經(jīng)接受放射治療、患有原發(fā)性或繼發(fā)性骨髓疾病、自身免疫疾病、遺傳疾病或失調(diào)或感染。
17.權(quán)利要求1到8中任一項的方法、權(quán)利要求9或10的用途或權(quán)利要求11到16中任一項的方法或用途，其中所述G-CSF為非格司亭(NeupogenTM；Amgen Inc.，Thousand Oaks，CA，USA)或雷諾司替(GranocyteTM；Chugai，日本)。
18.權(quán)利要求1到8中任一項的方法、權(quán)利要求9或10的用途或權(quán)利要求11到17中任一項的方法或用途，其中所述G-CSF的劑量選自1到20μg/kg所述受試者的體重。
19.權(quán)利要求1到8中任一項的方法、權(quán)利要求9或10的用途或權(quán)利要求11到17中任一項的方法或用途，其中所述G-CSF的劑量為1.0、2.5、5、7.5或10μg/kg所述受試者的體重。
20.權(quán)利要求1到8中任一項的方法、權(quán)利要求9或10的用途或權(quán)利要求11到19中任一項的方法或用途，其中所述足以允許白細胞動員或釋放的時間為1到120小時。
21.權(quán)利要求1到8中任一項的方法、權(quán)利要求9或10的用途或權(quán)利要求11到19中任一項的方法或用途，其中所述足以允許白細胞動員或釋放的時間為至少1小時、至少2小時、至少6小時、至少10小時、至少12小時、至少14小時或至少18小時。
全文摘要
本發(fā)明涉及確定受試者造血的細胞能力的方法，該方法包括以下步驟(a)確定從受試者得到的血樣中存在的白細胞量，其中所述受試者已經(jīng)被施與單劑量G－CSF；和(b)通過用對照受試者動員或釋放的白細胞量評估在步驟(a)中確定的白細胞量來確定造血的細胞能力。
文檔編號G01N33/569GK1643382SQ03806723
公開日2005年7月20日 申請日期2003年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月22日
發(fā)明者克里斯蒂安·施特拉卡 申請人:克里斯蒂安·施特拉卡