專利名稱：抗α的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及分子生物學領域，具體涉及抗αvβ6整聯(lián)蛋白抗體。
背景技術：
整聯(lián)蛋白是一個細胞表面受體超家族，介導細胞-細胞和細胞-基質(zhì)粘附。這些蛋白質(zhì)被認為在發(fā)育和組織損傷過程中為細胞的生長、遷移和分化提供錨定以及信號。整聯(lián)蛋白還與細胞的去分化和侵入有關，特別是在細胞失去它們的特化形態(tài)，而成為轉移的癌細胞時。
整聯(lián)蛋白是由兩個非共價連接的亞基-α和β組成的異源二聚體蛋白質(zhì)。整聯(lián)蛋白的結合特異性是由18種不同α鏈中的一些與8種不同β鏈中的一些組合所規(guī)定的。αvβ6整聯(lián)蛋白能夠結合多種配基，包括纖連蛋白、腱生蛋白、玻連蛋白和最近鑒定的潛伏相關肽(LAP)，即一種278個氨基酸的肽，其作為前體TGF-β蛋白的一部分合成(Munger等人，Cell96(3)319-328(1999))。在分泌過程中，LAP作為N端肽從TGF-β的成熟形式上切下，但是仍然與TGF-β非共價結合，從而保持潛伏狀態(tài)。該復合物不能與TGF-β受體結合，因此無生物學活性。αvβ6整聯(lián)蛋白能夠直接結合LAP內(nèi)所含的RGD基序，導致LAP的釋放和TGF-β的激活。由于αvβ6與LAP的結合對于TGF-β轉化為活性狀態(tài)可能非常重要，因此阻斷這種結合可導致αvβ6介導的TGF-β激活的抑制和相關的纖維化病理學。
發(fā)明概述本發(fā)明是基于抗αvβ6高親和力抗體的發(fā)現(xiàn)和表征，包括這些抗體的互補決定區(qū)(CDRs)中關鍵氨基酸殘基的鑒定和分析。
本發(fā)明包括一種單克隆抗體，其可以(a)特異性結合αvβ6；(b)抑制αvβ6與其配體(如LAP、纖連蛋白、玻連蛋白和腱生蛋白)的結合，其IC50值低于10D5的IC50值(國際專利申請公開文本W(wǎng)O 99/07405)；(c)阻斷TGF-β的激活；(d)含有提供αvβ6結合特異性的CDR中的某些氨基酸序列(如圖7A和7B所示)；(e)特異性結合β6亞基；和/或(f)在免疫染色程序，如石蠟包埋組織的免疫染色中識別αvβ6。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，與αvβ6結合的抗體可以被分類為生物物理學上不同的類和亞類。一類抗體顯示阻斷配體(如LAP)與αvβ6結合的能力(阻斷劑)。這類抗體可以被進一步分為依賴陽離子的阻斷劑和不依賴陽離子的阻斷劑之亞類。一些依賴陽離子的阻斷劑含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)肽序列，而不依賴陽離子的阻斷劑不含RGD序列。另一類抗體顯示與αvβ6結合的能力，并且不能阻斷αvβ6與配體的結合(非阻斷劑)。
因此，在本發(fā)明的一些實施方案中，本發(fā)明的一些抗體與αvβ6的結合是依賴二價陽離子的，而有些是不依賴二價陽離子的。示例性的陽離子是Ca2+、Mg2+和Mn2+。
在一些實施方案中，抗體包含與雜交瘤6.1A8、6.3G9、6.8G6、6.2B1、6.2B10、6.2A1、6.2E5、7.1G10、7.7G5或7.1C5產(chǎn)生的抗體相同的重鏈和輕鏈多肽序列。
在一些實施方案中，抗體包含一條重鏈和/或一條輕鏈，重鏈的互補決定區(qū)(CDR)1、2和3分別基本(即除了一些保守性變異之外)由SEQID NOs1、4和7的序列組成，該輕鏈的CDRs 1、2和3分別基本由SEQ ID NOs10、13和15的序列組成。
在一些實施方案中，抗體包含一條重鏈和/或一條輕鏈，重鏈的CDRs 1、2和3分別基本由SEQ ID NOs3、5和8的序列組成，該輕鏈的CDRs 1、2和3分別基本由SEQ ID NOs11、14和17的序列組成。
在一些實施方案中，抗體包含一條重鏈和/或一條輕鏈，重鏈的CDRs 1、2和3分別基本由SEQ ID NOs3、6和9的序列組成，該輕鏈的CDRs 1、2和3分別基本由SEQ ID NOs12、14和18的序列組成。
在一些實施方案中，抗體包含一條重鏈和/或一條輕鏈，重鏈的CDRs 1、2和3分別基本由SEQ ID NOs2、46和47的序列組成，該輕鏈的CDRs 1、2和3分別基本由SEQ ID NOs48、13和16的序列組成。
在一些實施方案中，抗體包含一條重鏈和/或一條輕鏈，重鏈的CDRs 1、2和3分別基本由SEQ ID NOs49、51和53的序列組成，該輕鏈的CDRs 1、2和3分別基本由SEQ ID NOs55、57和59的序列組成。
在一些實施方案中，抗體包含一條重鏈和/或一條輕鏈，重鏈的CDRs 1、2和3分別基本由SEQ ID NOs50、52和54的序列組成，該輕鏈的CDRs 1、2和3分別基本由SEQ ID NOs56、58和60的序列組成。
在一些實施方案中，抗體包含SEQ ID NOs19-36和61-62中任何一個的重鏈可變域序列。
在一些實施方案中，抗體分別包含下列重鏈和輕鏈可變域序列(1)SEQ ID NOs19和37；(2)SEQ ID NOs20或21，和SEQ ID NO38；(3)SEQ ID NOs22和43；(4)SEQ ID NOs23和44；(5)SEQ ID NOs24和45；(6)SEQ ID NOs25或26，和SEQ ID NOs42；(7)SEQ ID NOs27、28或29，和SEQ ID NOs39；(8)SEQ ID NOs34或35，和SEQ ID NOs40；(9)SEQ ID NOs36和41；(10)SEQ ID NOs61和63；或(11)SEQ ID NOs62和64。
在一些實施方案中，抗體可特異性結合αvβ6，但是不抑制αvβ6與潛伏相關肽(LAP)的結合。至少有些這樣的抗體能夠與石蠟包埋組織切片中的αvβ6結合，因此能夠用于診斷用途。示例性的抗體包括6.2A1和6.2E5。
本發(fā)明也包括可結合與上述任何抗體相同表位的抗體。
本發(fā)明也包括含有本發(fā)明的一種或多種抗體和藥學可接受的載體的組合物。在一些這樣的組合物中，抗體與細胞毒性劑(即影響細胞的存活力和/或功能的物質(zhì))如毒素或放射性核素偶聯(lián)。這些組合物中的抗體可以是依賴陽離子的抗體。這些組合物能夠?qū)加谢蛘呔哂谢鸡羦β6介導的疾病危險的對象(例如哺乳動物，如人)施用，以治療(例如緩解、減輕、降低、阻止、延遲發(fā)生)該疾病。這類疾病的例子包括，但不限于纖維化(例如硬皮病、結瘢、肝纖維化、肺纖維化和腎纖維化)；銀屑??；癌癥(例如上皮癌；口腔、皮膚、子宮頸、卵巢、咽、喉、食道、肺、乳房、腎或結腸直腸癌)；奧爾波特綜合征；急性及慢性肺、肝、腎和其它內(nèi)臟損傷；肺、肝、腎和其它內(nèi)臟的硬化?；歼@些疾病的危險可能是由于遺傳誘因；某些生活方式，如吸煙和酗酒；接觸環(huán)境污染物，如石棉；生理疾病，如糖尿病、肝炎病毒感染(例如丙型肝炎病毒感染)、自身免疫?。缓歪t(yī)學治療，如放射治療。
本發(fā)明還包括檢測來自哺乳動物(例如人)的組織標本中αvβ6的方法，包括使組織標本接觸本發(fā)明的抗體，如6.2A1和6.2E5。
本發(fā)明還包括雜交瘤6.1A8、6.2B10、6.3G9、6.8G6、6.2B1、6.2A1、6.2E5、7.1G10、7.7G5和7.1C5的細胞；包含編碼SEQ ID NOs19-45和61-64中任何一種的序列的分離的核酸；包含SEQ ID NOs19-45和61-64中任何一種的氨基酸序列的分離的多肽。
本發(fā)明的抗體是指完整抗體，例如，含有兩條重鏈和兩條輕鏈的抗體，或者是指完整抗體的抗原結合片段，如Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段或F(v)片段。本發(fā)明的抗體可以是鼠抗體或其同源物，或者是完整的人抗體。本發(fā)明的抗體也可以是人源化抗體、嵌合抗體或單鏈抗體。本發(fā)明的抗體可以是任何同種型和亞型的，如IgA(例如IgA1和IgA2)、IgG(如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)、IgE、IgD、IgM，其中免疫球蛋白的輕鏈可以是κ型或λ型。
在一些實施方案中，本發(fā)明的抗體可以在重鏈的一個或多個(例如2、3、4、5或6個)特定位點處含有突變(例如缺失、置換或添加)，使得該抗體的效應物功能(例如該抗體結合Fc受體或補體因子的能力)發(fā)生改變，而不影響抗體的抗原結合能力。在另外一些實施方案中，本發(fā)明的抗體可以在作為糖基化位點的氨基酸殘基處含有突變，使得糖基化位點消除。這種抗體可能具有臨床上有益的、降低的效應物功能或其它不希望的功能，而保留其抗原結合親和力。糖基化位點的突變也可能有利于工藝發(fā)展(例如蛋白質(zhì)的表達和純化)。在另外一些實施方案中，重鏈或輕鏈可能含有提高親和力或效能的突變。
幾種融合#6和融合#7雜交瘤根據(jù)布達佩斯條約保藏已在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC；P.O.Box 1549，Manassas，VA 20108，USA)。雜交瘤克隆6.1A8、6.2B10、6.3G9、6.8G6和6.2B1于2001年8月16日保藏，保藏號分別是ATCC PTA-3647、-3648、-3649、-3645和-3646。雜交瘤克隆6.2A1、6.2E5、7.1G10、7.7G5和7.1C5在2001年12月5日保藏，保藏號分別是ATCC PTA-3896、-3897、-3898、-3899和-3900。見下文表1。
本發(fā)明的抗體可用于治療由αvβ6與配體(如LAP和纖連蛋白)結合介導的任何臨床上不希望的病癥或疾病(如此處所述)。由于更高的親和力或親合力，以及與配體結合的陽離子依賴性或非依賴性，這些抗體可能比以前所知的αvβ6抗體更有效。
除了本發(fā)明的抗體特別是阻斷劑的治療用途之外，非阻斷劑類的抗體也能夠用于診斷目的，如用于抗原捕獲測定、酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)、免疫組化等。
通過下列詳述、附圖和權利要求書，本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點將是顯而易見的。
附圖簡述

圖1A和1B是顯示細胞捕獲測定結果的條形圖，該試驗是測定多種抗αvβ6單克隆抗體(“mAb”)結合β6轉染的FDC-P1細胞的能力(未轉染的細胞作為對照)。
圖2A是顯示ELISA測定結果的圖，該試驗是測定多種純化的抗αvβ6“融合6”單克隆抗體結合可溶性重組人αvβ6(“hsαvβ6”)的能力。這些抗體通過用截短的可溶性人αvβ6免疫β6-/-小鼠產(chǎn)生。圖例中的數(shù)字表示克隆數(shù)。相應的克隆名稱見表2。
圖2B是顯示ELISA測定結果的圖，該試驗是測定多種純化的抗αvβ6“融合7”單克隆抗體結合可溶性重組hsαvβ6的能力。這些抗體通過用β6轉染的NIH 3T3細胞(融合#7)免疫β6-/-小鼠產(chǎn)生。
圖3A-F是顯示多種抗αvβ6單克隆抗體與hsαvβ6結合的不同陽離子依賴性的圖。
圖4A和4B是顯示融合#6和融合#7單克隆抗體分別抑制生物素-hsαvβ6與LAP結合的圖。
圖5A-E是顯示本發(fā)明的示例性單克隆抗體抑制β6轉染的FDC-P1細胞與LAP結合的圖。圖5A和5B顯示融合#6抗體的結果。圖5C-E顯示融合#7抗體的結果。
圖6A和6B是顯示融合#6和融合#7抗體分別抑制αvβ6-介導的TGF-β激活的圖，其中使用PAI-1螢光素酶報道基因測定監(jiān)測TGF-β的激活。
圖7A顯示αvβ6單克隆抗體6.1A8、6.8G6(亞克隆A和B)、7.7G5、6.2B1、6.3G9、6.2B10(亞克隆A和B)、6.2G2、6.2A1、6.4B4(亞克隆A、B和C)、7.10H2、7.9H5、7.4A3(亞克隆A和B)、7.1C5(亞克隆A和B)和7.1G10的重鏈可變域的氨基酸序列?？贵w6.1A8、6.8G6和7.7G5與αvβ6的結合是依賴陽離子的，而抗體6.2B1、6.2A1、6.3G9、6.2B10、6.4B4、7.1C5和7.1G10則是不依賴陽離子的(見下文)。括號中的數(shù)字代表氨基酸殘基位點。CDR在大框中，而含有斜體氨基酸的小框則代表具體抗體在不同克隆中的多態(tài)性。
圖7B顯示αvβ6單克隆抗體6.1A8、6.8G6、6.4B4、6.2A1、7.1C5、7.1G10、6.2B10、7.7G5、6.2B1和6.3G9的輕鏈可變域的氨基酸序列。
圖8是一張散布圖，顯示人乳腺癌和人鱗狀癌組織切片中αvβ6的表達。正常人組織只顯示可以忽略的αvβ6表達水平。
圖9A和9B是二次曲線圖，顯示兩種抗αvβ6抗體6.8G6和6.3G9分別對可溶性αvβ6的溶液結合親和力。
圖10A和10B是兩張條形圖，證實純化的單克隆抗體與生物素化的6.3G9和生物素化的6.8G6分別競爭結合αvβ6的能力。
圖11是一張條形圖，顯示在用抗αvβ6單克隆抗體治療處理的UUO動物的腎臟中，平滑肌肌動蛋白染色的百分比。
圖12顯示根據(jù)FACS分析，腫瘤細胞系上αvβ6的表達(圖右側)，以及單克隆抗體6.3G9和6.4B4對腫瘤細胞系與LAP配體結合的抑制(圖左側)。
圖13是一張條形圖，證實抗αvβ6單克隆抗體6.3G9、6.8G6和6.4B4對三種腫瘤細胞系與LAP配體結合的抑制。單克隆抗體的結合與不添加試驗單克隆抗體的總結合(TB)并與單獨BSA對照的非特異性結合(NSB)相比較。
圖14A和14B顯示在33天的研究期內(nèi)，抗αvβ6單克隆抗體6.3G9和6.4B4分別對皮下植入Detroit 562細胞產(chǎn)生的腫瘤的作用。
圖15A-C顯示抗αvβ6單克隆抗體對博來霉素誘導的肺纖維化的作用。(A)使用6.3G9單克隆抗體的抗體治療在第0天施用博來霉素時開始，監(jiān)測30天；(B)使用6.3G9單克隆抗體的抗體治療在博來霉素治療15天后開始，監(jiān)測30天；(C)使用6.3G9、6.8G6和6.4B4單克隆抗體的抗體治療在博來霉素治療15天后開始，監(jiān)測延長的60天。在圖15A和15B中，左側的條圖代表μg羥脯氨酸/肺，而右側的條圖顯示與鹽水處理的小鼠(無博來霉素)相比，羥脯氨酸的增加百分數(shù)。在圖15C中，該圖顯示每個肺的羥脯氨酸含量。
發(fā)明詳述本發(fā)明表征了對于整聯(lián)蛋白αvβ6特異的抗體的類和亞類。至少一類抗體(阻斷劑)能夠阻斷αvβ6與LAP的結合或者阻止TGF-β的激活。
以下描述了制備本發(fā)明的抗體的多種方法。本領域公知但是在此沒有具體描述的方法也包含在發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，本發(fā)明的抗體也能夠用噬菌體展示抗體文庫鑒定，如Smith，Science 2281315-7(1985)；美國專利5,565,332、5,733,743、6,291,650和6,303,313所述。本發(fā)明的另外一些抗體能夠如下制備將此處鑒定的重鏈與非相關(noncognate)輕鏈(例如通過噬菌體展示技術鑒定的輕鏈)相偶聯(lián)。
非人雜交瘤抗體本發(fā)明的單克隆抗體能夠通過眾所周知的雜交瘤技術產(chǎn)生。為此，β6-/-動物(例如小鼠、大鼠或兔)用如下材料免疫純化的或粗αvβ6制品，用編碼αv、β6或這兩種抗原的cDNA構建體轉染的細胞，組成型表達αvβ6的細胞，等等?？梢宰鳛榧兓牡鞍踪|(zhì)、在細胞上表達的蛋白質(zhì)、其蛋白質(zhì)片段或肽，或者作為裸DNA或編碼該蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片段或肽的病毒載體遞送這些抗原。然后檢測免疫動物的血清中抗αvβ6抗體的存在。從檢測為陽性的動物中分離B細胞，用這些B細胞制備雜交瘤。
篩選雜交瘤分泌的抗體，這是根據(jù)它們特異性結合αvβ6(例如結合β6轉染的細胞，而不結合未轉染的親本細胞)的能力，和其它任何希望的特征，例如含有希望的CDR共有序列，以低于已知抗αvβ6抗體10D5的IC50值抑制(或者對于非阻斷劑，不抑制)LAP與αvβ6的結合，或抑制TGF-β的激活。
篩選實驗中檢測為陽性的雜交瘤細胞于使細胞向培養(yǎng)基內(nèi)分泌單克隆抗體的條件下在營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。然后收集條件雜交瘤培養(yǎng)上清液，純化上清液中所含的抗體。另外，希望的抗體也可以通過向未免疫的動物(例如小鼠)的腹腔內(nèi)注射雜交瘤細胞產(chǎn)生。雜交瘤細胞在腹腔內(nèi)增殖，分泌抗體，積累為腹水。然后可以用注射器從腹腔中吸出腹水，收集抗體。
單克隆抗體也能夠如下產(chǎn)生從希望的雜交瘤中分離編碼抗體的cDNA，用此cDNA轉染哺乳動物宿主細胞(例如CHO或NSO細胞)，培養(yǎng)轉染的宿主細胞，從培養(yǎng)基中回收抗體。
嵌合抗體本發(fā)明的單克隆抗體也能夠通過工程構建相關(cognate)雜交瘤(例如鼠、大鼠或兔)抗體產(chǎn)生。例如，可以通過重組DNA技術改變相關抗體，使得重鏈和/或輕鏈的部分或全部鉸鏈區(qū)和/或恒定區(qū)被替換為來自另外一個種(例如人)的抗體的相應成分。通常，工程化抗體的可變域與相關抗體的可變域相同或基本相同。這種工程化抗體被稱為嵌合抗體，當對作為鉸鏈區(qū)和/或恒定區(qū)來源的種(例如人)的個體施用時，抗原性低于相關抗體。制備嵌合抗體的方法在本領域公知。
本發(fā)明包括的嵌合抗體可包含一個重鏈可變域和/或一個輕鏈可變域，重鏈可變域含有與SEQ ID NOs19-36中任何一個相同(或基本相同)的序列，輕鏈可變域含有與SEQ ID NOs37-45中任何一個相同(或基本相同)的序列。
優(yōu)選的人恒定區(qū)包括來源于IgG1和IgG4的恒定區(qū)。
完全人抗體本發(fā)明的單克隆抗體還包括完全人抗體。它們可以用體外免疫(prime)的人脾細胞制備，如Boerner等人，J.Immunol. 14786-95(1991)所述，或者用噬菌體展示抗體文庫制備，如美國專利6,300,064所述。
生產(chǎn)完全人抗體的其它一些方法包括使用含有滅活的內(nèi)源Ig基因座并且對于未重排的人抗體重鏈和輕鏈基因而言是轉基因的非人動物。這些轉基因動物可以用αvβ6免疫，然后由來源于它們的B細胞制備雜交瘤。這些方法在下列文獻中描述，例如關于含有人Ig小基因座的轉基因小鼠的多篇GenPharm/Medarex(Palo Alto，CA)公開文本/專利(例如，Lonberg美國專利5,789,650)；關于XEMOMICE的多篇Abgenix(Fremont，CA)公開文本/專利(例如，Kucherlapati美國專利6,075,181、6,150,584和6,162,963；Green等人，Nature Genetics 713-21(1994)；和Mendez等人，15(2)146-56(1997)；和關于“transomic”小鼠的多篇Kirin(日本)公開文本/專利(例如，EP 843 961，和Tomizuka等人，NatureGenetics 16133-1443(1997))。
人源化抗體本發(fā)明的單克隆抗體還包括來源于其它種的人源化形式的相關抗αvβ6抗體。人源化抗體是通過重組DNA技術產(chǎn)生的抗體，其中用抗原結合不需要的人免疫球蛋白輕鏈或重鏈的一些或全部氨基酸(例如可變域的恒定區(qū)和框架區(qū))置換來自相關非人抗體的輕鏈和重鏈的相應氨基酸。例如，針對特定抗原的一種人源化鼠抗體在其重鏈和輕鏈上均含有(1)人抗體的恒定區(qū)；(2)來自人抗體的可變域的框架區(qū)；和(3)來自鼠抗體的CDR。必要時，能夠?qū)⑷丝蚣軈^(qū)中的一個或多個殘基改變?yōu)槭罂贵w相應位點的殘基，以保持人源化抗體與抗原的結合親和力。這種改變有時被稱為“回復突變”。人源化抗體在人體中引發(fā)免疫反應的可能性通常低于嵌合人抗體，因為前者含有相當少的非人成分。
制備人源化抗體的方法在下列文獻中描述，例如Winter EP 239400；Jones等人，Nature 321522-525(1986)；Riechmann等人，Nature332323-327(1988)；Verhoeyen等人，Science 2391534-1536(1988)；Queen等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 8610029(1989)；美國專利6,180,370；和Orlandi等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 863833(1989)。鼠(或其它非人)CDR向人抗體上的移植通常如下實現(xiàn)。從雜交瘤中分離編碼重鏈和輕鏈可變域的cDNA?？勺冇?，包括CDR的DNA序列通過測序測定。編碼CDR的DNA通過定點誘變轉移到人抗體重鏈或輕鏈可變域編碼序列的相應區(qū)。然后添加希望的同種型的人恒定區(qū)基因片段(例如對于CH添加γ1，對于CL添加κ)。人源化重鏈和輕鏈基因在哺乳動物宿主細胞(例如CHO或NSO細胞)中共表達，產(chǎn)生可溶性人源化抗體。為了促進抗體的大規(guī)模生產(chǎn)，通常希望在含有抗體表達細胞的生物反應器中生產(chǎn)這些人源化抗體，或者生產(chǎn)在乳汁中表達該抗體的轉基因哺乳動物(例如山羊、母?；蚓d羊)(參見，例如美國專利5,827,690)。
有時，CDR向人框架的直接轉移導致獲得的抗體丟失抗原結合親和力。這是因為在有些相關抗體中，框架區(qū)內(nèi)的某些氨基酸與CDR相互作用，從而影響抗體的總抗原結合親和力。在這種情況下，為了保留相關抗體的抗原結合活性，在接受抗體的框架區(qū)內(nèi)引入“回復突變”(同上)是很關鍵的。
形成回復突變的普通方法在本領域中公知。例如，Queen等人(同上)，Co等人，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 882869-2873(1991)和WO90/07861(Protein Design Labs Inc.)描述了一種包括兩個關鍵步驟的方法。首先，通過計算機分析與相關鼠抗體V區(qū)框架的最佳蛋白質(zhì)序列同源性，選擇人V框架區(qū)。然后，用計算機模擬鼠V區(qū)的三級結構，以顯示可能與鼠CDR相互作用的框架氨基酸殘基，然后將這些鼠氨基酸殘基疊加到同源的人框架上。
對于這種兩個步驟的方法，有幾個標準用來設計人源化抗體。第一個標準是用來自通常與非人供體免疫球蛋白同源的特定人免疫球蛋白的框架作為人受體，或者使用來自多種人抗體的共有框架。第二個標準是，如果人受體殘基異常且供體殘基在框架的特定殘基處是人序列典型的，則使用供體氨基酸而不是受體氨基酸。第三個標準是在緊鄰CDR的位置處使用供體框架氨基酸殘基而不是受體氨基酸殘基。
也可以使用一種不同的方法，如Tempest，Biotechnology 9266-271(1991)所述。對于這種方法，分別用來源于NEWM和REI重鏈和輕鏈的V區(qū)框架進行CDR移植，而不根本引入小鼠殘基。使用該方法的一個優(yōu)點是NEWM和REI可變區(qū)的三維結構通過X射線結晶學已知，因此CDR與V區(qū)框架殘基的特異性相互作用能夠容易地模擬。
其它部分本發(fā)明的單克隆抗體還可包含用來實現(xiàn)希望的功能的其它部分。例如，這些抗體可以包括毒素部分(例如破傷風類毒素或篦麻毒素)或放射性核素(例如111In或90Y)，用于殺傷抗體靶向的細胞(參見，例如美國專利6,307,026)。這些抗體可以含有易于分離或檢測的部分(例如生物素、熒光部分、放射性部分、組氨酸尾或其它肽標簽)。這些抗體也可含有一個能夠延長其血清半衰期的部分，例如聚乙二醇(PEG)部分。
病情和動物模型本發(fā)明的抗體可用于αvβ6介導的疾病的治療，包括預防。例如，這些抗體通過阻斷TGF-β的激活或阻斷αvβ6與其它任何配體(如纖連蛋白、玻連蛋白和腱生蛋白)的結合，能夠用來治療纖維化(如肺纖維化、急性肺損傷、腎纖維化、肝纖維化、奧爾波特綜合征和硬皮病)。該方法的新穎性包括(1)阻斷TGF-β的激活，而不是TGF-β與其受體的結合，(2)能夠局部抑制TGF-β(即在αvβ6上調(diào)位點處)，而不是全身抑制，(3)抑制αvβ6與配體的結合。除了纖維化疾病以外，本發(fā)明的抗體還可用于治療癌癥或癌癥轉移(包括腫瘤生長和侵襲)，特別是上皮癌。上皮癌的一個亞類是鱗狀細胞癌，例如頭頸癌、口、乳房、肺、前列腺、子宮頸、咽、結腸、胰腺和卵巢癌。我們使用新的αvβ6單克隆抗體的研究證實αvβ6在多種上皮癌中高表達，特別是在腫瘤的前緣。這些新抗體也能夠用于αvβ6介導的其它任何疾病，包括銀屑病。
本發(fā)明的治療對罹患這些疾病的人和動物對象都有效。本發(fā)明適用的動物對象擴展到作為寵物或為了商業(yè)目的獲得的家畜和牲畜。例子包括狗、貓、牛、馬、綿羊、豬和山羊。
本發(fā)明的抗體的效能可以用不同的動物模型檢驗。肺纖維化小鼠模型包括博來霉素誘導的(Pittet等人，J.Clin.Invest.107(12)1537-1544(2001)；和Munger等人，同上)和放射誘導的肺纖維化(Franko等人，Rad.Res.140347-355(1994))。在博來霉素處理的小鼠中，αvβ6的表達在肺上皮肺泡細胞中增加。但是β6敲除小鼠受到保護，免遭博來霉素誘導的損傷和纖維化。
腎纖維化小鼠模型包括COL4A3-/-小鼠(參見，例如Cosgrove等人，Amer.J.Path.1571649-1659(2000))、具有阿霉素誘導的損傷的小鼠(Wang等人，Kidney International 581797-1804(2000)；Deman等人，Nephrol Dial Transplant 16147-150(2001))、db/db小鼠(Ziyadeh等人，PNAS USA 978015-8020(2000))和單側輸尿管阻塞的小鼠(Fogo等人，Lab Investigation 81189A(2001))。在所有這些模型中，小鼠發(fā)展為腎損傷和纖維化，能夠進展為腎衰竭。對于COL4A3-/-小鼠、阿霉素處理的小鼠和單側輸尿管阻塞的小鼠，在其腎臟的上行小管和下行小管的上皮層中αvβ6上調(diào)。在多種腎損傷模型中，αvβ6的表達也可能增加。
也能夠在作為標準體內(nèi)腫瘤生長和轉移模型的這些動物模型中檢驗抗αvβ6單克隆抗體抑制腫瘤生長、進展和轉移的能力。參見，例如，Rockwell等人，J.Natl.Cancer Inst.49735(1972)；Guy等人，Mol.CellBiol.12954(1992)；Wyckoff等人，Cancer Res.602504(2000)；和Oft等人，Curr.Biol.8124(1998)。癌癥中重要的αvβ6配體可能包括與轉移有關的TGF-β(綜述見Akhurst等人，Trends in Cell Biology 11S44-S51(2001))、纖連蛋白和玻連蛋白。
本發(fā)明的治療的效能可以用多種可以獲得的診斷方法檢驗，包括身體檢查、血液檢查、蛋白尿測定、肌酐水平和肌酐清除率、肺功能檢查、血漿尿素氮(BUN)水平、瘢痕或纖維化損傷的觀察和評分、胞外基質(zhì)(如膠原蛋白、平滑肌肌動蛋白和纖連蛋白)的沉積、腎功能檢查、超聲波、磁共振成像(MRI)和CT掃描。
藥物組合物本發(fā)明的藥物組合物包含一種或多種本發(fā)明的抗體，或其藥學可接受的衍生物，任選地含有任何一種藥學可接受的載體。如此處所用的術語“載體”包括已知的可接受的佐劑和載體。
根據(jù)本發(fā)明，藥物組合物可以是無菌注射制劑的形式，例如無菌注射用水或油懸液。該懸液可以根據(jù)本領域公知的技術用適當?shù)姆稚?、濕潤劑和懸浮劑配制而成?br> 本發(fā)明的藥物組合物可以按需要口服、局部、靜脈內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)、肌肉內(nèi)、髓內(nèi)、關節(jié)內(nèi)、滑液內(nèi)、胸骨內(nèi)、鞘內(nèi)、肝內(nèi)或顱內(nèi)施用，或者只是在炎癥或腫瘤生長部位局部施用。本發(fā)明的藥物組合物也可以通過使用如噴霧器、干粉吸入器或計量劑量吸入器吸入施用。
可有效產(chǎn)生希望的效應的本發(fā)明之抗體的劑量和劑量率取決于多種因素，如所治療的疾病的性質(zhì)、受試者的體重、治療目的、使用的具體藥物組合物和主治醫(yī)生的判斷。約0.001-約100mg/kg體重每天，例如約0.1-約50mg/kg體重每天的活性成分化合物的劑量水平是有用的。例如，本發(fā)明的抗體將以1-14天的間隔，以約0.01mg/kg體重/天到約20mg/kg體重/天，例如約0.1mg/kg體重/天到約10mg/kg體重/天的劑量施用。在另一個實施方案中，當抗體腹膜內(nèi)施用時，以約0.3-1mg/kg體重的劑量施用。在另一個實施方案中，當抗體靜脈內(nèi)施用時，以約在5-12.5mg/kg體重的劑量施用。在一個實施方案中，抗體組合物以有效產(chǎn)生至少1mg/ml的血漿抗體水平的量施用。
診斷方法本發(fā)明的抗體能夠用來診斷與αvβ6表達水平改變有關的疾病。來自受試者的組織標本，如組織活檢、體液標本或灌洗液(如肺泡灌洗液)，可以通過使用這些抗體的抗原捕獲測定、ELISA、免疫組化測定等來檢測。來自正常個體的組織標本作為對照。
除非另外指出，本發(fā)明的實施將使用細胞生物學、細胞培養(yǎng)、分子生物學、微生物學、重組DNA、蛋白化學和免疫學常規(guī)技術，這些技術屬于本領域的技能。這些技術在文獻中描述。參見，例如《分子克隆實驗室指南》，第二版(Sambrook等人編)，1989；《寡核苷酸合成》(M.J.Gait編)，1984；授予Mullis等人的美國專利4,683,195；《核酸雜交》(B.D.Hames和S.J.Higgins)，1984《轉錄和翻譯》(B.D.Hames和S.J.Higgins)，1984《動物細胞培養(yǎng)》(R.I.Freshney編)，1987；《固定的細胞和酶》，IRL Press，1986《分子克隆實用指南》(B.Perbal)，1984；《酶學方法》，第154和155卷(Wu等人編)，Academic Press，紐約；《用于哺乳動物細胞的基因轉移載體》(J.H.Miller和M.P.Calos編)，1987；《細胞和分子生物學中的免疫化學方法》(Mayer和Walker編)，1987；《實驗免疫學手冊》，第I-IV卷(D.M.Weir和C.C.Blackwell編)，1986；《小鼠胚胎的操作》，1986。
除非另外定義，在此使用的所有技術和科學術語均與本發(fā)明所屬領域的技術人員通常理解的含義相同。典型的方法與材料在下文中描述，但是與此處所述相似或相當?shù)姆椒ㄅc材料也能夠在本發(fā)明的實施中使用。此處提到的所有公開文本和其它參考文獻在此全文引用作為參考。如果沖突，以本說明書，包括定義，為準。材料、方法和實施例只是說明性的，而非意在限制。在本說明書中，單詞“包含”或其時態(tài)變化意味著包含所述整體或整體組，但是并不排除其它任何整體或整體組。
實施例下列實施例旨在說明本發(fā)明的方法與材料。在抗體領域通常遇到的，本領域技術人員公知的，所述條件和參數(shù)的適當修改和改變，在本發(fā)明的精神和范圍之內(nèi)。
在下列實施例中，β6-/-小鼠如Huang等人，J.Cell Biol.133921(1996)所述產(chǎn)生。重組人LAP購自R&D Systems(Minneapolis，MN)?？贵w10D5購自Chemicon(Temecula，CA)。L230雜交瘤購自ATCC，分泌的抗體通過在固定的蛋白A上親和層析從飽和培養(yǎng)物的上清液中純化?？贵w的同種型分型用ISOSTRIP試劑盒(Roche Diagnostics)根據(jù)廠商說明書進行。β6轉染的SW480細胞系如Weinacker等人，J.Biol.Chem.2696940-6948(1994)所述制備。
實施例1β6轉染的穩(wěn)定細胞系的產(chǎn)生β6轉染的NIH 3T3和FDC-P1細胞如下產(chǎn)生用含有全長鼠β6cDNA和新霉素選擇性標記的DNA構建體電穿孔親本細胞系。穩(wěn)定轉染的細胞如下篩選在含有G418的培養(yǎng)基中傳代細胞14天，隨后通過熒光激活細胞分選(FACS)分離表達最高水平的表面β6的細胞。轉染的FDC-P1細胞在DMEM中培養(yǎng)，其中補充了4mM L-谷氨酰胺，調(diào)節(jié)為含有1.5g/L碳酸氫鈉、4.5g/L葡萄糖和1.0mM丙酮酸鈉、10％FBS、2.5％小鼠IL-3培養(yǎng)添加物和1.5mg/ml活性G418。轉染的NIH 3T3細胞在補充了10％FBS、2mM L-谷氨酰胺、青霉素/鏈霉素和1mg/ml活性G418的DMEM中培養(yǎng)。
實施例2可溶性人αvβ6的純化αvβ6蛋白質(zhì)基本如上文的Weinacker所述純化。培養(yǎng)一種表達hsαvβ6的CHO細胞系，離心收集獲得的上清液。使用抗αv抗體L230通過親和層析純化整聯(lián)蛋白。純化的L230與CNBr激活的Sepharose 4B(Sigma)以4.8mg抗體/ml樹脂的比例交聯(lián)。αvβ6上清液以0.5mg抗體/ml樹脂的比例加到L230親和柱上，用10倍體積的下列每種溶液洗柱(1)50mM Tris-Cl，pH7.5，1M NaCl，1mM MgCl2；(2)50mM Tris-Cl，pH7.5，50mM NaCl，1mM MgCl2；和(3)10mM Na3PO4，pH7.0。hsαvβ6用100mM甘氨酸，pH2.5洗脫到1∶10體積的1M Na3PO4，pH8.0內(nèi)。蛋白質(zhì)對磷酸緩沖液(PBS)透析，期間更換幾次PBS，貯存于-20℃。
實施例3β6-/-小鼠的免疫
β6-/-小鼠通過腹膜內(nèi)(IP)注射在完全弗氏佐劑(CFA)中乳化的25μg純化重組人αvβ6而免疫，其體積比為1∶1，總體積為200μl。此外，β6-/-小鼠也通過IP注射4×106β6轉染的NIH 3T3細胞而免疫，這些細胞重懸浮于補充了1mg/ml CaCl2和1mg/ml MgCl2的100μl PBS中，同一小鼠也在相鄰部位注射100μl CFA。開始免疫2周和4周后，用相同的試劑類似地加強免疫小鼠，不同之處是使用不完全弗氏佐劑代替CFA。小鼠在最后一次加強7天后采血，根據(jù)血清與純化的重組人αvβ6或與β6轉染的細胞的結合，測定抗β6滴度。對于用純化的重組人αvβ6免疫的小鼠，使小鼠休息3個月，用與ImmunEasy(Qiagen)混合的相同抗原再次免疫。在為了雜交瘤融合分離脾臟前3天，通過IP和靜脈內(nèi)注射，用12.5μg純化的重組人αvβ6蛋白免疫小鼠。在融合當天，殺死動物，取出脾臟，制成單細胞懸液。脾細胞通過與可藥物選擇的細胞融合配偶體融合而成為無限增殖的。
實施例4雜交瘤的篩選通過β6-/-小鼠的免疫產(chǎn)生兩組抗體。一組抗體通過用截短的可溶性人αvβ6(融合#6)免疫產(chǎn)生。另一組抗體通過用鼠β6轉染的NIH 3T3細胞(融合#7)免疫產(chǎn)生?？功羦β6抗體的篩選用如下所述的基于細胞的和無細胞的結合和功能測定進行。陽性克隆的最初篩選是基于與純化的hsαvβ6和β6轉染的人和鼠細胞的結合(未轉染的細胞作為對照)。使選擇的克隆擴增，利用細胞捕獲試驗再次評價終培養(yǎng)物與β6轉染的和未轉染的細胞的結合(實施例5b，同上)(圖1A和1B顯示的代表性實施例，其中省略了mAb名稱的前綴“6.”或“7.”，它們分別是指融合6和融合7；參見下表2)。某些抗體偏愛結合β6轉染的細胞，而有些與轉染的和未轉染的細胞都結合，表明只有一個亞類的抗體具有β6偏好性(圖1A和1B)。進一步的篩選是基于抗體阻斷生物素化的hsαvβ6和β6轉染的鼠細胞與LAP結合的能力。使用FACS亞克隆選擇的克隆，凍存到使用前。
根據(jù)與αvβ6結合的特異性篩選單克隆抗體，這是基于它們結合β6轉染的細胞而不結合未轉染的親本細胞的能力。根據(jù)它們不能與表達αvβ3、αvβ8、α5β1、αvβ1或α5β1的細胞系結合，這些單克隆抗體進一步被證實為αvβ6而不是其它αv整聯(lián)蛋白或非特異性整聯(lián)蛋白(即與含RGD的配體結合的非αv整聯(lián)蛋白)的特異結合劑。其中包括穩(wěn)定轉染的細胞以及未轉染的JY、K562、SW480、NIH 3T3和FDCP1細胞系。
已經(jīng)由ATCC保藏的其中一些抗體在下面表1中列出。
表1保藏的雜交瘤
實施例5用于篩選和表征的試驗a.αvβ6ELISA一塊96孔微孔板(Corning COSTAR EASY-WASH)用50μl/孔50μg/ml hsαvβ6在4℃下包被過夜。平板在自動洗板機中用洗滌緩沖液(0.1％TWEEN-20，溶于PBS)洗滌4次。然后加入180μl/孔溶于TBS的3％BSA，在25℃下溫育1小時以阻斷非特異性結合。平板如上所述洗滌，加入(50μl/孔)雜交瘤上清液(用于篩選試驗)或純化的抗體(用于表征)在含有1mg/ml BSA，1mM CaCl2和1mM MgCl2的TBS中的稀釋液。平板在25℃下溫育1小時，洗滌，然后與50μl/孔過氧化物偶聯(lián)的山羊抗小鼠IgG+A+M抗體(Cappel)溫育1小時。用3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)檢測結合的抗體。結合用450nm測量的吸光度表示。
b.細胞捕獲試驗一塊96孔微孔板用50μl/孔第二抗體(驢抗小鼠IgG(JacksonImmunoresearch)；5μg/ml，在pH9.2的50mM碳酸氫鈉中稀釋)在4℃下包被過夜。平板用100μl/孔測定緩沖液(RPMI+2％BSA)洗滌兩次，然后用100μl/孔測定緩沖液在37℃下封閉1小時。對于FDC-P1細胞和β6轉染的FDC-P1細胞，平板用抗小鼠Ig(Jackson ImmunoResearch；20μg/ml)在室溫下封閉10分鐘，以降低第二抗體的非特異性Fc受體結合(其它細胞型省略)。封閉平板時，細胞在測定緩沖液中以5×106細胞/ml的濃度用2μM熒光染料(鈣黃綠素-AM，Molecular Probes)標記。細胞與染料在測定緩沖液中在37℃水浴和輕輕振搖下溫育15分鐘，離心收集，重懸浮于測定緩沖液中至5×106細胞/ml。在封閉步驟后，通過拍打平板棄去緩沖液，向平板中加入25μl/孔的上清液或純化的抗體。在37℃下溫育15分鐘，之后加入25μl/孔標記的細胞，平板在37℃下溫育1小時。平板用測定緩沖液(100μl/孔)洗滌3-5次，記錄平板上捕獲的細胞發(fā)出的熒光。通過比較最后一個洗滌步驟之前的熒光(即添加的總細胞)與洗滌后的熒光(即結合的細胞)，測定結合百分比。
c.FACS通過胰蛋白酶消化收集細胞，用PBS洗滌一次，然后重懸浮于FACS緩沖液(1×PBS，2％FBS，0.1％NaN3，1mM CaCl2和1mM MgCl2)中。0.2×105細胞然后在FACS緩沖液中在冰上溫育1小時，該緩沖液中含有雜交瘤上清液，總體積為100μl。溫育后，細胞用冰冷的FACS緩沖液洗滌兩次，重懸浮于100μl含有5μg/ml驢抗小鼠IgG PE(JacksonImmunoResearch)的FACS緩沖液中，在冰上溫育30分鐘。細胞然后用冰冷的FACS緩沖液洗滌兩次，重懸浮于200μl FACS緩沖液中。通過流式細胞分析監(jiān)測PE標記的第二抗體的結合。
d.生物素-hsαvβ6與LAP的結合96孔微孔板(Cornin COSTAR EASY-WASH)用在PBS中稀釋的0.3μg/ml重組人LAP(R&D Systems，Cat.#246-LP)(50μl/孔)在4℃下包被過夜。除去包被溶液后，平板用180μl/孔3％BSA/TBS在25℃下封閉1小時。在另外一塊96孔圓底平板上，60μl/孔2×貯存液(0.5μg/ml(1.25nM)生物素-αvβ6，2mM CaCl2和2mM MgCl2，溶于含有1mg/mlBSA的TBS)與60μl/孔雜交瘤上清液(用于篩選)或純化的抗體(也溶于含有1mg/ml BSA的TBS)的2×原液混合，并在25℃下溫育1小時。LAP包被的平板用自動洗板機用洗滌緩沖液(0.1％TWEEN-20，溶于PBS)洗滌4次，之后將100μl抗體-αvβ6混合物轉移到平板上，在25℃下溫育1小時。平板如上所述洗滌，與50μl/孔extravidin-辣根過氧化物酶偶聯(lián)物(Sigma)在TBS(1mg/ml BSA)中的1∶1000稀釋液在25℃下溫育1小時。結合的蛋白質(zhì)用TMB底物檢測。
e.β6-FDC-P1細胞與LAP的粘附96孔微孔板(Cornin COSTAR EASY-WASH)用50μl/孔在50mM碳酸氫鈉，pH 9.2中稀釋的0.5μg/ml重組人LAP(R&D Systems)在4℃下包被過夜。平板用PBS(100μl/孔)洗滌兩次，用溶于PBS的1％BSA(100μl/孔)在25℃下封閉1小時。平板用100μl/孔測定緩沖液(TBS完全溶液加1mM CaCl2和1mM MgCl2)洗滌兩次。然后，向平板的各個孔中加入25μl雜交瘤上清液(或純化的抗體)和25μl β6-FDC-P1細胞(5×106細胞/ml，如上所述用鈣黃綠素AM標記)。平板在25℃下溫育1小時，然后用測定緩沖液(100μl/孔)洗滌4-6次。記錄在平板上捕獲的細胞發(fā)出的熒光。通過比較最后一個洗滌步驟之前的熒光(即添加的總細胞)與洗滌后的熒光(即結合的細胞)，測定結合百分比。
f.TGF-β生物測定此處使用的TGF-β生物測定是Abe等人，Anal.Biochem.216276-284(1994)所述的水貂肺上皮細胞(MLEC)PAI-1螢光酶共培養(yǎng)測定的一種變化，其中β6轉染的細胞與報道細胞共培養(yǎng)，以監(jiān)測αvβ6對TGF-β的激活(Munger，同上)。這是對TGF-β的一種定量生物測定，是基于它能夠誘導纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-1)表達的能力。在該測定中，MLEC細胞用一種表達構建體穩(wěn)定轉染，該構建體含有與螢火蟲螢光素酶報道基因融合的截短的PAI-1啟動子。轉染的MLEC細胞與活性TGF-β(0.2到＞30pM)接觸導致細胞裂解物中螢光素酶活性依賴劑量地增加。
為了進行該測定，TMLC(水貂肺上皮細胞系Mv 1 Lu)細胞用PAI-1-螢光素酶構建體轉染。轉染的細胞在含有L-Gln、Pen/Strep和200μg/ml G418的DMEM+10％FBS中培養(yǎng)。用整聯(lián)蛋白β6構建體轉染的SW480細胞(“β6-SW480”或“SW480β6”細胞)在含有L-Gln和Pen/Strep的DMEM+10％FBS中培養(yǎng)。從含有PBS+5mM EDTA的搖瓶中挑取細胞，用PBS+0.5％BSA洗滌，用血細胞計數(shù)器計數(shù)，接種于96孔板中。SW480-β6細胞在洗滌緩沖液中以4×104細胞/孔接種。單克隆抗體用DMEM(無血清)稀釋，加到SW480-β6細胞中，在室溫下預溫育20分鐘。然后以2×104細胞/孔加入TMLC細胞至終體積為100μl。平板在潮濕、富含CO2的孵箱中溫育20小時。棄去平板的上清液，替換為100μl PBS+1mM Ca2+和1mM Mg2+。然后裂解平板上的細胞，用發(fā)光型反應Packard LUCLITE試劑盒(#6016911)和TROPIX微孔板光度計檢測螢光素酶活性水平。
實施例6抗體的純化選擇8個來自融合#6的雜交瘤克隆(用前綴“6.”表示)和14個來自融合#7的雜交瘤克隆(用前綴“7.”表示)進一步放大并表征(表2)。
制備每種雜交瘤的小規(guī)模培養(yǎng)物(150ml)，離心收集上清液。利用蛋白A親和層析從這些上清液中純化抗體。對于IgG2a同種型抗體，直接將上清液加到蛋白A Sepharose 4 Fast Flow(Amersham PharmaciaBiotech，AB，Uppsala，瑞典)上(1ml沉積床體積)。用PBS洗柱，IgG級分用25mM磷酸，100mM NaCl，pH2.8洗脫到1∶20體積的0.5MNa3PO4，pH8.6中。對于鼠IgG1抗體，在上樣前將上清液調(diào)節(jié)為1.5M甘氨酸，3M NaCl，pH8.9，在洗脫前用25mM Na3PO4，3M NaCl，pH8.6洗柱。用這些制品進行此處所述的體外生物化學表征。
表2雜交瘤克隆的表征
*阻斷劑被定義為一種阻斷αvβ6與LAP結合的抗體，根據(jù)配體與純化的hsαvβ6或與表達β6的細胞的結合測定。
為了在動物模型中使用，雜交瘤克隆放大為2L培養(yǎng)基，在LifecellCulture Bags-PL732(Nexell，目錄號R4R2113)中培養(yǎng)4周。首先通過如上所述的蛋白A親和層析，隨后通過Q Sepharose(AmershamPharmacia)上的離子交換步驟，純化雜交瘤產(chǎn)生的抗體。用2M Tris堿將蛋白A層析步驟獲得的洗脫液調(diào)節(jié)為pH 8.6，用水稀釋10倍，加到用10mM Na3PO4，25mM NaCl，pH8.6平衡的Q Sepharose柱上(20mg蛋白質(zhì)/ml樹脂)。用5倍柱體積的平衡緩沖液洗柱，用25mM Na3PO4，150mM NaCl，pH7.2洗脫結合的蛋白質(zhì)。無菌過濾(0.45μm)洗脫的蛋白質(zhì)，貯存于-70℃直到使用。
實施例7純化的抗體的表征對以下方面定量表征純化的抗體(表2，同上)它們在MLEC測定(同上)中(1)結合hsαvβ6，(2)結合β6轉染的SW480和FDC-P1細胞，(3)抑制生物素-αvβ6與LAP結合，(4)抑制β6轉染的FDC-P1細胞與LAP結合，和(5)阻斷αvβ6-介導的TGF-β激活的能力。每種測定的相對效能與已知的αvβ6抗體10D5(Huang等人，J.Cell Sci.1112189(1998))相比較，在有些情況下，與抗αv-抗體L230相比較。為了表征融合#7抗體，融合#6抗體6.8G6也作為陽性對照。
在1mM Ca2+和1mM Mg2+存在下進行的一項最初的結合實驗(實施例5a，同上)表明大多數(shù)純化的抗體與hsαvβ6結合(圖2A和2B)。然而意外的是，對于10D5和克隆7.2F5和7.10D7沒有觀察到結合。隨后的一項實驗表明，10D5(圖3E)、7.2F5和7.10D7的結合只被Ca2+/Mg2+較弱地支持，但是1mM MnCl2更強。在這些新克隆中，有三個(6.1A8(圖3A)、7.7G5和6.8G6(圖3C))顯示需要二價陽離子，但是Ca2+/Mg2+態(tài)和Mn+-結合態(tài)沒有觀察到不同。
其余的克隆顯示不需要二價陽離子，即在10mM EDTA存在下能夠與抗原結合(圖3B、3D和3F)。FACS分析可與β6轉染的NIH 3T3細胞或SW480細胞結合的抗體顯示一種類似的模式，不同之處是在本文中，10D5在Ca2+/Mg2+和Mn2+態(tài)時相同地結合。與可溶性αvβ6結合的需要可能不同于與細胞表面表達的αvβ6結合的需要，因為蛋白質(zhì)構象或親合力效應不同。
這些結果提示，這組中至少有3個不同類別的β6阻斷抗體。其中一類(10D5)可區(qū)別Ca2+/Mg2+與Mn2+條件。另一類(包括6.1A8、7.7G5和6.8G6)需要陽離子，但是不能區(qū)別Ca2+/Mg2+與Mn2+。最后一類(包括抗αv抗體L230、6.2B10、6.3G9(圖3B)和6.2B1(圖3D)、7.1C5和7.1G10)是不依賴陽離子的。
然后評價純化的抗體抑制αvβ6-LAP相互作用的能力。在上文所述的實施例5d的無細胞測定中，抗體6.1A8、6.2B1、6.3G9和6.8G6顯示低于10D5的IC50值(圖4A；表3)。6.2B10顯示較高的IC50，但是仍然產(chǎn)生完全抑制(圖4A)。6.4B4只顯示部分抑制，而6.6B5和6.8B4不顯示抑制(圖4A)。利用同一測定系統(tǒng)，抗體7.1C5、7.1G10、7.2A1、7.4A3、7.7G5、7.9G8、7.9H5和7.10H2顯示低于10D5的IC50值(圖4B；表3)?？贵w7.2F5、7.2H2和7.8H12顯示幾乎相同的或較高的IC50值，并且仍然產(chǎn)生完全抑制(圖4B)。
在上文實施例5e所述的細胞測定中觀察到相似的趨勢，例外的是6.1A8、6.2B10和7.9D4，它們對細胞的效能低于對純化的蛋白質(zhì)的效能(圖5A-E；表3)。
總之，這些結果表明，我們已經(jīng)成功產(chǎn)生了可特異性抑制人和鼠αvβ6與LAP相互作用的抗體。一些這樣的抗體以高親和力結合αvβ6(表觀Kd′s≥0.3nM，通過流式細胞術測定)，抑制β6轉染的細胞與LAP的結合，IC50≥0.05nM(8ng/mL)，并且阻止αvβ6介導的TGF-β1的激活，IC50≥0.58nM(87ng/mL)。
最后，利用PAI-1/螢光素酶報道基因測定(實施例5f，同上)評價純化的抗體阻斷αvβ6介導的TGF-β激活的能力。6.3G9、6.8G6、6.2B1、7.1G10和7.7G5再次能夠抑制αvβ6介導的TGF-β的激活，IC50值低于10D5，而在該測定中其余的抗體似乎有效性顯著較低(圖6A和6B；表3)。因此，阻斷αvβ6與LAP相互作用的能力與在體外抑制TGF-β激活的能力相關。
表3雜交瘤克隆的表征
*數(shù)據(jù)來自不同的實驗。
**未檢測。
***表3總結的所有實驗均在1mM Ca2+和1mM Mg2+存在下進行。
****以黑體字表示的抗體是現(xiàn)有技術中的抗體10D5和L230，以及對αvβ6有特別高的抑制能力的新抗體。
然后，利用一種動力學排除試驗(KinExA)測定6.3G9和6.8G6對可溶性αvβ6的溶液親和力?？扇苄哉?lián)蛋白的一系列稀釋液(1×10-8M到2.4×10-12M)與1×10-10M抗體溫育3小時。然后使用KinExA儀器(SapidyneInstruments，Inc.，Boise，Idaho)，使這些樣品通過用整聯(lián)蛋白包被的聚甲基丙烯酸甲酯珠。對于6.8G6，溫育和測定緩沖液中包含1mM CaCl2和1mM MgCl2。結合的和游離的抗體的含量用Cy5-標記的抗小鼠第二抗體測定。用KinExA軟件進行二次曲線擬合，以獲得每個相互作用的解離常數(shù)(Kd)。用該方法測定的Kd′s是，6.3G9為15.6pM，6.8G6為22.8pM(圖9A和9B)。因此，這兩種抗體對αvβ6都有極高的親和力。
我們進一步鑒定了可識別整聯(lián)蛋白的“激活”狀態(tài)的抗αvβ6抗體的類別。αvβ6有兩種可能的激活狀態(tài)。第一種狀態(tài)，激活的整聯(lián)蛋白被定義為對其配體有較高的親和力。在活化的陽離子如1mM MnCl2存在下，對于這種激活狀態(tài)特異的抗體顯示與整聯(lián)蛋白的結合增強。通過流式細胞分析比較1mM MnCl2和1mM MgCl2(未活化的陽離子)中的結合程度，表明此處所述的某些αvβ6抗體，包括6.1A8和6.6B5，在MnCl2存在下顯示顯著增強的結合。
對于αvβ6的第二種激活狀態(tài)，如上所述該整聯(lián)蛋白能夠激活潛伏的TGF-β。準備表達截短的αvβ6的一種細胞系(SW480(β6-770T))。在TMLC螢光素酶測定(Munger等人，同上)中，該細胞系能夠結合LAP，但是不能激活TGF-β。因此，可與全長β6轉染的SW480細胞結合、但是不與770T截短的轉染細胞結合的抗體，對于能夠激活TGF-β的αvβ6形式是特異的。抗體7.8B3和7.8C9滿足這一標準。
實施例8根據(jù)抗體競爭的表位作圖也用ELISA形式檢測了純化的單克隆抗體與6.8G6競爭結合生物素化αvβ6的能力。在該測定中，6.8G6包被于ELISA板上，向含有各1mM Ca2+和Mg2+的緩沖液中加入競爭抗體與生物素化αvβ6的混合物。結合的整聯(lián)蛋白用extravidin-HRP偶聯(lián)物檢測，根據(jù)競爭性抗體阻斷結合的能力對其評分。除了6.2B10(一種弱阻斷劑)以外，所有共同阻斷劑(表2)都顯示能夠與6.8G6不同程度地競爭(表4)。這些數(shù)據(jù)證實，這些共同阻斷劑可結合與6.8G6相同或重疊的表位。
表4根據(jù)抗體競爭的表位作圖
利用ELISA檢測純化的單克隆抗體與生物素化6.3G9或生物素化6.8G6競爭結合αvβ6的能力。在該測定中，未標記的αvβ6包被于ELISA板上，向含有各1mM Ca2+和Mg2+的緩沖液中加入競爭抗體與生物素化抗體的混合物。利用neutravidin-HRP偶聯(lián)物檢測結合的生物素化抗體。數(shù)據(jù)表明，最強的阻斷抗體(例如6.2B1、7.1C5和7.1G10)與6.3G9和6.8G6競爭結合αvβ6(表4.1，圖10A和10B)?？贵w6.1A8和7.7G5顯示較低的競爭性，這可能是由于它們對αvβ6的親和力較低。在該測定中，非阻斷抗體或抗αv抗體L230都不顯示與6.3G9或6.8G6有任何競爭。這些結果表明，αvβ6特異的阻斷抗體可結合與αvβ6相同或重疊的表位。
表4.1根據(jù)抗體競爭的表位作圖
實施例9CDR序列如Coligan等人(編著)的《(現(xiàn)代免疫學方法》，Wiley，Media，PA(2001)所述，利用標準技術分離并測序某些純化的單克隆抗體的cDNA。推斷的氨基酸序列在圖7A和7B中顯示。
如下比較高親和力結合劑6.8G6、6.1A8、6.2B1、6.3G9和6.2A1和非阻斷劑6.2G2的重鏈CDR的氨基酸序列(破折號表示缺口)。
CDR16.8G6SYTFTDYAMH(SEQ ID NO1)6.1A8SYTFTDYTMH(SEQ ID NO2)6.2B1GFTFSRYVMS(SEQ ID NO3)6.3G9GFTFSRYVMS(SEQ ID NO3)6.2A1GYDFNNDLIE(SEQ ID NO49)6.2G2GYAFTNYLIE(SEQ ID NO50)CDR26.8G6VISTYYGNTNYNQKFKG(SEQ ID NO4)6.1A8VIDTYYGKTNYNQKFEG(SEQ ID NO46)6.2B1SISSG-GSTYYPDSVKG(SEQ ID NO5)6.3G9SISSG-GRMYYPDTVKG(SEQ ID NO6)6.2A1VINPGSGRTNYNEKFKG(SEQ ID NO51)6.2G2VISPGSGIINYNEKFKG(SEQ ID NO52)CDR36.8G6GGLRRGDRPSLRYAMDY(SEQ ID NO7)6.1A8GGFRRGDRPSLRYAMDS(SEQ ID NO47)6.2B1GAIYDG-----YYVFAY(SEQ ID NO8)6.3G9GSIYDG-----YYVFPY(SEQ ID NO9)6.2A1IYYGPH-----SYAMDY(SEQ ID NO53)6.2G2ID-YSG-----PYAVDD(SEQ ID NO54)
在SEQ ID NO7中，以黑體表示的“R”(第12個殘基)表示其具有多態(tài)性，例如可以是Q。
如下比較這4種高親和力結合劑和非阻斷劑6.2G2的輕鏈CDR的氨基酸序列。
CDR16.8G6RASQSVSTSS-YSYMY (SEQ ID NO10)6.1A8RASQSVSIST-YSYIH (SEQ ID NO48)6.2B1SASSSVSSS----YLY (SEQ ID NO11)6.3G9SANSSVSSS----YLY (SEQ ID NO12)6.2A1KASLDVRTAVA (SEQ ID NO55)6.2G2KASQAVNTAVA (SEQ ID NO56)CDR26.8G6YASNLES (SEQ ID NO13)6.1A8YASNLES (SEQ ID NO13)6.2B1STSNLAS (SEQ ID NO14)6.3G9STSNLAS (SEQ ID NO14)6.2A1SASYRYT (SEQ ID NO57)6.2G2SASYQYT (SEQ ID NO58)CDR36.8G6QHNWEIPFT (SEQ ID NO15)6.1A8QHSWEIPYT (SEQ ID NO16)6.2B1HQWSSYPPT (SEQ ID NO17)6.3G9HQWSTYPPT (SEQ ID NO18)6.2A1QQHYGIPWT (SEQ ID NO59)6.2G2QHHYGVPWT (SEQ ID NO60)如圖7A和7B所示，屬于依賴二價陽離子的類別的單克隆抗體(例如6.1A8和6.8G6)在CDR內(nèi)似乎含有非常類似的氨基酸序列，而不依賴二價陽離子的單克隆抗體(例如6.2B1和6.3G9)在其CDR內(nèi)含有另外一組基序。
抗αvβ6單克隆抗體的效能和特異性可能受微小差異的氨基酸殘基控制。對于6.1A8和6.8G6，可變域的氨基酸序列非常相似，在重鏈中含有10個氨基酸差異，其中3個是保守的，在輕鏈中含有11個氨基酸差異。然而這些抗體在體外測定中有大約100倍的活性差異。氨基酸差異分散在多肽鏈的整個可變域中，這些殘基可以單獨起作用，或者與同一鏈或配偶鏈上的殘基協(xié)同起作用，影響抗體的效能。在重鏈中，7個殘基的位置使得它們可能緊密接近αvβ6，或者在與αvβ6的結合中起活性作用。
在大量整聯(lián)蛋白結合蛋白質(zhì)(配體)中發(fā)現(xiàn)了一種RGD基序。這種基序已經(jīng)顯示通過直接接觸整聯(lián)蛋白上的結合袋可介導它們與整聯(lián)蛋白的相互作用。因為RGD本身在整聯(lián)蛋白結合蛋白質(zhì)中相當常見，該基序之外的側翼殘基在使整聯(lián)蛋白-配體相互作用具有結合特異性方面肯定起作用。在6.1A8和6.8G6中，一個這樣的側翼殘基位于重鏈的位點101處，在CDR3內(nèi)。該氨基酸殘基位于RGD基序側翼，可能位于抗原識別位點處，影響結合的效能和特異性。
6.1A8和6.8G6的相同重鏈CDR內(nèi)的其它不同殘基包括位點33(CDR1)；位點52、57和65(CDR2)；和位點115(CDR3)處的殘基。重鏈中的另外一個差異位于框架1的位點4處，靠近N端。通過結晶學模型預測該殘基折疊接近抗體的CDR，可能在αvβ6結合中起重要作用。6.1A8與6.8G6之間的其余3個差異是位點20(框架1)、44(框架2)和82(框架3)處的保守差異。
不依賴陽離子的抗體的氨基酸序列也是高度同源的。它們能夠被分成兩類與含有RGD的抗體6.8G6競爭的(即6.2B1、6.3G9、7.10H2、7.9H5、7.1C5、7.1G10和7.4A3)；和不與之競爭的(即6.2A1、6.2B10和6.4B4)。與6.8G6競爭的一類在重鏈的CDR3中含有FXY基序，而非競爭的一類不含。這種差異提示，F(xiàn)XY基序?qū)τ诮閷cαvβ6的不依賴陽離子的結合至關重要。另外，這類含有FXY的抗體可能與αvβ6上的一個表位結合，該表位與RGD結合袋重疊，但是與之不同。抗體6.2B10和6.4B4不含F(xiàn)XY基序，是較差的αvβ6阻斷劑。它們證實可與αvβ6I域樣部分結合，定義了可與抗αvβ6抗體結合的另外一個表位。有意思的是，單克隆抗體6.2A1屬于不依賴陽離子的類別，但是與其它不依賴陽離子的單克隆抗體一樣，不含RGD序列。
單克隆抗體7.7G5屬于依賴陽離子的類別。然而，7.7G5的輕鏈序列與不依賴陽離子的I域結合抗體6.2B10高度同源。7.7G5的重鏈在CDR1上也類似于不依賴陽離子的抗體。但是其CDR2和CDR3更類似于依賴陽離子的類別。這一發(fā)現(xiàn)提示，特定CDR使抗體具有特異性。對于重鏈的CDR3這是特別正確的，這可能是由于抗體該部分內(nèi)的高度變異性。實際上，3種依賴陽離子的抗體中的2種和9種不依賴陽離子的抗體中的7種含有重鏈CDR3序列，該序列可能在αvβ6識別中起重要作用。眾所周知，7.7G5在其重鏈CDR2中缺乏RGD基序，但是含有XGD基序。該XGD基序可能以類似于RGD的方式起作用，并且使7.7G5具有結合親和力/特異性。
上述序列檢查和據(jù)此的推斷為合理設計提供特定結合性質(zhì)的特定可變區(qū)氨基酸序列提供了基礎。
實施例10診斷抗體能夠檢測石蠟包埋組織切片或其它組織標本中的αvβ6表達的抗體可以用作診斷劑。例如，這些診斷工具能夠用來檢測如癌癥或纖維化的適應證的組織切片中上調(diào)的αvβ6。
為了鑒定可檢測石蠟包埋組織中的αvβ6的抗體，我們第一次篩查了一系列用于結合HPLC純化的β6亞基的抗體。可結合該亞基的抗體可能識別線性肽表位，因此預計在石蠟包埋組織中有較高的成功可能性。使用與測定αvβ6結合所述(同上)相同的ELISA形式測定與純化的β6亞基的結合，不同之處在于平板上固定純化的β6整聯(lián)蛋白，而不是αvβ6蛋白。利用該方法，鑒定了大量能夠結合純化的αvβ6蛋白和純化的β6亞基的融合6抗體。見上文中的表5，其中省略克隆名稱的前綴“6.”。
表5可與純化的αvβ6或純化的β6亞基結合的抗體
如上所示，一些抗體可與純化的β6亞基結合。它們與變性αvβ6結合的可能性較高，因而能夠用于檢測石蠟包埋的組織切片中的αvβ6。有些抗體可結合可溶性αvβ6，而不結合β6亞基。這兩類抗體都用來染色變性的石蠟包埋的β6轉染的SW480細胞和未轉染的親本細胞，數(shù)據(jù)在表6中顯示。
為了染色石蠟包埋的組織或細胞，標本載玻片首先通過在下列溶液中溫育去除石蠟(de-paraffinized)(1)二甲苯，5分鐘，兩次；(2)100％乙醇，2分鐘，兩次；(3)95％乙醇，2分鐘，兩次；(4)50％乙醇，2分鐘，一次；和(5)蒸餾水，2分鐘，一次。載玻片然后在含有200ml甲醇和3ml 30％H2O2的溶液中溫育15分鐘，以封閉內(nèi)源過氧化物酶。載玻片用PBS漂洗兩次，每次2分鐘。然后用胃蛋白酶(Zymed 00-3009)暴露載玻片上的石蠟切片，37℃5分鐘。載玻片再用PBS漂洗兩次，每次2分鐘。然后，先用抗生物素蛋白然后用生物素(Vector SP-2001；Vector Laboratories，Burlingame，CA)封閉載玻片，每次在室溫下10分鐘，在每次溫育之間如上所述洗滌。從載玻片上除去封閉溶液，之后向載玻片上添加用PBS/0.1％BSA稀釋的第一抗體(雜交瘤培養(yǎng)上清液)，在4℃下溫育過夜。
次日，載玻片如上所述用PBS漂洗。同時，如下制備抗生物素蛋白-生物素復合物-辣根過氧化物酶溶液(ABC試劑)1ml PBS與來自Vector Kit PK-6102的20μl溶液A(1∶50)和20μl溶液B(1∶50)混合；混合物在使用前在室溫下溫育30分鐘。在此期間，載玻片與含有15μl/ml正常血清的來自Vector Kit的抗小鼠生物素化抗體(1∶200)在室溫下溫育30分鐘。然后用PBS漂洗載玻片兩次，每次2分鐘。然后向載玻片上添加上述ABC試劑，在室溫下溫育30分鐘。再次如上所述漂洗載玻片。向載玻片上添加底物(Vector SK-4100)——100μl DAB(3，3′-二氨基聯(lián)苯胺)，在室溫下溫育5分鐘。DAB如下制備向5ml H2O中加入2滴緩沖液貯存溶液，充分混合；然后加入4滴DAB貯存溶液，充分混合；然后加入2滴H2O2溶液，充分混合。用流水漂洗載玻片2分鐘。其次，如下增強所有載玻片的DAB信號用0.05M碳酸氫鈉，pH9.6漂洗石蠟切片10分鐘；印跡過量的緩沖液；加入DAB增強溶液15秒；然后用水快速漂洗1分鐘終止反應。載玻片然后在Mayer′s蘇木精(一種核復染劑)中染色1分鐘。用流水漂洗載玻片1分鐘，然后在PBS中浸沒1分鐘，使蘇木精變成藍色。再用流水漂洗載玻片1分鐘，脫水，如下澄清浸沒于(1)95％乙醇中1分鐘，兩次；(2)100％乙醇中1分鐘，兩次；和(3)二甲苯中2分鐘，兩次。然后使用permount向載玻片上加上蓋玻片。
結果提示，融合6抗體1A1、2C4、3B2、3B11、5D6、5G9、5H3、6D12、7C7、9B5、9B7、9D11、9F5、10E4、10H11、6H8、7A5、7G9、9A3、2A1、2E5、4E4、4H4、8B4、2G2和4E6，它們都能夠結合純化的β6亞基(表5)，確實能夠強烈染色石蠟包埋的β6轉染的SW480細胞，而不染色未轉染的親本細胞(表6)。
表6可與石蠟包埋的SW480細胞結合的抗體
就此臨床研究來說，僅選擇VAS標尺(VAS視覺模擬標尺)上疼痛強度至少為40mm的患者。
疼痛強度在線性VAS標尺上以“mm”單位表示，并通過提示患者在線性VAS標尺上與各自疼痛強度相一致的點上作標記來測定。因此無感覺疼痛的值為0mm，而可能的最強疼痛的值為100mm。
持續(xù)檢查患者的疼痛強度，患者也須說明單次疼痛期的各自持續(xù)時間。
結果與僅接受安慰劑的患者相比，接受UMP的患者在第一次注射后起初的24小時內(nèi)，可顯示其疼痛已有明顯下降(見表I)。
表I證明，在起始注射后短期內(nèi)，UMP組患者在靜止及運動時疼痛強度明顯下降。手指-地面間距離代表了運動性的測量值，即彎腰能力的程度，用“cm”單位來表示，測量手臂完全伸展時指尖與腰盡可能彎曲時曲度(curvature)的距離。
表IUMP和安慰劑組患者的平均值
表II著重比較UMP和安慰劑組患者在疼痛強度下降方面的差值。
表IIUMP組和安慰劑組患者的疼痛減輕狀況如上所述制備石蠟包埋的腎臟切片，然后染色，檢測平滑肌肌動蛋白——腎纖維化中成肌細胞和基質(zhì)沉積的一種標記物。我們發(fā)現(xiàn)，與1E6處理的小鼠相比，在mAb 6.8G6或6.3G9處理的Alport小鼠的腎臟間質(zhì)和腎小球區(qū)中，平滑肌肌動蛋白染色顯著減少。
圖11A和11B顯示Alport腎臟的腎小球和間質(zhì)區(qū)中平滑肌肌動蛋白染色的點圖。與陰性對照1E6處理的小鼠相比，6.8G6和6.3G9處理的Alport小鼠的腎臟中平滑肌肌動蛋白染色顯著減少。
實施例13抗αvβ6mAb在預防單側輸尿管阻塞誘導的腎硬化癥方面的有效性我們使用另外一種腎纖維化進展小鼠模型來檢驗6.8G6和6.3G9的抗纖維化效能。在這個小鼠模型中，動物的一側輸尿管被結扎，導致單側輸尿管阻塞(UUO)。在小鼠中，UUO導致進行性腎硬化癥而不導致短期腎衰竭，因為未阻塞的腎臟能夠維持相對正常的腎功能。阻塞的腎臟經(jīng)歷快速腎小球纖維化，而未阻塞的腎臟則經(jīng)歷適應性肥大。
該研究通過形態(tài)測量定量抗αvβ6處理對UUO誘導的腎纖維化的影響。使用體重25.5±0.2g的不含病毒抗原的8-12周齡雄性C57BL小鼠(Jackson Laboratories，Bar Harbor，ME)。在開始研究前使小鼠適應7天。在適應和實驗期間小鼠可隨意獲得照射的標準鼠食和無菌水。定期稱量體重，作為動物健康監(jiān)測的一部分。結果顯示，年齡匹配的未操作的小鼠在兩周的研究期內(nèi)體重增加約10％。UUO小鼠到第二天體重減少約9％，但是到第14天減少的體重逐漸恢復。這種體重改變模式與治療處理無關。
為了誘發(fā)腎纖維化，在氯胺酮∶賽拉嗪(100∶10mg/kg皮下)麻醉下，通過中線左側剖腹術無菌分離左輸尿管。將兩條拉緊的阻塞6-0結扎絲線置于輸尿管上位于腎臟較低極(lower pole)的水平，在結扎線之間切開輸尿管。腹壁用4-0 Vicryl縫線閉合，皮膚用4-0尼龍閉合。使動物在熱墊上恢復，在第0天和第1天皮下給予0.05mg/kg丁丙諾啡，每日兩次。該程序來自Ma等人，Kidney Int.53(4)937-944(1998)。
然后將小鼠分為下列研究組組別 處理 劑量 n*( mg/kg，腹膜內(nèi))16.8G6(依賴陽離子的抗αvβ6mAb4 926.3G9(不依賴陽離子的抗αvβ6mAb) 4 831E6(陰性對照mAb)4 104PBS載體對照 (100μl) 85未操作的未處理的對照--8*動物數(shù)除了第5組之外所有動物都從手術前一天開始每周兩次施用。
然后在結扎后的第10天用二氧化碳麻醉動物，并解剖。在UUO小鼠中，腎盂和輸尿管顯著腫脹，液體充滿于阻塞的結扎處之上。在處理組之間，腫脹程度和其余腎組織質(zhì)量范圍不同。第2組顯示約為陰性對照組的腫脹的一半。結扎的腎臟顏色灰白。對側腎臟鮮紅，增大約三分之一。
然后，取出動物的兩個腎臟(左側結扎，右側未結扎)，通過腎盂中心對半橫切。將每個腎臟的一半置于10％中性緩沖的福爾馬林中進行固定組織染色。每個腎臟的另一半置于15％蔗糖中，隨后置于30％蔗糖中，進行免疫組化染色。
針對肌成纖維細胞(平滑肌肌動蛋白)——纖維化的一種標記，免疫染色福爾馬林固定的腎臟切片。用標準化的光照條件和數(shù)碼相機曝光設置獲取圖像，根據(jù)背景校正，并根據(jù)距離標準校準。從每只動物獲取涵蓋整個左腎切片的相鄰視野的圖像進行定量。
平滑肌肌動蛋白表示為測量的視野內(nèi)總組織面積的百分數(shù)。包括除了腎乳突之外的切片的所有皮質(zhì)和髓質(zhì)組織。
總之，用6.3G9和6.8G6處理的小鼠顯示纖維化顯著減少。
實施例14抗αvβ6阻斷單克隆抗體對博來霉素誘發(fā)的小鼠肺纖維化的有效性博來霉素誘發(fā)的小鼠肺纖維化已經(jīng)建立為一種體內(nèi)肺纖維化模型，用來檢驗藥理制劑的治療效果。在博來霉素處理5-15天后炎癥通常明顯。在129系小鼠中，肺纖維化程度逐漸增大，可到博來霉素處理后的60天。基質(zhì)積累通常在第15天左右可檢測到。在該實施例中，從第0天或第15天開始，以4mg/kg/次的濃度對博來霉素誘發(fā)的肺纖維化小鼠腹膜內(nèi)注射單克隆抗體6.3G9，每周3次。在第0天誘發(fā)肺纖維化，方法是施用氣管內(nèi)單劑量的博來霉素，其溶于50μl無菌鹽水中，濃度為0.03單位/kg。在第30天殺死動物，評價肺纖維化程度。抗體1E6作為陰性對照。
收集每只動物的肺，如上文Munger等人所述，測定羥脯氨酸含量作為肺膠原蛋白沉積的指數(shù)。如圖15A所示，在第0天開始用6.3G9處理顯著抑制博來霉素誘發(fā)的肺羥脯氨酸含量的增加。重要的是，6.3G9處理至少如在博來霉素施用后15天開始時一樣有效，此時膠原蛋白沉積已經(jīng)開始。
我們也用延長的博來霉素誘發(fā)纖維化方案(持續(xù)60天)檢查了6.3G9、依賴陽離子的6.8G6和非阻斷抗體6.4B4抑制更高程度肺纖維化的作用。為此，我們在施用博來霉素后15天(第15天)開始抗體處理。然后在第60天取肺，檢測羥脯氨酸含量。如圖15C所示，用6.8G6處理顯著抑制博來霉素誘發(fā)的纖維化(與博來霉素和鹽水處理的動物相比，羥脯氨酸含量減少70％以上)。用6.3G9處理也顯示保護的趨勢，但是這些結果沒有統(tǒng)計學顯著性(圖15C)。
總之，在博來霉素處理的小鼠中，依賴陽離子的和不依賴陽離子的抗αvβ6阻斷單克隆抗體都減少肺纖維化。而且，甚至在直到纖維化開始發(fā)生后才開始抗體處理，這種干預仍然有效。
實施例15人銀屑病損傷中αvβ6的上調(diào)為了確定αvβ6是否與銀屑病有關，檢查了5名銀屑病患者和4名正常個體的損傷和非損傷皮膚活檢上的αvβ6表達。利用mAb 6.2A1免疫染色，我們發(fā)現(xiàn)，與銀屑病患者的非損傷皮膚和正常對照相比，銀屑病損傷中αvβ6表達顯著提高。因此，銀屑病損傷中αvβ6的上調(diào)提示使用抗αvβ6抗體的診斷和治療意義。
實施例16在患有膽道疾病的小鼠和人肝臟中αvβ6的上調(diào)如前所述，αvβ6的表達與組織損傷有關。在該研究中，研究了被膽道疾病損傷的小鼠和人肝臟中αvβ6的表達。
通過膽道結扎誘發(fā)小鼠的肝損傷。參見，例如，George等人，PNAS9612719-24(1999)；George等人，Am J Pathol 156115-24(2000)。使用mAb 6.2G2，我們發(fā)現(xiàn)αvβ6的表達在膽道結扎后的第9、14、16天顯著升高。
類似地，通過使用mAb 6.2G2的免疫組化檢測，患有膽道疾病的患者的人肝臟切片顯示αvβ6表達上調(diào)。例如，在來自1名44歲的急性膽汁淤積男性患者、1名59歲的移植后急性膽道阻塞男性患者、1名22歲的膽道閉鎖男性患者和1名24歲的慢性膽道阻塞男性患者的肝臟標本中觀察到αvβ6表達提高。
總之，這些新抗αvβ6抗體是對于肝疾病有用的診斷和治療工具。
實施例17多種人類癌癥中αvβ6的上調(diào)整聯(lián)蛋白αvβ6在健康成人組織中通常以可以忽略的水平到低水平表達。使用抗體6.2A1和此處概述的方法，評價了多種人腫瘤組織的αvβ6表達。結果顯示在幾種人上皮癌中αvβ6整聯(lián)蛋白的表達顯著上調(diào)。特別是，免疫組織學顯示，αvβ6在多種上皮癌的腫瘤島邊緣上特別顯著地表達。為了進一步研究上皮癌細胞中αvβ6的表達，Detroit 562細胞(咽癌)和SCC-14細胞(舌鱗狀細胞癌)以及SW480β6細胞(同上)用6.3G9和6.4B4染色，通過流式細胞術分析。
圖12的右側顯示不同腫瘤細胞系上的αvβ6表達，用熒光激活細胞分選(FACS)中6.3G9的結合表示。實心峰代表6.3G9的結合，而空心峰代表第二單克隆抗體單獨的背景結合。圖12左側的線圖顯示濃度逐漸升高的6.3G9或6.4B4對腫瘤細胞系與LAP配體結合的抑制。與6.3G9相比，6.4B4是αvβ6與LAP結合的一種效能顯著較低的抑制劑(對于Detroit 562，＞10倍IC50；對于SW480B6，＞30倍IC50；對于SCC-14，＞100倍IC50)。這與以前的體外結果一致，表明6.3G9是一種強阻斷單克隆抗體，6.4B4是一種弱阻斷單克隆抗體。該數(shù)據(jù)也與Detroit異種移植模型中6.4B4的可以忽略的抑制活性一致(圖14B)。圖13進一步顯示多種抗αvβ6單克隆抗體對腫瘤細胞系與LAP結合的相對抑制。6.3G9和6.8G6顯示相當?shù)囊种苹钚?與以前的所有數(shù)據(jù)一致)，而6.4B4是αvβ6與LAP結合的一種效能顯著較低的抑制劑。
實施例18抗αvβ6阻斷單克隆抗體在人腫瘤異種移植模型中的作用移植了人腫瘤異種移植物的免疫缺陷動物(例如裸鼠和SCID小鼠)已經(jīng)建立為一種有用的體內(nèi)模型，用來檢驗抗癌劑的治療效果(參見，例如，van Weerden等人，Prostate 43(4)263-71(2000)；Bankert等人，F(xiàn)ront Biosci 7c44-62(2002))。因此，能夠在異種移植模型中體內(nèi)檢驗本發(fā)明的阻斷抗αvβ6單克隆抗體抑制腫瘤生長的能力。在該實驗中，我們在移植了人咽癌(Detroit 562細胞系)異種移植物的無胸腺雌性裸鼠中檢驗了一些新αvβ6抗體抑制腫瘤生長的能力。
為此，Detroit 562細胞(ATCC)在基本必需培養(yǎng)基(Eagle)中體外傳代，該培養(yǎng)基中含有2mM L-谷氨酰胺和Earle′s BSS，調(diào)節(jié)為含有1.5g/L碳酸氯鈉、0.1mM非必需氨基酸和1.0mM丙酮酸鈉和10％胎牛血清，不含抗生素。約5×106細胞/0.2ml培養(yǎng)基(不含血清)皮下植入裸鼠的右脅。3-4天后開始測量腫瘤大小，持續(xù)到腫瘤達到約5mm(長度)×5mm(寬度)。將小鼠隨機化，在第1天腹膜內(nèi)注射檢測抗體或?qū)φ杖芤?，隨后每周注射3次，共33天。檢測抗體和對照溶液是(1)6.3G9，1mg/kg，10只小鼠；(2)6.3G9，4mg/kg，10只小鼠；(3)6.3G9，10mg/kg，10只小鼠；(4)6.4B4，1mg/kg，10只小鼠；(5)6.4B4，4mg/kg，10只小鼠；(6)6.4B4，10mg/kg，10只小鼠；和(7)載體對照(PBS)，0.2ml/每只小鼠，30只小鼠。另外，對10只小鼠皮下注射2mg/kg順鉑作為化療對照。順鉑注射在第1天進行，然后每2天注射一次，總共6次治療。在33天結束時，測量動物體重和腫瘤大小，通過免疫組織學評價αvβ6的表達，測定血清抗αvβ6水平。
免疫組織學染色顯示，植入的腫瘤細胞在體內(nèi)強烈表達αvβ6。腫瘤重量數(shù)據(jù)進一步證明，阻斷單克隆抗體6.3G9在檢測的所有三個濃度都有效抑制腫瘤生長(圖14A)。相反，弱阻斷的單克隆抗體6.4B4不抑制腫瘤生長(圖14B)。
總之，在處理的小鼠中，阻斷抗體抑制腫瘤生長40-50％。相反，弱阻斷的抗αvβ6抗體不抑制腫瘤生長。
實施例19αvβ6抗體的內(nèi)化被細胞內(nèi)化的抗體對于某些臨床適應證(如癌癥)有優(yōu)點，因為這些抗體能夠與毒素、放射性化合物或其它抗癌劑偶聯(lián)，從而選擇性靶向并抑制癌細胞的生長。在SW480β6(同上)和SCC-14細胞中研究了抗αvβ6抗體被內(nèi)化的能力。
將細胞1∶5分開，接種于4室載玻片上，在37℃和5％CO2下溫育過夜。次日，稀釋單克隆抗體6.8G6、6.1A8、6.3G9、7.1C5、6.4B4、10D5和8B3至終濃度為20μg/mL。將這些單克隆抗體或單獨的培養(yǎng)基加到適當?shù)目字?。?nèi)化的時間從0小時到48小時。包括的時點是0、5、10、30分鐘，和1、4、24、48小時。加入第二抗體(抗鼠-Alexa 594)作為陰性對照。通過除去抗體并用緩沖液洗滌細胞層在每個時點終止內(nèi)化。加入麥胚凝集素-Alexa-488，18℃20分鐘，用綠色熒光染色細胞的外緣。洗滌細胞后，加入Cytofix/Cytoperm溶液，18℃20分鐘，固定并透化細胞。再次洗滌細胞，加入第二抗體抗小鼠-Alexa 594(紅色熒光)，18℃20分鐘，標記結合的或內(nèi)化的鼠αvβ6抗體。然后洗滌細胞，加入2％低聚甲醛固定，用共聚焦顯微鏡檢查。然后用LeitzPlan-Apochromatic 63x(1.32數(shù)值孔徑，空氣曝浸(ail immersion))物鏡(Leica)以2倍數(shù)碼變焦拍攝圖像。每個畫面代表一個光學切面，它來自在所有條件下觀察內(nèi)化的細胞的中截面。在核中沒有觀察到染色。
對于依賴陽離子的單克隆抗體(含有RGD的模擬配體)，如6.8G6和6.1A8，觀察到內(nèi)化。對于不依賴陽離子的單克隆抗體，如6.3G9、7.1C5和6.4B4，未觀察到內(nèi)化。
權利要求
1.一種單克隆抗體，其(a)特異性結合αvβ6；和(b)抑制αvβ6與潛伏相關肽(LAP)的結合，其IC50值低于10D5的IC50值。
2.權利要求1的抗體，其中該抗體含有與雜交瘤6.1A8(ATCC保藏號PTA-3647)產(chǎn)生的抗體相同的重鏈和輕鏈多肽序列。
3.權利要求1的抗體，其中該抗體含有與雜交瘤6.3G9(ATCC保藏號PTA-3649)產(chǎn)生的抗體相同的重鏈和輕鏈多肽序列。
4.權利要求1的抗體，其中該抗體含有與雜交瘤6.8G6(ATCC保藏號PTA-3645)產(chǎn)生的抗體相同的重鏈和輕鏈多肽序列。
5.權利要求1的抗體，其中該抗體含有與雜交瘤6.2B1(ATCC保藏號PTA-3646)產(chǎn)生的抗體相同的重鏈和輕鏈多肽序列。
6.權利要求1的抗體，其中該抗體含有與雜交瘤7.1G10(ATCC保藏號PTA-3898)產(chǎn)生的抗體相同的重鏈和輕鏈多肽序列。
7.權利要求1的抗體，其中該抗體含有與雜交瘤7.7G5(ATCC保藏號PTA-3899)產(chǎn)生的抗體相同的重鏈和輕鏈多肽序列。
8.權利要求1的抗體，其中該抗體含有與雜交瘤7.1C5(ATCC保藏號PTA-3900)產(chǎn)生的抗體相同的重鏈和輕鏈多肽序列。
9.權利要求1的抗體，其中抗體與αvβ6的結合依賴于二價陽離子。
10.權利要求9的抗體，其中二價陽離子是Ca2+、Mg2+或Mn2+。
11.權利要求1的抗體，其中抗體與αvβ6的結合不依賴于二價陽離子。
12.一種抗αvβ6抗體，其重鏈互補決定區(qū)(CDR)1、2和3分別基本由SEQ ID NOs1、4和7的序列組成，其輕鏈CDR任選地分別基本由SEQ ID NOs10、13和15的序列組成。
13.一種抗αvβ6抗體，其重鏈互補決定區(qū)(CDR)1、2和3分別基本由SEQ ID NOs3、5和8的序列組成，其輕鏈CDR任選地分別基本由SEQ ID NOs11、14和17的序列組成。
14.一種抗αvβ6抗體，其重鏈互補決定區(qū)(CDR)1、2和3分別基本由SEQ ID NOs3、6和9的序列組成，其輕鏈CDR任選地分別基本由SEQ ID NOs12、14和18的序列組成。
15.一種抗αvβ6抗體，其重鏈互補決定區(qū)(CDR)1、2和3分別基本由SEQ ID NOs2、46和47的序列組成，其輕鏈CDR任選地分別基本由SEQ ID NOs48、13和16的序列組成。
16.一種抗αvβ6抗體，其重鏈互補決定區(qū)(CDR)1、2和3分別基本由SEQ ID NOs49、51和53的序列組成，其輕鏈CDR任選地分別基本由SEQ ID NOs55、57和59的序列組成。
17.一種抗αvβ6抗體，其重鏈互補決定區(qū)(CDR)1、2和3分別基本由SEQ ID NOs50、52和54的序列組成，其輕鏈CDR任選地分別基本由SEQ ID NOs56、58和60的序列組成。
18.一種抗αvβ6抗體，其含有SEQ ID NOs19-36和61-62中任何一個的重鏈可變域序列。
19.一種抗αvβ6抗體，其含有SEQ ID NO19的重鏈可變域序列和SEQ ID NO37的輕鏈可變域序列。
20.一種抗αvβ6抗體，其含有SEQ ID NO20或21的重鏈可變域序列和SEQ ID NO38的輕鏈可變域序列。
21.一種抗αvβ6抗體，其含有SEQ ID NO22的重鏈可變域序列和SEQ ID NO43的輕鏈可變域序列。
22.一種抗αvβ6抗體，其含有SEQ ID NO23的重鏈可變域序列和SEQ ID NO44的輕鏈可變域序列。
23.一種抗αvβ6抗體，其含有SEQ ID NO24的重鏈可變域序列和SEQ ID NO45的輕鏈可變域序列。
24.一種抗αvβ6抗體，其含有SEQ ID NO25或26的重鏈可變域序列和SEQ ID NO42的輕鏈可變域序列。
25.一種抗αvβ6抗體，其含有SEQ ID NO27、28或29的重鏈可變域序列和SEQ ID NO39的輕鏈可變域序列。
26.一種抗αvβ6抗體，其含有SEQ ID NO34或35的重鏈可變域序列和SEQ ID NO40的輕鏈可變域序列。
27.一種抗αvβ6抗體，其含有SEQ ID NO36的重鏈可變域序列和SEQ ID NO41的輕鏈可變域序列。
28.一種抗αvβ6抗體，其含有SEQ ID NO61的重鏈可變域序列和SEQ ID NO63的輕鏈可變域序列。
29.一種抗αvβ6抗體，其含有SEQ ID NO62的重鏈可變域序列和SEQ ID NO64的輕鏈可變域序列。
30.一種單克隆抗體，其能特異性結合αvβ6，但是不抑制αvβ6與潛伏相關肽(LAP)的結合。
31.權利要求30的抗體，其中該抗體含有與雜交瘤6.2A1(ATCC保藏號PTA-3896)產(chǎn)生的抗體相同的重鏈和輕鏈多肽序列。
32.權利要求30的抗體，其中該抗體含有與雜交瘤6.2E5(ATCC保藏號PTA-3897)產(chǎn)生的抗體相同的重鏈和輕鏈多肽序列。
33.一種組合物，用于預防或治療哺乳動物中由αvβ6介導的疾病，其含有權利要求1-32中任何一項的抗體，和藥學可接受的載體。
34.權利要求33的組合物，其中所述抗體與細胞毒性劑偶聯(lián)。
35.權利要求33的組合物，其中所述抗體是依賴陽離子的抗體。
36.一種方法，用于治療患有αvβ6介導的疾病或者具有患αvβ6介導的疾病危險的研究對象，包括對研究對象施用權利要求32的組合物，從而緩解該疾病或延遲其發(fā)作。
37.權利要求36的方法，其中研究對象是人。
38.權利要求36的方法，其中所述疾病是纖維化。
39.權利要求38的方法，其中所述纖維化是硬皮病、結瘢、肝纖維化、腎纖維化或肺纖維化。
40.權利要求36的方法，其中所述疾病是銀屑病。
41.權利要求36的方法，其中所述疾病是癌癥。
42.權利要求41的方法，其中所述疾病是上皮癌。
43.權利要求41的方法，其中所述癌癥是口腔、皮膚、子宮頸、卵巢、咽、喉、食道、肺、乳房、腎或結腸直腸癌。
44.權利要求36的方法，其中所述疾病是奧爾波特綜合征。
45.一種檢測哺乳動物組織標本中的αvβ6的方法，包括使組織標本接觸權利要求1或30的抗體。
46.權利要求45的方法，其中所述抗體選自6.2A1(ATCC保藏號PTA 3896)和6.2E5(ATCC保藏號PTA 3897)。
47.雜交瘤細胞6.1A8(ATCC保藏號PTA-3647)。
48.雜交瘤細胞6.2B10(ATCC保藏號PTA-3648)。
49.雜交瘤細胞6.3G9(ATCC保藏號PTA-3649)。
50.雜交瘤細胞6.8G6(ATCC保藏號PTA-3645)。
51.雜交瘤細胞6.2B1(ATCC保藏號PTA-3646)。
52.雜交瘤細胞6.2A1(ATCC保藏號PTA-3896)。
53.雜交瘤細胞6.2E5(ATCC保藏號PTA-3897)。
54.雜交瘤細胞7.1G10(ATCC保藏號PTA-3898)。
55.雜交瘤細胞7.7G5(ATCC保藏號PTA-3899)。
56.雜交瘤細胞7.1C5(ATCC保藏號PTA-3900)。
57.一種分離的核酸，其含有編碼SEQ ID NOs19-45和61-64中任何一個的序列。
58.一種分離的多肽，其含有SEQ ID NOs19-45和61-64中任何一個的氨基酸序列。
59.一種單克隆抗體，其含有與雜交瘤6.2B10(ATCC保藏號PTA-3648)產(chǎn)生的抗體相同的重鏈和輕鏈多肽序列。
全文摘要
能特異性結合M.96的單克隆抗體。也包括利用這些抗體治療患有或具有患α
文檔編號G01N33/574GK1646160SQ03808906
公開日2005年7月27日 申請日期2003年3月13日 優(yōu)先權日2002年3月13日
發(fā)明者S·M·維歐雷特, P·H·維尼爾博, K·J·西蒙, D·舍帕德, D·R·利昂 申請人:拜奧根Idec馬薩諸塞公司, 加利福尼亞大學董事會