專利名稱：過氧化物酶的熒光檢測的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及熒光化合物及采用該熒光化合物檢測過氧化物酶的方法。本發(fā)明還涉及使用這些方法來檢測與過氧化物酶或者與特定結(jié)合對(duì)的一員連接的分析物，該結(jié)合對(duì)對(duì)于過氧化物酶標(biāo)記的特定的結(jié)合伙伴具有特定的親合力。
背景技術(shù)：
諸如辣根過氧化物酶(HRP)之類的過氧化物酶在生物分子和其他感興趣的分析物，例如藥品、激素、類固醇、癌癥標(biāo)志物，的酶連接試驗(yàn)中經(jīng)常被用作標(biāo)志物或標(biāo)記物。通過使用會(huì)產(chǎn)生可檢測物的底物可實(shí)現(xiàn)這些酶的檢測。例如鄰苯二胺、ABTS或者N-四甲聯(lián)苯胺(TMB)等的顯色底物產(chǎn)生有色的反應(yīng)產(chǎn)物，熒光底物產(chǎn)生發(fā)熒光的產(chǎn)物，而化學(xué)發(fā)光的底物產(chǎn)生作為可檢測物的光。這些方法中的每一種均能提供安全、便利和靈敏的手段來對(duì)樣品中的酶的數(shù)量或者酶標(biāo)記分析物或用于分析物的被標(biāo)記的特定結(jié)合伙伴的數(shù)量提供定量測量。
a.化學(xué)發(fā)光的過氧化物酶底物申請(qǐng)人在專利號(hào)為5491072、5523212和5593845的美國專利公開了化學(xué)發(fā)光的N-烷基二氫化吖啶羧酸酯、硫酯和磺酰亞胺，當(dāng)它們與過氧化物和過氧化物酶反應(yīng)時(shí)產(chǎn)生了用于過氧化物酶的檢測和試驗(yàn)中的光。專利號(hào)為5545834的美國專利描述了螺環(huán)二氫化吖啶化合物(spiroacridan compounds)和過氧化氫的化學(xué)發(fā)光的反應(yīng)。該反應(yīng)通過添加辣根過氧物酶(HRP)而得以加強(qiáng)。
總稱為熒光素的生物起源的各種化合物均被過氧化物酶氧化(概括于L.J Kricka和G.H.G.Thorpe，在Luminescence Immunoassay andMolecular Applications，K.Van Dyke and R.van Dyke，eds.，CRC Press，Boca Raton，1990，pp.77-98)。在某些實(shí)例中，當(dāng)所述酶用作氧化酶時(shí)，不使用過氧化氫。
b.熒光過氧化物酶底物U.S.6,040,150公開了一種從熒光底物和過氧化物酶的反應(yīng)中生成熒光報(bào)告化合物的改進(jìn)方法。該方法包括將一種包括3-(4-羥苯基)-丙酸的酚類化合物用作底物。其他的酚類熒光底物在Zaitsu and Ohkura，Anal.Biochem.，109，109-113(1980)中有所公開，并包括2-(4-羥苯基)乙酸、高香草酸和酪胺(Y.Li，et al.，Anal.Chim.Acta，(340)，159-168，(1997))。其他公知的熒光過氧化物酶底物包括鄰苯二胺和N，N′-二氰基甲基-鄰苯二胺(Li，et al.，Microchem.J.，53(4)，428-436(1996))、對(duì)-氨基苯酚的酰胺和氨基甲酸酯衍生物(M.Kawaguchi，et al.，Bioluminescence and Chemeluminescence Perspectives for the 21stCentury，A.Roda et al.，Eds.，Wiley&Sons，Chichester，pp 508-511，(1999))、3，4-二氫-2(1H)-喹喔啉和相關(guān)衍生物(Li，et al.，Anal.Chim.Acta，340(1-3)，159-168(1997))，熒光素、若丹明和其他黃嘌呤染料的還原形式以及后者的氟化衍生物(專利號(hào)為6,162,931的美國專利和公開號(hào)為WO99/01768的PCT專利申請(qǐng))。
c.吖啶鎓(acridinium)標(biāo)記物的熒光檢測在化學(xué)發(fā)光技術(shù)中，吖啶鎓酯和酰胺是公知的。這些化合物通常被用來標(biāo)記要在試驗(yàn)中檢測的底物。依據(jù)化學(xué)發(fā)光的檢測包括標(biāo)記物和強(qiáng)堿性的過氧化氫溶液的反應(yīng)。吖啶鎓標(biāo)記化合物的熒光試驗(yàn)也已經(jīng)被描述，其中通過它們固有的熒光來測量這些相同的化學(xué)發(fā)光化合物(D.O.Shan and V.A.Salbilla，Proceedings of the 11th InternationalSymposium on Bioluminescence and Chemiluminescence，J.F.Case et al.，Eds.，Wiley&Sons，Chichester，pp 235-238，(2001))。


圖1示出了從包含化合物10和HRP的反應(yīng)溶液中獲得的一系列有序的熒光光譜。該光譜對(duì)應(yīng)于吖啶鎓產(chǎn)物的熒光。為了便于比較，示出了甲基N-甲基吖啶鎓的獨(dú)立制備樣品的熒光光譜。
圖2示出了從圖1所述的反應(yīng)中生成熒光產(chǎn)物的時(shí)間過程。通過在357nm處激發(fā)并在495nm處檢測熒光發(fā)射來監(jiān)視該產(chǎn)物。
圖3示出了根據(jù)本發(fā)明的方法執(zhí)行而使用熒光底物檢測HRP的線性度。將存在于醋酸鹽緩沖液中，包含0.05mM底物1或4、0.1mM 4-苯基苯酚、0.5mM過氧化脲、1mM EDTA、0.025％TWEEN 20的溶液(pH 5)，和存在于10mM tris中的0.05mM底物2、0.1mM 4-苯基苯酚、0.5mM過氧化脲、1mM EDTA、0.025％TWEEN 20的溶液(pH8)與指示量的HRP一起進(jìn)行反應(yīng)。在15-20分鐘的反應(yīng)周期后，所測量的熒光強(qiáng)度處于最大值。術(shù)語強(qiáng)度背景(Intensity-Background)是指對(duì)缺少HRP時(shí)的背景熒光(B)進(jìn)行存在HPR時(shí)的修正后，以相對(duì)光單位表示的熒光強(qiáng)度。在這種方式下可檢測到小于1amol(渺摩爾)的HRP。
圖4示出了從包含化合物12和HRP的反應(yīng)溶液中獲得的一系列有序的熒光光譜。該光譜揭示了吖啶鎓酯中間體和N-甲基吖啶酮產(chǎn)物的形成。
圖5示出了通過熒光和化學(xué)發(fā)光檢測，采用包含底物13的試劑組合物進(jìn)行HRP檢測的線性度。10mM tris中包含0.05mM化合物13、0.1mM 4-苯基苯酚、0.5mM過氧化脲、1mM EDTA、0.025％TWEEN20的溶液(PH 8.0)，與指示量的HRP進(jìn)行反應(yīng)。在加入酶后10分鐘檢測化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，加入酶后30分鐘檢測515nm的熒光。
發(fā)明目的因此，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種用于制造熒光化合物的方法，該方法包括使一種過氧化物酶的熒光底物與一種過氧化物酶進(jìn)行反應(yīng)。另一個(gè)目的是提供一種檢測過氧化物酶的方法，該方法包括通過使一種熒光底物與過氧化物酶反應(yīng)以制成一種熒光反應(yīng)產(chǎn)物，然后檢測所述熒光反應(yīng)產(chǎn)物。另一個(gè)目的是提供一種在試驗(yàn)過程中檢測分析物的方法，其中使用一種過氧化物酶對(duì)被標(biāo)記的分析物或者被標(biāo)記的分析物結(jié)合的化合物進(jìn)行標(biāo)記，然后所述過氧化物酶與一種熒光過氧化物酶底物反應(yīng)以制成一種熒光反應(yīng)產(chǎn)物。
優(yōu)選實(shí)施方案的描述本發(fā)明涉及熒光化合物，當(dāng)該熒光化合物與過氧化物酶和過氧化物反應(yīng)時(shí)產(chǎn)生熒光。在實(shí)施本發(fā)明的方法中有用的化合物將落入依賴于使用模式的兩個(gè)范疇之一。
本發(fā)明的一組化合物具有通式I 其中將R1選自對(duì)于過氧化物的攻擊呈惰性的基團(tuán)，并包含選自C、H、N、O、S、P、Si和鹵素中的1到20個(gè)原子；R2選自于烷基、取代烷基、芳基取代芳基、芳烷基和取代芳烷基基團(tuán)；R3到R10每一個(gè)都是包含選自C、H、N、O、S、P、Si和鹵素中的1到20個(gè)原子的基團(tuán)。在本文所指的意義上，對(duì)過氧化物的攻擊不具惰性的基團(tuán)R1包括芳基酯(-COOAr)、烷基酯(-COOR)(其中該烷基基團(tuán)R被吸電子基團(tuán)例如鹵素、氰基和硝基取代，因?yàn)檫@些取代基增加了-OR基團(tuán)的離去基團(tuán)能力)，烷基硫酯和芳基硫酯(-COSR，COSAr)、磺酰亞胺(-CO(NR)SO2R′)、-C(＝O)X(其中X是一種鹵素)以及氰基基團(tuán)?；鶊F(tuán)R1優(yōu)先選自烷基、取代烷基、烯基、取代烯基、炔基、取代炔基、烷氧基、烷硫基、芳基、取代芳基、芳烷基、取代芳烷基、羧酸、羧酸鹽、羧酰胺、烷基羧基酯、羧基酰肼基團(tuán)、酮基、-CHO、氨基、烷基氨基、芳基氨基，以及氫原子。優(yōu)選地，基團(tuán)R3到R10獨(dú)立地選自氫、烷基、烷氧基、烷硫基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、芳基、烯基、炔基、鹵素、羥基、巰基、磺酸酯、硫酸酯，以及磷酸酯。
當(dāng)一個(gè)基團(tuán)被稱為取代的時(shí)，是指所述基團(tuán)的碳骨架上的一個(gè)或多個(gè)氫原子被不同的原子或基團(tuán)代替。包含在這種用法中的公知基團(tuán)包括鹵素、羥基、烷氧基、芳氧基、三烷基硅氧基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、烷硫基、芳硫基、巰基、硝基、磺酸酯、硫酸酯、磷酸酯、膦酸酯、氰基、羧酸酯、羧基酯、羧酰胺、羧基醛。
在一種實(shí)施方式中，通式I的熒光化合物中，R3到R10的每個(gè)取代基都將含有氫原子。這組化合物具有如下所示的通式，其中的R1和R2的定義同上。
在另一種實(shí)施方式中，通式I的熒光化合物含有至少一個(gè)對(duì)水溶性有貢獻(xiàn)的基團(tuán)。優(yōu)選基團(tuán)包括羧酸酯、磺酸酯、硫酸酯、磷酸酯、銨基和膦基團(tuán)。水溶性基團(tuán)在R1、R2或R3-R10的位置被取代。
在另一種實(shí)施方式中，通式I的熒光化合物可包括附加的環(huán)基，該環(huán)基是通過采用連接鏈在該二氫化吖啶環(huán)的兩個(gè)相鄰的位置而結(jié)合。該附加環(huán)基將包括4-7員環(huán)，優(yōu)選地，為5-6員的環(huán)。該環(huán)可包括飽和原子或其它不飽和基團(tuán)如雙鍵或苯環(huán)型的環(huán)。為了便于說明，下面將對(duì)所示的示例性結(jié)構(gòu)進(jìn)行描述。該附加環(huán)可進(jìn)一步包括上面所定義的取代基。
在另一種實(shí)施方式中，通式I的熒光化合物選自于下列化合物1-11

在另一種實(shí)施方式中，熒光底物具有通式II 其中R1是其中含有離去基團(tuán)的基團(tuán)，該離去基團(tuán)可被充當(dāng)親核試劑的過氧化物取代，并且該離去基團(tuán)選自芳基酯(-COOAr)、取代烷基酯(-COOR)(其中該烷基基團(tuán)R可被吸電子基團(tuán)例如鹵素、氰基和硝基取代，這些取代基增加了-OR基團(tuán)的離去基團(tuán)能力)，硫酯(-COSR，COSAr)、磺酰亞胺(-CO(NR)SO2R′)、-C(＝O)X(其中X是一種鹵素)以及氰基基團(tuán)；R2選自烷基、取代烷基、芳基取代芳基、芳烷基、取代芳烷基基團(tuán)；R3到R10每一個(gè)都是包含選自C、H、N、O、S、P、Si和鹵素中的1到20個(gè)原子的基團(tuán)，其中R3或R10中至少有一個(gè)非H基團(tuán)，在與過氧物酶活性相容的條件下，該非H基團(tuán)在空間上阻礙化學(xué)發(fā)光反應(yīng)生成吖啶酮產(chǎn)物。優(yōu)選地，基團(tuán)R3到R10獨(dú)立地選自氫、烷基、烷氧基、烷硫基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、芳基、烯基、炔基、鹵素、羥基、巰基、磺酸酯、硫酸酯，以及磷酸酯。優(yōu)選地，R3或R10中至少有一個(gè)是鹵素、烷基或者烷氧基基團(tuán)。在通式II中，相鄰的取代基對(duì)能夠接合在一起成為環(huán)，結(jié)合方式與通式I中所定義的相同。在與過氧物酶的酶促反應(yīng)條件下，通式II的化合物形成一種穩(wěn)定的吖啶鎓產(chǎn)物，但在與過氧物酶活性相容的條件下，通式II的化合物在空間上受到阻礙，不進(jìn)行隨后的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。屬于這組的代表性化合物在專利號(hào)為5,670,644和5,723,295的美國專利中有詳細(xì)描述，將這些專利全部并于此以作參考，代表性化合物包括芳基和烷基酯、硫酯以及磺酰胺。
另一組熒光化合物的通式III如下所示
其中R1是其中含有離去基團(tuán)的基團(tuán)，該離去基團(tuán)可被充當(dāng)親核試劑的過氧化物取代，并且該離去基團(tuán)選自芳基酯(-COOAr)、取代烷基酯(-COOR)(其中該烷基基團(tuán)R被吸電子基團(tuán)例如鹵素、氰基和硝基取代，這些取代基增加了-OR基團(tuán)的離去基團(tuán)能力)，硫酯(-COSR，COSAr)、磺酰亞胺(-CO(NR)SO2R′)、-C(＝O)X(其中X是一種鹵素)以及氰基基團(tuán)；R2選自烷基、取代烷基、芳基取代芳基、芳基和取代芳烷基基團(tuán)；R3到R10每一個(gè)都是包含選自C、H、N、O、S、P、Si和鹵素中的1到20個(gè)原子的基團(tuán)，但條件是通式I的化合物不包括表示為化合物12的化合物N-甲基二氫化吖啶-9-羧酸2，3，6-三氟苯基酯。優(yōu)選地，基團(tuán)R3到R10獨(dú)立地選自氫、烷基、烷氧基、烷硫基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、芳基、烯基、炔基、鹵素、羥基、巰基、磺酸酯、硫酸酯，以及磷酸酯。在通式III中的相鄰取代基對(duì)能夠接合在一起成為環(huán)，結(jié)合方式與通式I和II中所定義的相同。
在另一種實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及一種用于產(chǎn)生熒光的方法，該方法包括讓通式I、II或III的化合物與一種過氧物酶以及任選的一種過氧化物反應(yīng)，以生成一種熒光產(chǎn)物。以適當(dāng)波長的光對(duì)這樣形成的熒光產(chǎn)物進(jìn)行照射，致使該熒光產(chǎn)物發(fā)出熒光。適于激發(fā)熒光的光波長可以利用本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定，例如通過記錄吸收光譜或熒光激發(fā)光譜。選擇一個(gè)使激發(fā)最大化的波長或波長范圍可能是有利的，但這樣做并不是必須的。激發(fā)波長也可基于光源的特性進(jìn)行選擇，特別是使用了單色激光光源的時(shí)候。
本方法包括兩種不同的反應(yīng)方式。在一種方式中，通式I或II的熒光底物轉(zhuǎn)化為發(fā)熒光的環(huán)氧化吖啶鎓反應(yīng)產(chǎn)物。由于即使存在過量的過氧化物的情況下也不在發(fā)生反應(yīng)，因此在酶促反應(yīng)條件下該產(chǎn)物積累起來。
反應(yīng)路線1 生熒光的底物 發(fā)熒光的產(chǎn)物當(dāng)熒光底物為通式I或II的化合物時(shí)，進(jìn)行這一反應(yīng)方式，通式I或II的化合物不允許當(dāng)9位上受到過氧化物的攻擊時(shí)，而發(fā)生反應(yīng)路線2中所示的快速和不可逆的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。
反應(yīng)路線2 促進(jìn)熒光吖啶鎓反應(yīng)產(chǎn)物隨后發(fā)生不可逆的消耗而產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的9位上的取代基和吖啶酮產(chǎn)物包括通式III的化合物。示例性化合物在申請(qǐng)人提出的專利號(hào)為5,491,072、5,523,212和5,593,845的美國專利以及專利號(hào)為6,030,803的美國專利中列出，包括芳基酯(-COOAr)、烷基酯(-COOR)(其中烷基基團(tuán)R被諸如鹵素、氰基和硝基之類的基團(tuán)取代，這些基團(tuán)提高了-OR基的離去基團(tuán)能力)、硫酯(-COSR，COSAr)、磺基酰亞胺(-CO(NR)SO2R′)和氰基。
當(dāng)熒光底物是通式III的化合物并且其允許在9-位上受到過氧化物的攻擊之后發(fā)生快速的、不可逆的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)時(shí)，進(jìn)行第二種方式的反應(yīng)。這類底物的反應(yīng)形成了反應(yīng)路線1中所示的環(huán)氧化的吖啶鎓化合物。含有良好的離去基團(tuán)且缺乏空間位阻基團(tuán)的9-位取代基的存在有利于按照反應(yīng)路線2發(fā)生吖啶鎓化合物進(jìn)一步的化學(xué)發(fā)光發(fā)應(yīng)。在這種方式中，由于熒光吖啶鎓化合物并不永久地聚集，因而更適于觀察。這種反應(yīng)順序的最終反應(yīng)產(chǎn)物是吖啶酮，其自身就具有熒光性，在430-450nm下發(fā)射最大。在這種方式中反應(yīng)的化學(xué)發(fā)光化合物可用作商用化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)(ECL Plus Chemifluorescent System，Amersham Pharmacia Biotech)的基礎(chǔ)。在該產(chǎn)品中所用的過氧化物酶底物是化學(xué)發(fā)光的二氫化吖啶N-甲基-二氫化吖啶-9-羧酸2，3，6-三氟苯基酯。
似乎還未承認(rèn)在反應(yīng)過程中伴隨著吖啶酮產(chǎn)物一起形成了濃度可測定的熒光吖啶鎓酯中間體，并且兩種物質(zhì)的熒光光譜相互不同并相互覆蓋。申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)了這一行為事實(shí)上是在按照如上所述的第二種方式的反應(yīng)進(jìn)行的許多化學(xué)發(fā)光的底物中觀察到的。通過檢測吖啶鎓化合物或吖啶酮產(chǎn)物的熒光，可測定作為熒光底物的那些底物，所述底物的9-位上具有取代基，使底物能隨后進(jìn)行中間體吖啶鎓化合物的化學(xué)發(fā)光轉(zhuǎn)換。申請(qǐng)人進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)所形成的兩種種類的相對(duì)量在反應(yīng)過程中發(fā)生了改變，并根據(jù)所采用的酶的用量而變化。
這一熒光行為有兩個(gè)方面從根本上不同于由第一種反應(yīng)方式所產(chǎn)生的熒光。與吖啶酮最終產(chǎn)物相比，吖啶鎓化合物在較短的波長處被激發(fā)，而與吖啶酮產(chǎn)物相比，吖啶鎓化合物在通常為約500-520nm的較長波長處被發(fā)射。換種說法，吖啶鎓中間產(chǎn)物的Stokes轉(zhuǎn)換(斯托克斯轉(zhuǎn)換)約為150nm，而吖啶酮的Stockes轉(zhuǎn)換則約為50nm。更重要的是，在能產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的二氫化吖啶熒光底物的基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)期間，檢測瞬間形成的吖啶鎓化合物的熒光表現(xiàn)出完全不同的時(shí)間進(jìn)程。在檢測反應(yīng)的終產(chǎn)物的過程中，信號(hào)逐漸上升到最高水平并保持不變。對(duì)中間產(chǎn)物的檢測提供了從開始時(shí)上升一段時(shí)間然后再衰減的可檢測信號(hào)。
進(jìn)行第一種反應(yīng)的底物跨越了很寬的pH范圍和過氧化物濃度。pH只受到酶的生效范圍的限制。已知過氧化物酶在約為4-10的pH范圍內(nèi)作用。進(jìn)行第二種反應(yīng)的底物的作用方式受到pH和過氧化物濃度的影響。過氧化物的高濃度和7以上的pH值促進(jìn)了消耗中間產(chǎn)物吖啶鎓化合物。
盡管過氧化物是過氧化物酶的主要底物，但過氧化物組分是本發(fā)明任選的組分。在本領(lǐng)域公知的或是背景技術(shù)部分所列舉的過氧化物酶催化熒光反應(yīng)中，過氧化物通常是必要反應(yīng)組分。然而申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)了在酶濃度相對(duì)較高的條件下，將生熒光底物轉(zhuǎn)化為發(fā)熒光的產(chǎn)物這一反應(yīng)中不需要過氧化物。
本發(fā)明進(jìn)一步的實(shí)施方式涉及由過氧化物酶對(duì)熒光底物的作用而產(chǎn)生發(fā)熒光的產(chǎn)物這一方法在檢測過氧化物酶或過氧化物酶和生物分子的偶聯(lián)物的方法中的應(yīng)用。過氧化物酶或者過氧化物酶偶聯(lián)物與熒光底物相反應(yīng)，產(chǎn)生發(fā)熒光的產(chǎn)物，然后用光照射該發(fā)熒光的產(chǎn)物，從而引起熒光的發(fā)射。檢測熒光，熒光的量或強(qiáng)度與過氧化物酶的量有關(guān)。
在又一種實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及用分析物試驗(yàn)中所述的熒光檢測過氧化物酶偶聯(lián)物的方法在其中過氧化物酶與分析物相連接或與特異性結(jié)合到分析物的結(jié)合伙伴相連接的過程中的應(yīng)用。過氧化物酶與分析物或與結(jié)合分析物的伙伴的連接方式包括直接的共價(jià)連接，以及包括半抗原/抗-半抗原結(jié)合對(duì)等的不直接連接方式。例如，偶聯(lián)到抗生物素蛋白鏈菌素或抗生物素抗體的過氧化物酶的偶聯(lián)物可與生物素標(biāo)記的分析物進(jìn)行特異性結(jié)合或俘獲生物素標(biāo)記的分析物。在這些試驗(yàn)方法中，所形成的熒光產(chǎn)物的量與如上所述的過氧化物酶的量有關(guān)，且過氧化物酶的量與分析物的量有關(guān)。例如，該方法分別用于檢測通過免疫分析技術(shù)產(chǎn)生的半抗原、抗原和抗體，由Western印跡產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，由Southern和Northern印跡產(chǎn)生的DNA和RNA。該方法也用于檢測DNA測序應(yīng)用中的DNA。
在又一種實(shí)施方式中，本發(fā)明還涉及將這些方法用于檢測過氧化物。在可通過實(shí)驗(yàn)檢測的某些有限范圍上的過氧化物酶濃度，固定量的過氧化物酶和固定濃度的熒光底物的反應(yīng)的速率與可用于反應(yīng)的過氧化物的量成比例。在特定的時(shí)間間隔期間，改過氧化物的量將引起熒光產(chǎn)物的量發(fā)生變化?？删_測量的過氧化物的濃度范圍由分析過氧化物標(biāo)準(zhǔn)物的系列稀釋液而容易地測定。
在又一種實(shí)施方式中，本發(fā)明還涉及將這些方法應(yīng)用于檢測如過氧化物酶或脫氫酶等產(chǎn)生過氧化物的酶。已知過氧化物酶這一類別中的各種酶產(chǎn)生了會(huì)氧化其底物的反應(yīng)副產(chǎn)物過氧化氫。已知的過氧化物酶包括半乳糖氧化酶、葡萄糖氧化酶、膽固醇氧化酶、胺氧化酶、各種氨基酸氧化酶、聚苯酚氧化酶、黃嘌呤氧化酶、尿酸酶、醇脫氫酶、乳酸酯脫氫酶、蘋果酸酯脫氫酶、甘油醛-3-磷酸酯脫氫酶、甘油脫氫酶以及葡萄糖-6-磷酸酯脫氫酶。在實(shí)踐中，過氧化物酶與過氧化物酶的底物反應(yīng)生成過氧化氫。在合適的反應(yīng)時(shí)間后，積累的過氧化氫和過氧化物酶以及通式I的熒光底物反應(yīng)生成可由上述的自身熒光檢測到的熒光產(chǎn)物。氧化物酶和過氧化物酶的反應(yīng)可同時(shí)進(jìn)行或連續(xù)進(jìn)行。
在本發(fā)明的另一種實(shí)施方式方便地提供了存在于與過氧化物酶反應(yīng)的反應(yīng)物組合物中的熒光化合物。該反應(yīng)物組合物包括含有式I、II或III的化合物和過氧化物化合物的水溶液。該制劑還可進(jìn)一步包括增強(qiáng)劑物質(zhì)，可為酚類化合物以增強(qiáng)過氧化物酶的活性。其它任選的成分包括表面活性劑、防止過氧化物化合物在與過氧化物酶反應(yīng)之前就活化的螯合劑，以及幫助加溶底物的有機(jī)溶劑。
用于本發(fā)明實(shí)踐中的反應(yīng)物和材料可封裝為試劑盒，該試劑盒通過檢測生成熒光產(chǎn)物的反應(yīng)而用于檢測試驗(yàn)過程中的任何分析物、水解酶或水解物偶聯(lián)物。用于以任何方式實(shí)踐本發(fā)明的試劑盒將包括一個(gè)或多個(gè)容器a)上述存在于緩沖溶液中的熒光化合物；b)如果被檢測的分析物不是過氧化物酶或產(chǎn)生過氧化物酶的反應(yīng)物，則含有過氧化物；c)如果被檢測的分析物不是過氧化物酶，或過氧化物酶與分析物的偶聯(lián)物，或過氧化物酶與反應(yīng)物的偶聯(lián)物(該反應(yīng)物與分析物形成特異性結(jié)合對(duì))，則含有過氧化物酶；d)任選地，增強(qiáng)劑化合物；e)任選地，表面活性劑；f)以及任選地，螯合劑。
試劑盒可單獨(dú)包裝，也可以各種組合包裝，該組合包裝在考慮到進(jìn)行本發(fā)明下述反應(yīng)的各種方式后將是顯而易見的。
過氧化物成分是能與過氧化物酶進(jìn)行反應(yīng)的任何過氧化物或烷基氫過氧化物。優(yōu)選的過氧化物包括過氧化氫、過氧化脲、以及過硼酸鹽。
能進(jìn)行熒光反應(yīng)的過氧化物酶包括乳過氧化物酶、微過氧化物酶、髓過氧物酶、鹵代過氧化物酶(haloperoxidase)如釩溴代過氧化物酶、辣根過氧化物酶、真菌過氧化物酶如木質(zhì)素過氧化物酶和來自Arthromyces ramosus的過氧化物酶和白腐菌(white rot fungi)中產(chǎn)生的Mn依賴型物過氧化物酶，以及大豆過氧化物酶。不是酶，但具有類似于過氧化物酶活性的其它過氧化物酶模擬化合物，包括鐵絡(luò)合物如血紅素、氯化血紅素和其它相關(guān)的鐵-卟啉絡(luò)合物以及Mn-TPPS4(Y.-X.Ci，等.，Mikrochem.J.，52，257-62(1995))是已知的，并明確地認(rèn)為落在本文中所采用的過氧化物的含義范圍內(nèi)。過氧化物酶和生物分子的偶聯(lián)物或絡(luò)合物也可用于產(chǎn)生熒光的方法中，唯一的條件是該偶聯(lián)物顯示了過氧化物酶的活性?？膳c過氧化物酶的一個(gè)或多個(gè)分子偶聯(lián)結(jié)合的生物分子包括DNA、RNA、寡核苷酸、抗體、抗體片斷、抗體-DNA嵌合體、抗原、半抗原、蛋白質(zhì)、外源凝集素、抗生物素蛋白、抗生物素蛋白鏈菌素，以及生物素。本發(fā)明的方法中也可采用包括了或并入了過氧化物酶如功能是連接生物分子的脂質(zhì)體、膠束、囊泡和聚合物的絡(luò)合物。
將某些增強(qiáng)劑化合物并入反應(yīng)混合物中可促進(jìn)酶的活性。這些增強(qiáng)劑中包括如授予Stout的專利號(hào)為4,521,511的美國專利中所述的公知用于提高其它過氧化物酶反應(yīng)的酚類化合物和芳香胺。其它的酚類增強(qiáng)劑在M.Ii，H.Yoshida，Y.Aramaki，H.Masuya，T.Hada，M.Terada，M.Hatanaka，Y.Ichimori，Biochem.BIOPHYS.Res.Comm.，193(2)，540-5(1993)中以及在專利號(hào)為5,171,668和5,206,149的美國專利中有所描述，將其列于此以作參考。列于此以作參考的專利號(hào)為5,512,451的美國專利中所公開的取代和未取代的芳基硼酸化合物及其酯類和酸酐衍生物也被認(rèn)為落入本發(fā)明中所采用的增強(qiáng)劑的范圍之內(nèi)。優(yōu)選的增強(qiáng)劑包括但不限于對(duì)-苯基苯酚、對(duì)-碘苯酚、對(duì)-溴苯酚、對(duì)-羥基肉桂酸、對(duì)-咪唑基苯酚、對(duì)乙酰氨基酚、2，4-二氯苯酚、2-萘酚和6-溴-2-萘酚。也可采用上述的那些類別中一種以上的增強(qiáng)劑的混合物。
在本發(fā)明的熒光反應(yīng)中采用非離子性表面活性劑作為添加劑是有利的。將非離子性表面活性劑并入采用過氧化物酶而產(chǎn)生熒光的反應(yīng)中，使對(duì)過氧化物酶的分析靈敏性得到了提高。用于本發(fā)明實(shí)踐中的非離子性表面活性劑示例性地包括了聚氧化乙烯化的烷基苯酚、聚氧化乙烯化的醇類、聚氧化乙烯化的醚類和聚氧化乙烯化的山梨糖醇酯。
包括季胺鹽化合物如溴化十六烷基三甲基銨(CTAB)的陽離子表面活性劑對(duì)用于增加在本發(fā)明的某些化合物與過氧化物酶或過氧化物進(jìn)行反應(yīng)時(shí)發(fā)出的熒光水平是有利的。
可用于本發(fā)明實(shí)踐中的螯合劑所包括的例子有多配位基的陽離子絡(luò)合試劑如乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇二(β-氨基乙醚)四乙酸(EGTA)及其鹽，以及其它本領(lǐng)域公知的試劑。
有機(jī)溶劑是那些具有高度水溶性的溶劑，且典型地構(gòu)成本制劑的小于5％b體積。合適的有機(jī)溶劑包括低級(jí)醇類如甲醇、乙醇、2-丙醇、乙二醇、丙二醇和2-甲氧基乙醇，低分子量的醚類如四氫呋喃(THF)、二噁烷、甘醇二甲醚和二甘醇二甲醚，丙酮，二氨基甲酰胺(DMF)，乙酰胺和二甲基亞砜(DMSO)。
本發(fā)明的反應(yīng)在例如水性緩沖劑的溶液中進(jìn)行，該水性緩沖劑可與固體支持物如涂覆有過氧化物酶的珠、管、膜或微孔板的表面相接觸。合適的緩沖劑包括能將pH值保持在約4到約10的范圍內(nèi)的任何常用緩沖劑，例如乙酸鹽、磷酸鹽、硼酸鹽、碳酸鹽、tris(三羥甲基氨基甲烷)、甘氨酸、三(羥甲基)甲基甘氨酸(tricine)、2-氨基-2-甲基-1-丙醇和二乙醇胺?？赏ㄟ^特定的所需用途的要求而確定在這方面實(shí)踐本發(fā)明的優(yōu)選方法。
可采用合適的已知裝置如分光熒光計(jì)、X-射線膠片、高速感光膠片、CCD照相機(jī)、閃煉計(jì)數(shù)器、磷光屏，或通過視覺觀察即可檢測本發(fā)明方法所發(fā)出的光。每一種檢測裝置具有不同的光譜靈敏度。人眼對(duì)綠光最敏感，CCD照相機(jī)對(duì)紅光顯示最大敏感性，可獲得X-射線膠片對(duì)UV，對(duì)藍(lán)光或?qū)G光的最大響應(yīng)。由應(yīng)用和成本、方便性、是否要求生成永久性的記錄等因素確定選擇何種檢測設(shè)備。
考慮實(shí)施例之后，本發(fā)明的這些優(yōu)點(diǎn)和其它優(yōu)點(diǎn)將變得顯而易見。
實(shí)施例按照本發(fā)明的方法合成二氫化吖啶羧酸衍生物1-11并對(duì)其進(jìn)行測試。
表1制備的二氫化吖啶底物化合物R1R2R3-R101 CO2C2H5CH3全為H2 CONHNH2CH3全為H3 4-CH3OC6H4CH3全為H4 H 4-FC6H4全為H5 H CH2C6H5全為H6 H C6H5R5＝OCH37 CH3CH3全為H8 COOH CH2C6H4全為H9 COOH CH3全為H10H CH3全為H11N-苯基二氫化吖啶基C6H5全為H
實(shí)施例1合成過氧化物酶底物化合物1如文獻(xiàn)中所述，從商購的吖啶-9-羧酸出發(fā)，按照采用SOCl2轉(zhuǎn)化為酰氯，用乙醇酯化，用三氟甲磺酸甲基酯(methyl triflate)進(jìn)行N-甲基化，然后用鋅/乙酸進(jìn)行還原的順序制備化合物1。或者，可從化合物9，即相應(yīng)的羧酸出發(fā)通過標(biāo)準(zhǔn)的酯化條件而形成化合物1。
實(shí)施例2合成過氧化物酶底物化合物2將N-甲基二氫化吖啶-9-羧酸甲酯(0.728g，2.8mmol)溶解于25mL甲醇和2mL CH2Cl2的溶液中。加入肼(1.9mL，62mmol)后，反應(yīng)混合物回流1天。收集沉淀，依次用甲醇和CH2Cl2進(jìn)行洗滌，然后從CH2Cl2/己烷中進(jìn)行重結(jié)晶。1H NMR(CDCl3)δ3.39(s，3H)，3.69(d，2H)，4.85(s，1H)，6.65(br s，1H)，6.96-7.35(m，8H)。
實(shí)施例3合成過氧化物酶底物化合物3將三氟甲磺酸N-甲基吖啶鎓酯(1.0g，2.9mmol)懸浮于30mLTHF中并在氬氣層中冷卻至0℃。通過注射器注射溶于THF的溴化4-甲氧基苯基鎂的溶液(7mL濃度為0.5M)到混合物中，得到的混合物攪拌3小時(shí)。蒸發(fā)除去溶劑，以10-20％EtOAc/己烷在二氧化硅上對(duì)殘留物進(jìn)行色譜分析。得到的化合物3為白色固體。1H NMR(CDCl3)δ3.41(s，3H)，3.73(3，3H)，5.13(s，1H)，6.74-7.23(m，12H)。
實(shí)施例4合成過氧化物酶底物化合物4將1.0g二氫化吖啶(5.5×10-3mol)，24.8mg乙酸鈀(1.1×10-4mol)，17.8mg三-特丁基膦(8.8×10-5mol)，795mg特丁氧基鈉(8.29×10-3mol)，以及1.06g 1-溴-4-氟苯(6.0×10-3mol)置于圓底燒瓶中，用氬氣清洗該圓底燒瓶。向燒瓶中加入無水甲苯(10mL)，并在室溫下攪拌黑色的溶液達(dá)16小時(shí)。
將9.0g二氫化吖啶(4.96×10-2mol)，446mg乙酸鈀(1.98×10-3mol)，321mg of三-特丁基膦(1.58×10-9mol)，7.16g特丁氧基鈉(7.4×10-2mol)，以及9.6g 1-溴-4-氟苯(0.054mol)置于圓底燒瓶中，用氬氣清洗該圓底燒瓶。向燒瓶中加入90ml無水甲苯，事黑色溶液在室溫下攪拌2小時(shí)。
將上述合并的反應(yīng)混合物通過瓷漏斗(Buchner funnel)過濾后用二氯甲烷進(jìn)行洗滌。在真空下濃縮濾液，在二氯甲烷中吸收殘留物并再次過濾。薄層層析(TLC)分析表明僅有濾液中含有產(chǎn)物。向?yàn)V液中加入50g硅膠，使溶液濃縮至干燥，然后將溶液裝載到處于溶于己烷的5％乙酸乙酯中的硅膠柱的頂部。用溶于己烷的5％乙酸乙酯洗脫柱，但產(chǎn)物在柱上就開始沉降，因此用純的CH2Cl2洗脫柱。收集產(chǎn)物的兩個(gè)級(jí)份，并濃縮至干燥。1H NMR顯示兩個(gè)級(jí)份中都含有純的產(chǎn)物。合并兩個(gè)級(jí)份，得到14g預(yù)期產(chǎn)物。1H NMR(CDCl3)δ4.22(s，2H)，6.16-6.19(d，2H)，6.84-6.88(t，2H)，6.93-6.98(t，2H)，7.13-7.16，(d，2H)，7.29-7.31(d，4H)。
實(shí)施例5合成過氧化物酶底物化合物5在3-L的燒瓶中裝入200g吖啶酮(1.03mol)，49.3g 60％NaH/油分散體(1.23mol)和1L DMF?；旌衔锷郎睾笤跉鍤庀聰嚢柽^夜。向棕色的溶液中加入芐基溴(185g，1.08mol)。反應(yīng)在保持?jǐn)嚢璧那闆r下升溫。2小時(shí)后燒瓶中的物質(zhì)基本固化。1小時(shí)后，加入1L乙醚，抽吸過濾混合物以除去固體，另用1L乙醚洗滌后，再用3L水仔細(xì)洗滌。通過蒸發(fā)合并的濾液至干燥生成黃色固體，從而分離出第二次的產(chǎn)物。用1L水洗滌該固體，在空氣中干燥，然后用400mL丙酮洗滌。合并的產(chǎn)物為234g 80％的N-芐基吖啶酮。
用存在于4L二乙醚中的104.7g氫化鋰鋁(2.76mol)還原N-芐基吖啶酮(229g，0.8mol)。然后用氬氣凈化灰色的漿狀物，反應(yīng)自發(fā)加熱到回流?；旌衔镌谑覝叵聰嚢柽^夜。用100mL水，然后用100mL15％NaOH水溶液和315mL水猝滅混合物。使固體懸浮后用4LCH2Cl2進(jìn)行徹底洗滌。濾液濃縮至干燥，得到204g二氫化吖啶白色固體(96％)。1H NMR(CDCl3)δ4.08(s，2H)，5.13(s，2H)，6.65-6.68(d，2H)，6，85-6.9(t，2H)，7.01-7.06(t，2H)，7.13-7.34(m，7H)。
實(shí)施例6合成過氧化物酶底物化合物6按照公開號(hào)為2001/0031869，
公開日為2001年10月18日的美國專利申請(qǐng)中所述的方法制備化合物6。所述化合物的制備與合成其中稱為1p的化合物有關(guān)。
實(shí)施例7合成過氧化物酶底物化合物7在氬氣下，將用三氟甲磺酸甲基酯對(duì)吖啶進(jìn)行烷基化而制備的三氟甲磺酸N-甲基吖啶鎓酯(5.0g，14.5mmol)懸浮于100mL干THF中，用處于己烷中的5.8mL 3M的溴化甲基鎂(17mmol)進(jìn)行處理并攪拌過夜。將溶液濃縮至干燥。在采用5％EtOAc/己烷洗脫的硅膠柱上進(jìn)行色譜純化之后，分離出產(chǎn)物。得到2.82g(92.5％)9-甲基化的衍生物白色固體。1H NMR(CDCl3)δ1.31-1.33(d，3H)，3.39(s，3H)，3.94-4.02(q，1H)，6.89-6.97(m，4H)，7.17-7.23(m，4H)。
實(shí)施例8合成過氧化物酶底物化合物8在惰性氣氛下，將溶于200mL干THF中的化合物5，N-芐基二氫化吖啶(10g，37mmol)的溶液冷卻到-78℃，在超過15分鐘的時(shí)間內(nèi)滴加入溶于己烷中的25.0mL 2.5M正丁基鋰的溶液(37.5mmol)。溶液在-78℃下攪拌1小時(shí)，然后升溫到室溫下保持45分鐘以上。再次將反應(yīng)混合物冷卻到-78℃，然后加入計(jì)算值(ca.)200g壓碎的干冰引起沉淀形成。使反應(yīng)緩慢升溫到室溫，并在氬氣下攪拌過夜。蒸發(fā)混合物，然后將固體懸浮于300mL水中，用12N HCl酸化至pH 3。固體收集后用水洗滌，溶解于CH2Cl2中，通過硫酸鈉干燥并濃縮得到11g N-芐基-二氫化吖啶-9-羧酸。1H NMR(CDCl3)δ4.99(s，1H)，5.12(s，2H)，6.72-6.75(d，2H)，6.88-6.94(t，2H)，7.10-7.17(m，4H)，7.22-7.32(m，5H)。
實(shí)施例9合成過氧化物酶底物化合物9用THF中的n-BuLi進(jìn)行處理，從而使49.6g(25.5mmol)化合物10發(fā)生羧化，然后按照實(shí)施例8中所述的方法加入壓碎的干冰，生成了55.5g(91％)羧酸9。1H NMR(DMSO-d6)δ3.33(s，3H)，4.93(s，1H)，6.91-7.26(m，8H)。
實(shí)施例10合成過氧化物酶底物化合物10按照實(shí)施例5所述的方法在二乙醚中采用LiAlH4還原商購的N-甲基吖啶酮60.2g。收率為49.6g，88％。1H NMR(CDCl3)δ3.38(s，3H)，3.89(s，3H)，6.87-7.22(m，8H)。
實(shí)施例11合成過氧化物酶底物化合物11將吖啶(5.2g，29mmol)溶解于200mL CH2Cl2中并放置于氬氣下。加入鋅粉(2.09g，32mmol)和1.9mL乙酸(33mmol)，攪拌混合物達(dá)2天。過濾收集固體，并用CH2Cl2進(jìn)行洗滌。在空氣中干燥之后，將固體碾成細(xì)粉末，并與300mL 2N HCl一起攪拌30分鐘。再次過濾固體，依次用水，2-丙醇和己烷洗滌固體。干燥之后，得到4.71g 9，9′-二二氫化吖啶基(90％)。
在圓底燒瓶中裝入9，9’-二二氫化吖啶基(1.0g，27.7mmol)，62.2mg乙酸鈀(0.27mmol)，45mg三-特丁基膦(0.22mmol)，0.80g特丁氧基鈉(3當(dāng)量)以及0.96g溴苯(6.1mmol)，并用氬氣清洗燒瓶。向燒瓶中加入干甲苯(30mL)，黑色的溶液在室溫下攪拌過夜。將反應(yīng)混合物傾入100mL CH2CL2中，通過20g 氧化硅過濾，用另外的CH2Cl2進(jìn)行洗滌。蒸發(fā)掉溶劑后留下了黃色固體，該黃色固體在10％EtOAc/己烷洗脫的二氧化硅上進(jìn)行色譜層離，得到化合物11，其為淺黃色固體(1.25g，88％)。1H NMR(CDCl3)7 4.41(s，2H)，5.99-6.02(d，4H)，6.66-6.78(m，12H)，6.94-7.0(m，4H)，7.35-7.48(m，6H)。
實(shí)施例12制備反應(yīng)物配方以下述的堿性配方或酸性配方制備含有化合物1-13中的增強(qiáng)型反應(yīng)物配方。
堿性配方酸性配方10mM Tris緩沖液，pH 8 10mM乙酸鈉緩沖液，pH 50.05mM底物 0.05mM底物0.5mM過氧化脲 0.5mM過氧化脲1mM EDTA1mM EDTA0.1mM對(duì)-苯基苯酚0.1mM對(duì)-苯基苯酚0.025％Tween-20 0.025％Tween-20實(shí)施例13熒光光譜在激發(fā)和發(fā)射狹縫設(shè)置在1.0nm通帶處的Jobin Yvon/SPEXFluoroMax-3分光熒光計(jì)上獲得熒光光譜。采用UV熒光計(jì)比色杯(容量為3.5mL，Perfector Scientific)。
實(shí)施例14底物評(píng)定通過與HRP反應(yīng)，然后進(jìn)行分光熒光分析，從而測定化合物1-13中的每一個(gè)產(chǎn)生熒光產(chǎn)物的情況。以下描述了采用化合物1的代表性方法。其它化合物采用基本相同的方法。
用移液管將采用酸性配方的3mL濃度為0.05mM的N-甲基二氫化吖啶9-羧酸乙基酯(化合物)的溶液移至比色杯中。記錄激發(fā)(λem＝524nm)和發(fā)射(λex＝364nm)光譜。加入HRP(13.8fmol，4.6×10-12M)并混合完全。經(jīng)過15分鐘時(shí)，記錄524nm處熒光性的增加。再次記錄激發(fā)(λem＝524nm)和發(fā)射(λex＝357nm)光譜。
表2二氫化吖啶底物的熒光性質(zhì)化合物 pH 5 pH 81 524 5242 487 4883 484 4844 497 4965 494 4946 512 5117 490 4888 4939 4891049011 494 494實(shí)施例15熒光信號(hào)/背景測定用移液管將三毫升采用實(shí)施例12的酸性或堿性配方的每種底物的溶液移至比色杯中。加入HRP(13.8fmol，4.6×10-12M)并完全混合。15分鐘后記錄每種底物最大值處的熒光性增加。通過比較t＝0分鐘和t＝15分鐘時(shí)的熒光強(qiáng)度，計(jì)算出信號(hào)-背景值。
表3HRP存在下二氫化吖啶底物的熒光強(qiáng)度(為S/B)化合物 pH 5pH 81 29.511.02 6.63 1.44 3.95 5.66 3.67 15.89 4.311 84.06.1
實(shí)施例16N-甲基二氫化吖啶(化合物10)和HRP的反應(yīng)產(chǎn)物的熒光光譜用移液管將采用酸性配方的3mL 0.05mM的N-甲基二氫化吖啶的溶液移至比色杯中。加入HRP(13.8fmol，4.6×10-12M)并完全地混合。在1.8小時(shí)內(nèi)以4.5分鐘的時(shí)間間隔獲得發(fā)射光譜(在357nm處激發(fā))。獲得的一系列光譜示于圖1中。為與N-甲基二氫化吖啶/HRP溶液的發(fā)射光譜作比較，圖中也顯示了采用酸性配方的濃度為0.05mM的三氟甲磺酸N-甲基吖啶鎓酯的發(fā)射光譜(在357nm處激發(fā))。光譜的一致性表明化合物10被酶致轉(zhuǎn)變?yōu)榘l(fā)熒光的吖啶鎓化合物。
實(shí)施例17從化合物10形成的熒光產(chǎn)物的動(dòng)力學(xué)圖2顯示了實(shí)施例16的反應(yīng)溶液在495nm處的熒光強(qiáng)度(在357nm處激發(fā))，其為時(shí)間的函數(shù)。在2小時(shí)內(nèi)熒光強(qiáng)度到達(dá)最大值，然后保持恒定。
實(shí)施例18采用化合物1對(duì)HPR的敏感性進(jìn)行熒光檢測在采用激發(fā)通帶濾光器(380nm)和發(fā)射通帶濾光器(465或530nm)的Labsystems Fluoroskan Ascent微量滴定板熒光計(jì)上得到熒光檢測界限。采用黑色的MicroFLUOR B 12-孔色條(strips)(DynatechLaboratories)。連續(xù)在1型的水中稀釋HRP，然后用移液管將10μl稀釋的HRP移至每個(gè)孔中。制備采用酸性配方的濃度為0.05mM的N-甲基二氫化吖啶9-羧酸乙基酯的溶液，并采用移液管將100μL的上述溶液移至每個(gè)孔中。然后在帶有380nm-530nm濾光器裝置的Fluoroskan Ascent上讀取色條。圖3示出了采用這種底物獲得的優(yōu)秀敏感性。
實(shí)施例19采用化合物2對(duì)HPR的敏感性進(jìn)行熒光檢測連續(xù)在1型的水中稀釋HRP，然后用移液管將10μl稀釋的HRP移至每個(gè)孔中。制備堿性配方中濃度為0.05mM的N-甲基二氫化吖啶9-羧酸酰肼的溶液，并采用移液管將100μL的上述溶液移至每個(gè)孔中。然后在帶有380nm-465nm濾光器裝置的Fluoroskan Ascent上讀取色條。圖3示出了采用這種底物獲得的優(yōu)秀敏感性。
實(shí)施例20采用化合物4對(duì)HPR的敏感性進(jìn)行熒光檢測連續(xù)在1型的水中稀釋HRP，然后用移液管將10μl稀釋的HRP移至每個(gè)孔中。制備采用酸性配方的濃度為0.05mM的N-(4-氟苯基)二氫化吖啶的溶液，并采用移液管將100μL的上述溶液移至每個(gè)孔中。然后在帶有380nm-465nm濾光器裝置的Fluoroskan Ascent上讀取色條。圖3示出了采用這種底物獲得的優(yōu)秀敏感性。
實(shí)施例21從化合物12形成的熒光產(chǎn)物的動(dòng)力學(xué)采用移液管將含有存在于0.01M tris緩沖液中的0.3mM 10-甲基二氫化吖啶-9-羧酸2′，3′，6′-三氟苯基酯(化合物12)，0.1mM 4-苯基苯酚，0.5mM過氧化脲，1mM EDTA，以及0.025％TWEEN 20的3mL反應(yīng)物(pH 8.0)移至比色杯中。加入HRP(13.8fmol，4.6×10-12M)并混合完全。在1.8小時(shí)內(nèi)以4.5分鐘的時(shí)間間隔獲得發(fā)射光譜(在357nm處激發(fā))。獲得的一系列發(fā)射光譜示于圖4中。光譜表明了反應(yīng)的進(jìn)展顯示了吖啶鎓熒光的增長和N-甲基吖啶酮的熒光逐漸占主導(dǎo)。
實(shí)施例22采用二氫化吖啶底物13以化學(xué)發(fā)光檢測HRP在Labsystems Luminoskan微量滴定板讀數(shù)器上獲得采用含有存在于0.01M tris緩沖液中的0.05mM 3-甲氧基-10-甲基二氫化吖啶-9-羧酸2′，3′，6′-三氟苯基酯(化合物13)，0.1mM 4-苯基苯酚，0.5mM過氧化脲，1mM EDTA，以及0.025％TWEEN 20的反應(yīng)物組合物(pH 8.0)的化學(xué)發(fā)光HRP檢測界限。含有100μL這一反應(yīng)物的白色Microlite 1FB 12孔色條(Dynatech Laboratories)在每個(gè)孔中與10μL HRP稀釋液反應(yīng)。在10分鐘時(shí)測定光強(qiáng)度。
實(shí)施例23采用二氫化吖啶底物13以熒光檢測HRP采用實(shí)施例22的反應(yīng)溶液以第二種方式產(chǎn)生熒光，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)HPR的敏感性檢測。進(jìn)行化學(xué)發(fā)光檢測之后，將色條轉(zhuǎn)移到熒光計(jì)下，在530nm處檢測熒光強(qiáng)度(以380nm激發(fā))。圖5顯示了該方法能檢測到小于1amol的HRP。敏感性相當(dāng)于采用相同底物的化學(xué)發(fā)光檢測。
實(shí)施例24采用化合物14對(duì)HRP進(jìn)行熒光檢測在室溫下使含有存在于0.01M tris緩沖液中的0.05mM化合物14，0.6mM過氧化脲，0.1mM對(duì)-苯基苯酚，0.025％TWEEN 20，1mMEDTA的40μL檢測反應(yīng)物(pH 8.0)與1μL HRP(1.4×10-16mol)進(jìn)行反應(yīng)。采用分光光度法在5分鐘后檢測到有吖啶鎓酯終產(chǎn)物形成，該吖啶鎓酯終產(chǎn)物在超過1小時(shí)的時(shí)間內(nèi)繼續(xù)增長，熒光處于500nm處。
在采用底物1，6-二甲氧基-4，10-二甲基二氫化吖啶-9-羧酸2，3，6-三氟苯基酯(化合物15)的類似實(shí)驗(yàn)中，該化合物與HRP的反應(yīng)導(dǎo)致形成熒光吖啶鎓終產(chǎn)物，該熒光吖啶鎓終產(chǎn)物可由分光光度法檢測到，熒光位于500nm處。

權(quán)利要求
1.產(chǎn)生熒光的方法，包括a)提供過氧化物酶和具有下列通式的熒光底物 其中R1是選自對(duì)于過氧化物的攻擊呈惰性的基團(tuán)，并包含選自C、H、N、O、S、P、Si和鹵素中的1到20個(gè)原子；R2選自于烷基、取代烷基、芳基取代芳基、芳烷基和取代芳烷基基團(tuán)；R3到R10每一個(gè)都是包含選自C、H、N、O、S、P、Si和鹵素中的1到20個(gè)原子的基團(tuán)；b)使過氧化物酶和熒光底物進(jìn)行反應(yīng)，以產(chǎn)生在反應(yīng)中積累且不發(fā)生進(jìn)一步反應(yīng)的熒光產(chǎn)物；和c)用合適波長的光照射熒光產(chǎn)物，致使熒光產(chǎn)物發(fā)射熒光。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，條件是R1不包括芳基酯(-COOAr)，烷基酯(-COOR)其中烷基R被選自于鹵素、氰基和硝基的吸電子基團(tuán)所取代的，烷基硫酯(-COSR)，芳基硫酯(-COSAr)，磺酰亞胺(-CO(NR)SO2R′)，酰鹵基-C(＝O)X其中X是鹵素，或氰基基團(tuán)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中R1選自烷基、取代烷基、烯基、取代烯基、炔基、取代炔基、烷氧基、烷硫基、芳基、取代芳基、芳烷基、取代芳烷基、羧酸、羧酸鹽、羧酰胺、烷基羧基酯、羧基酰肼基團(tuán)、酮基、-CHO、氨基、烷基氨基、芳基氨基，以及氫原子。
4.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中基團(tuán)R3到R10獨(dú)立地選自氫、烷基、烷氧基、烷硫基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、芳基、烯基、炔基、鹵素、羥基、巰基、磺酸酯、硫酸酯，以及磷酸酯。
5.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中基團(tuán)R3到R10中的每一個(gè)都為氫。
6.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中該通式I的化合物包括至少一個(gè)賦予水溶性的基團(tuán)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中賦予水溶性的基團(tuán)選自羧酸酯、磺酸酯、硫酸酯、磷酸酯、銨基和膦基團(tuán)。
8.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中該通式I的化合物選自具有以下結(jié)構(gòu)的化合物1-11
9.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括提供用于與過氧化物酶進(jìn)行反應(yīng)的過氧化物。
10.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中氧化物酶與氧化物酶底物的反應(yīng)產(chǎn)生了過氧化物。
11.權(quán)利要求1的方法應(yīng)用于過氧化物酶試驗(yàn)中，進(jìn)一步包括下列步驟d)檢測由熒光產(chǎn)物發(fā)射的熒光；和e)將所產(chǎn)生的熒光量與過氧化物酶的用量聯(lián)系起來。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中該過氧化物酶與生物分子結(jié)合連接。
13.權(quán)利要求1的方法應(yīng)用于分析物試驗(yàn)中，進(jìn)一步包括下列步驟d)檢測由熒光產(chǎn)物發(fā)射的熒光；e)將所產(chǎn)生的熒光量與過氧化物酶的用量聯(lián)系起來；和f)將過氧化物酶的用量與分析物的量聯(lián)系起來。
14.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所提供的該熒光底物是包括底物、過氧化物和增強(qiáng)劑的反應(yīng)物組合物。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中該增強(qiáng)劑選自酚類、芳香胺、芳基硼酸和烷基硼酸酯。
16.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中該增強(qiáng)劑選自對(duì)-苯基苯酚、對(duì)-碘苯酚、對(duì)-溴苯酚、對(duì)-羥基肉桂酸、對(duì)-咪唑基苯酚、對(duì)乙酰氨基酚、2，4-二氯苯酚、2-萘酚和6-溴-2-萘酚。
17.產(chǎn)生熒光的方法，包括a)提供過氧化物酶和具有下列通式的熒光底物 其中R1是包含選自C、H、N、O、S、P、Si和鹵素中的1到20個(gè)原子的基團(tuán)；R2選自于烷基、取代烷基、芳基取代芳基、芳烷基和取代芳烷基基團(tuán)；而R3到R10每一個(gè)都是包含選自C、H、N、O、S、P、Si和鹵素中的1到20個(gè)原子的基團(tuán)，且對(duì)R1-R10的選擇產(chǎn)生了具有具有下列通式的穩(wěn)定熒光吖啶鎓產(chǎn)物 b)使過氧化物酶和熒光底物進(jìn)行反應(yīng)，以產(chǎn)生在反應(yīng)中積累且不發(fā)生進(jìn)一步反應(yīng)的穩(wěn)定熒光吖啶鎓；和c)用合適波長的光照射熒光產(chǎn)物，致使熒光產(chǎn)物發(fā)射熒光。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中R1是內(nèi)部含有離去基團(tuán)的基團(tuán)，該離去基團(tuán)可被充當(dāng)親核試劑的過氧化物取代，并且該離去基團(tuán)選自芳基酯；其中烷基基團(tuán)R被選自鹵素、氰基和硝基的吸電子基團(tuán)所取代的取代烷基酯；硫酯；磺酰亞胺；酰鹵以及氰基基團(tuán)；其中R3或R10中至少有一個(gè)非H基團(tuán)，該非H基團(tuán)在與過氧物酶活性相容的條件下在空間上阻礙化學(xué)發(fā)光反應(yīng)生成吖啶酮產(chǎn)物。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中基團(tuán)R3到R10獨(dú)立地選自氫、烷基、烷氧基、烷硫基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、芳基、烯基、炔基、鹵素、羥基、巰基、磺酸酯、硫酸酯，以及磷酸酯。
20.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中R3或R10中至少有一個(gè)是鹵素、烷基或者烷氧基。
全文摘要
本發(fā)明公開了從具有與過氧化物酶有反應(yīng)性的生熒光底物產(chǎn)生熒光的方法。也提供了使用這些方法檢測過氧化物酶或者過氧化物酶標(biāo)記的分析物。描述了用于與過氧化物酶反應(yīng)的生熒光化合物，組合物和試劑盒。描述了產(chǎn)生熒光化合物的兩種模式。
文檔編號(hào)G01N33/533GK1659278SQ03813075
公開日2005年8月24日 申請(qǐng)日期2003年5月15日 優(yōu)先權(quán)日2002年6月6日
發(fā)明者H·阿哈萬－塔夫提, R·德席爾瓦, M·D·桑迪森, R·S·漢德利 申請(qǐng)人:魯米根公司