專利名稱：血管生成調(diào)節(jié)劑的鑒定方法,由此發(fā)現(xiàn)的化合物和使用該化合物的治療方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明要求2002年4月12日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/372,127，在此整體引用作為參考。
1.介紹本發(fā)明涉及利用血管細(xì)胞或非胚胎干細(xì)胞來鑒定血管生成的調(diào)節(jié)劑的方法。在體外測(cè)定系統(tǒng)中，利用人多能干細(xì)胞，本發(fā)明方法能用于測(cè)定調(diào)節(jié)人血管生成的化合物和小分子。本發(fā)明還涉及在體外檢測(cè)系統(tǒng)中，利用非胚胎多能干細(xì)胞，通過確定檢驗(yàn)化合物調(diào)節(jié)自發(fā)性血管形成(vasogenesis)的能力來鑒定人血管生成調(diào)節(jié)劑的方法。本發(fā)明涉及體外測(cè)定系統(tǒng)，其利用了非胚胎多能干細(xì)胞來鑒定可調(diào)節(jié)人血管生成或人血管形成的化合物。本發(fā)明也涉及需要調(diào)節(jié)人血管生成或血管形成的治療方法，其包括將這種已被確定是人血管生成或血管形成抑制劑的化合物或小分子對(duì)需要這種治療的患者進(jìn)行給藥。
2.發(fā)明背景在鑒定和生產(chǎn)可調(diào)節(jié)人血管生成化合物上有很大關(guān)注。在鑒定可調(diào)節(jié)人血管生成和血管形成化合物上的主要障礙是缺乏可真實(shí)地模擬如在體內(nèi)發(fā)生的人血管生成和血管形成過程的體外檢測(cè)系統(tǒng)。
已經(jīng)證明了一些疾病過程，其作為所屬病理學(xué)一部分，需要內(nèi)皮細(xì)胞侵襲或遷移，包括腫瘤入侵，腫瘤轉(zhuǎn)移，病理的血管生成，炎癥和子宮內(nèi)膜異位癥(Aznavoorian等，1993，Cancer 71(4)1368-1383；Femandez等，1995，F(xiàn)ertil.and Steril.63(1)45-51；Fox等，1996，J.Pathol.179232-237；Lennarz等，1991，Biochim.Biophys.Acta 1071149-158；Liotta等，1991，Cell 64327-336；Mareel等，1990，Cancerand Metastasis Rev.945-62；和Osbom 1990，Cell 623-6.)。血管生成也涉及其他的是血管生成依賴性的疾病和病癥，包括關(guān)節(jié)炎和動(dòng)脈粥樣硬化斑、糖尿病性視網(wǎng)膜病、新生血管性青光眼、沙眼和角膜移植物新血管化、牛皮癬、硬皮病、血管瘤和肥大性疤痕、血管粘連和血管纖維瘤。
血管生成是由預(yù)存在的血管形成新血管的過程。血管形成是單層內(nèi)皮細(xì)胞的管形成過程。普通生理學(xué)條件下，人或動(dòng)物在非常特殊情形出現(xiàn)血管生成和血管形成，例如傷口愈合，胎兒和胚胎發(fā)育，卵巢黃體、子宮內(nèi)膜和胎盤的形成。
內(nèi)皮細(xì)胞形成一層細(xì)胞，其排列了所有血管和調(diào)節(jié)在血流和周圍組織間的交換。通過這些內(nèi)皮細(xì)胞的突起，新血管從已有的小血管壁發(fā)育而來，所述突起具有甚至在培養(yǎng)時(shí)得到分離，并能形成中空毛細(xì)管的能力。一旦血管系統(tǒng)發(fā)育完全，血管內(nèi)皮細(xì)胞通常保持休眠而沒有新的血管生成。如果發(fā)生疾病或創(chuàng)傷，如在傷口自然愈合時(shí)，新血管的形成通常能繼續(xù)進(jìn)行。新血管的形成不足可導(dǎo)致急性皮膚潰瘍。作為選擇地，如在腫瘤生成、糖尿病性視網(wǎng)膜病、牛皮癬和炎癥中，生長(zhǎng)的失調(diào)節(jié)能引起血管密度的異常增長(zhǎng)。這樣，對(duì)于藥品開發(fā)項(xiàng)目而言，抑制不合適的血管生成或增強(qiáng)在非愈合的傷口中的血管生成是理所當(dāng)然的非常重要的目標(biāo)。然而在此領(lǐng)域中的研究由于缺乏體外血管生成模型而受到阻止，該模型可準(zhǔn)確地模擬體內(nèi)血管的天然環(huán)境。
血管生成是一個(gè)非常復(fù)雜的過程，其涉及大范圍的生長(zhǎng)因子，細(xì)胞外基質(zhì)分子，酶和各種細(xì)胞類型。如此復(fù)雜的關(guān)系給發(fā)展一種體外檢測(cè)(系統(tǒng))帶來較大的困難，該(系統(tǒng))可模擬體內(nèi)的全部過程。血管生成能被分成3個(gè)時(shí)期增殖期、移植期和分化期。對(duì)這些時(shí)期的各個(gè)模型單獨(dú)檢測(cè)。特別地，簡(jiǎn)單體外的檢測(cè)可測(cè)量在細(xì)胞類型范圍的增殖中的變化，和評(píng)估在基底膜蛋白上的遷移。目前體外檢測(cè)系統(tǒng)，其取決于蛋白基體的供應(yīng)，通常測(cè)量?jī)?nèi)皮細(xì)胞生成血管的能力。測(cè)量分化的檢測(cè)系統(tǒng)包括靠近內(nèi)皮細(xì)胞的索狀結(jié)構(gòu)的形成。所有這些系統(tǒng)都取決于用在細(xì)胞遷移形成小管之處的外源基底蛋白來供應(yīng)細(xì)胞。然而，這些檢測(cè)系統(tǒng)的問題在于它們中沒有一個(gè)聯(lián)合了所有的需要血管生成的時(shí)期一種體外模型系統(tǒng)是大鼠動(dòng)脈環(huán)模型。在大鼠動(dòng)脈環(huán)模型中，在短期和長(zhǎng)期維持條件下鼠主動(dòng)脈環(huán)外植體培養(yǎng)得到利用。在這種檢測(cè)系統(tǒng)中，為了獲得內(nèi)皮細(xì)胞和肌細(xì)胞的純細(xì)胞群體，鼠環(huán)主動(dòng)脈片段在短期維持條件下得到培養(yǎng)三至四天。相反地，大鼠動(dòng)脈環(huán)外植體的長(zhǎng)期培養(yǎng)可讓內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞兩者的協(xié)同衍生和分化(Dialio等，1989，Laboratory Investigation 60(4)523-531)。
近來，另一小組嘗試發(fā)展一種人體外檢測(cè)系統(tǒng)來研究血管生成，并且在這種情況下，可利用源自11至12天齡晶胚的胚胎主動(dòng)脈環(huán)外植體，該晶胚已包埋在膠原凝膠中(Allesandri等，2001，LaboratoryInvestigation 81(6)875-885)。
其他的模擬了血管生成的復(fù)合時(shí)期的體外檢測(cè)，其包括了使用從出生后6小時(shí)內(nèi)的獲得的人胎盤組織的血管片斷(Parish等，美國專利號(hào)5,976,782)，使用商業(yè)上可用的豬頸動(dòng)脈(Stiffey-Wilusz，申請(qǐng)?zhí)?001/0046666)，和使用內(nèi)皮細(xì)胞和纖維原細(xì)胞的雙重培養(yǎng)(Grant等，WO99/17116；Grant等，美國專利申請(qǐng)?zhí)?001/0005581)。通過將人成熟皮膚纖維原細(xì)胞以約2∶1至8∶1細(xì)胞比率去接種人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)多細(xì)胞模型非常類似于體內(nèi)血管生成(Grant等，WO99/17116；Grant等，美國專利申請(qǐng)?zhí)?001/0005581)。
然而到今天為止，還沒有一種血管生成模型利用了干細(xì)胞，或者結(jié)合了血管組織的干細(xì)胞，或者結(jié)合了干細(xì)胞或血管組織區(qū)域之一的腫瘤細(xì)胞。據(jù)信，利用了這些細(xì)胞的血管生成檢測(cè)系統(tǒng)比先前描述的檢測(cè)系統(tǒng)將更準(zhǔn)確的反應(yīng)出血管生成的過程。
3.發(fā)明概述本發(fā)明涉及利用了人多能干細(xì)胞的體外檢測(cè)系統(tǒng)來鑒定調(diào)節(jié)人血管生成或人血管形成的化合物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，人多能干細(xì)胞是胎盤源。本發(fā)明的篩選分析能被用于鑒定可抑制或刺激血管生成和/或血管形成的化合物。
本發(fā)明涉及篩選血管生成的調(diào)節(jié)劑的檢測(cè)方法，其包括在適宜血管生成和可確定作用于血管生成過程中的檢驗(yàn)化合物的效果的條件下，用一部分血管，也就是血管環(huán)，來培養(yǎng)人多能干細(xì)胞。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，多能干細(xì)胞是非胚胎源。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，非胚胎干細(xì)胞是胎盤衍生的干細(xì)胞。在本方面的另一個(gè)優(yōu)選方案中，一部分血管是人源，優(yōu)選人臍帶。
本發(fā)明也優(yōu)選提供篩選血管生成的調(diào)節(jié)劑的檢測(cè)方法，其包括在腫瘤細(xì)胞存在下和可確定作用于血管生成過程中的檢驗(yàn)化合物的效果的條件下，培養(yǎng)血管環(huán)，或干細(xì)胞。
優(yōu)選本發(fā)明的篩選檢測(cè)包括以下步驟(a).在合適的生長(zhǎng)容器里提供一種適宜的培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基適于維持內(nèi)皮細(xì)胞的最低限度的生長(zhǎng)；(b).在所述的生長(zhǎng)容器里，人血管樣品至少被培養(yǎng)24小時(shí)，所述的血管無結(jié)締組織；(c).定期改變培養(yǎng)基；和(d).監(jiān)測(cè)微血管突起的形成。
這樣，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種鑒定血管生成調(diào)節(jié)劑的方法，其包括(a)在檢驗(yàn)化合物的存在下和適于內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的條件下，將多個(gè)干細(xì)胞培養(yǎng)一段時(shí)間；和(b)將在所述檢驗(yàn)化合物的存在下源自所述干細(xì)胞的微血管突起的量與作為對(duì)照的微血管突起的量進(jìn)行比較，其中如果所述微血管突起大于或小于所述微血管突起的對(duì)照水平，該檢驗(yàn)化合物被鑒定為血管生成調(diào)節(jié)劑。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，以血管切片來培養(yǎng)所述的干細(xì)胞。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，以多個(gè)腫瘤細(xì)胞來培養(yǎng)所述的干細(xì)胞。在更具體的實(shí)施方案中，所述的腫瘤細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞系的細(xì)胞。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述的干細(xì)胞還在氫化可的松，表皮生長(zhǎng)因子，或牛腦提取物的存在下被培養(yǎng)。在另一個(gè)更具體的實(shí)施方案中，所述的血管生成調(diào)節(jié)劑被鑒定為一種抗血管生成劑。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述的血管生成調(diào)節(jié)劑被鑒定為一種血管生成劑。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，在檢驗(yàn)化合物的存在下，將所述多個(gè)干細(xì)胞培養(yǎng)至少7天。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，在檢驗(yàn)化合物的存在下，將所述多個(gè)干細(xì)胞培養(yǎng)至少14天。在另一個(gè)更加具體的實(shí)施方案中，將所述干細(xì)胞在含有血纖蛋白的基質(zhì)上培養(yǎng)。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，將所述干細(xì)胞在含有血纖蛋白的生理凝膠中培養(yǎng)。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，將所述干細(xì)胞在含有非變性膠原的生理凝膠中培養(yǎng)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種鑒定血管生成調(diào)節(jié)劑的方法，其包括(a)在多個(gè)腫瘤細(xì)胞和檢驗(yàn)化合物的存在下及適于內(nèi)皮細(xì)胞和所述腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的條件下，培養(yǎng)血管切片一段時(shí)間；和(b)將在所述檢驗(yàn)化合物的存在下源自所述血管切片的微血管突起的量與作為對(duì)照的微血管突起的量進(jìn)行比較，其中如果所述微血管突起大于或小于所述微血管突起的對(duì)照水平，該檢驗(yàn)化合物被鑒定為血管生成調(diào)節(jié)劑。
本發(fā)明也提供了用在以上檢測(cè)中鑒定的化合物來治療個(gè)體的方法。在這方面中，本發(fā)明涉及需要調(diào)節(jié)人血管生成或血管形成的治療方法，其包括對(duì)需要這種治療的患者給藥化合物或小分子，所述化合物或小分子已被證實(shí)是人血管生成或血管形成的抑制劑。本發(fā)明也涉及需要調(diào)節(jié)人血管生成或血管形成的治療方法，其包括的患者給藥化合物或小分子，所述化合物或小分子已被證實(shí)是人血管生成或血管形成的刺激劑。
因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了治療個(gè)體的方法，所述的個(gè)體患有與異常血管生長(zhǎng)有關(guān)的疾病或病癥，包括給藥所述的個(gè)體治療有效量的TNF-α抑制劑。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述的TNF-α抑制劑是IMiDTM。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述的IMiDTM是AcimidTM或RevimidTM。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述的疾病或病癥是癌癥。在更為具體的實(shí)施方案中，所述的癌癥是轉(zhuǎn)移性癌。在另一個(gè)更為具體的實(shí)施方案中，所述的癌癥是乳癌。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述的疾病或病癥選自于炎癥、子宮內(nèi)膜異位、關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化斑、糖尿病性視網(wǎng)膜病、新生血管性青光眼、沙眼和角膜移植物新血管化、牛皮癬、硬皮病、血管瘤和肥大性疤痕、血管粘連和血管纖維瘤。
在全文中，本發(fā)明也提供了抑制血管生成的方法。因此，本發(fā)明提供了抑制血管生成的方法，其包括用TNF-α抑制劑接觸多個(gè)細(xì)胞，所述的多個(gè)細(xì)胞能形成血管。在一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述的TNF-α抑制劑是AcimidTM或RevimidTM。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述的多個(gè)細(xì)胞是個(gè)體體內(nèi)的多個(gè)細(xì)胞。在另一個(gè)具體的實(shí)施方案中，所述的多個(gè)細(xì)胞是細(xì)胞培養(yǎng)中的多個(gè)細(xì)胞。
本發(fā)明也涉及血管生成檢測(cè)試劑盒，包括胎盤衍生的干細(xì)胞樣品和人臍帶樣品。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，該檢測(cè)試劑盒包括人臍帶血漿樣品。
可被用于與本發(fā)明的篩選檢測(cè)有關(guān)的檢驗(yàn)化合物的實(shí)例包括，并不限于小分子、有機(jī)化合物、無機(jī)化合物、多肽、肽、蛋白、激素、細(xì)胞因子、寡核苷酸、核酸或其他大分子?？杀挥糜谂c本發(fā)明相關(guān)的小分子化合物的其他實(shí)例，包括但不限于，抑制TNF-α活性的化合物。優(yōu)選的，化合物的分子量小于1000克/摩爾。這樣的化合物包括但不限于，取代的苯乙烯的氰基和羧基衍生物，環(huán)酰亞胺類，環(huán)烷基酰胺類和亞硝酸環(huán)烷基酯類，芳基酰胺類，1-氧代-2-(2，6-二氧代-3-氟哌啶-3-基)異吲哚啉和1，3-二氧代-2-(2，6-二氧代-3-氟哌啶-3-基)異吲哚啉，四取代的2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代異吲哚啉，酰亞胺/酰胺醚和醇類，琥珀酰亞胺和馬來酰亞胺類，1-氧代和1，3-二氧代-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)異吲哚啉，非多肽環(huán)酰胺類，酰亞氨基和酰氨基取代的鏈烷羥肟酸類，取代的苯乙基砜類，沙利度胺，氨基沙利度胺，3-(4-氨基-1-氧代-1，3-二氫-異吲哚-2-基)-哌啶-2，6-二酮，以及沙利度胺、氨基沙利度胺和3-(4-氨基-1-氧代-1，3-二氫-異吲哚-2-基)-哌啶-2，6-二酮的類似物、水解產(chǎn)物、代謝物、衍生物和前體，芳基酰胺類，取代的2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)鄰苯二甲酰亞胺和取代的2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧異吲哚，和異吲哚-酰亞胺化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選化合物是沙利度胺，以及沙利度胺的類似物、水解產(chǎn)物、代謝物、衍生物和前體。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，該化合物是IMiDSTM，包括但不限于ActimidTM和RevimidTM(Celgene Corp.，Warren，NJ)，或SeICIDsTM。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，干或祖細(xì)胞不是來源于產(chǎn)后灌注的胎盤，而是從例如臍帶血、骨髓、外周血或成人血的其他來源中分離得到。
3.1定義如此處所用的，術(shù)語“血管生成”和“血管形成”指新血管的生成。
如此處所用的，術(shù)語“生物反應(yīng)器”指一種可繁殖細(xì)胞的體外系統(tǒng)，生產(chǎn)或表達(dá)生物材料和發(fā)育或培養(yǎng)細(xì)胞組織、類器官、病毒、蛋白質(zhì)、多肽和微生物。
如此處所用的，術(shù)語“胚胎干細(xì)胞”指源于胚囊(例如4-5天的人胚胎)內(nèi)生細(xì)胞團(tuán)的細(xì)胞，且具有多能性。
如此處所用的，術(shù)語“胚胎樣干細(xì)胞”指不從內(nèi)細(xì)胞群胚囊衍生而來的細(xì)胞。如此處所用的，“胚胎樣干細(xì)胞”也可指胎盤干細(xì)胞。胚胎樣干細(xì)胞優(yōu)選是多能的。然而，干細(xì)胞，可從胎盤獲得的，包括胚胎樣干細(xì)胞、多能細(xì)胞、定向祖細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明的方法，一旦胎盤被抽血和被灌注了一段充分的時(shí)間來除去殘余細(xì)胞，從分離的胎盤中就可收集衍生于胎盤的胚胎樣干細(xì)胞。
如此處所用的，術(shù)語“內(nèi)皮”指一層薄薄的、扁平的上皮細(xì)胞，其通常排列有漿膜腔，淋巴管和血管。
如此處所用的，術(shù)語“抽血”或“抽血法”，用及與胎盤有關(guān)時(shí)，指從胎盤充分地除去和/或排干全部的臍帶血。根據(jù)本發(fā)明，胎盤抽血能通過，例如，但不是作為限定地，排干、重力誘導(dǎo)流出、按摩、擠壓、抽吸等方式來完成。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，進(jìn)一步用含或不含，如輔助胎盤抽血的抗凝劑的，試劑的流體，通過灌注、洗滌或沖洗胎盤完成胎盤抽血。
如此處所用的，術(shù)語“灌注”或“灌注法”指將流體傾注或通注到器官或組織之上或內(nèi)部的行動(dòng)過程，優(yōu)選用足夠的外力或壓力將流體通注器官或組織內(nèi)部來除去殘余細(xì)胞，例如，器官或組織的非附著細(xì)胞。如此處所用的，術(shù)語“灌注液”指跟隨通注器官或組織后收集的液體。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，灌注液含有一種或多種抗凝劑。
如此處所用的，術(shù)語“內(nèi)生細(xì)胞”指“非外來細(xì)胞”，也就是，“自身”或自體細(xì)胞，其衍生于胎盤。
如此處所用的，術(shù)語“外生細(xì)胞”指“外來細(xì)胞”，也就是，異種細(xì)胞(也就是，衍生于其他來源而非胎盤供體的“非自身”細(xì)胞)或衍生于器官或組織而非胎盤的自體細(xì)胞(也就是，衍生于胎盤供體的“自身”細(xì)胞)。
如此處所用的，術(shù)語“類器官”指在外觀表面或在實(shí)際結(jié)構(gòu)中裝配的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞型的集合體，如哺乳動(dòng)物體的器官或腺體，優(yōu)選人體。
如此處所用的，術(shù)語“多潛能細(xì)胞”指具有發(fā)育成哺乳動(dòng)物體的約260種細(xì)胞型亞群能力的細(xì)胞。不像多能細(xì)胞，多潛能細(xì)胞不具備形成所有細(xì)胞型的能力。
如此處所用的，術(shù)語“多能細(xì)胞”指具有完全的多能性分化的細(xì)胞，也就是，發(fā)育成哺乳動(dòng)物體約260種細(xì)胞型的能力。多能細(xì)胞能自我更新，和能在組織中保持休眠或靜止?fàn)顟B(tài)。不像全能細(xì)胞(也就是，二倍體受精卵細(xì)胞)，胚胎干細(xì)胞通常不能形成新的胚泡。
如此處所用的，術(shù)語“祖細(xì)胞”指定向分化成特殊類型的細(xì)胞或形成特殊類型的組織的細(xì)胞。
如此處所用的，術(shù)語“干細(xì)胞”指無限再生繁殖來形成組織和器官的特化細(xì)胞的母細(xì)胞。干細(xì)胞是發(fā)育中的多能細(xì)胞或多潛能細(xì)胞。干細(xì)胞能分裂產(chǎn)生兩個(gè)子干細(xì)胞，或者一個(gè)子干細(xì)胞和一個(gè)祖細(xì)胞(“運(yùn)輸”)，其然后增殖成成熟組織的、完全成形的細(xì)胞。
如此處所用的，術(shù)語“全能細(xì)胞”指能形成完全胚胎(也就是，胚泡)的細(xì)胞。
如此處所用的，術(shù)語“血管形成”指發(fā)生或形成管道或微管。
如此處所用的，術(shù)語“血管環(huán)”意味著血管切片。通常血管切片是呈現(xiàn)環(huán)狀的橫切片，但可以是任意的可培養(yǎng)的血管切片。血管切片可以是任何血管(也就是，動(dòng)脈的，靜脈，淋巴管，等等)。
4.附圖簡(jiǎn)述附

圖1(A-D).6.2節(jié)表示在臍帶血管環(huán)檢測(cè)中的培養(yǎng)細(xì)胞的顯微照片。A.陽性對(duì)照。外植體培養(yǎng)在EGCF 200μg/ml的培養(yǎng)基中。從外植體遷出來的大量的細(xì)胞包裹著外植體，并且細(xì)胞個(gè)體出現(xiàn)大范圍的突起。B.陰性對(duì)照。外植體培養(yǎng)在補(bǔ)充胎盤條件培養(yǎng)基中。在缺少了EGCF時(shí)，與在陽性對(duì)照(A)中的比較，較少的細(xì)胞從外植體遷出。C.治療組3。外植體培養(yǎng)在胎盤條件培養(yǎng)基中+EGCF 200μg/ml+ThalomidTM100μg/ml。在缺少了100μg/ml的ThalomidTM時(shí)，與在陽性對(duì)照(A)中的比較，細(xì)胞從外植體中遷出更短的距離。D.治療組2。外植體培養(yǎng)在胎盤條件培養(yǎng)基中+EGCF 200μg/ml+ThalomidTM10μg/ml。在缺少了10μg/ml的ThalomidTM時(shí)，與在陽性對(duì)照(A)中的比較，細(xì)胞從外植體中遷出更短的距離，及它們呈現(xiàn)更小密度的突起。
圖2(A-C).如6.2節(jié)所述在臍帶血管環(huán)檢測(cè)中的培養(yǎng)細(xì)胞的顯微照片。A.對(duì)照。細(xì)胞培養(yǎng)在胎盤條件培養(yǎng)基+ECGF 200μg/ml+DMSO1μg/ml中。B.細(xì)胞培養(yǎng)在胎盤條件培養(yǎng)基+ECGF 200μg/ml+DMSO1μg/ml+ThalomidTM1μg/ml中。與對(duì)照(A)比較，看到很少的細(xì)胞。B.細(xì)胞培養(yǎng)在胎盤條件培養(yǎng)基+ECGF 200μg/ml+DMSO 1μg/ml+ThalomidTM10μg/ml中。與在對(duì)照(A)或(B)中的比較，看到很少的細(xì)胞。
圖3(A-B).如6節(jié)所述在臍帶血管環(huán)檢測(cè)中的培養(yǎng)細(xì)胞的顯微照片。A.對(duì)照。細(xì)胞培養(yǎng)在胎盤條件培養(yǎng)基+DMSO中。細(xì)胞主要地呈現(xiàn)不分支(例如，內(nèi)皮的)的表型。B.細(xì)胞培養(yǎng)在胎盤條件培養(yǎng)基+DMSO+ThalomidTM中。與在對(duì)照(A)中的比較，更多的細(xì)胞呈現(xiàn)分支(例如，神經(jīng)元)的表型。
圖4.不同濃度的Thall、ActimidTM(CC-4047)，和煙曲霉素對(duì)人血管生成影響的圖示。
圖5.如6.3節(jié)所示的、在不同濃度Thall、ActimidTM(CC-4047)，和煙曲霉素存在下的、在臍帶血管環(huán)檢測(cè)中的胎盤胚胎樣干細(xì)胞的顯微照片。
圖6.臍帶血管環(huán)檢測(cè)的圖解法。
5.發(fā)明詳述本發(fā)明涉及利用了人多能干細(xì)胞的體外檢測(cè)系統(tǒng)來鑒定可調(diào)節(jié)人血管生成或人血管形成的化合物。本發(fā)明的篩選檢測(cè)法可被用于鑒定抑制或刺激血管生成和/或血管形成的化合物。
本發(fā)明涉及篩選血管生成的調(diào)節(jié)劑的檢測(cè)，包括在允許血管生成和確定檢驗(yàn)化合物在血管生成過程中的效果的條件下，培養(yǎng)人多能干細(xì)胞或血管的一部份。在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，多能干細(xì)胞是非胚胎源。在本發(fā)明一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，非胚胎干細(xì)胞是胎盤衍生的干細(xì)胞。在本發(fā)明另一個(gè)優(yōu)選的具體實(shí)施方案中，血管的一部分是人源，優(yōu)選來源于人臍帶。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，干細(xì)胞或祖細(xì)胞不是來源于產(chǎn)后被灌注的胎盤，而是從例如臍帶血、骨髓、末梢血管或已成體血管的其他來源分離獲得。
本發(fā)明包含用于鑒定血管生成調(diào)節(jié)劑的體外篩選檢測(cè)法，這種檢測(cè)依賴于人多能干細(xì)胞和來源于人臍帶血的血管的共培養(yǎng)。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，人多能干細(xì)胞是胎盤源。
本發(fā)明也涉及血管生成檢測(cè)試劑盒，包括胎盤衍生的干細(xì)胞樣品和人臍帶樣品。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，該檢測(cè)試劑盒還包括人臍帶血漿樣品。
本發(fā)明也涉及需要調(diào)節(jié)人血管生成或血管形成的治療方法，其包括對(duì)需要這種治療的患者給藥化合物或小分子，所述化合物或小分子已證實(shí)是人血管生成或血管形成的抑制劑。本發(fā)明也涉及需要調(diào)節(jié)人血管生成或血管形成的治療方法，其包括對(duì)需要這種治療的患者所需的治療化合物或小分子，所述化合物或小分子已被證實(shí)是人血管生成或血管形成的刺激劑。
可被用于與本發(fā)明的篩選檢測(cè)有關(guān)的檢驗(yàn)化合物的實(shí)施例包括但不限于小分子，有機(jī)化合物、無機(jī)化合物、多肽、肽、蛋白、激素、細(xì)胞因子、寡核苷酸、核酸或其他大分子。
可被用于與此處所示的治療方法有關(guān)的小分子化合物的實(shí)例包括但不限于，抑制TNF-α活性的化合物。這樣的化合物包括但不限于，取代的苯乙烯的氰基和羧基衍生物，環(huán)酰亞胺類，環(huán)烷基酰胺類和亞硝酸環(huán)烷基酯類，芳基酰胺類，1-氧代-2-(2，6-二氧代-3-氟哌啶-3-基)異吲哚啉和1，3-二氧代-2-(2，6-二氧代-3-氟哌啶-3-基)異吲哚啉，四取代的2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代異吲哚啉，酰亞胺/酰胺醚和醇類，琥珀酰亞胺和馬來酰亞胺類，1-氧代和1，3-二氧代-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)異吲哚啉，非多肽環(huán)酰胺類，酰亞氨基和酰氨基取代的鏈烷羥肟酸類，取代的苯乙基砜類，沙利度胺，氨基沙利度胺，3-(4-氨基-1-氧代-1，3-二氫-異吲哚-2-基)-哌啶-2，6-二酮，以及沙利度胺、氨基沙利度胺和3-(4-氨基-1-氧代-1，3-二氫-異吲哚-2-基)-哌啶-2，6-二酮的類似物、水解產(chǎn)物、代謝物、衍生物和前體，芳基酰胺類，取代的2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)鄰苯二甲酰亞胺和取代的2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧異吲哚，和異吲哚-酰亞胺化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，優(yōu)選化合物是沙利度胺，以及沙利度胺的類似物、水解產(chǎn)物、代謝物、衍生物和前體。
依照本發(fā)明的方法所用到的任一種人干細(xì)胞，包括但不限于，從臍帶血(“CB”細(xì)胞)、胎盤和其他來源分離的干細(xì)胞。干細(xì)胞可以包括多能細(xì)胞，也就是，具有完全的多能性分化的細(xì)胞，自我更新的細(xì)胞，和能在組織中保持體眠或靜止?fàn)顟B(tài)的細(xì)胞。干細(xì)胞也包括多潛能細(xì)胞或定向祖細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，發(fā)明利用有活力的、靜息的干細(xì)胞，和存在于妊娠期滿的胎盤中多能干細(xì)胞，其能在順利分娩后及胎盤排氣、放血和灌注后得到回收，從而導(dǎo)致多潛能和多能干細(xì)胞得到回收。
5.1鑒定血管生成調(diào)節(jié)劑的篩選檢測(cè)法本發(fā)明包括鑒定血管生成調(diào)節(jié)劑的篩選檢測(cè)法，其包括篩選可調(diào)節(jié)血管形成或管形成的檢驗(yàn)化合物的能力。依照發(fā)明的該方面，培育人多能干細(xì)胞或血管環(huán)并使之接觸檢驗(yàn)化合物，并且確定在血管生成中的效果。
5.1.1檢測(cè)方法本發(fā)明提供一種血管形成或血管生成的調(diào)節(jié)劑的鑒定方法，其中血管來源于平板干細(xì)胞。將干細(xì)胞鋪平板，并從非粘附細(xì)胞群落中分離粘附細(xì)胞，優(yōu)選培養(yǎng)24小時(shí)后。在適宜的培養(yǎng)基中培養(yǎng)粘附細(xì)胞。一些適宜的培養(yǎng)基被包括在該方法中；優(yōu)選一種培養(yǎng)基是添加了5-20％的臍帶血清(CBS)和抗生素的DMEM。優(yōu)選地，培養(yǎng)基進(jìn)一步添加了氫化可的松、表皮生長(zhǎng)因子和/或牛腦提取物。培養(yǎng)干細(xì)胞導(dǎo)致自發(fā)的血管形成。可通過微管結(jié)構(gòu)的裝配來檢定自發(fā)的血管形成。在此方法中，檢驗(yàn)化合物以其調(diào)節(jié)這些微管結(jié)構(gòu)的裝配的能力得到檢測(cè)。與對(duì)照比較，血管生成抑制劑可以以其阻止或減少微管形成過程的能力為基礎(chǔ)得到鑒定，例如，在缺乏檢驗(yàn)化合物的檢測(cè)條件。相反地，與對(duì)照比較，血管生成刺激物可以以其增強(qiáng)或增加微管形成過程的能力為基礎(chǔ)得到鑒定，例如，在缺乏檢驗(yàn)化合物的檢測(cè)條件。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供一種篩選對(duì)血管形成有調(diào)節(jié)活性的物質(zhì)的方法，包括從一份生物樣品中，連同生理凝膠、適宜的營養(yǎng)物、至少一種被懷疑暫時(shí)有血管生成調(diào)節(jié)活性的和克足的條件下能讓新血管組織發(fā)育的物質(zhì)，來培養(yǎng)非胚胎多能干細(xì)胞，和為新血管組織發(fā)育來檢驗(yàn)所述的片斷，及將所述的發(fā)育與對(duì)照的發(fā)育進(jìn)行比較。術(shù)語“血管生成調(diào)節(jié)”指物質(zhì)調(diào)節(jié)或改變正常血管片斷的血管生成活性的能力，術(shù)語包括抑制、促進(jìn)、增強(qiáng)血管生成活性。該方法被用于檢驗(yàn)化合物或可能是血管生成抑制劑、促進(jìn)物，或增強(qiáng)物的物質(zhì)。術(shù)語“生物樣品”指一份最終來源于動(dòng)物組織的樣品，其中它是理想地檢測(cè)是否物質(zhì)對(duì)特殊組織和/或動(dòng)物種具有血管生成調(diào)節(jié)活性。優(yōu)選生物樣品來源于人組織。
根據(jù)本發(fā)明用過的干細(xì)胞包括但不限于，臍帶血(CB)干細(xì)胞、胎盤干細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞(ES)、胚胎樣干細(xì)胞、滋養(yǎng)層干細(xì)胞、祖細(xì)胞、和多潛能、多能和全能細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，非胚胎多能干細(xì)胞可被用于通過具有潛在血管生成調(diào)節(jié)活性的檢驗(yàn)化合物得到篩選的對(duì)照和培養(yǎng)物。
本發(fā)明也包含鑒定血管形成或血管生成的調(diào)節(jié)劑，其中血管來源于培養(yǎng)的血管環(huán)，也就是，體外生長(zhǎng)的血管切片。根據(jù)發(fā)明的該方面，血管環(huán)段，優(yōu)選從臍帶中獲得，是在適宜血管突起的條件下培養(yǎng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，從人臍帶切下近似直徑1-2mm和長(zhǎng)度1-2cm的血管。優(yōu)選地，在出生12至24小時(shí)里即完成這樣的切除。動(dòng)脈和靜脈都單獨(dú)地被采集和被培養(yǎng)。血管被放置在培養(yǎng)基中，例如含2.5μg/ml兩性霉素B的DMEM，和切成1-2mm長(zhǎng)度的部分。血管斷片優(yōu)選無殘余的凝血塊和在使用前浸泡在培養(yǎng)基中。最好在外科顯微鏡的輔助下完成血管的解剖和切片。也可以采用小靜脈或動(dòng)脈血管源。優(yōu)選地，對(duì)于每個(gè)實(shí)驗(yàn)，采用僅僅來源于一個(gè)血管的血管斷片。
在有蓋培養(yǎng)皿或多孔培養(yǎng)板中完成血管突起的檢測(cè)(Costar，Cambridge，Mass.)。優(yōu)選以來形成基質(zhì)的0.1％白明膠(Sigma，St.Louis，MO)或Matrigel預(yù)包埋的培養(yǎng)皿。包埋之后，用培養(yǎng)基包埋培養(yǎng)皿。作為本發(fā)明的一個(gè)典型地實(shí)施方案，在包埋平板后，在每個(gè)培養(yǎng)皿/孔中加入含50μl人臍帶血漿的5ml DMEM來在基質(zhì)上形成表面膜。在除去基質(zhì)并每皿/孔中留置一層薄膜之后，可將膜在37℃放置90分鐘。一旦完成了培養(yǎng)皿的準(zhǔn)備，就可以在培養(yǎng)皿中放置血管環(huán)段。
通常在12小時(shí)內(nèi)血管環(huán)段粘附在基質(zhì)材料上，讓培養(yǎng)基的條件不要由于浮力而分離血管切片。粘附之后，37℃下將血管在潮濕的環(huán)境中培養(yǎng)7-21天。優(yōu)選地，在定期間隔里改變培養(yǎng)基，例如，72小時(shí)間隔。典型的培養(yǎng)條件包括在補(bǔ)充了20％人臍帶血漿、L-谷氨酰胺、青霉素/鏈霉素和肝素的DMEM中維持培養(yǎng)。優(yōu)選地，培養(yǎng)基可進(jìn)一步補(bǔ)充了氫化可的松、表皮生長(zhǎng)因子和/或牛腦提取物。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，充分培養(yǎng)血管片斷一段時(shí)間來形成在被給藥的物質(zhì)之前的有效血管生成應(yīng)答。然后優(yōu)選量化和記錄應(yīng)答的范圍。
在確定所有的血管生成調(diào)節(jié)的培養(yǎng)期間，檢驗(yàn)化合物得到給藥。檢驗(yàn)化合物可隨培養(yǎng)基的改變而給藥，或者可在培養(yǎng)的任何時(shí)間內(nèi)單獨(dú)被加入。優(yōu)選地，一旦干細(xì)胞或血管環(huán)是粘附時(shí)，和培養(yǎng)持續(xù)完整的7-2 天時(shí)，即加入檢驗(yàn)化合物。然而，可在其他時(shí)間加入檢驗(yàn)化合物。例如，在檢驗(yàn)化合物單獨(dú)的給藥，可以允許在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多天里將血管突起放入培養(yǎng)基中。每個(gè)檢驗(yàn)化合物在能生成劑量應(yīng)答分析的不同濃度下得到評(píng)價(jià)。規(guī)定陽性對(duì)照為，例如，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)補(bǔ)充物(ECGS；200μ/ml；Collaborative Research，Bedford，MA)的應(yīng)答(例如，微血管突起)，規(guī)定陰性對(duì)照為，例如，只對(duì)培養(yǎng)基的應(yīng)答。當(dāng)與如下表所示的陽性和陰性對(duì)照進(jìn)行的定量比較時(shí)記下血管突起，和當(dāng)來自血管環(huán)的血管萌芽發(fā)育微米的最大長(zhǎng)度和血管環(huán)(VRA)的內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋(ECA)/區(qū)域的總面積時(shí)記下形態(tài)測(cè)量的血管突起。
在本發(fā)明的另一個(gè)篩選檢測(cè)的實(shí)施方案中，將從臍帶動(dòng)脈獲得的一小段人臍帶血管環(huán)用一種溶液包埋，如添加了人膠原蛋白的MATRIGEL，以及在優(yōu)化的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，優(yōu)選含生長(zhǎng)因子的無血清培養(yǎng)基。可以培養(yǎng)臍帶血管環(huán)一至四周，最好為3周，或者直到微管從血管環(huán)發(fā)育的時(shí)間。作為抑制或增強(qiáng)血管生成能力的表示，檢驗(yàn)化合物因它們抑制或增強(qiáng)微管發(fā)育的能力而得到檢測(cè)。
在以上兩個(gè)方法的組合中，如上獲得和鋪平板血管，和在也是如上獲得的干細(xì)胞存在下培養(yǎng)血管。將血管環(huán)和干細(xì)胞共培養(yǎng)7-21天，在此期間測(cè)定血管突起的長(zhǎng)度。這里，可以使用讓內(nèi)皮細(xì)胞和其他細(xì)胞發(fā)育的任何培養(yǎng)基?？梢灶A(yù)計(jì)添加的干細(xì)胞將導(dǎo)致這些細(xì)胞分化成將促進(jìn)血管發(fā)育的細(xì)胞型，這樣比其他檢測(cè)方法更接近重建的血管自然環(huán)境。如上在培養(yǎng)的一開始，或者在培養(yǎng)中的任何時(shí)候，可添加檢驗(yàn)和/或?qū)φ栈衔锏脚囵B(yǎng)基中。
這樣，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種測(cè)定物質(zhì)的調(diào)節(jié)(也就是，阻止或刺激)新血管組織發(fā)育和/或誘導(dǎo)新血管組織退化的能力，包括連同血管切片、生理凝膠和允許新血管發(fā)育一段時(shí)間的合適的營養(yǎng)物來培養(yǎng)非胚胎多能干細(xì)胞，將待測(cè)物給藥所述片段，和連同合適的營養(yǎng)物培養(yǎng)所述的片段一段時(shí)間，然后檢測(cè)所述的片段來判斷是否出現(xiàn)了抑制新血管組織發(fā)育和/或新血管組織的退化。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，將所述干細(xì)胞或血管環(huán)與腫瘤細(xì)胞，特別是有轉(zhuǎn)移性癌起源的細(xì)胞共培養(yǎng)。由于一些轉(zhuǎn)移性的或擴(kuò)張性的癌有血管源成分(即，促進(jìn)血管生成的腫瘤分泌因子)，這樣的共培養(yǎng)將重建腫瘤的自然環(huán)境。用于這樣的共培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞可以是從個(gè)體中直接獲得的腫瘤細(xì)胞、從個(gè)體中獲得并保藏的細(xì)胞、或本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任意數(shù)量的永生化腫瘤細(xì)胞系。這樣的腫瘤細(xì)胞系包括，例如，HTβ-104或CRL-1973細(xì)胞(睪丸腫瘤細(xì)胞；來自于美國典型培養(yǎng)物保藏中心的)；或BT483、Hs578T、HTB2、BT20或T47D細(xì)胞(乳癌細(xì)胞系)。也可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的其他癌細(xì)胞系。
培養(yǎng)血管環(huán)和/或干細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞的基質(zhì)性質(zhì)對(duì)于成功的血管生成十分重要。所以，發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案是將這些組織和細(xì)胞置于已被用來創(chuàng)造成長(zhǎng)基質(zhì)的生理凝膠預(yù)處理的平板或皿中培養(yǎng)。優(yōu)選地，成長(zhǎng)基質(zhì)包括非變形人膠原蛋白。在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，生理凝膠是血纖蛋白、膠原蛋白或MATRIGEL。更優(yōu)選地該凝膠是血纖蛋白。
可以通過該方法篩選被疑有血管生成調(diào)節(jié)活性的任何物質(zhì)或物質(zhì)組合。其包括了預(yù)純化的化合物和各種例如植物或動(dòng)物組織提取物或可來自微生物的提取物。因此，這些物質(zhì)不得不以合適的類型來給藥于非胚胎多能干細(xì)胞。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉各種將這樣的物質(zhì)用于給藥的合適類型的方法。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，當(dāng)用該方法檢驗(yàn)有血管生成增強(qiáng)作用的化合物時(shí)，培養(yǎng)基基本上無血清以至于所有的血清不存在，及培養(yǎng)基不含血清成分，或者不含來自于血清的最低成分，或是血管生成必要的其他來源的最低成分。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，將該物質(zhì)給藥后，將非胚胎多能干細(xì)胞培養(yǎng)一段充足的時(shí)間來清除新血管發(fā)育的阻止和/或退化，比方說，例如，將該物質(zhì)給藥后7-17天。然后將新血管發(fā)育的狀態(tài)與記錄的應(yīng)答和優(yōu)選對(duì)照進(jìn)行比較。
5.1.2血管生成的鑒定根據(jù)本發(fā)明，使用本領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，例如免疫細(xì)胞化學(xué)，可通過鑒定細(xì)胞表面標(biāo)記來測(cè)定血管生成。根據(jù)發(fā)明的該方面，使用免疫組織化學(xué)可測(cè)定顯示可探測(cè)的血管生成應(yīng)答(也就是，新血管的發(fā)育)的樣品?？墒褂冒▎慰寺⌒∈罂谷艘蜃覸III相關(guān)抗原(Dako，Denmark)、抗人內(nèi)皮細(xì)胞mAb(Gibco，Grand Island，N.Y.)和在John Curtin醫(yī)學(xué)研究學(xué)院制備的CD31特異性mAb(克隆20G5)在內(nèi)的抗體樣品。可對(duì)血管生成樣品進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色法來檢測(cè)因子VIII相關(guān)抗原，和清楚地顯示衍生物是血管的反應(yīng)。血管也和人內(nèi)皮細(xì)胞的特異性mAb(Gibco)反應(yīng)，及和對(duì)CD31的mAb、僅在內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)的抗原、血小板和一些白細(xì)胞反應(yīng)。也可在電子顯微鏡下進(jìn)行血管生成樣品的檢測(cè)，來揭示有典型內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)的細(xì)胞。
在培養(yǎng)7至21天后，確定血管生成的量并與對(duì)照培養(yǎng)比較。至于假定的抗血管生成物質(zhì)，與對(duì)照培養(yǎng)比較來確定血管減少的生長(zhǎng)。發(fā)明也包括通過添加檢驗(yàn)物質(zhì)來建立血管生成應(yīng)答(在7-21天培養(yǎng)之后)和下一個(gè)7-14天里用顯微鏡監(jiān)控血管“枯萎”，來測(cè)定檢驗(yàn)化合物誘導(dǎo)最近形成的血管衰退的能力。
在確定的實(shí)施方案中，可通過鑒定分化表達(dá)基因來鑒別血管形成(例如，鑒定來自未分化的目標(biāo)祖細(xì)胞的基因庫對(duì)來自衍生于祖細(xì)胞的分化細(xì)胞的基因庫)。例如，可使用如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)或堿基轉(zhuǎn)錄擴(kuò)增方法(例如，體外轉(zhuǎn)錄(IVT))的核酸擴(kuò)增方法來在不同細(xì)胞群落中的差異基因表達(dá)，例如，使用多核苷酸微陣列。這些差異分化基因表達(dá)的方法是本領(lǐng)域眾所周知(參見例如Wieland等，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872720-2724；Lisityn等，1993，Science259946-951；Lisityn等，1995，Meth.Enzymology 254291-304；美國專利5,436,142；美國專利5,501,964；Lisityn等，1994，NatureGenetics 657-63；Hubank和Schatz，1994，Nucleic AcidsResearch 225640-5648；Zeng等，1994，Nucleic Acids Research224381-4385；美國專利5,525,471；Lisityn等，美國專利6,271,002，“RNA擴(kuò)增方法”2001年8月1日公布；Van Gelder等，美國專利5,716,785，“使用啟動(dòng)子的遺傳操作過程，”1998年2月10日公布；Stoflet等，1988，Science 239491-494，1988；Sarkar和Sommer，1980，Science 244331-334；Mullis等，美國專利4,683,195；Malek等，美國專利5,130,238；Kacian和Fultz，美國專利5,399,491；Burg等，美國專利5,437,990；Van Gelder等，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 871663Lockhart等，1996，Nature Biotechnol.14，1675；Shannon，美國專利6,132,99；Lindemann等，美國專利6,235,503，“消減雜交和分析差異的程序”，2001年5月22日公開)。
基因譜可利用商業(yè)化試劑盒，例如，標(biāo)有PROFILETM系列的試劑盒(Qbiogene，Carlsbad，CA)，其使用了凝膠為基礎(chǔ)的差異基因表達(dá)方法。該試劑盒利用了限制型酶切片段差異顯示-PCR(RFDD-PCR)可用于基因差異在真核細(xì)胞中比較基因表達(dá)模式。也可以使用PCR選擇消減試劑盒(Clontech)和PCR選擇差異篩選試劑盒(Clontech)，其可在消減文庫中鑒定差異表達(dá)克隆。在用PCR選擇消減試劑盒來生成差異表達(dá)基因庫后，使用PCR選擇差異篩選試劑盒。將消減文庫和從測(cè)試子和驅(qū)趕子群體中直接合成的探針雜交，探針用消減cDNA制成，和探針用反向消減cDNA(第二次消減反向完成)制成。差異表達(dá)與測(cè)試子而不是驅(qū)趕子探針雜交的克?。蝗欢?，非消減探針對(duì)于檢測(cè)微弱信息不足夠靈敏。通過差異表達(dá)cDNA可富集消減探針，但會(huì)給出錯(cuò)誤的陽性結(jié)果。根據(jù)制造商的說明書使用消減和非消減探針鑒定差異表達(dá)基因。
5.2發(fā)明的化合物可用于篩選血管生成調(diào)節(jié)的檢驗(yàn)化合物的實(shí)施例包括但不限于，小分子、有機(jī)化合物、無機(jī)化合物、多肽、肽、蛋白質(zhì)、激素、細(xì)胞因子、寡核苷酸、核酸或其他大分子。
如此處所用的術(shù)語“化合物”描述任意的分子，例如，蛋白質(zhì)或非蛋白質(zhì)有機(jī)藥物。通常，將多個(gè)測(cè)定混合物與不同化合物濃度比較，以獲得對(duì)各種濃度的差異應(yīng)答。一般地，這些濃度中一個(gè)作為陰性對(duì)照，也就是零濃度或低于檢測(cè)水平的濃度。
候選化合物包含眾多的化學(xué)類別，盡管一般地它們是有機(jī)分子，優(yōu)選具有分子量超過50并不低于約2,500道爾頓的小有機(jī)化合物。候選化合物包括與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)相互作用的必需化學(xué)官能團(tuán)，特別是氫鍵結(jié)合，和一般地至少包括胺、羰基、羥基或羧基，優(yōu)選至少兩個(gè)化學(xué)官能團(tuán)。候選化合物經(jīng)常在被一個(gè)或多個(gè)上述官能團(tuán)取代的雜環(huán)結(jié)構(gòu)和/或芳環(huán)或多芳環(huán)結(jié)構(gòu)中包含環(huán)碳。也在生物分子，包括但不限于肽、糖類、脂肪酸、類固醇、嘌呤、嘧啶、衍生物、結(jié)構(gòu)類似物或及其組合中發(fā)現(xiàn)了候選化合物。
從包括合成文庫或天然化合物在內(nèi)的各種來源中獲得候選調(diào)節(jié)化合物。例如，對(duì)于隨機(jī)和直接合成各種的有機(jī)化合物和生物分子，包括隨機(jī)表達(dá)寡核苷酸和寡肽，的許多方法是有效的?？蛇x擇地，在細(xì)菌、真菌、植物和動(dòng)物提取物的類型中的天然化合物文庫是有效的或容易合成的。此外，通過常規(guī)的化學(xué)、物理和生物方法容易調(diào)節(jié)天然或合成生成的文庫和化合物，和其可用于生成組合文庫。已知的藥理學(xué)試劑可受到直接或隨機(jī)化學(xué)調(diào)節(jié)，例如?；⑼榛?、酯化、酰胺化等， 來生成結(jié)構(gòu)類似體?？墒褂煤侠淼乃幬镌O(shè)計(jì)或計(jì)算機(jī)模擬來開發(fā)新的潛在治療試劑?？蓪?duì)已知的藥理學(xué)活性化合物及其化學(xué)類似體，或?qū)哂欣缤ㄟ^合理的藥物設(shè)計(jì)開發(fā)的藥物的未知性質(zhì)的新化合物進(jìn)行直接篩選。
5.2.1TNF-α抑制劑當(dāng)調(diào)節(jié)血管生成和/或血管形成時(shí)，在這里使用其他地方公開的檢測(cè)方法，可鑒定一類化合物的成員；特別地，這些化合物是抗血管生成的化合物；更特別地，這些化合物包括ImiDsTM(CelgeneCorporation)。如此處所用的和除非另外指明，此處用及的術(shù)語“抗血管生成化合物”或“ImiDsTM”包含顯著地抑制TNF-α的、和具有抗血管生成活性的有機(jī)小分子；即，它們起作用抑制新血管的形成。具體地，本發(fā)明的抗血管生成化合物增強(qiáng)TNF-αmRNA的降解。這類包括外消旋的、富立體異構(gòu)體的或純立體異構(gòu)體的和可藥用的鹽、溶劑化物、水合物、立體異構(gòu)體、包合物、和這些抗血管生成化合物的前藥。在發(fā)明中用到的優(yōu)選的化合物是具有分子量小于約1000g/mol的有機(jī)小分子，不是蛋白質(zhì)、肽、寡核苷酸、寡糖或其他大分子。以下討論本發(fā)明的具體化合物。從Celgene(Warren，NJ)商業(yè)上獲得這些化合物，或者根據(jù)在這里列出的專利或出版物中描述的方法可制備這些化合物。
本發(fā)明的抗血管生成化合物的具體實(shí)例，包括但不限于，取代的苯乙烯的氰基和羧基衍生物，例如在美國專利5,929,117中公開的那些；1-氧代-2-(2，6-二氧代-3-氟哌啶-3-基)異吲哚啉化合物和1，3-二氧代-2-(2，6-二氧代-3-氟哌啶-3-基)異吲哚啉化合物，例如在美國專利5,874,448中描述的那些；四取代的2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代異吲哚啉化合物，例如在美國專利5,798,368中描述的那些；1-氧代和1，3-二氧代-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)異吲哚啉化合物(例如沙利度胺的4-甲基衍生物和EM-12)，包括但不限于在美國專利5,635,517中公開的那些；和在美國專利5,698,579和5,877,200中公開的一類非多肽環(huán)酰胺化合物。所有專利分別在此引用作為參考。然而，本發(fā)明的抗血管生成化合物不包括沙利度胺。
本發(fā)明其他具體的抗血管生成化合物包括但不限于，如在此結(jié)合引用的美國專利5,635,517所描述的在苯并環(huán)中被氨基或取代的氨基取代的1-氧代和1，3-二氧代-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)異吲哚啉化合物。這些化合物具有結(jié)構(gòu)I 其中X和Y當(dāng)中有一個(gè)是C＝O，X和Y當(dāng)中另一個(gè)是C＝O或CH2，R2是氫或低級(jí)烷基，特別是甲基。具體的抗血管生成化合物包括但不限于1-氧代-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-4-氨基異吲哚啉；1-氧代-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-5-氨基異吲哚啉；1-氧代-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-6-氨基異吲哚啉；1-氧代-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-7-氨基異吲哚啉；1，3-二氧代-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-4-氨基異吲哚啉；和1，3-二氧代-2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-5-氨基異吲哚啉。
本發(fā)明其他具體的抗血管生成化合物屬于一類取代的2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)鄰苯二甲酰亞胺化合物和取代的2-(2，6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代異吲哚化合物，例如在美國專利6,281,230；6,316,471；6,335,349；和6,476,052，和國際專利申請(qǐng)PCT/US97/13375(國際公開專利WO98/03502)中描述的那些，每篇在此進(jìn)行引用。這類典型的化合物具有以下通式 其中R1是氫或甲基。在一個(gè)單獨(dú)的實(shí)施方案中，本發(fā)明包括這些化合物的對(duì)映體純的形式(例如旋光純的(R)或(S)對(duì)映體)的用途。
發(fā)明的其他具體抗血管生成化合物屬于在美國專利申請(qǐng)10/032,286和09/972,487，和國際專利申請(qǐng)PCT/US01/50401(國際公開專利WO02/059106)中公開的一類異吲哚酰亞胺化合物，本文引用每一篇作為參考。典型的化合物具有以下通式II 及其可藥用鹽、水合物、溶劑化物、包合物、對(duì)映體、非對(duì)映體、外消旋體和立體異構(gòu)體混合物，其中X和Y當(dāng)中有一個(gè)是C＝O，另一個(gè)是CH2或C＝O；R1是H、(C1-C8)烷基、(C3-C7)環(huán)烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、芐基、芳基、(C0-C4)烷基-(C1-C6)雜環(huán)烷基、(C0-C4)烷基-(C2-C5)雜芳基、C(O)R3、C(S)R3、C(O)OR4、(C1-C8)烷基-N(R6)2、(C1-C8)烷基-OR5、(C1-C8)烷基-C(O)OR5、C(O)NHR3、C(S)NHR3、C(O)NR3R3’、C(S)NR3R3’或(C1-C8)烷基-O(CO)R5；R2是H、F、芐基、(C1-C8)烷基、(C2-C8)烯基或(C2-C8)炔基；R3和R3’獨(dú)立地為(C1-C8)烷基、(C3-C7)環(huán)烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、芐基、芳基、(C0-C4)烷基-(C1-C6)雜環(huán)烷基、(C0-C4)烷基-(C2-C5)雜芳基、(C0-C8)烷基-N(R6)2、(C1-C8)烷基-OR5、(C1-C8)烷基-C(O)OR5、(C1-C8)烷基-O(CO)R5或C(O)OR5；R4是(C1-C8)烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、(C1-C4)烷基-OR5、芐基、芳基、(C0-C4)烷基-(C1-C6)雜環(huán)烷基或(C0-C4)烷基-(C2-C5)雜芳基；R5是(C1-C8)烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、芐基、芳基或(C2-C5)雜芳基；R6在每次出現(xiàn)時(shí)獨(dú)立地為H、(C1-C8)烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、芐基、芳基、(C2-C5)雜芳基或(C0-C8)烷基-C(O)O-R5，或者R6可以連接以形成雜環(huán)烷基；n是0或1；且*代表手性碳中心。
在具體的式II化合物中，當(dāng)n是0時(shí)，則R1是(C3-C7)環(huán)烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、芐基、芳基、(C0-C4)烷基-(C1-C6)雜環(huán)烷基、(C0-C4)烷基-(C2-C5)雜芳基、C(O)R3、C(O)OR4、(C1-C8)烷基-N(R6)2、(C1-C8)烷基-OR5、(C1-C8)烷基-C(O)OR5、C(S)NHR3或(C1-C8)烷基-O(CO)R5；R2是H或(C1-C8)烷基；且R3是(C1-C8)烷基、(C3-C7)環(huán)烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、芐基、芳基、(C0-C4)烷基-(C1-C6)雜環(huán)烷基、(C0-C4)烷基-(C2-C5)雜芳基、(C5-C8)烷基-N(R6)2；(C0-C8)烷基-NH-C(O)O-R5；(C1-C8)烷基-OR5、(C1-C8)烷基-C(O)OR5、(C1-C8)烷基-O(CO)R5或C(O)OR5；且其他變量具有與上相同的定義。
在其它具體的式II化合物中，R2是H或(C1-C4)烷基。
在其它具體的式II化合物中，R1是(C1-C8)烷基或芐基。
在其它具體的式II化合物中，R1是H、(C1-C8)烷基、芐基、CH2OCH3、CH2CH2OCH3或 在式II化合物的另一個(gè)實(shí)施方案中，R1是 或 其中Q是O或S，且R7在每次出現(xiàn)時(shí)獨(dú)立地為H、(C1-C8)烷基、芐基、CH2OCH3或CH2CH2OCH3。
在其它具體的式II化合物中，R1是C(O)R3。
在其它具體的式II化合物中，R3是(C0-C4)烷基-(C2-C5)雜芳基、(C1-C8)烷基、芳基或(C0-C4)烷基-OR5。
在其它具體的式II化合物中，雜芳基是吡啶基、呋喃基或噻吩基。
在其它具體的式II化合物中，R1是C(O)OR4。
在其它具體的式II化合物中，可用(C1-C4)烷基、芳基或芐基取代C(O)NHC(O)的H。
本發(fā)明的其他具體抗血管生成化合物屬于在美國專利申請(qǐng)09/781,179、國際公開專利WO98/54170和美國專利6,395,754中公開的一類異吲哚酰亞胺化合物，本文引用每一篇作為參考。典型的化合物具有以下通式III 及其可藥用鹽、水合物、溶劑化物、包合物、對(duì)映體、非對(duì)映體、外消旋體和立體異構(gòu)體混合物，其中X和Y當(dāng)中有一個(gè)是C＝O，且另一個(gè)是CH2或C＝O；R是H或CH2OCOR9；(i)每個(gè)R1、R2、R3或R4彼此獨(dú)立地為鹵素、具有1-4個(gè)碳原子的烷基或具有1-4個(gè)碳原子的烷氧基；或(ii)R1、R2、R3或R4當(dāng)中有一個(gè)是硝基或-NHR5，其余R1、R2、R3或R4是氫；R5是氫或具有1-8個(gè)碳的烷基；R6是氫、具有1-8個(gè)碳原子的烷基、芐基(benzo)、氯或氟；R’是R7-CHR10-N(R8R9)；R7是間亞苯基或?qū)啽交?(CnH2n)-，其中n具有0-4的值；每個(gè)R8和R9彼此獨(dú)立地為氫或具有1-8個(gè)碳原子的烷基，或者R8和R9一起是四亞甲基、五亞甲基、六亞甲基或-CH2CH2[X]X1CH2CH2-，其中[X]X1是-O-、-S-或-NH-；R10是氫、具有1-8個(gè)碳原子的烷基或苯基；且*代表手性碳中心。
本發(fā)明的最優(yōu)選的抗血管生成化合物是4-(氨基)-2-(2，6-二氧代-(3-哌啶基))異吲哚啉-1，3-二酮和3-(4-氨基-1-氧代-1，3-二氫-異吲哚-2-基)-哌啶-2，6-二酮。這些化合物可通過標(biāo)準(zhǔn)合成方法制得(例如參見美國專利5,635,517，在此引用作為參考)。這些化合物可從Celgene Corporation，Warren，NJ獲得。4-(氨基)-2-(2，6-二氧代-(3-哌啶基))-異吲哚啉-1，3-二酮(ACTIMIDTM)具有下面的化學(xué)結(jié)構(gòu) 3-(4-氨基-1-氧代-1，3-二氫-異吲哚-2-基)-哌啶-2，6-二酮(REVIMIDTM)有如下的化學(xué)結(jié)構(gòu) 可通過本領(lǐng)域公知的方法制備以上其他化合物，包括全部在此引用作為參考的在以上引用的專利中公開的那些。
顯然地，本發(fā)明最優(yōu)選的化合物是沙立度胺、氨基沙立度胺和3-(4-氨基-1-氧代-1，3-二氫-異吲哚基-2-基)-哌啶-2，6-二酮。
使用本領(lǐng)域公知的方法可檢測(cè)本發(fā)明中能調(diào)節(jié)TNF-α生成的化合物，例如，在“異吲哚-酰亞胺化合物、組合物，及其用途”(美國專利申請(qǐng)?zhí)朥S2003045552，2003年3月6日公布，Robarge等)中公開的檢測(cè)方法，在此全部引用作為參考。
此處所用的和除非另外指明，術(shù)語“純立體異構(gòu)體地”指包括化合物的一種立體異構(gòu)體和基本上無該化合物的其他立體異構(gòu)體。例如，具有一個(gè)手性中心的的化合物的純立體異構(gòu)體成分基本上沒有該化合物的相反對(duì)映體。具有兩個(gè)手性中心的化合物的純立體異構(gòu)體成分基本上沒有該化合物的其他非對(duì)映體。此處所用的和除非另外指明，術(shù)語“純對(duì)映體地”指具有一個(gè)手性中心的化合物的純立體異構(gòu)體成分。此處所用的和除非另外指明，術(shù)語“富立體異構(gòu)體地”指包括比化合物的一種立體異構(gòu)體的大了約60％重量的成分，優(yōu)選大了約70％重量，更優(yōu)選比化合物的一種立體異構(gòu)體的大了約80％重量。此處所用的，術(shù)語“純對(duì)映體地”指具有一個(gè)手性中心的化合物的純對(duì)映體成分。同樣地，術(shù)語“富對(duì)映體地”指具有一個(gè)手性中心的化合物的富對(duì)映體成分。
5.2.2PDE IV抑制劑另一類預(yù)期具有抗血管生成活性的化合物稱為PDE IV抑制劑。PDEIV抑制劑，像ImiDs，有TNF-α抑制活性。發(fā)明中用到的優(yōu)選的化合物是公知的Celgene公司的選擇性細(xì)胞因子抑制藥物(SelCIDsTM)。也可以測(cè)定這類化合物成員的血管生成調(diào)節(jié)活性。
此處用到的和除非另外指明，發(fā)明用到的術(shù)語“ SelCIDsTM”包含小分子藥物，例如，不是肽、蛋白質(zhì)、核酸、寡糖或其他大分子的有機(jī)小分子。優(yōu)選抑制TNF-α生成的化合物。進(jìn)一步，該化合物對(duì)LPS誘導(dǎo)IL1β和IL12也可具有適度的抑制效果。
更優(yōu)選的，本發(fā)明的化合物是有效的PDE IV抑制劑。PDE IV是一種在人脊髓和淋巴血統(tǒng)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的磷酸二酯酶同工酶。該酶在通過降解普遍存在的第二信使cAMP和維持其在細(xì)胞內(nèi)的低水平來調(diào)整細(xì)胞活性中起關(guān)鍵性的作用。
選擇性細(xì)胞因子抑制藥物的特別實(shí)例包括但不限于，在美國專利號(hào)5,605,914中公開的環(huán)酰亞胺類；分別在美國專利號(hào)5,728,844和5,728,845中公開的環(huán)烷基酰胺類和環(huán)烷基腈類；美國專利號(hào)5,801,195和5,736,570中的芳基酰胺類(例如一個(gè)實(shí)施方案是N-苯甲酰基-3-氨基-(3’，4’-二甲氧基苯基)-丙酰胺)；在美國專利號(hào)5,703,098中公開的酰亞胺/酰胺醚和醇類(例如3-鄰苯二甲酰亞氨基-3-(3’，4’-二甲氧基苯基)丙-1-醇)；在美國專利號(hào)5,658,940中公開的琥珀酰亞胺和馬來酰亞胺類(例如3-(3’，4’，5’6’-四氫鄰苯二甲酰亞氨基)-3-(3”，4”-二甲氧基苯基)丙酸甲酯)；在WO99/06041中公開的酰亞氨基和酰氨基取代的鏈烷羥肟酸和在美國專利號(hào)6,020,358中公開的取代的苯乙基砜類；和在美國專利號(hào)6,046,221中描述的芳基酰胺類，例如N-苯甲?；?3-氨基-3-(3’，4’-二甲氧基苯基)丙酰胺。分別在此引用所有專利和專利申請(qǐng)作為參考。
此外選擇性細(xì)胞因子抑制藥物屬于合成的化合物，其一般的實(shí)施方案包括3-(1，3-二氧代苯并[f]異吲哚-2-基)-3-(3-環(huán)戊氧基-4-甲氧基苯基)丙酰胺和3-(1，3-二氧代-4-氮雜異吲哚-2-基)-3-(3，4-二甲氧基苯基)-丙酰胺。
其他具體的選擇性細(xì)胞因子抑制藥物屬于在美國專利號(hào)5,698,579和5,877,200中公開的一類非多肽環(huán)酰胺，在此引用二者作為參考。代表性環(huán)酰胺包括下式的化合物 其中n具有1、2或3的值；R5是鄰亞苯基，所述亞苯基未取代或被1-4個(gè)取代基取代，所述取代基各自獨(dú)立地選自硝基、氰基、三氟甲基、乙氧羰基、甲氧羰基、丙氧羰基、乙?；?、氨基甲?；?、乙酰氧基、羧基、羥基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、酰氨基、具有1-10個(gè)碳原子的烷基、具有1-10個(gè)碳原子的烷基和鹵素；R7是(i)苯基或被一個(gè)或多個(gè)取代基取代的苯基，所述取代基各自獨(dú)立地選自硝基、氰基、三氟甲基、乙氧羰基、甲氧羰基、丙氧羰基、乙酰基、氨基甲酰基、乙酰氧基、羧基、羥基、氨基、具有1-10個(gè)碳原子的烷基、具有1-10個(gè)碳原子的烷氧基和鹵素，(ii)未取代或被1-3個(gè)取代基取代的芐基，所述取代基選自硝基、氰基、三氟甲基、乙氧羰基、甲氧羰基、丙氧羰基、乙?；?、氨基甲酰基、乙酰氧基、羧基、羥基、氨基、具有1-10個(gè)碳原子的烷基、具有1-10個(gè)碳原子的烷基和鹵素，(iii)萘基，和(iv)芐氧基；R12是-OH、具有1-12個(gè)碳原子的烷氧基，或
R8是氫或具有1-10個(gè)碳原子的烷基；且R9是氫、具有1-10個(gè)碳原子的烷基、-COR10或-SO2R10，其中R10是氫、具有1-10個(gè)碳原子的烷基或苯基。
這類具體的化合物包括但不限于3-苯基-2-(1-氧代異吲哚啉-2-基)丙酸；3-苯基-2-(1-氧代異吲哚啉-2-基)丙酰胺；3-苯基-3-(1-氧代異吲哚啉-2-基)丙酸；3-苯基-3-(1-氧代異吲哚啉-2-基)丙酰胺；3-(4-甲氧基苯基)-3-(1-氧代異吲哚啉基)丙酸；3-(4-甲氧基苯基)-3-(1-氧代異吲哚啉基)丙酰胺；3-(3，4-二甲氧基苯基)-3-(1-氧代異吲哚啉-2-基)丙酸；3-(3，4-二甲氧基苯基)-3-(1-氧代-1，3-二氫異吲哚-2-基)-丙酰胺；3-(3，4-二甲氧基苯基)-3-(1-氧代異吲哚啉-2-基)丙酰胺；3-(3，4-二乙氧基苯基)-3-(1-氧代異吲哚啉-2-基)-丙酸；3-(1-氧代異吲哚啉-2-基)-3-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)丙酸甲酯；3-(1-氧代異吲哚啉-2-基)-3-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)丙酸；3-(1-氧代異吲哚啉-2-基)-3-(3-丙氧基-4-甲氧基苯基)丙酸；3-(1-氧代異吲哚啉-2-基)-3-(3-丁氧基-4-甲氧基苯基)丙酸；3-(1-氧代異吲哚啉-2-基)-3-(3-丙氧基-4-甲氧基苯基)丙酰胺；3-(1-氧代異吲哚啉-2-基)-3-(3-丁氧基-4-甲氧基苯基)丙酰胺；3-(1-氧代異吲哚啉-2-基)-3-(3-丁氧基-4-甲氧基苯基)丙酸甲酯；和3-(1-氧代異吲哚啉-2-基)-3-(3-丙氧基-4-甲氧基苯基)丙酸甲酯。
其他特殊的選擇性細(xì)胞因子抑制藥物包括在WO99/06041中公開的酰亞氨基和酰氨基取代的鏈烷羥肟酸，此處引用其作為參考。這樣化合物的實(shí)例包括但不限于
其中每個(gè)R1和R2，當(dāng)相互獨(dú)立地取值時(shí)，是氫、低鏈烷烴，或當(dāng)與各自結(jié)合的所述碳原子一起取值時(shí)，R1和R2為鄰亞烷基、鄰亞萘基或環(huán)己烯-1，2-二基，所述基團(tuán)未被取代或被1-4個(gè)取代基取代，所述取代基獨(dú)立地選自硝基、氰基、三氟甲基、乙氧羰基、甲氧羰基、丙氧羰基、乙酰基、氨基甲?；?、乙酰氧基、羧基、羥基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、酰氨基、具有1-10個(gè)碳原子的烷基、具有1-10個(gè)碳原子的烷氧基和鹵素；R3為被1-4個(gè)取代基取代的苯基，所述取代基選自硝基、氰基、三氟甲基、乙氧羰基、甲氧羰基、丙氧羰基、乙?；?、氨基甲?；⒁阴Ｑ趸?、羧基、羥基、氨基、具有1-10個(gè)碳原子的烷基、具有1-10個(gè)碳原子的烷氧基、具有1-10個(gè)碳原子的烷硫基、芐氧基、具有3-6個(gè)碳原子的環(huán)烷氧基、C4-C6亞環(huán)烷基甲基、C3-C10亞烷基甲基、茚滿氧基和鹵素；R4為氫、具有1-6個(gè)碳原子的烷基、苯基或芐基；R4’為氫或具有1-6個(gè)碳原子的烷基；R5為-CH2-、-CH2-CO-、-SO2-、-S-或-NHCO-；n具有0、1或2的值；并且包含能夠被質(zhì)子化的氮原子的所述化合物的酸加成鹽。
用于本發(fā)明的另外的具體的選擇性細(xì)胞因子抑制藥物包括，但不限于3-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-N-羥基-3-(1-氧代異吲哚啉基)丙酰胺；3-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-N-甲氧基-3-(1-氧代異吲哚啉基)丙酰胺；N-芐氧基-3-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-3-鄰苯二甲酰亞氨基丙酰胺；N-芐氧基-3-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-3-(3-硝基鄰苯二甲酰亞氨基)丙酰胺；N-芐氧基-3-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-3-(1-氧代異吲哚啉基)丙酰胺；3-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-N-羥基-3-鄰苯二甲酰亞氨基丙酰胺；N-羥基-3-(3，4-二甲氧基苯基)-3-鄰苯二甲酰亞氨基丙酰胺；3-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-N-羥基-3-(3-硝基鄰苯二甲酰亞氨基)丙酰胺；N-羥基-3-(3，4-二甲氧基苯基)-3-(1-氧代異吲哚啉基)丙酰胺；3-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-N-羥基-3-(4-甲基-鄰苯二甲酰亞氨基)丙酰胺；3-(3-環(huán)戊氧基-4-甲氧基苯基)-N-羥基-3-鄰苯二甲酰亞氨基丙酰胺；3-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-N-羥基-3-(1，3-二氧代-2，3-二氫-1H-苯并[f]異吲哚-2-基)丙酰胺；N-羥基-3-{3-(2-丙氧基)-4-甲氧基苯基}-3-鄰苯二甲酰亞氨基丙酰胺；3-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-3-(3，6-二氟鄰苯二甲酰亞氨基)-N-羥基丙酰胺；3-(4-氨基鄰苯二甲酰亞氨基)-3-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-N-羥基丙酰胺；3-(3-氨基鄰苯二甲酰亞氨基)-3-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-N-羥基丙酰胺；N-羥基-3-(3，4-二甲氧基苯基)-3-(1-氧代異吲哚啉基)丙酰胺；3-(3-環(huán)戊氧基-4-甲氧基苯基)-N-羥基-3-(1-氧代異吲哚啉基)丙酰胺；和N-芐氧基-3-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-3-(3-硝基鄰苯二甲酰亞氨基)丙酰胺。
用于本發(fā)明的另外的選擇性細(xì)胞因子抑制藥物包括在苯基上被氧代異吲哚啉基取代的苯乙基砜類。這樣的化合物的實(shí)例包括但不限于在為本文所引用的美國專利號(hào)6,020,358中所公開的那些，它們包括下列化合物
其中標(biāo)有*的碳原子構(gòu)成一個(gè)手性中心；Y為C＝O、CH2、SO2或CH2C＝O；每個(gè)R1、R2、R3和R4各自相互獨(dú)立地為氫、鹵素、具有1-4個(gè)碳原子的烷基、具有1-4個(gè)碳原子的烷氧基、硝基、氰基、羥基或-NR8R9；或在相鄰碳原子上的R1、R2、R3和R4當(dāng)中的任意兩個(gè)與所述亞苯基環(huán)一起為亞萘基；每個(gè)R5和R6各自相互獨(dú)立地為氫、具有1-4個(gè)碳原子的烷基、具有1-4個(gè)碳原子的烷氧基、氰基或具有最高達(dá)18個(gè)碳原子的環(huán)烷氧基；R7為羥基、具有1-8個(gè)碳原子的烷基、苯基、芐基或NR8R9；每個(gè)R8和R9各自相互獨(dú)立地為氫、具有1-8個(gè)碳原子的烷基、苯基或芐基，或R8和R9當(dāng)中有一個(gè)是氫，而另一個(gè)為-COR10或-SO2R10，或R8和R9一起是四亞甲基、五亞甲基、六亞甲基或-CH2CH2X1CH2CH2-，其中X1為-O-、-S-或-NH-；且每個(gè)R8′和R9′各自相互獨(dú)立地為氫、具有1-8個(gè)碳原子的烷基、苯基或芐基，或R8′和R9′當(dāng)中有一個(gè)是氫，而另一個(gè)為-COR10′或-SO2R10′，或R8′和R9′一起是四亞甲基、五亞甲基、六亞甲基或-CH2CH2X2CH2CH2-，其中X2為-O-、-S-或-NH-。
應(yīng)當(dāng)理解，在為了方便起見將上面的化合物稱為苯乙基砜類時(shí)，當(dāng)R7為NR8′R9′時(shí)，它們包括磺酰胺類。
這樣的化合物的具體組為其中Y為C＝O或CH2的那些。
這樣的化合物的另一個(gè)具體組為定義如下的那些其中每個(gè)R1、R2、R3和R4各自相互獨(dú)立地為氫、鹵素、甲基、乙基、甲氧基、乙氧基、硝基、羥基或-NR8R9，其中每個(gè)R8和R9相互獨(dú)立地為氫或甲基，或R8和R9當(dāng)中有一個(gè)是氫，而另一個(gè)為-COCH3。
特定的化合物是定義如下的那些其中R1、R2、R3和R4當(dāng)中有一個(gè)是-NH2，而其余R1、R2、R3和R4為氫。
特定的化合物是定義如下的那些其中R1、R2、R3和R4當(dāng)中有一個(gè)是NHCOCH3，而其余R1、R2、R3和R4為氫。
特定的化合物是定義如下的那些其中R1、R2、R3和R4當(dāng)中有一個(gè)是N(CH3)2，而其余R1、R2、R3和R4為氫。
另一組優(yōu)選的這樣的化合物是定義如下的那些其中R1、R2、R3和R4當(dāng)中有一個(gè)是甲基，而其余R1、R2、R3和R4為氫。
特定的化合物是定義如下的那些其中R1、R2、R3和R4當(dāng)中有一個(gè)是氟，而其余R1、R2、R3和R4為氫。
特定的化合物是定義如下的那些其中每個(gè)R5和R6相互獨(dú)立地為氫、甲基、乙基、丙基、甲氧基、乙氧基、丙氧基、環(huán)戊氧基或環(huán)己氧基。
特定的化合物是定義如下的那些其中R5為甲氧基，且R6為單環(huán)烷氧基、多環(huán)烷氧基和苯并環(huán)烷氧基。
特定的化合物是其中R5為甲氧基，且R6為乙氧基的那些。
特定的化合物是定義如下的那些其中R7為羥基、甲基、乙基、苯基、芐基或NR8’R9’，其中每個(gè)R8’和R9’相互獨(dú)立地為氫或甲基。
特定的化合物是其中R7為甲基的那些。
特定的化合物是定義如下的那些其中R7為NR8’R9’，其中每個(gè)R8’和R9’相互獨(dú)立地為氫或甲基。
其它具體的選擇性細(xì)胞因子抑制藥物包括在Muller等人于2002年12月30日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/436,975中記載的氟烷氧基取代的1，3-二氫-異吲哚基化合物，本文引用其全部?jī)?nèi)容作為參考。代表性的氟烷氧基取代的1，3-二氫-異吲哚基化合物包括下式化合物
其中Y為-C(O)-、-CH2、-CH2C(O)-、-C(O)CH2-或SO2；Z是-H、-C(O)R3、-(C0-1-烷基)-SO2-(C1-4-烷基)、-C1-8-烷基、-CH2OH、CH2(O)(C1-8-烷基)或-CN；R1和R2分別獨(dú)立地為-CHF2、-C1-8-烷基、-C3-18-環(huán)烷基或-(C1-10-烷基)(C3-18-環(huán)烷基)，并且R1和R2中至少有一個(gè)是CHF2；R3為-NR4R5、-烷基、-OH、-O-烷基、苯基、芐基、取代的苯基或取代的芐基；R4和R5分別獨(dú)立地為-H、-C1-8-烷基、-OH、-OC(O)R6；R6為-C1-8-烷基、-氨基(C1-8-烷基)、-苯基、-芐基或-芳基；X1、X2、X3和X4分別獨(dú)立地為-H、-鹵素、-硝基、-NH2、-CF3、-C1-6-烷基、-(C0-4-烷基)-(C3-6-環(huán)烷基)、(C0-4-烷基)-NR7R8、(C0-4-烷基)-N(H)C(O)-(R8)、(C0-4-烷基)-N(H)C(O)N(R7R8)、(C0-4-烷基)-N(H)C(O)O(R7R8)、(C0-4-烷基)-OR8、(C0-4-烷基)-咪唑基、(C0-4-烷基)-吡咯基、(C0-4-烷基)-噁二唑基或(C0-4-烷基)-三唑基，或者X1、X2、X3和X4當(dāng)中的兩個(gè)可以連接在一起形成環(huán)烷基或雜環(huán)烷基環(huán)(例如X1和X2、X2和X3、X3和X4、X1和X3、X2和X4或X1和X4可以形成3、4、5、6或7元環(huán)，所述環(huán)可以是芳環(huán)，由此與異吲哚基環(huán)形成雙環(huán)系)；且R7和R8分別獨(dú)立地為H、C1-9-烷基、C3-6-環(huán)烷基、(C1-6-烷基)-(C3-6-環(huán)烷基)、(C1-6-烷基)-N(R7R8)、(C1-6-烷基)-OR8、苯基、芐基或芳基；或其可藥用鹽、溶劑化物、水合物、立體異構(gòu)體、包合物或藥物前體。
優(yōu)選的化合物包括但不限于3-(4-乙?；被?1，3-二氧代-1，3-二氫-異吲哚-2-基)-3-(3-環(huán)丙基甲氧基-4-二氟甲氧基-苯基)-丙酸；3-(4-乙?；被?1，3-二氧代-1，3-二氫-異吲哚-2-基)-3-(3-環(huán)丙基甲氧基-4-二氟甲氧基-苯基)-N，N-二甲基-丙酰胺；3-(4-乙酰基氨基-1，3-二氧代-1，3-二氫-異吲哚-2-基)-3-(3-環(huán)丙基甲氧基-4-二氟甲氧基-苯基)-丙酰胺；3-(3-環(huán)丙基甲氧基-4-二氟甲氧基-苯基)-3-(1，3-二氧代-1，3-二氫-異吲哚-2-基)-丙酸；3-(3-環(huán)丙基甲氧基-4-二氟甲氧基-苯基)-3-(1，3-二氧代-1，3-二氫-異吲哚-2-基)-N-羥基-丙酰胺；
3-(3-環(huán)丙基甲氧基-4-二氟甲氧基-苯基)-3-(7-硝基-1-氧代-1，3-二氫-異吲哚-2-基)-丙酸甲酯；3-(3-環(huán)丙基甲氧基-4-二氟甲氧基-苯基)-3-(7-硝基-1-氧代-1，3-二氫-異吲哚-2-基)-丙酸；3-(3-環(huán)丙基甲氧基-4-二氟甲氧基-苯基)-3-(7-硝基-1-氧代-1，3-二氫-異吲哚-2-基)-N，N-二甲基-丙酰胺；3-(7-氨基-1-氧代-1，3-二氫-異吲哚-2-基)-3-(3-環(huán)丙基甲氧基-4-二氟甲氧基-苯基)-N，N-二甲基-丙酰胺；3-(4-二氟甲氧基-3-乙氧基-苯基)-3-(7-硝基-1-氧代-1，3-二氫-異吲哚-2-基)丙酸甲酯；3-(7-氨基-1-氧代-1，3-二氫-異吲哚-2-基)-3-(4-二氟甲氧基-3-乙氧基-苯基)-丙酸甲酯；3-[7-(環(huán)丙烷羰基-氨基)-1-氧代-1，3-二氫-異吲哚-2-基]-3-(4-二氟甲氧基-3-乙氧基-苯基)-丙酸甲酯；3-(7-乙?；被?1-氧代-1，3-二氫-異吲哚-2-基)-3-(4-二氟甲氧基-3-乙氧基-苯基)-丙酸甲酯；3-(7-乙?；被?1-氧代-1，3-二氫-異吲哚-2-基)-3-(4-二氟甲氧基-3-乙氧基-苯基)-丙酸；3-[7-(環(huán)丙烷羰基-氨基)-1-氧代-1，3-二氫-異吲哚-2-基]-3-(4-二氟甲氧基-3-乙氧基-苯基)-丙酸；環(huán)丙烷甲酸{2-[2-氨基甲酰基-1-(4-二氟甲氧基-3-乙氧基-苯基)-乙基]-3-氧代-2，3-二氫-1H-異吲哚-4-基}-酰胺；環(huán)丙烷甲酸{2-[1-(4-二氟甲氧基-3-乙氧基-苯基)-2-二甲基氨基甲?；?乙基]-3-氧代-2，3-二氫-1H-異吲哚-4-基}-；環(huán)丙烷甲酸{2-[1-(4-二氟甲氧基-3-乙氧基-苯基)-2-羥基氨基甲?；?乙基]-3-氧代-2，3-二氫-1H-異吲哚-4-基}-酰胺；3-(7-乙?；被?1-氧代-1，3-二氫-異吲哚-2-基)-3-(4-二氟甲氧基-3-乙氧基-苯基)-丙酰胺；3-(7-乙酰基氨基-1-氧代-1，3-二氫-異吲哚-2-基)-3-(4-二氟甲氧基-3-乙氧基-苯基)-N，N-二甲基-丙酰胺；3-(7-乙酰基氨基-1-氧代-1，3-二氫-異吲哚-2-基)-3-(4-二氟甲氧基-3-乙氧基-苯基)-N-羥基-丙酰胺；
3-(4-乙?；被?1，3-二氧代-1，3-二氫-異吲哚-2-基)-3-(4-二氟甲氧基-3-乙氧基-苯基)-丙酸；3-(4-乙?；被?1，3-二氧代-1，3-二氫-異吲哚-2-基)-3-(4-二氟甲氧基-3-乙氧基-苯基)-丙酰胺；3-(4-乙?；被?1，3-二氧代-1，3-二氫-異吲哚-2-基)-3-(4-二氟甲氧基-3-乙氧基-苯基)-N，N-二甲基-丙酰胺；3-(4-乙?；被?1，3-二氧代-1，3-二氫-異吲哚-2-基)-3-(4-二氟甲氧基-3-乙氧基-苯基)-N-羥基-丙酰胺；環(huán)丙烷甲酸{2-[1-(4-二氟甲氧基-3-乙氧基-苯基)-2-甲磺?；?乙基]-3-氧代-2，3-二氫-1H-異吲哚-4-基}-酰胺；N-{2-[1-(4-二氟甲氧基-3-乙氧基-苯基)-2-甲磺?；?乙基]-1，3-二氧代-2，3-二氫-1H-異吲哚-4-基)-乙酰胺；和環(huán)丙烷甲酸{2-[2-氨基甲?；?1-(4-二氟甲氧基-3-乙氧基-苯基)-乙基]-7-氯-3-氧代-2，3-二氫-1H-異吲哚-4-基}-酰胺。
其它選擇性的細(xì)胞因子抑制藥物包括在Muller等人于2002年3月12日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/454,155中記載的7-酰氨基取代的異吲哚基化合物，本文引用其全部?jī)?nèi)容作為參考。
代表性的7-酰氨基取代的異吲哚基化合物包括下式化合物 其中Y為-C(O)-、-CH2、-CH2C(O)-或-SO2；X為H，Z為(C0-4-烷基)-C(O)R3、C1-4-烷基、(C0-4-烷基)-OH、(C1-4-烷基)-O(C1-4-烷基)、(C1-4-烷基)-SO2(C1-4-烷基)、(C0-4-烷基)-SO(C1-4-烷基)、(C0- 4-烷基)-NH2、(C0-4-烷基)-N(C1-8-烷基)2、(C0-4-烷基)-N(H)(OH)、CH2NSO2(C1-4-烷基)；R1和R2獨(dú)立地為C1-8-烷基、環(huán)烷基或(C1-4-烷基)環(huán)烷基；R3為NR4R5、OH或O-(C1-8-烷基)；R4為H；R5為-OH或-OC(O)R6；R6為C1-8-烷基、氨基-(C1-8-烷基)、(C1-8-烷基)-(C3-6-環(huán)烷基)、C3-6-環(huán)烷基、苯基、芐基或芳基；或其可藥用的鹽、溶劑化物、水合物、立體異構(gòu)體、包合物或藥物前體；或是下式所示化合物 其中Y為-C(O)-、-CH2、-CH2C(O)-或SO2；X為鹵素、-CN、-NR7R8、-NO2或-CF3，W為 或
Z為(C0-4-烷基)-SO2(C1-4-烷基)、-(C0-4-烷基)-CN、-(C0-4-烷基)-C(O)R3、C1-4-烷基、(C0-4-烷基)OH、(C0-4-烷基)O(C1-4-烷基)、(C0-4-烷基)SO(C1-4-烷基)、(C0-4-烷基)NH2、(C0-4-烷基)N(C1-8-烷基)2、(C0- 4-烷基)N(H)(OH)或(C0-4-烷基)NSO2(C1-4-烷基)；W為-C3-6-環(huán)烷基、-(C1-8-烷基)-(C3-6-環(huán)烷基)、-(C0-8-烷基)-(C3-6-環(huán)烷基)-NR7R8、(C0-8-烷基)-NR7R8、(C0-4-烷基)-CHR9-(C0-4-烷基)-NR7R8，R1和R2獨(dú)立地為C1-8-烷基、環(huán)烷基或(C1-4-烷基)環(huán)烷基；R3為C1-8-烷基、NR4R5、OH或O-(C1-8-烷基)；R4和R5相互獨(dú)立地為H、C1-8-烷基、(C0-8-烷基)-(C3-6-環(huán)烷基)、OH或-OC(O)R6；R6為C1-8-烷基、(C0-8-烷基)-(C3-6-環(huán)烷基)、氨基-(C1-8-烷基)、苯基、芐基或芳基；R7和R8各自獨(dú)立地為氫、C1-8-烷基、(C0-8-烷基)-(C3-6-環(huán)烷基)、苯基、芐基或芳基，或可以與連接它們的原子一起形成3-7元雜環(huán)烷基或雜芳基環(huán)；R9為C1-4-烷基、(C0-4-烷基)芳基、(C0-4-烷基)-(C3-6-環(huán)烷基)、(C0-4-烷基)雜環(huán)；或其可藥用鹽、溶劑化物、水合物、立體異構(gòu)體、包合物或藥物前體。
其它選擇性的細(xì)胞因子抑制藥物還包括在Muller等人于2003年3月12日提交的美國臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/454,149中記載的N-烷基-羥肟酸-異吲哚基化合物，本文引用其全部?jī)?nèi)容作為參考。代表性的N-烷基-羥肟酸-異吲哚基化合物包括下式化合物 其中
Y為-C(O)-、-CH2、-CH2C(O)-或-SO2；R1和R2獨(dú)立地為C1-8-烷基、CF3、CH2CHF2、環(huán)烷基或(C1-8-烷基)環(huán)烷基；Z1為H、C1-6烷基、-NH2-NR3R4或OR5；Z2為H或C(O)R5；X1、X2、X3和X4獨(dú)立地各為氫、鹵素、NO2、OR3、CF3、C1-6-烷基、(C0-4-烷基)-(C3-6-環(huán)烷基)、(C0-4-烷基)-N-(R8R9)、(C0-4-烷基)-NHC(O)-(R8)、(C0-4-烷基)-NHC(O)CH(R8)(R9)、(C0-4-烷基)-NHC(O)N(R8R9)、(C0-4-烷基)-NHC(O)O(R8)、(C0-4-烷基)-O-R8、(C0-4-烷基)-咪唑基、(C0-4-烷基)-吡咯基、(C0-4-烷基)-噁二唑基、(C0-4-烷基)-三唑基或(C0-4-烷基)-雜環(huán)；R3、R4和R5各自獨(dú)立地為H、C1-6-烷基、O-C1-6-烷基、苯基、芐基或芳基；R6和R7各自獨(dú)立地為H或C1-6-烷基；R8和R9各自獨(dú)立地為H、C1-9-烷基、C3-6-環(huán)烷基、(C1-6-烷基)-(C3-6-環(huán)烷基)、(C0-6-烷基)-N(R4R5)、(C0-6-烷基)-OR5、苯基、芐基、芳基、哌啶基、哌嗪基、吡咯烷基、嗎啉代或C3-7-雜環(huán)烷基；或其可藥用鹽、溶劑化物、水合物、立體異構(gòu)體、包合物或其藥物前體。
具體的選擇性細(xì)胞因子抑制藥物包括但不限于2-[1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-甲基-磺?；一鵠異吲哚啉-1-酮；2-[1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-(N，N-二甲基-氨基磺酰基)乙基]異吲哚啉-1-酮；2-[1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-甲基-磺?；一鵠異吲哚啉-1，3-二酮；2-[1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-甲基-磺酰基乙基]-5-硝基-異吲哚啉-1，3-二酮；2-[1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-甲基-磺?；一鵠-4-硝基異吲哚啉-1，3-二酮；2-[1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-甲基磺酰基乙基]-4-氨基異吲哚啉-1，3-二酮；
2-[1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-甲基磺?；一鵠-5-甲基異二氫吲哚-1，3-二酮；2-[1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-甲基磺酰基乙基]-5-乙酰氨基異吲哚啉-1，3-二酮；2-[1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-甲基磺酰基乙基]-4-二甲基氨基異吲哚啉-1，3-二酮；2-[1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-甲基磺?；一鵠-5-二甲基氨基異吲哚啉-1，3-二酮；2-[1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-甲基磺酰基乙基]苯并[e]異吲哚啉-1，3-二酮；2-[1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-甲基磺?；一鵠-4-甲氧基異吲哚啉-1，3-二酮；1-(3-環(huán)戊氧基-4-甲氧基苯基)-2-甲基磺?；一?胺；2-[1-(3-環(huán)戊氧基-4-甲氧基苯基)-2-甲基磺?；一鵠異吲哚啉-1，3-二酮；和2-[1-(3-環(huán)戊氧基-4-甲氧基苯基)-2-甲基磺?；一鵠-4-二甲基氨基異吲哚啉-1，3-二酮。
另外的選擇性細(xì)胞因子抑制藥物包括在G.Muller等人于2002年3月20日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?0/366,515和60/366,516以及G.Muller等人于2003年1月7日提交的美國臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?0/438,450和60/438,448中公開的對(duì)映體純的化合物，本文引用所有這些專利作為參考。優(yōu)選的化合物包括2-[1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-甲基磺?；一鵠-4-乙?；被愡胚徇?1，3-二酮的對(duì)映體和3-(3，4-二甲氧基-苯基)-3-(1-氧代-1，3-二氫-異吲哚-2-基)-丙酰胺的對(duì)映體。
優(yōu)選的用于本發(fā)明的選擇性細(xì)胞因子抑制藥物為3-(3，4-二甲氧基-苯基)-3-(1-氧代-1，3-二氫-異吲哚-2-基)-丙酰胺和環(huán)丙烷甲酸{2-[1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-甲磺?；一鵠-3-氧代-2，3-二氫-1H-異吲哚-4-基}-酰胺，其可從Celgene公司W(wǎng)arren，NJ獲得。3-(3，4-二甲氧基-苯基)-3-(1-氧代-1，3-二氫-異吲哚-2-基)-丙酰胺具有下面的化學(xué)結(jié)構(gòu)
環(huán)丙烷甲酸{2-[1-(3-乙氧基-4-甲氧基苯基)-2-甲磺?；一鵠-3-氧代-2，3-二氫-1H-異吲哚-4-基}-酰胺具有下面的化學(xué)結(jié)構(gòu) 本發(fā)明的化合物也包括但不限于抑制PDE IV活性的化合物，如西洛司特、茶堿、扎達(dá)維林、咯利普蘭、已酮可可堿、依諾昔酮、異吲哚酰亞胺類、苯乙基砜類、鏈烷羥肟酸類、非多肽環(huán)酰胺類、氧代異吲哚類、異吲哚啉類、吲唑類、雜取代的吡啶類、二苯基吡啶類、芳基噻吩類、芳基呋喃類、茚類、三取代的苯基類、二氮雜萘酮類、苯磺酰胺類、四環(huán)化合物及其鹽、溶劑化物、異構(gòu)體、包合物、藥物前體、水合物及其衍生物。在一個(gè)實(shí)施方案中，該化合物不是多肽、肽、蛋白質(zhì)、激素、細(xì)胞因子、寡核苷酸或核酸。
在另一個(gè)實(shí)施例中，本發(fā)明的化合物具有下面的結(jié)構(gòu)(I)
包括其異構(gòu)體、藥物前體和可藥用鹽、水合物、溶劑化物和包合物，其中Y代表N或N-氧化物；R1和R2獨(dú)立地選自H、C1-6烷基和鹵代C1-6烷基；R3和R4獨(dú)立地選自H和C1-6烷基，或者連接在同一碳原子上的R3和R4一起代表羰基氧原子，或者連接在不同碳原子上的R3和R4與它們所連接的碳原子以及任何介于其間的原子一起代表飽和5、6或7元碳環(huán)；R5和R6獨(dú)立地代表選自H、C1-6烷基、鹵代C1-6烷基和CN的基團(tuán)；n代表0-6的整數(shù)；Ar1選自噻吩基、噻唑基、吡啶基、苯基和萘基；所述Ar1可任選被1-3個(gè)選自下列的基團(tuán)取代鹵素、C1-6烷氧基、C1-7烷硫基、CN、C1-6烷基、羥基C1-6烷基、-C(O)C1-6烷基、-CO2H、-CO2C1-6烷基、NH(SO2Me)、N(SO2Me)2、SO2Me、SO2NH2、SO2NHC1-6烷基、SO2N(C1-6烷基)2NO2、C2-6烯基、C1-6烷基和NH2；并且當(dāng)Ar1代表具有二或三個(gè)取代基的苯基或萘基時(shí)，這兩個(gè)取代基可一起代表5或6元稠合內(nèi)酯環(huán)。
該實(shí)施方案還包括如美國專利號(hào)6,316,472中記載的化合物，本文引用其全部?jī)?nèi)容作為參考。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物具有下面的結(jié)構(gòu)(II)
包括其異構(gòu)體、藥物前體和可藥用鹽、水合物、溶劑化物和包合物，其中R1和R2代表C1-C4烷基或C3-C10環(huán)烷基；R3和R4獨(dú)立地代表C1-C4烷基、環(huán)烷基、具有一個(gè)雙鍵的C2-C4烯基、具有一個(gè)三鍵的C2-C4炔基、(CH2)nCO(CH2)mCH3、(CH2)pCN、(CH2)pCO2Me，或與它們所連接的氮原子一起形成3-10元環(huán)；n和m為0-3；p為1-3。
該實(shí)施方案還包括在美國專利號(hào)6,162,830中記載的化合物，本文引用其全部?jī)?nèi)容作為參考。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物具有下面的結(jié)構(gòu)(III) 包括其異構(gòu)體、藥物前體和可藥用鹽、水合物、溶劑化物和包合物，其中R1獨(dú)立地選自氫、鹵素、低級(jí)烷氧基、羥基、低級(jí)烷基、低級(jí)烷基巰基、低級(jí)烷基磺?；?、低級(jí)烷基氨基、二-低級(jí)烷基氨基、氨基、硝基、腈、低級(jí)烷基羧基(carboxylate)、-CO2H和磺酰氨基；R2選自氫和低級(jí)烷基；
R3選自氫、低級(jí)烷基、羥基和氨基；R4選自-COM和CH2OH，其中M選自羥基、取代的低級(jí)烷氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、N-嗎啉代、羥基烷基氨基、多羥基氨基、二氨基烷基氨基、氨基烷基氨基和OMe，其中Me是陽離子；R5為烷基磺?；?；且n為0-4的整數(shù)。
該實(shí)施方案還包括在美國專利號(hào)6,177,471中記載的化合物，本文此用其全部?jī)?nèi)容作為參考。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物具有下面的結(jié)構(gòu)(IV) 包括其異構(gòu)體、藥物前體和可藥用鹽、水合物、溶劑化物和包合物，其中R0代表氫、鹵素或C1-6-烷基；R1選自氫；C1-6-烷基，所述烷基任選被一個(gè)或多個(gè)選自下列的取代基取代苯基、鹵素、-CO2Ra、-NRaRb；C3-6-環(huán)烷基、苯基和選自吡啶基、嗎啉基、哌嗪基、吡咯烷基和哌啶基的5或6元雜環(huán)，所述基團(tuán)可任選被一個(gè)或多個(gè)C1-6-烷基取代，并任選連接在R1通過C1-6-烷基所連接的氮原子上；R2選自苯基，所述苯基任選被一個(gè)或多個(gè)選自下列的取代基取代-ORa、-NRa、Rb、鹵素、羥基、三氟甲基、氰基和硝基；且Ra和Rb獨(dú)立地代表氫或C1-6-烷基，包括其異構(gòu)體、前藥和可藥用鹽。
該實(shí)施方案還包括在美國專利號(hào)6,218,400中記載的化合物，本文此用其全部?jī)?nèi)容作為參考。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物具有下面的結(jié)構(gòu)(V)
包括其異構(gòu)體、藥物前體和可藥用鹽、水合物、溶劑化物和包合物，其中X為S或O；Ar1為選自苯基、吡啶基或呋喃基的芳環(huán)，所述芳環(huán)任選被最高達(dá)兩個(gè)取代基取代，每個(gè)取代基獨(dú)立地為C1-6烷基，所述烷基任選被-OH、-CO2H、CO2C1-3烷基或CN取代；C1-6烷氧基；C1-3烷硫基、C1-3烷基磺?；?、C1-3氟烷基，所述基團(tuán)任選被-OH取代；鹵素、-OH、-CO2H或-CO2C1-3烷基；R2為氫或C1-3烷基；且R3為苯基、吡啶基、喹啉基或呋喃基，所述基團(tuán)任選被最高達(dá)兩個(gè)取代基取代，每個(gè)取代基獨(dú)立地為C1-3烷基、C1-3氟烷基、C1-6烷氧基、C1-3氟烷氧基、C1-3烷硫基、鹵素或-OH。
該實(shí)施方案還包括在美國專利號(hào)6,034,089和美國專利號(hào)6,020,339中記載的化合物，本文引用它們的全部?jī)?nèi)容作為參考。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物具有下面的結(jié)構(gòu)(VI) 包括其異構(gòu)體、藥物前體和可藥用鹽、水合物、溶劑化物和包合物，其中Y為氫或烷基或-XRa基團(tuán)；Z為-O-、-S(O)p-或-N(Rb)-，其中p為0或整數(shù)1或2；L為-XR、-C(R11)C(R1)(R2)或-(CHR11)nCH(R1)(R2)，其中n為0或整數(shù)1；每個(gè)Ra和Rb獨(dú)立地為氫或任選被取代的烷基；R為任選被取代的烷基、烯基、環(huán)烷基或環(huán)烯基；每個(gè)R1和R2可相同或不同，并且為氫、氟、-CN、-NO2，或任選被取代的烷基、烯基、炔基、烷氧基、烷硫基、-CO2R8、-CONR9R10或-CSNR9R10，或R1和R2與它們所連接的碳原子一起連接以形成任選被取代的環(huán)烷基或環(huán)烯基；R3為氫、氟、羥基或任選被取代的直鏈或支鏈烷基；R4為氫、-(CH2)tAr或-(CH2)t-Ar-(L1)n-Ar1，其中t為0或整數(shù)1、2或3；R5為-(CH2)tAr或-(CH2)t-Ar-(L1)n-Ar’；R6為氫、氟或任選被取代的烷基；R7為氫、氟、任選被取代的直鏈或支鏈烷基、-ORc，其中Rc為氫或任選被取代的烷基或烯基，或甲?；⑼檠趸榛?、鏈烷?；?、甲酰氨基(carboxamido)或硫代甲酰氨基(thiocarboxamido)；每個(gè)R8、R9和R10獨(dú)立地為氫或任選被取代的烷基、芳烷基或芳基；且R11為氫、氟或甲基。
該實(shí)施方案還包括在美國專利號(hào)5,798,373中記載的化合物，本文引用它們的全部?jī)?nèi)容作為參考。
在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，化合物具有結(jié)構(gòu)(VII) 或其可藥用鹽、水合物、溶劑化物、包合物、對(duì)映體、非對(duì)映體、外消旋體或立體異構(gòu)體混合物。
在另一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，化合物具有結(jié)構(gòu)(VIII) 包括其異構(gòu)體、鹽、包合物、溶劑化物、水合物、藥物前體及可藥用鹽。
這些化合物的某些可以由Celgene，Inc.，Warren，新澤西商業(yè)上獲得。其它上面的化合物可以通過本領(lǐng)域公知的方法生產(chǎn)，包括那些公開于上面引述的專利中的方法，本文引用它們的全部?jī)?nèi)容作為參考。
此外本發(fā)明的方法中用到的PDE IV抑制劑實(shí)例包括在以下中公開的抑制劑GB2063249A、EP0607439A1、美國專利號(hào)6,333,354，US6,300,335、美國專利號(hào)6,166,041、美國專利號(hào)6,069,156、美國專利號(hào)6,011,060、美國專利號(hào)5,891,896、美國專利號(hào)5,849,770、美國專利號(hào)5,710,170、美國專利號(hào)4,101,548、美國專利號(hào)4,001,238、美國專利號(hào)4,001,237、美國專利號(hào)3,920,636、美國專利號(hào)4,060,615、WO97/03985、EP0607439A1、美國專利號(hào)4,101,548、美國專利號(hào)4,001,238、美國專利號(hào)4,001,237、美國專利號(hào)3,920,636、美國專利號(hào)4,060,615、WO97/03985、EP0395328、美國專利號(hào)4,209,623、EP0395328、美國專利號(hào)4,209,623、美國專利號(hào)5,354,571、EP0428268A2、美國專利號(hào)5,354,571、EP0428268A2、807,826、美國專利號(hào)3,031,450、美國專利號(hào)3,322,755、美國專利號(hào)5,401,774,807,826、美國專利號(hào)3,031,450、美國專利號(hào)3,322,755、美國專利號(hào)5,401,774、美國專利號(hào)3,031,4502、美國專利號(hào)3,322,7552、美國專利號(hào)5,401,7742、美國專利號(hào)5,147,875、PCT WO93/12095、美國專利號(hào)5,147,875、PCT WO93/12095、美國專利號(hào)4,885,301、WO93/07149、EP0349239A2、EP0352960A2、EP0526004A1、EP0463756A1、美國專利號(hào)4,855,301、WO93/07149、EP0349239A2、EP0352960A2、EP0526004A1、EP0463756A1、EP0607439A1、EP0607439A1、WO94/05661、EP0351058、美國專利號(hào)4,162,316、EP0347146、美國專利號(hào)4,047,404、美國專利號(hào)5,614,530、美國專利號(hào)5,488,055、WO97/03985、WO97/03675、WO95/19978、美國專利號(hào)4,880,810、WO98/08848、美國專利號(hào)5,439,895、美國專利號(hào)5,614,627、PCT US94/01728、WO98/16521、EP0722943A1、EP0722937A1、EP0722944A1、WO98/17668、WO97/24334、WO97/24334、WO97/24334、WO97/24334、WO97/243344、WO98/06722、PCT/JP97/03592、WO98/23597、WO94/29277、WO98/14448、WO97/03070、WO98/38168、WO96/32379和PCT/GB98/03712，在此全部引用作為參考。
許多作為本發(fā)明的部分的化合物可以使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)拆分或不對(duì)稱合成而富集所述化合物的旋光對(duì)映體。參見例如，Shealy等，Chem.Indus.1030(1965)；和Casini等，F(xiàn)armaco Ed.Sci.19563(1964)。
本發(fā)明也和生理學(xué)可接受的化合物的非毒性酸加成鹽有關(guān)。這樣的鹽包括那些衍生于有機(jī)或無機(jī)酸或本領(lǐng)域公知的堿這樣的酸包括例如，鹽酸、溴酸、磷酸、硫酸、甲烷磺酸、乙酸、酒石酸、乳酸、琥珀酸、檸檬酸、蘋果酸、馬來酸、山梨酸、烏頭酸、水楊酸、鄰苯二甲酸、恩貝酸(embolic acid)和庚酸。
具有酸性的本發(fā)明的化合物能夠與各種可藥用的堿形成鹽。這些能夠用于制備本發(fā)明的這些酸性化合物的可藥用的堿加成鹽的堿是那些形成非毒性堿加成鹽，即，含有可藥用陽離子的鹽，如但不限于堿金屬或堿土金屬鹽，特別是鈣、鎂、鈉或鉀鹽。適合的有機(jī)堿包括但不限于，N，N-二芐基乙二胺、氯普魯卡因、膽堿、二乙醇胺、乙二胺、葡甲胺(N-甲基葡萄糖胺)、賴氨酸和普魯卡因。
測(cè)定本發(fā)明的化合物抑制PDE IV的效力，可使用本領(lǐng)域公知的方法，例如，在美國專利號(hào)6,316,472；美國專利號(hào)6,204,275；Featherstone R.L.等。(2000)“比較被加到用于大鼠肺低體溫保存的St.Thomas’醫(yī)院的心肺麻痹性溶液中的差異同工酶選擇性的磷酸二酯酶抑制劑”，Am.J.Respir Crit.Care Med.162850-6；和BrackeenM.F.等。(1995)“作為cAMP特異性磷酸二酯酶的有效抑制劑，4-(3-丁氧基-4-甲氧苯基)2-咪烷基-一(Ro20-1724)構(gòu)像類似物的設(shè)計(jì)和合成”，J.Med.Chem.384848-54，在此全部引用作為參考。
本發(fā)明的化合物能從Celgene Corp.(Warren，NJ)商業(yè)化購買，也可根據(jù)本專利或在此公開的專利中描述的方法得到制備。進(jìn)一步，既使用公知的拆分試劑或手性柱，也可使用其他標(biāo)準(zhǔn)的合成有機(jī)化學(xué)技術(shù)來非對(duì)稱合成或拆分旋光純的成分。
5.3干細(xì)胞群體本發(fā)明提供鑒定可調(diào)節(jié)人血管生成的化合物的方法。在本發(fā)明方法中用到的任何干細(xì)胞，包括但不限于，從臍帶血(CB細(xì)胞)中分離的干細(xì)胞、外周血、成年人血、骨髓、胎盤、間葉細(xì)胞干細(xì)胞和其他來源。在一個(gè)非優(yōu)選的實(shí)施方案中，干細(xì)胞是從其他來源而不是胎盤中分離的胚胎干細(xì)胞。
間葉細(xì)胞干細(xì)胞來源包括包括骨髓、胚胎卵黃囊、胎盤、臍帶、胎兒或青少年的皮膚，和血?？蓮镊泪铡⑼裙?jié)、脛骨、脊骨、肋骨或其他骨髓腔中得到骨髓細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明中的方法用到的干細(xì)胞可以包括多能干細(xì)胞，也就是，具有完全分化多能性、能自我恢復(fù)的細(xì)胞，其能在組織中保持休眠或靜息。干細(xì)胞也包括多能潛細(xì)胞、定向祖細(xì)胞，和類成纖維細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明利用了是有活力的、靜息的、從妊娠足月放血灌注的胎盤中分離的多能干細(xì)胞。
干細(xì)胞群體包括通過商業(yè)服務(wù)，例如，LifeBank USA(CedarKnolls，NJ)、ViaCord(Boston MA)、Cord Blood Registry(SanBruno，CA)和Cryocell(Clearwater，F(xiàn)L)中獲得的胎盤干細(xì)胞。
干細(xì)胞群體也包括根據(jù)在美國公開申請(qǐng)US2002/0123141，2002年9月5日，“收集胎盤干細(xì)胞的方法”和美國公開申請(qǐng)US2003/0032179，2003年2月13日公開，“產(chǎn)后的哺乳動(dòng)物胎盤，用途及其胎盤干細(xì)胞”(二者在此全部引用作為參考)中公開的方法而收集的胎盤干細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明用到的優(yōu)選干細(xì)胞是起源于放血灌注的胎盤的胚胎樣干細(xì)胞，或衍生于類胚胎胎盤干細(xì)胞的細(xì)胞?？赏ㄟ^用如流式細(xì)胞計(jì)和免疫細(xì)胞化學(xué)的技術(shù)來測(cè)量形態(tài)學(xué)和細(xì)胞表面標(biāo)記中的變化，和用如PCR的技術(shù)來測(cè)量基因表達(dá)中的變化，來鑒定本發(fā)明的胚胎樣干細(xì)胞。在發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，可通過下列細(xì)胞表面標(biāo)記的存在CD10、CD29、CD44、CD54、CD90、SH2、SH3、SH4、OCT-4和ABC-p，或缺乏以下細(xì)胞表面標(biāo)記CD34、CD38、CD45、SSEA3和SSEA4，來鑒定上述的胚胎樣干細(xì)胞。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，可通過細(xì)胞表面標(biāo)記OCT-4+和APC-p+的存在來鑒定胚胎樣干細(xì)胞。根據(jù)本領(lǐng)域非常熟悉的方法，例如，在用抗細(xì)胞表面標(biāo)記抗體洗滌和染色之后，通過流式細(xì)胞計(jì)，可常規(guī)地確定所述的細(xì)胞表面標(biāo)記。例如，為確定CD-34或CD-38的存在，可將細(xì)胞在PBS中洗滌和然后用抗-CD34藻紅蛋白和抗-CD38熒光素異硫氰酸鹽(Becton Dickinson，Mountain View，CA)雙重染色。
源于胎盤的胚胎樣干細(xì)胞具有胚胎干細(xì)胞但不是衍生于胚胎的特征。換句話說，發(fā)明包括從產(chǎn)后灌注胎盤中分離的未分化干細(xì)胞的OCT-4+和ABC-p+的用途。以上提及的，在不同時(shí)點(diǎn)從persfuseplacenta中能分離許多不同的多能或多潛能干細(xì)胞，例如，CD34+/CD38+、CD34+/CD38-，和CD34-/CD38-造血細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明方法，出生后的人胎盤可用作胚胎樣干細(xì)胞來源。
例如，在從子宮取出后，盡快將胎盤除血以防止或?qū)⒌蛲鰷p少到最少。隨后，在除血后盡可能快將胎盤灌注以清除血液、殘余細(xì)胞、蛋白質(zhì)、因子和其他器官中存在的物質(zhì)。也可從胎盤中清除物質(zhì)碎片。以合適的灌注液通常持續(xù)灌注至少2至超過24小時(shí)。在一些另外的實(shí)施方案中，將胎盤灌注至少4、6、8、10、12、14、16、18、20和22小時(shí)。換句話說，本發(fā)明至少是部分地根據(jù)通過除血和灌注一段充足的時(shí)間可激活產(chǎn)后胎盤細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)。所以，胎盤容易作為豐富的和充裕的胚胎樣干細(xì)胞來源，其細(xì)胞能用于研究，包括藥物研究、治療和預(yù)防疾病、特別是外科移植術(shù)或其他療法，和定向細(xì)胞、組織和類器官的繁殖。參見，美國申請(qǐng)公開US20020123141，2002年9月5日公布，“收集胎盤干細(xì)胞的方法”和美國申請(qǐng)公開US2003/0032179，2003年2月13日公開，“產(chǎn)后的哺乳動(dòng)物胎盤，用途及其胎盤干細(xì)胞”(二者在此全部引用作為參考)。
從排干的胎盤中，通過利用臍動(dòng)脈和臍靜脈中任何一個(gè)或兩者的灌注技術(shù)來提取胚胎樣干細(xì)胞。優(yōu)選通過驅(qū)血法和收集殘余血(例如，殘余的臍帶血)來排干胎盤。然后處理排干的胎盤直至建立體外的、天然生物反應(yīng)器的環(huán)境，軟組織和血管外區(qū)域中的原有胚胎樣干細(xì)胞在其中可得到恢復(fù)。根據(jù)本發(fā)明的方法，優(yōu)選通過用灌注液沖到導(dǎo)管中，胚胎樣干細(xì)胞移入收集它們的、已排干的、空微循環(huán)中。
5.4干細(xì)胞培養(yǎng)方法在本發(fā)明某種方法中，本發(fā)明的體外篩選測(cè)定中用到的，干或祖細(xì)胞，包括但不限于胚胎干細(xì)胞、胚胎樣干細(xì)胞、祖細(xì)胞、多能細(xì)胞、全能細(xì)胞、多潛能細(xì)胞、內(nèi)源細(xì)胞到產(chǎn)后被灌注的胎盤、臍帶血細(xì)胞、衍生于外周血液或成人血液的干或祖細(xì)胞，或骨髓細(xì)胞。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，干或祖細(xì)胞不是衍生于產(chǎn)后被灌注的胎盤而是，從例如臍帶血、骨髓、外周血液或成人血液中分離的，暴露于本發(fā)明和測(cè)定血管生成的化合物。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，培養(yǎng)的干細(xì)胞，例如，在體外或在產(chǎn)后被灌注的胎盤中培養(yǎng)的干細(xì)胞，得到刺激來增殖，例如，通過給藥促紅細(xì)胞生成素、細(xì)胞因子、淋巴因子、干擾素、集落刺激因子(CSF’s)、干擾素、趨化因子、重組人造血生長(zhǎng)因子包括配體、干細(xì)胞因子、血小板生成素(Tpo)、白血病介素，和粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)或其他生長(zhǎng)因子。
5.4.1體外培養(yǎng)干細(xì)胞體外培養(yǎng)干或祖細(xì)胞的方法是本領(lǐng)域公知的，例如，參見，Thomson等，1998，Science 2821145-47(胚胎干細(xì)胞)；Hirashima等，1999，Blood 93(4)1253-63，和Hatzopoulos等，1998，Development1251457-1468(內(nèi)皮祖細(xì)胞)；Slager等，1993，Dev.Genet.14(3)212-24(神經(jīng)元或肌祖細(xì)胞)；Genbachev等，1995，Reprod Toxicol.9(3)245-55(細(xì)胞滋養(yǎng)層，也就是，胎盤內(nèi)皮祖細(xì)胞)；Nadkarni等，1984，Tumori 70503-505，Melchner等，1985，Blood 66(6)1469-1472，2000年5月18日公布的國際PCTWO00/27999，Himori等，1984，Intl.J.Cell Cloning 2254-262，和Douay等，1995，Bone Marrow Transplantation 15769-755(造血祖細(xì)胞)；Shamblott等，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA9513726-31(原生殖細(xì)胞)；Yan等，2001，Devel.Biol.235422-432(滋養(yǎng)層干細(xì)胞)。
5.4.2在產(chǎn)后被灌注的胎盤中的干細(xì)胞培養(yǎng)本發(fā)明的方法包括衍生于胎盤的多能干細(xì)胞的用途。獲得和培養(yǎng)所述細(xì)胞的方法，如以下所述，在美國專利申請(qǐng)?zhí)朥S2002123141(2002年9月5日公布，“胎盤干細(xì)胞的收集方法”)和美國專利申請(qǐng)?zhí)朥S20030032179(2003年2月13日公布，“產(chǎn)后的哺乳動(dòng)物胎盤，用途及其胎盤干細(xì)胞”)中得到詳細(xì)描述，二者在此全部引用作為參考。
5.4.2.1胎盤的預(yù)處理根據(jù)本發(fā)明的方法，將出生后的胎盤排氣，即刻回收人胎盤和，在某種實(shí)施方案中，回收在胎盤中的臍帶血。在某種實(shí)施方案中，胎盤受到常規(guī)的臍帶血回收處理。在重力的輔助下，一般地使用針或套管，從胎盤中排干(也就是放血)臍帶血(Boyse等，美國專利號(hào)5,192,553，1993年3月9日公布；Boyse等，美國專利號(hào)5,004,681，1991年4月2日公布；Anderson，美國專利號(hào)5,372,581，1994年12月13日公布；Hessel等，美國專利號(hào)5,415,665，“臍帶鉗位、切除，和血液收集裝置和方法”，1995年5月16日公布)?？缮虡I(yè)化獲得所述的臍帶血回收，例如，LifeBank USA(Cedar Knolls，NJ)，ViaCord(Boston MA)，Cord Blood Registry(San Bruno，CA)和Cryocell(Clearwater，F(xiàn)L)。將胎盤排氣后即刻排干臍帶血。
產(chǎn)后排干胎盤的臍帶血?？稍跓o菌條件下和或在室溫或在5至25℃(攝氏度)下保存胎盤。胎盤可保存長(zhǎng)于48小時(shí)的一段時(shí)期，和優(yōu)選在灌注胎盤來除去任何殘余的臍帶血之前保存4至24小時(shí)的一段時(shí)期。
優(yōu)選無菌的條件下排氣后回收胎盤，和5至25℃(攝氏度)下保存在抗凝血?jiǎng)┤芤褐?。合適的抗凝血?jiǎng)┤芤菏潜绢I(lǐng)域公知的。例如，能使用肝素或殺鼠靈溶液，例如，肝素溶液(1％w/w在1∶1000溶液中)。在收集胚胎樣干細(xì)胞之后，保存排干的胎盤優(yōu)選不超過36小時(shí)。所用到的灌注胎盤來除去殘余細(xì)胞的溶液 能是相同的用來灌注和培養(yǎng)胎盤以回收干細(xì)胞的溶液。任何這些灌注液可得到收集和作為胚胎樣干細(xì)胞而使用。
也可通過被告知同意和患者以前完整的與胎盤有關(guān)的病歷，從患者回收胎盤，也可在孕期和孕后取材。這些病歷能用于協(xié)調(diào)隨后的胎盤用途或從其中采集的干細(xì)胞。例如，對(duì)被懷疑的嬰兒、雙親、同胞或其他親屬，人胎盤干細(xì)胞能順利的用作個(gè)人化藥物。的確，人胚胎干細(xì)胞比臍帶血更通用。然而，應(yīng)當(dāng)指出本發(fā)明包括將通過放血、灌注和/或培養(yǎng)胎盤或臍帶血而生成人胎盤干細(xì)胞添加到臍帶中，及源自相同或不同的胎盤和臍帶中的血。最后得到的臍帶血將具有增加的人干細(xì)胞濃度/群體，和因此更適合用于移植，例如，用于骨髓移植。
5.4.2.2胎盤驅(qū)血法和殘余細(xì)胞的除去根據(jù)本發(fā)明某種實(shí)施方案，包括但不限于胚胎樣干細(xì)胞，從去血后的胎盤中回收干或祖細(xì)胞，也就是，完全排干臍帶血而留下胎衣和/或常規(guī)臍帶血回收程序。
5.4.2.3培養(yǎng)胎盤及其干細(xì)胞根據(jù)本發(fā)明的方法，在放血和灌注胎盤一段充裕的時(shí)間后，優(yōu)選通過用灌注液沖到收集導(dǎo)管中，觀察胚胎樣干細(xì)胞移入已放血的和灌注的、收集它們的胎盤微循環(huán)中。灌注分離的胎盤不僅用來除去殘余的臍帶血，而且也提供胎盤適當(dāng)?shù)臓I養(yǎng)，包括氧。也可用相似的除去殘余的臍帶血細(xì)胞的溶液來培養(yǎng)和灌注胎盤，優(yōu)選無抗凝血?jiǎng)┑母郊游铩?br> 在本發(fā)明某種的實(shí)施方案中，排干的、去血的胎盤可作為生物反應(yīng)器得到培養(yǎng)，也就是，增殖細(xì)胞或生成生物物質(zhì)的體外系統(tǒng)。通過從可回收增殖的細(xì)胞或生成的生物物質(zhì)的地方、定期地或連續(xù)地除去被導(dǎo)入生物反應(yīng)器中的一部分培養(yǎng)基或灌注流體，來保持在胎盤生物反應(yīng)器中的增殖細(xì)胞數(shù)量或生物物質(zhì)生成水平的平衡增長(zhǎng)的連續(xù)狀態(tài)。
通過用如流式細(xì)胞計(jì)、細(xì)胞分選術(shù)、免疫細(xì)胞化學(xué)(例如，用組織特異性或細(xì)胞標(biāo)記特異性抗體)、熒光激活細(xì)胞分選術(shù)(FACS)、磁激活細(xì)胞分選術(shù)(MACS)，來測(cè)量在形態(tài)學(xué)和細(xì)胞表面標(biāo)記中的變化，通過用光學(xué)或共聚焦顯微鏡來檢測(cè)細(xì)胞形態(tài)學(xué)，或通過用如PCR和基因差異表達(dá)的本領(lǐng)域公知的技術(shù)來測(cè)量基因表達(dá)中的變化，從而很容易地監(jiān)測(cè)細(xì)胞增殖的數(shù)量和類型。
導(dǎo)入到灌注液的生長(zhǎng)因子能刺激未分化的胚胎樣干細(xì)胞、定向祖細(xì)胞、或分化細(xì)胞(例如，造血細(xì)胞)的增殖。生長(zhǎng)因子能刺激生物物質(zhì)和生物活性分子的產(chǎn)量，包括但不限于，免疫球蛋白、激素、酶或先前描述的生長(zhǎng)因子。應(yīng)該定期“喂養(yǎng)”培養(yǎng)的胎盤來除去耗盡的培養(yǎng)基、減少分泌的細(xì)胞，和添加新鮮培養(yǎng)基。應(yīng)該在無菌條件下保存所培養(yǎng)的胎盤來降低污染的可能性，和在間歇和定期增壓下創(chuàng)造維持對(duì)胎盤細(xì)胞充足營養(yǎng)供應(yīng)的條件下維持所培養(yǎng)的胎盤。應(yīng)當(dāng)認(rèn)可的是為了效率和提高產(chǎn)量，胎盤的灌注和培養(yǎng)能實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化和計(jì)算機(jī)化。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，處理胎盤來除去所有的內(nèi)源性增殖細(xì)胞，例如胚胎樣干細(xì)胞，和讓外來的(也就是，外源的)細(xì)胞在灌注的胎盤環(huán)境中得到導(dǎo)入和增殖。本發(fā)明預(yù)計(jì)在胎盤生物反應(yīng)器中能培養(yǎng)多種干或祖細(xì)胞，包括但不限于，胚胎樣干細(xì)胞、間質(zhì)干細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、肝細(xì)胞、角化細(xì)胞，和對(duì)于特殊細(xì)胞類型的干或祖細(xì)胞、組織或器官，包括但不限于神經(jīng)元、骨磷脂、肌、血、骨髓、皮膚、心臟、結(jié)締組織、肺、腎、肝，和胰腺(例如，胰島細(xì)胞)。
5.5使用測(cè)定-鑒別化合物的治療方法如工作實(shí)施例所示(參見節(jié)6，下面的)，該測(cè)定法鑒別了一類表現(xiàn)出抗血管生成活性的化合物。這些化合物是在節(jié)5.2中描述的一類化合物的代表性成員。特別地，這些代表性化合物是ActimidTM，RevimidTM和沙利度胺。通過如在實(shí)施例和其他地方描述的相同方式的測(cè)定法，可鑒定其他的化合物。所述的化合物可以是在血管生成或血管形成中具有預(yù)期的調(diào)節(jié)效果的任意化合物，和可以是蛋白質(zhì)、肽、類肽、核酸或類核酸、碳水化合物、脂、無機(jī)小分子等等。
確定為抗血管生成的化合物可以用來治療疾病或具有抗抗血管生成成分的病癥。例如，一個(gè)在癌中侵略性的標(biāo)記，例如乳腺癌，是血管生成試劑的腫瘤癌的產(chǎn)物；和加快了腫瘤內(nèi)部和外周的血管形成，導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)和癌轉(zhuǎn)移的速度加快。抑制這種血管生成將有助于抑制腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。因而，本發(fā)明的抗血管生成化合物可以用于治療癌癥，包括轉(zhuǎn)移性癌癥。所述的治療優(yōu)選聯(lián)合其他的癌癥療法。通過本發(fā)明的篩選方法用鑒別化合物可以治療的其他病癥，包括炎癥、子宮內(nèi)膜異位、關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化斑、糖尿病性視網(wǎng)膜病、新生血管性青光眼、沙眼、角膜移植物新血管化、牛皮癬、硬皮病、血管瘤和肥大性疤痕、血管粘連和血管纖維瘤。
因而，在一個(gè)實(shí)施方案中，發(fā)明提供一種個(gè)體治療方法，其中所述的個(gè)體具有和血管生成或血管形成有關(guān)的病癥或疾病，包括對(duì)所述個(gè)體給藥相當(dāng)數(shù)量的、足以檢測(cè)到地能減少所述血管生成或血管形成的試劑，其中在此描述為具有抗血管生成或抗血管形成活性的測(cè)定法可鑒別所述的試劑。在特別的實(shí)施方案中，所述的試劑是抑制TNF-α活性的化合物。在更特別的實(shí)施方案中，所述的試劑選自于沙利度胺、ActimidTM或RevimidTM。在另一個(gè)實(shí)施方案中，發(fā)明提供一種個(gè)體治療方法，其中所述的個(gè)體具有和血管生成或血管形成有關(guān)的病癥或疾病，包括對(duì)所述個(gè)體給藥相當(dāng)數(shù)量的能抑制TNF-α活性的化合物，其中所述的相當(dāng)數(shù)量是足以檢測(cè)到地減少所述的血管生成或血管形成。在更特別的實(shí)施方案中，所述化合物選自于沙利度胺、ActimidTM或RevimidTM。
相同的鑒別方法可用于鑒別增加血管形成或血管生成的化合物，也就是，血管生成化合物；所述的試劑可用于治療與血管形成機(jī)能不全、或血管損傷有關(guān)的疾病或病癥。例如，可對(duì)正進(jìn)行手術(shù)的、特別是血管或心臟手術(shù)的個(gè)體給藥所述的化合物，來提高血管修復(fù)速度。在第二個(gè)實(shí)施例中，所述的化合物可用來治療外周血流量不足的個(gè)體，例如有非愈合傷口的個(gè)體，或Reynaud疾病。因而，在另一個(gè)實(shí)施方案中，發(fā)明提供個(gè)體治療的方法，其中所述的個(gè)體具有和血管生成或血管形成機(jī)能不全有關(guān)的病癥或疾病，包括對(duì)所述個(gè)體給藥相當(dāng)數(shù)量的、可檢測(cè)到地增加血管生成或血管形成的試劑，所述的試劑給藥足夠數(shù)量來增加所述的血管生成或血管形成的。
通過在以下的節(jié)5.6略述的方法可給藥血管生成和/血管形成的調(diào)節(jié)劑。
5.6藥物組合物本發(fā)明包括藥物組合物，其包含通過本發(fā)明的方法鑒定為血管生成調(diào)節(jié)劑的化合物?？蓪⒈景l(fā)明的藥物組合物給藥需要所述治療來調(diào)節(jié)血管生成的患者。
本發(fā)明的化合物給藥是全身性的或局部的。在多數(shù)情況下，對(duì)哺乳動(dòng)物給藥將導(dǎo)致全身性釋放本發(fā)明的化合物(也就是，進(jìn)入血流)。給藥方法包括腸道路徑，例如口的、口腔的、舌下的，和直腸的；一般的給藥，例如透皮的和皮內(nèi)的；和腸道外給藥。合適的腸道外路徑，包括通過皮下注射器針頭或?qū)Ч艿尼槃?，例如，靜脈的、肌內(nèi)的、皮下的、皮內(nèi)的、腹膜內(nèi)的、動(dòng)脈的、心室內(nèi)的、鞘內(nèi)的，和前房?jī)?nèi)注射和非注射路徑，例如陰道直腸，或鼻腔給藥。優(yōu)選地，本發(fā)明的化合物和組合物是口服給藥。在特別的實(shí)施方案中，理想的是本發(fā)明的一種或多種化合物局部給藥到需要治療的地方。例如，在手術(shù)或局部應(yīng)用中，也就是手術(shù)后結(jié)合創(chuàng)傷敷裹，通過局部注射、或借助導(dǎo)管、栓劑、或種植體的注射，而實(shí)現(xiàn)理想給藥，所述的種植體是多孔的、無孔的，或凝膠材料，其包括膜，例如涎管擴(kuò)張膜或纖維。
也可通過常規(guī)的非標(biāo)準(zhǔn)給藥系統(tǒng)，例如，脂質(zhì)體包裹、微顆粒、微膠囊、膠囊等，將本發(fā)明的化合物給藥。例如，可將本發(fā)明化合物和組合物用泡囊給藥，特別是脂質(zhì)體(參見Langer，1990，Science2491527-1533；Treat等，傳染性疾病和癌癥治療的脂質(zhì)體，Lopez-Berestein和Fidler(eds.)，Liss，紐約，pp.353-365(1989)；Lopez-Berestein，同上，pp.317-327；參見同上)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過控釋系統(tǒng)可給藥本發(fā)明的化合物和組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，可以使用泵(參見Langer，supra；Sefton，1987，CRC Crut.Ref.Biomed.Eng.14201；Buchwald等，1980，Surgery 88507 Saudek等，1989，N.Engl.J.Med.321574)。在另一個(gè)實(shí)施例中，可使用聚合體材料(參見控釋的醫(yī)學(xué)應(yīng)用，Langer和Wise(eds.)，CRCPress.，Boca Raton，F(xiàn)lorida(1974)；藥物控釋的生物利用度，藥物產(chǎn)品設(shè)計(jì)和性能，Smolen和Ball(eds.)，Wiley，NewYork(1984)；Ranger和Peppas，1983，J.Macromol.Sci.Rev.Macromol.Chem.2361；也可參見Levy等，1985，Science 228190；During等，1989，Ann.Neurol.25351；Howard等，1989，J.Neurosurg.71105)。在另一個(gè)實(shí)施例中，將控釋系統(tǒng)置于被治療靶區(qū)的鄰近位置，例如，肝，這樣只需要全身性的分割劑量(參見，例如，Goodson，醫(yī)療應(yīng)用中的控釋，supra，vol.2，pp.115-138(1984))。在Langer，1990，Science 2491527-1533中討論的其他控釋系統(tǒng)能得到使用。當(dāng)作為組合物給藥時(shí)，以適當(dāng)數(shù)量的可藥用的媒介物或載體配制本發(fā)明的化合物，以至于可提供對(duì)哺乳動(dòng)物適宜的給藥類型。術(shù)語“可藥用的”指被聯(lián)邦政府或州政府管理機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)的，或在美國藥典上或其他常規(guī)公認(rèn)用于哺乳動(dòng)物、和特別是人的藥典上列出的。術(shù)語“賦形劑”指稀釋劑、助劑、賦性劑，或具有配制用于給藥哺乳動(dòng)物的本發(fā)明化合物的載體。所述的藥物媒介物能是流體，例如水或油，包括石油、動(dòng)物油、植物油或合成油，例如花生油、大豆油、礦物油、芝麻油和類似物。藥物媒介物能是鹽水、阿拉伯膠、凝膠、淀粉糊、滑石、硅膠、尿素，和類似物。此外，可使用輔助劑、穩(wěn)定劑、增厚劑、潤滑劑和染料。優(yōu)選地，當(dāng)給藥哺乳動(dòng)物時(shí)，本發(fā)明的化合物和組合物和可藥用的媒介物、賦性劑，或稀釋劑是無菌的。當(dāng)靜脈給藥本發(fā)明的化合物時(shí)，水介質(zhì)是優(yōu)選的媒介物，例如水、鹽溶液、葡萄糖溶液和甘油溶液。
本發(fā)明的化合物和組合物可以是膠囊、片劑、丸劑、球劑、錠劑、粉劑、顆粒、糖漿、酏藥、溶液、混懸劑、乳劑、栓劑，或及其緩釋處方，或其他用于給藥哺乳動(dòng)物的劑型。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，作為適合人口服或靜脈給藥的藥物組合物，根據(jù)常規(guī)程序配制用于給藥的本發(fā)明的化合物和組合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，可藥用的媒介物是是硬膠囊。合適藥物媒介物的實(shí)施例及其配制方法在Remington得到描述(The Science and Practice of Pharmacy，Alfonso R.Gennaroed.，Mack Publishing Co.Easton，PA，19th ed.，1995年，86、87、88、91和92章，在此引用作為參考)用于口服而配制的本發(fā)明的化合物和組合物優(yōu)選膠囊、片劑、丸劑，或任何扁平的藥物劑型。在片劑或丸劑劑型中，可包埋化合物和組合物來延遲在胃腸道中崩解和吸收，從而提供長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)的持續(xù)作用。包裹了滲透活性的驅(qū)動(dòng)化合物的選擇性滲透膜，也適合本發(fā)明的化合物和組合物的口服給藥。在這些后來的平臺(tái)中，可膨脹來頂替藥劑或組合物藥劑的驅(qū)動(dòng)化合物，從縫隙中吸收了膠囊周圍環(huán)境的流體。與之即釋劑型的峰值圖相對(duì)，這些釋藥平臺(tái)能提供基本上釋藥零級(jí)圖。也可使用例如單硬脂酸甘油酯或硬脂酸甘油酯的時(shí)間延緩材料?？诜M合物包括標(biāo)準(zhǔn)媒介物、賦性劑，和稀釋劑，例如硬脂酸鎂、糖精鈉、纖維素、碳酸鎂、乳酸、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露糖、淀粉、阿拉伯膠、硅酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、水、糖漿，和甲基纖維素，配方另外包括潤滑劑，例如滑石、硬脂酸鎂、礦物油、潤濕劑、乳化懸浮劑、例如甲基和丙基羥苯甲酸鹽的防腐劑。所述的媒介物優(yōu)選是藥用級(jí)。本發(fā)明的口服給藥化合物和組合物優(yōu)選包括一種或多種甜味劑，例如果糖、天冬酰苯丙氨酸甲酯或糖精；一種或多種調(diào)味劑例如薄荷油、冬青油，或櫻桃；或者一種或多種著色劑來提供藥用的美味處理。
對(duì)于特殊病癥或病癥的治療，有效治療的給藥方案取決于它的本性和嚴(yán)重性，和根據(jù)醫(yī)師的判斷，通過標(biāo)準(zhǔn)臨床技術(shù)能得到確定。此外，體外或體內(nèi)測(cè)定能有用于確定最佳劑量。當(dāng)然，構(gòu)成有效治療劑量的本發(fā)明化合物的數(shù)量也取決于給藥途徑。通常，對(duì)于口服給藥的合適劑量范圍是每天每公斤體重約0.001毫克至20毫克的本發(fā)明化合物，優(yōu)選地，約0.7毫克至6毫克，更優(yōu)選地，約1.5毫克至4.5毫克。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，哺乳動(dòng)物，優(yōu)選地，人每天口服給藥約0.01mg至1000mg的發(fā)明化合物，更優(yōu)選地，每天約0.01mg至300mg，或者單次劑量或分次量約1mg至250mg。在此描述的劑量指給藥總量；即，如果給藥超過一種發(fā)明的化合物，優(yōu)選的劑量相當(dāng)于給藥發(fā)明的化合物的總量。口服組合物優(yōu)選含有按總量計(jì)算的10％至95％的發(fā)明化合物。優(yōu)選的單位口服劑量的類型包括丸劑、片劑，和膠南，更優(yōu)選膠南。一般地所述單位劑量的類型含有發(fā)明的化合物約0.01mg、0.1mg、1mg、5mg、10mg、15mg、20mg、50mg、100mg、250mg、或500mg，優(yōu)選地，每單位劑量約5mg至200mg化合物。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，能腸道外給藥本發(fā)明的化合物和組合物(例如，通過肌肉、鞘內(nèi)、靜脈，和動(dòng)脈途徑)。一般地，對(duì)于靜脈給藥，本發(fā)明的化合物和組合物是無菌等滲水媒介物的溶液，例如水、鹽水、林格式溶液，或葡萄糖溶液。必要的是，組合物也包括增溶劑。靜脈給藥的藥物優(yōu)選包括局部麻醉劑例如在注射位置鎮(zhèn)痛的利諾卡因。對(duì)于靜脈給藥，本發(fā)明的化合物和組合物可作為在密封容器中的無菌、凍干的粉末或無水濃縮物得到供應(yīng)，例如安瓿或cachette、標(biāo)明大量的活性劑容器。在靜脈給藥前以合適的水介質(zhì)稀釋所述的粉末或濃縮物。無菌水、鹽溶液、或其他合適水介質(zhì)的安瓿裝置給藥之前的、待稀釋的粉末或濃縮物?；蛞灾苽浜玫慕o藥的預(yù)混合類型來提供組合物。例如，當(dāng)通過靜脈注射給藥本發(fā)明化合物或組合物時(shí)，其能以盛有無菌藥用級(jí)水、鹽水、或其他合適的介質(zhì)的注射瓶來配制。
直腸給藥通過使用從常規(guī)載體(例如可可脂、改性植物油、和其他低級(jí)脂肪)配制的栓劑起作用。通過用公知配方和公知方法配制栓劑，例如參見RemingtonThe Science and Practice of Pharmacy，Alfonso R.Gennaro編輯，Mack Publishing Co.Easton，PA，第19版，1995，1591-1597頁，在此引用作為參考。
使用公知的例如洗劑、乳膏劑、軟膏劑的透皮和皮下輸入介質(zhì)，和例如貼片的透皮輸入裝置(Ghosh，T.K.；Pfister，W.R.；Yum，S.I.；“透皮的和局部給藥系統(tǒng)”；國際藥物化學(xué)出版社，249-297頁，在此引用作為參考)，來配制和給藥局部劑量類型。例如，設(shè)計(jì)的貼片盒類型包括了粘合劑包埋的底膜，和含有本發(fā)明化合物或組合物的貯存盒，其通過半透膜分離于皮膚(例如，美國專利號(hào)4,615,699，在此引用作為參考)。
本發(fā)明也提供藥學(xué)包裝物或藥盒，包括一或多種填充有一種或多種本發(fā)明化合物的貯存器。選擇性的聯(lián)合這些貯存器可通過政府機(jī)構(gòu)規(guī)定的形式來公告，這些機(jī)構(gòu)規(guī)定藥學(xué)或生物學(xué)產(chǎn)品的生產(chǎn)、使用或銷售。在一個(gè)實(shí)施方案中，藥盒由多種本發(fā)明化合物組成。在另一個(gè)實(shí)施方案中，藥盒由本發(fā)明化合物和其他生物學(xué)活性劑組成。
在用于人之前，優(yōu)選在體外和體內(nèi)檢測(cè)本發(fā)明的化合物的預(yù)期的治療或預(yù)防活性。例如，體外檢測(cè)能用于確定是優(yōu)選給藥本發(fā)明特殊化合物，還是本發(fā)明的組合化合物。使用動(dòng)物模型體系也可表明本發(fā)明的化合物和組合物的安全有效。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的其他方法也在本發(fā)明范圍之內(nèi)。
6.實(shí)施例6.1實(shí)施例1人血管生成測(cè)定的發(fā)展源自多能胎盤干細(xì)胞的自發(fā)性血管形成(試管形成)從非粘附群體中挑選粘附細(xì)胞24小時(shí)之后，立刻將多能干細(xì)胞植于群體之上。以補(bǔ)充10％的臍帶血血清(CBS)和抗生素的DMEM培養(yǎng)這些粘附細(xì)胞。微管結(jié)構(gòu)的組裝特點(diǎn)可確定自發(fā)性血管形成的時(shí)程表，和在不同時(shí)點(diǎn)測(cè)定特異性內(nèi)皮標(biāo)記物和合成產(chǎn)物來收集細(xì)胞標(biāo)本。基于這樣獲得的時(shí)期，可研究治療劑量和時(shí)間表來篩選候選血管生成調(diào)節(jié)化合物。
臍帶血管環(huán)的預(yù)處理在出生后12小時(shí)內(nèi)，將來自于人臍帶的血管切成近似直徑1-2mm和長(zhǎng)度1-2cm。單獨(dú)收集和培養(yǎng)動(dòng)脈和靜脈組織。用精細(xì)的解剖鑷和虹膜切除術(shù)剪刀將血管切成1-2mm長(zhǎng)度的片段，并植入含有2.5pg/ml兩性霉素B的DMEM中。使用前除去血管片段殘余的凝血塊和并在DMEM中浸濕。可在外科顯微鏡的輔助下進(jìn)行血管的解剖和切片。從小靜脈和動(dòng)脈源的血管可獲得類似的血管生成應(yīng)答，但是對(duì)于每次測(cè)定，則使用僅來自于一個(gè)血管的血管片段。
測(cè)定準(zhǔn)備在培養(yǎng)皿(10至25cm2)或6孔培養(yǎng)板(Costar，Cambridge，Mass.)中進(jìn)行測(cè)定，將其用0.1％凝膠(Sigma，St.Louis，MO)或MATRIGEL(BD Biosciences)預(yù)包埋處理來形成基質(zhì)。在包埋了平板后，在每個(gè)培養(yǎng)皿/孔中加入含50gl的人臍帶血漿的5ml DMEM，來在基質(zhì)上形成表面膜。在除去基質(zhì)后，每個(gè)培養(yǎng)皿/孔留下薄膜，將膜在37℃放置90分鐘。然后將血管環(huán)置于培養(yǎng)板或皿的中心位置。將培養(yǎng)皿分成四等分，并將血管環(huán)片段置于各個(gè)四分體的中心。對(duì)于6孔培養(yǎng)板，將血管環(huán)片段放入各個(gè)孔中。通常血管環(huán)片段在12小時(shí)內(nèi)粘附于包埋的基質(zhì)，讓培養(yǎng)基的條件不要由于浮力而分離血管切片。粘附之后，將血管置于添加了20％人臍帶血漿、L-谷氨酰胺、青霉素/鏈霉素和肝素的DMEM中，并在37℃下的潮濕環(huán)境中培養(yǎng)14-21天。約72小時(shí)間隔改變培養(yǎng)基。
有時(shí)纖維原細(xì)胞污染培養(yǎng)物，但通常僅以單層出現(xiàn)在培養(yǎng)孔的底部，因?yàn)椴幌駜?nèi)皮細(xì)胞，纖維原細(xì)胞不能侵襲MATRIGEL。血管片段不是接觸培養(yǎng)孔的塑料底而是懸浮于血纖蛋白凝膠中之處，可忽略纖維原細(xì)胞衍生物。為了抑制血塊凝縮和由此帶來的血纖蛋白原的污染，在培養(yǎng)基中加入纖溶抑制劑，6-氨基乙酸。
檢驗(yàn)化合物的給藥和評(píng)分結(jié)果一旦選擇了粘附干細(xì)胞，或一旦確定血管環(huán)已經(jīng)粘附于基質(zhì)，培養(yǎng)之初即給藥檢驗(yàn)化合物。每個(gè)檢驗(yàn)化合物在能生成劑量應(yīng)答分析的不同濃度下得到評(píng)價(jià)。
規(guī)定血管生成調(diào)節(jié)為同陽性和陰性對(duì)照相比，在每次測(cè)定中血管生成的變化。規(guī)定陽性對(duì)照為，對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)補(bǔ)充物(ECGS；200μ/ml；Collaborative Research，Bedford，MA)的應(yīng)答。規(guī)定陰性對(duì)照為對(duì)DMSO的應(yīng)答。
使用如下的符號(hào)表示法，將與陽性和陰性對(duì)照進(jìn)行定量比較的血管突起記分-陰性對(duì)照；+/-最低水平的陰性對(duì)照；+低水平的突起；++中水平的突起；+++高水平的突起；++++陽性對(duì)照的突起。也可通過形態(tài)測(cè)量源自血管環(huán)生長(zhǎng)的微米級(jí)血管萌芽的最大長(zhǎng)度，和內(nèi)皮細(xì)胞覆蓋的總面積(ECA)/血管環(huán)面積(VRA)來對(duì)血管突起記分。
移植測(cè)定由于在萌芽起點(diǎn)血管萌芽表現(xiàn)對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的存在和性質(zhì)敏感，使用調(diào)節(jié)方法來刺激血管外的生理環(huán)境。使用非變性人膠原基質(zhì)(Anthromatrix)，在上述血管環(huán)片段的相同條件下培養(yǎng)固定的人臍動(dòng)脈片段。作為調(diào)節(jié)，將這些血管片段包埋在基質(zhì)的固定位置。有了這些安排，內(nèi)芽在基質(zhì)上生長(zhǎng)，并從細(xì)胞培養(yǎng)皿中回收全部血管片段“盒”來用于分析。同上對(duì)血管生成程度記分。
免疫組織化學(xué)將表現(xiàn)出可檢測(cè)到的血管生成應(yīng)答(即新的血管生長(zhǎng))的平板4℃過夜固定于4％多聚甲醛的PBS中，以備免疫組化。石蠟包埋固定的基質(zhì)。從這些包埋的基質(zhì)，切出3um的組織學(xué)片段并在聚L-賴氨酸包埋的顯微鏡載片上包埋片段。將片段微波處理3分鐘并用0.1％胰島素的0.1％CaCl2中部分酶解以暴露抗原。然后將片段與抗體及用作檢測(cè)系統(tǒng)的、偶合了羊F(ab′)-2-抗鼠Ig(Amersham，Amersham，Herts.，英國)的辣根過氧化物酶反應(yīng)。以銀加強(qiáng)法將片段與二氨基聯(lián)苯胺反應(yīng)，并用蘇木精復(fù)染色。使用的抗體包括單克隆鼠抗人因子VIII相關(guān)抗原(Dako，丹麥)、抗人內(nèi)皮細(xì)胞mAb(Gibco，Grand Island，紐約)和John Curtin School of Medical Research生產(chǎn)的特異性CD31mAb(克隆20G5)。
對(duì)血管生成樣品進(jìn)行免疫組化染色來檢測(cè)因子VIII相關(guān)抗原，清楚地顯示衍生物是否血管的反應(yīng)。也可將血管與人內(nèi)皮細(xì)胞特異性的mAb(Gibco)及僅在內(nèi)皮細(xì)胞、血小板和一些白血球山表達(dá)的CD31 mAb反應(yīng)。有時(shí)，也可在電子顯微鏡下進(jìn)行血管生成樣品的檢測(cè)，來鑒別具有典型內(nèi)皮形態(tài)學(xué)的細(xì)胞。
確認(rèn)方法和測(cè)定在培養(yǎng)14-21天后，如上所述，量化血管生成和將其與對(duì)照培養(yǎng)進(jìn)行比較。
測(cè)定下列物質(zhì)以建立基準(zhǔn)值●肝素(100μg/ml)●低分子量的肝素(100μg/ml)●蘇拉明(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的有效抑制劑)(100μg/ml & 10μg/ml)●3-氫化可的松(10-5M)●3-氫化可的松(10-5M)和肝素(100μg/ml)●酸性纖維原細(xì)胞生長(zhǎng)因子(aFGF)的多克隆中和抗體●堿性纖維原細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)的多克隆中和抗體●aFGF和bFGF的多克隆中和抗體混合物●血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的多克隆中和抗體研究確認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)開展這些研究來證明該系統(tǒng)在測(cè)定已知的血管生成調(diào)節(jié)劑有效應(yīng)。
單獨(dú)的肝素和低分子量肝素(100μg/ml)通常不抑制血管生成。Flokman & Brem(1992)，“血管生成和發(fā)炎”，炎癥，基本原理和臨床性，Gallin等，Raven出版社，紐約。然而在顯示的測(cè)定中，這兩種分子顯示小的但重要的血管生成抑制作用。然而，這種抑制效果無法在其他測(cè)定中重現(xiàn)。相反，實(shí)際上在100μg/ml時(shí)蘇拉明抑制血管生成而在10μg/ml時(shí)該化合物便喪失了抑制活性。類似于肝素，單獨(dú)的氫化可的松通常有很小或沒有抗血管生成活性(Flokman &Brem(1992))。眾所周知，在10-5M相對(duì)高的濃度時(shí)，與DMSO(0.5％)稀釋的對(duì)照(CITATION)相比，氫化可的松不完全抑制血管生成。這里，然而，肝素和氫化可的松的組合幾乎完全抑制血管生成的應(yīng)答。所述的結(jié)果在體內(nèi)表明肝素和引起生長(zhǎng)毛細(xì)管的萎縮的類固醇一起有協(xié)同作用synergize(Flokman & Brem(1992))。
陽性對(duì)照生長(zhǎng)因子酸性纖維原細(xì)胞生長(zhǎng)因子(aFGF)和堿性纖維原細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)是已知的最有效的血管生成因子。最近，特別是在胚胎發(fā)生和實(shí)體腫瘤中，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子作為重要的血管生長(zhǎng)因子得以確定。表1提供了可能的陽性對(duì)照名單。
表1.天然存在的血管生成刺激物蛋白質(zhì)●酸性纖維原細(xì)胞生長(zhǎng)因子(aFGF)●血管生長(zhǎng)素●堿性纖維原細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)
●表皮生長(zhǎng)因子●粒細(xì)胞集落刺激因子●肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子●白細(xì)胞介素8●胎盤生長(zhǎng)因子●避免血小板的內(nèi)皮生長(zhǎng)因子●分散因子●轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α●腫瘤壞死因子α●血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)小分子●腺苷●丁酰甘油●煙酰胺●前列腺素E1和E2人們發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照抗體比較，抗bFGF和aFGF的多克隆中和抗體不完全抑制血管生成，兩者之中抗-bFGF抗體抑制效果更強(qiáng)。相反，抗VEGF的中和抗體對(duì)血管生成應(yīng)答沒有作用。這些數(shù)據(jù)表明bFGF和aFGF，但不是VEGF，在所述的體外血管生成測(cè)定中起重要作用。
為了量化陽性和/或最大的應(yīng)答，以血清饑餓進(jìn)行培養(yǎng)來減少自發(fā)性血管生成。這個(gè)步驟包括最初24小時(shí)內(nèi)在含有20％人血清的培養(yǎng)基中維持培養(yǎng)，然后下一個(gè)13-20天里在無血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)樣品，每3-4天更換培養(yǎng)基。將疑有增強(qiáng)血管生成活性的物質(zhì)分別等分試樣，并將其加入如上所述的單孔中。
對(duì)已知的前-血管生成因子研究用藥反應(yīng)數(shù)據(jù)評(píng)價(jià)不同濃度的血管生成生長(zhǎng)因子bFGF、aFGF和VEGF，來確定它們?cè)谘屦囸I培養(yǎng)中增強(qiáng)血管生成的能力。進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)用藥反應(yīng)分析。盡管使用“血清饑餓”培養(yǎng)條件來進(jìn)行測(cè)定，當(dāng)對(duì)增強(qiáng)血管生成的物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定時(shí)，使用含有內(nèi)皮細(xì)胞存活的最小量血清成分的培養(yǎng)基。
陰性對(duì)照同樣的用藥反應(yīng)分析，通過已知的證明有抗血管生成效果的因子得到進(jìn)行。
6.2實(shí)施例2ThalomidTM、ActimidTM和RevimidTM在衍生于胎盤的胚胎樣干細(xì)胞的增殖和分化中的作用以下實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)ThalomidTM、ActimidTM和RevimidTM在衍生于胎盤的胚胎樣干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)分化中的作用。在胎盤條件培養(yǎng)基和DMSO(對(duì)照)、ThalomidTM、ActimidTM或RevimidTM的存在下培養(yǎng)14天后，所培養(yǎng)的胚胎樣干細(xì)胞的形態(tài)學(xué)分化得到評(píng)價(jià)。在多種細(xì)胞標(biāo)記物的存在下檢驗(yàn)和評(píng)分細(xì)胞，也對(duì)形態(tài)學(xué)外表，例如在培養(yǎng)皿中所占的總面積和顯示出的分支和/或分叉的總數(shù)，進(jìn)行評(píng)分。
6.2.1材料與方法從在以上5.4節(jié)描述的胎盤中分離胚胎樣干細(xì)胞。使用上述的培養(yǎng)調(diào)節(jié)培養(yǎng)胚胎樣干細(xì)胞。
對(duì)CD34(早期造血祖細(xì)胞的標(biāo)記物；也是內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)記物)、CD45(除紅血球外的所有造血細(xì)胞的標(biāo)記物)、CD105(增殖內(nèi)皮細(xì)胞的標(biāo)記物)、平滑肌(SMC)特異性肌球蛋白重鏈、巢蛋白(血管生成的標(biāo)記物)、和膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)的表達(dá)細(xì)胞進(jìn)行評(píng)分。也可確定CD34細(xì)胞/TNC(細(xì)胞總數(shù))、CD45細(xì)胞/TNC和CD105細(xì)胞/TNC的比值。通過光學(xué)顯微鏡檢查所有的血管占據(jù)的面積或范圍，和是否它們顯示分支或分叉，也可對(duì)細(xì)胞評(píng)分。
6.2.2結(jié)果與討論下列表2-4和圖1A-1C，總結(jié)了結(jié)果。在表2中，如以下記分-未染色；+/-＜20％染色；+20-50％染色；++50-75％染色；+++＞75％染色。
表2中的結(jié)果顯示培養(yǎng)中，當(dāng)ThalomidTM、ActimidTM或RevimidTM和巢蛋白及膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)的表達(dá)細(xì)胞增加時(shí)，CD34、CD35和平滑肌(SMC)特異性肌球蛋白重鏈的表達(dá)細(xì)胞減少。
表2DMSO、ThalomidTM、ActimidTM或RevimidTM在CD34、CD45、肌球蛋白重鏈、巢蛋白或GFAP表達(dá)中的作用
在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，表3總結(jié)了結(jié)果，使用在上述的臍帶血管環(huán)檢測(cè)中描述的條件，及在DMSO(陰性對(duì)照)、ThalomidTM、ActimidTM或RevimidTM的胎盤條件培養(yǎng)基存在下，培養(yǎng)衍生于胎盤的胚胎樣干細(xì)胞。培養(yǎng)14天后，然后對(duì)CD34+、CD45+、CD105+的表達(dá)細(xì)胞免疫染色。
結(jié)果顯示在ThalomidTM、ActimidTM或RevimidTM存在下的培養(yǎng)引起表達(dá)CD34、CD45和CD105表達(dá)細(xì)胞數(shù)量的減少。參見圖2A-2C。
表3DMSO、ThalomidTM、ActimidTM或RevimidTM在培養(yǎng)胎盤干細(xì)胞中表達(dá)CD34、CD45、CD105的作用
在另一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，表4總結(jié)了結(jié)果，使用在上述的臍帶血管環(huán)檢測(cè)中描述的條件，及在ECGF、DMSO、ThalomidTM、ActimidTM或RevimidTM的胎盤條件培養(yǎng)基存在下，培養(yǎng)衍生于胎盤的胚胎樣干細(xì)胞。
“+”表示觀察到分支或分叉，“-”表示沒有觀察到分支或分叉。圖4的該結(jié)果顯示在ThalomidTM、ActimidTM或RevimidTM存在下培養(yǎng)胎盤胚胎樣干細(xì)胞，引起被細(xì)胞覆蓋的血管的總面積/范圍的減少，也引起細(xì)胞出現(xiàn)的分支和/或分叉的減少。
表4ECGF、ECGF+DMSO、ThalomidTM、ActimidTM或RevimidTM在血管生成的作用
6.3實(shí)施例3沙利度胺在體外血管生成測(cè)定法中的作用以下實(shí)施例表明了用于鑒定人血管生成調(diào)節(jié)劑的體外測(cè)定法發(fā)明的效果。當(dāng)與現(xiàn)有技術(shù)的體外檢測(cè)法比較，例如，大鼠主動(dòng)脈血管生成的測(cè)定法，本發(fā)明的體外檢測(cè)法顯示更高的特異性和敏感性，有利于檢測(cè)現(xiàn)有技術(shù)測(cè)定法無法檢測(cè)的血管生成調(diào)節(jié)劑。
6.3.1大鼠主動(dòng)脈血管生成測(cè)定250μl Matirgel覆蓋12孔組培級(jí)平板并將凝膠于37℃、5％CO2中放置30-45分鐘。從8至10周齡的雄性Sprague Dawley大鼠中切下胸主動(dòng)脈，并除去纖維脂肪組織。將主動(dòng)脈切斷成1mm長(zhǎng)的片段，用EGM-2(Clonetics Corp)洗滌8次，置于Matrigel包埋的孔中，用250μl Matrigel覆蓋，并讓膠于37℃中放置30-45分鐘。環(huán)在2mlEGM-2中培養(yǎng)24小時(shí)。24小時(shí)后，重組小鼠血管內(nèi)皮抑素在EBM中得到重新配制，并作為單獨(dú)處理在第一天得到加入。在存在或缺乏如表5所示的兔微粒體時(shí)，將沙利度胺按不同濃度(1μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、50μg/ml和100μg/ml)加入。每天對(duì)主動(dòng)脈環(huán)照相。
表5的結(jié)果表明為了有效抑制血管形成，沙利度胺需要添加兔微粒體。然而ActimidTM不需要微粒體來抑制血管形成。
表5沙利度胺在大鼠主動(dòng)脈血管生成測(cè)定(表達(dá)的&對(duì)照的)中平均微血管生長(zhǎng)的作用
6.3.2人血管生成受過訓(xùn)練的醫(yī)務(wù)人員在來自當(dāng)?shù)蒯t(yī)院知情同意的完全供體上，采集新鮮人臍帶血。三小時(shí)內(nèi)運(yùn)到并處理臍帶。用冷基礎(chǔ)營養(yǎng)培養(yǎng)基洗滌臍帶和血管腔。在無菌環(huán)境中，使用機(jī)械法、鑷子和外科小剪刀從臍帶上除去動(dòng)脈。清除血管上的結(jié)締組織并將血管環(huán)橫切成1mm的長(zhǎng)度。將血管環(huán)置于50ml錐形底試管的EGM-2培養(yǎng)基(Clonetics Corp.)中，4℃保存。用250ml Matrigel覆蓋六孔組培平板，并將凝膠于37℃、5％CO2中放置30-45分鐘。用EGM-2培養(yǎng)基洗滌血管環(huán)，并將其置于Matrigel包埋孔中，添加250μl Matrigel覆蓋，及將凝膠于37℃下放置30-45分鐘(參見圖6)。將血管在4ml EGM-2中培養(yǎng)24小時(shí)，讓組織適應(yīng)新環(huán)境。溫育24小時(shí)后，或用作為對(duì)照的0.1％DMSO，或用不同濃度的化合物(沙利度胺或CC-4047)來處理血管環(huán)?？偣?周，每周更換兩次培養(yǎng)基。
將化合物在培養(yǎng)血管環(huán)中的效果與DMSO在培養(yǎng)血管環(huán)中的效果相比。使用Image-ProPlus軟件(MediaCybernetic，Inc.Carsbad，California)分析結(jié)果。
如表6和圖4至5所示，當(dāng)與DMSO處理的樣品比較時(shí)，沙利度胺和ActimidTM對(duì)微血管突起的抑制作用呈劑量依賴性。這些實(shí)驗(yàn)得到重復(fù)進(jìn)行，并取同一實(shí)驗(yàn)中的兩個(gè)血管環(huán)的平均結(jié)果。在實(shí)驗(yàn)中，以不同濃度的煙曲霉素作為陽性對(duì)照。
表6人血管生成檢測(cè)中，沙利度胺和Actimid對(duì)微血管生長(zhǎng)的作用
特別指出檢測(cè)中對(duì)于人或兔微粒體，不需要沙利度胺的參與(比較人血管環(huán)結(jié)果和兔血管環(huán)結(jié)果)。
6.4實(shí)施例4使用血管環(huán)和干細(xì)胞測(cè)定血管生成調(diào)節(jié)劑將至少十個(gè)單獨(dú)培養(yǎng)的血管環(huán)與干細(xì)胞共培養(yǎng)，來有效重建血管的天然環(huán)境。可如以上實(shí)施例1中所示，獲得血管片段并在平板培養(yǎng)。將來自于胎盤的胚胎樣干細(xì)胞和血管片段一起置于平板培養(yǎng)，并讓血管環(huán)和干細(xì)胞粘附在一起。培養(yǎng)12小時(shí)后，溫和洗滌來除去非粘附的干細(xì)胞。將共培養(yǎng)物至少分為2組。然后設(shè)置一組共培養(yǎng)物用DMSO處理來作為對(duì)照。設(shè)置第二組共培養(yǎng)物用檢驗(yàn)化合物處理。其他共培養(yǎng)物可作為陽性對(duì)照或其他對(duì)照而進(jìn)行處理。將共培養(yǎng)的干細(xì)胞和血管環(huán)追加培養(yǎng)21天。在21天的末期，檢查對(duì)照和測(cè)試共培養(yǎng)物，并通過圖像掃描確定血管生成的范圍。測(cè)試共培養(yǎng)物表明如果微血管突起的平均面積大于對(duì)照共培養(yǎng)物的血管突起的平均面積，檢驗(yàn)化合物是血管生成的，如果微血管突起的平均面積小于對(duì)照的平均面積，檢驗(yàn)化合物是抗血管生成的。
6.5實(shí)施例5使用血管環(huán)和腫瘤細(xì)胞測(cè)定血管生成調(diào)節(jié)劑將至少十個(gè)單獨(dú)培養(yǎng)的血管環(huán)和腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)，來有效重建血管的腫瘤內(nèi)或外周的天然環(huán)境?？扇缫陨蠈?shí)施例1中所示，獲得血管片段并在平板培養(yǎng)。即可從腫瘤樣品中，也可從腫瘤細(xì)胞系中獲得腫瘤細(xì)胞。將腫瘤細(xì)胞和血管切片在平板培養(yǎng)以形成共培養(yǎng)物，并讓血管切片和干細(xì)胞粘附在一起。將共培養(yǎng)物至少分為2組。設(shè)置一組共培養(yǎng)物用DMSO處理來作為對(duì)照。設(shè)置第二組共培養(yǎng)物用檢驗(yàn)化合物處理。其他共培養(yǎng)物可作為陽性對(duì)照或其他對(duì)照而進(jìn)行處理。將共培養(yǎng)的干細(xì)胞和血管環(huán)追加培養(yǎng)21天。在21天的末期，檢查對(duì)照和測(cè)試共培養(yǎng)物，并通過圖像掃描確定血管生成的范圍。測(cè)試共培養(yǎng)物表明如果微血管突起的平均面積大于對(duì)照共培養(yǎng)物的血管突起的平均面積，檢驗(yàn)化合物是血管生成的，如果微血管突起的平均面積小于對(duì)照的平均面積，檢驗(yàn)化合物是抗血管生成的。
本發(fā)明的范圍不受這里所描述的具體實(shí)施方案的限制。事實(shí)上，除了這里描述的，從前面的描述中，本發(fā)明的多種改進(jìn)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。這些改進(jìn)也用于落入所附的權(quán)利要求范圍內(nèi)。
7.參考文獻(xiàn)與本文為了所有目的而引用每一個(gè)個(gè)別的出版物、專利或?qū)＠暾?qǐng)的全部?jī)?nèi)容作為參考的程度一樣，本文為了所有的目的引用所有參考文獻(xiàn)的全部?jī)?nèi)容作為參考。
引用任何出版物都是由于其
公開日早于本申請(qǐng)日并且不能解釋為一種許可，即本發(fā)明并不能由于在先發(fā)明的作用而提早這種
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權(quán)利要求
1.一種鑒定血管生成調(diào)節(jié)劑的方法，其包括(a)在檢驗(yàn)化合物的存在下和適于內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的條件下，將多個(gè)干細(xì)胞培養(yǎng)一段時(shí)間；和(b)將在所述檢驗(yàn)化合物的存在下源自所述干細(xì)胞的微血管突起的量與作為對(duì)照的微血管突起的量進(jìn)行比較，其中如果所述微血管突起大于或小于所述微血管突起的對(duì)照水平，該檢驗(yàn)化合物被鑒定為血管生成調(diào)節(jié)劑。
2.權(quán)利要求1的方法，其中將所述干細(xì)胞和血管切片一起培養(yǎng)。
3.權(quán)利要求1的方法，其中將所述干細(xì)胞和多個(gè)腫瘤細(xì)胞一起培養(yǎng)。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述腫瘤細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞系的細(xì)胞。
5.權(quán)利要求1的方法，其中將所述干細(xì)胞還在氫化可的松、表皮生長(zhǎng)因子、或牛腦提取物的存在下培養(yǎng)。
6.權(quán)利要求1的方法，其中所述血管生成調(diào)節(jié)劑被確定為抗血管生成劑。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述血管生成調(diào)節(jié)劑被確定血管生成劑。
8.權(quán)利要求1的方法，其中在檢驗(yàn)化合物的存在下，將所述多個(gè)干細(xì)胞至少培養(yǎng)7天。
9.權(quán)利要求1的方法，其中在檢驗(yàn)化合物的存在下，將所述多個(gè)干細(xì)胞至少培養(yǎng)14天。
10.權(quán)利要求1的方法，其中將所述干細(xì)胞在含有血纖蛋白的基質(zhì)上培養(yǎng)。
11.權(quán)利要求1的方法，其中將所述干細(xì)胞在含有血纖蛋白的生理凝膠中培養(yǎng)。
12.權(quán)利要求1的方法，其中將所述干細(xì)胞在含有非變性膠原的生理凝膠中培養(yǎng)。
13.一種鑒定血管生成調(diào)節(jié)劑的方法，其包括(a)在多個(gè)腫瘤細(xì)胞和檢驗(yàn)化合物的存在下及適于內(nèi)皮細(xì)胞和所述腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的條件下，培養(yǎng)血管切片一段時(shí)間；和(b)將在所述檢驗(yàn)化合物的存在下源自所述血管切片的微血管突起的量與作為對(duì)照的微血管突起的量進(jìn)行比較，其中如果所述微血管突起大于或小于所述微血管突起的對(duì)照水平，該檢驗(yàn)化合物被鑒定為血管生成調(diào)節(jié)劑。
14.一種治療個(gè)體的方法，所述個(gè)體具有與異常血管生長(zhǎng)有關(guān)的疾病或病癥，包括給藥所述個(gè)體有效治療量的TNF-α抑制劑。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述TNF-α抑制劑是IMiDTM。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述IMiDTM是ActimidTM或RevimidTM。
17.權(quán)利要求14的方法，其中所述疾病或病癥是癌癥。
18.權(quán)利要求17的方法，其中所述癌癥是轉(zhuǎn)移性癌癥。
19.權(quán)利要求17的方法，其中所述癌癥是乳癌。
20.權(quán)利要求14的方法，其中所述疾病或病癥選自于炎癥、子宮內(nèi)膜異位、關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化斑、糖尿病性視網(wǎng)膜病、新生血管性青光眼、沙眼、角膜移植物新血管化、牛皮癬、硬皮病、血管瘤和肥大性疤痕、血管粘連和血管纖維瘤。
21.一種抑制血管生成的方法，其包括用TNF-α抑制劑接觸多個(gè)細(xì)胞，所述多個(gè)細(xì)胞能形成血管。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述TNF-α抑制劑是ActimidTM或RevimidTM。
23.權(quán)利要求21的方法，其中所述多個(gè)細(xì)胞是個(gè)體之內(nèi)的多個(gè)細(xì)胞。
24.權(quán)利要求21的方法，其中所述多個(gè)細(xì)胞是在細(xì)胞培養(yǎng)中的多個(gè)細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用人細(xì)胞來鑒定血管生成調(diào)節(jié)劑的方法。在體外測(cè)定系統(tǒng)中，利用人多能干細(xì)胞，本發(fā)明方法能用于測(cè)定調(diào)節(jié)人血管生成的化合物和小分子。本發(fā)明還涉及在體外檢測(cè)系統(tǒng)中，利用非胚胎多能干細(xì)胞，通過確定檢驗(yàn)化合物調(diào)節(jié)自發(fā)性血管形成的能力來鑒定人血管生成調(diào)節(jié)劑的方法。本發(fā)明涉及體外測(cè)定系統(tǒng)，其利用了非胚胎多能干細(xì)胞來鑒定可調(diào)節(jié)人血管生成或人血管形成的化合物。本發(fā)明也涉及需要調(diào)節(jié)人血管生成或血管形成的治療方法，其包括將這種已被確定是人血管生成或血管形成抑制劑的化合物或小分子對(duì)需要這種治療的患者進(jìn)行給藥。
文檔編號(hào)G01N33/50GK1658848SQ03813733
公開日2005年8月24日 申請(qǐng)日期2003年4月14日 優(yōu)先權(quán)日2002年4月12日
發(fā)明者R·J·哈里里, F·佩范迪, L·吳, D·I·斯蒂爾林, Q·葉 申請(qǐng)人:細(xì)胞基因公司