專利名稱：探針載體及其生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及高密度陣列(DNA芯片)，在固體表面上排列了多個DNA片段和寡核苷酸，可用于同時分析基因表達(dá)，突變和多態(tài)性等。
背景技術(shù)：
將能夠特異性地結(jié)合靶物質(zhì)的探針固定在基質(zhì)上的多種方法是已知的。具體地講，所述方法包括這樣的方法，其中，探針的合成是在基質(zhì)上進(jìn)行的，以便將所述探針固定在所述基質(zhì)上，以及這樣一種方法，其中，通過別針或沖壓方式將預(yù)先提供的探針提供到基質(zhì)上，以便將所述探針固定在所述基質(zhì)上。
作為在基質(zhì)上進(jìn)行探針合成的固定方法，已知有這樣的方法，其中，例如在USP 51438545中所述的，通過激活劑將保護(hù)基團(tuán)從所述基質(zhì)的選定部位除去，并且將具有可除去的保護(hù)基團(tuán)的單體反復(fù)結(jié)合到所述選定部位，以便在所述基質(zhì)上合成具有各種序列的聚合物。
另外，作為將預(yù)先提供的探針提供在基質(zhì)上以便將所述探針固定在所述基質(zhì)上的方法，已知有這樣的方法，其中，例如在日本專利公開號8-23975中所述的，讓由基質(zhì)和具有攜帶在所述基質(zhì)上的碳化二亞胺基團(tuán)的聚合物組成的用于固定探針的材料與對碳化二亞胺基團(tuán)具有反應(yīng)性的生物活性物質(zhì)接觸，由此將所述探針固定在所述基質(zhì)上。另外，正如在日本專利申請公開號8-334509中所披露的，有一種方法是已知的，其中，在檢測生物學(xué)活性物質(zhì)時，通過碳化二亞胺基團(tuán)將探針固定在具有碳化二亞胺的化合物上，由此檢測所述物質(zhì)。
另外，在日本專利申請公開號2001-178442中披露了一種將DNA片段固定在固相載體表面上的方法，包括使末端具有硫醇基團(tuán)的DNA片段與固相載體接觸，在所述固相載體的表面上固定了具有活性取代基的排列分子(liner molecule)，它在與位于末端的硫醇基團(tuán)起反應(yīng)時能形成共價鍵，從而在所述DNA片段和所述鏈分子之間形成共價鍵。在上述文獻(xiàn)中披露的能夠與硫醇基團(tuán)起反應(yīng)形成共價鍵的所述活性取代基的具體例子包括具有選自下列一組的基團(tuán)的取代基馬來酰亞胺基，α，β-不飽和羰基，α-鹵代羰基，鹵化烷基，氮丙啶基，和二硫基。
例如，正如在Analytical Biochemistry 292，250-256中所披露的，用離子鍵將探針固定在基質(zhì)上的方法包括這樣一種方法，其中，將氨基硅烷偶聯(lián)劑固定在固相上，并且通過氨基硅烷偶聯(lián)劑的氨基上的正電荷和寡核苷酸的磷酸部分上的負(fù)電荷之間的相互作用而固定探針。
不過，在日本專利申請公開號2001-178442中所披露的固定探針的方法中，探針在固相載體表面上的固定是通過以下方法實(shí)現(xiàn)的使固相載體表面上的具有硫醇基團(tuán)的探針與固相載體的表面起反應(yīng)，以便導(dǎo)入所述取代基，所述表面是通過接觸硅烷偶聯(lián)劑處理過的，所述耦合劑具有要導(dǎo)入所述固相載體的表面上的取代基；然后使具有能夠與硅烷偶聯(lián)劑起反應(yīng)的末端和能夠與硫醇基團(tuán)起反應(yīng)的末端的物質(zhì)與所述取代基起反應(yīng)。就是說，為了將具有硫醇基團(tuán)的所述探針固定在所述固相載體的表面上，在用硅烷偶聯(lián)劑處理所述固相載體的表面之后，需要進(jìn)一步的處理。
另外，在所述方法中，氨基基團(tuán)的正電荷和寡核苷酸的磷酸部分的負(fù)電荷之間的相互作用被用來固定探針，在所述基質(zhì)上磷酸基團(tuán)和氨基基團(tuán)之間的結(jié)合狀態(tài)是不確定的，因此，所述探針和載體之間的離子鍵受到雜交反應(yīng)和隨后的洗滌步驟中使用的溶液的離子強(qiáng)度的影響。這有可能影響隨后進(jìn)行的分析的結(jié)果。
發(fā)明說明因此，本發(fā)明的目的是提供一種將探針固定在基質(zhì)上的方法，其中，用于將所述探針固定在所述基質(zhì)上所需要的處理步驟數(shù)減少了，并且可以獲得簡單和牢固的固定。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明涉及在它上面固定了能特異性結(jié)合靶物質(zhì)的探針的探針載體，所述探針是通過以下物質(zhì)固定在所述載體上a)與所述探針結(jié)合的接頭；b)與所述接頭結(jié)合的第一官能團(tuán)；和c)與第一官能團(tuán)的第二官能團(tuán)，其中，第一官能團(tuán)和第二官能團(tuán)的組合包括酸性官能團(tuán)和堿性官能團(tuán)。
另外，本發(fā)明涉及固定上述探針的方法。
另外，本發(fā)明涉及用于生產(chǎn)上述探針載體的裝置。
另外，本發(fā)明涉及檢測方法，包括將含有要檢測的物質(zhì)的分析物放置在上述探針載體中，并且檢測與所述探針載體結(jié)合的所述分析物中要檢測的物質(zhì)。
另外，本發(fā)明涉及檢測裝置，它包括用于將含有要檢測的物質(zhì)的分析物放置在上述探針載體中的設(shè)施，和用于檢測與所述探針載體結(jié)合的所述分析物中要檢測的物質(zhì)的設(shè)施。
另外，本發(fā)明還涉及通過使用NMR選擇官能團(tuán)的可供利用的組合的方法。
附圖的簡要說明

圖1是顯示實(shí)施例11的結(jié)果的曲線圖。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方式本發(fā)明涉及探針載體，它包括固相載體和固定在所述固相載體上的探針，所述探針能夠特異性地結(jié)合靶物質(zhì)，這種結(jié)合是通過以下方式實(shí)現(xiàn)的(a)接頭；(b)所述接頭上所包含的第一官能團(tuán)；和(c)所述接頭上所包含的第二官能團(tuán)，并且涉及固定探針的方法。
作為固相載體的基質(zhì)沒有特別的限制，只要它不會對將探針固定在它上面以及使用所獲得的固定了探針的基質(zhì)檢測要檢測的物質(zhì)(靶物質(zhì))造成破壞就行，具體地講，優(yōu)選的是，當(dāng)導(dǎo)入不與接頭直接結(jié)合的第二官能團(tuán)時，用具有第二官能團(tuán)或能夠衍生第二官能團(tuán)的官能團(tuán)的硅烷偶聯(lián)劑處理所述基質(zhì)。所述基質(zhì)沒有特別限制，只要與硅烷偶聯(lián)劑的反應(yīng)能夠有效進(jìn)行就行。具體地講，石英，玻璃，硅石，氧化鋁，滑石，黏土，鋁，氫氧化鋁，鐵，和云母等都是優(yōu)選的。還可以使用氧化物，如氧化鈦，鋅白，和氧化鐵。另外，當(dāng)考慮到靶物質(zhì)的檢測和所述基質(zhì)材料的多樣性時，無堿性玻璃或不含堿性成分的石英基質(zhì)材料是特別優(yōu)選的。
在將樹脂用作基質(zhì)時，樹脂對所述硅烷偶聯(lián)劑的親和力必須改進(jìn)，例如，通過將所述樹脂硅烷化來實(shí)現(xiàn)。對于硅烷化來說，例如，可以使用這樣的方法，其中，讓烯烴和具有乙烯基的硅烷偶聯(lián)劑共聚化，以便產(chǎn)生硅烷化的聚烯烴；或使用這樣一種方法，其中，用具有環(huán)氧基的硅烷偶聯(lián)劑處理具有羧基的聚合物的表面。不過，所述硅烷化方法并不局限于上述方法，只要可以改善對硅烷偶聯(lián)劑的親和力就行。
另外，可以對具有官能團(tuán)的樹脂進(jìn)行表面的處理，以便將所述官能團(tuán)轉(zhuǎn)化成具有堿性或酸性的第二官能團(tuán)?；蛘?，可以使用在聚合物的側(cè)鏈或在聚合物的末端具有表現(xiàn)出堿性或酸性的基團(tuán)的樹脂。
作為具有堿性的第二官能團(tuán)的官能團(tuán)典型例子包括氨基。在選擇氨基作為第二官能團(tuán)時，具有氨基的硅烷偶聯(lián)劑的例子包括N-β-(氨乙基)-γ-氨基丙基三烷氧基硅烷，N-β-(氨乙基)-γ-氨基丙基甲基二烷氧基硅烷，γ-氨基丙基三烷氧基硅烷，γ-氨基丙基甲基二烷氧基硅烷，N，N-二甲基氨基丙基三烷氧基硅烷，N-甲基氨基丙基三烷氧基硅烷，和N-苯基-γ-氨基丙基三烷氧基硅烷。比較理想的是所述硅烷偶聯(lián)劑中所包含的氨基基團(tuán)具有某些堿性。具體地講，在將巰基基團(tuán)用于探針時，所述氨基基團(tuán)的解離常數(shù)優(yōu)選為1.0×10-6或更高。另外，考慮到所述官能團(tuán)的反應(yīng)性，伯氨基或仲氨基基團(tuán)因?yàn)榫哂休^低的位阻而是優(yōu)選的。所述烷氧基甲硅烷基優(yōu)選是能以高速度水解的甲氧基甲硅烷基或乙氧基甲硅烷基。
應(yīng)當(dāng)指出的是，對于諸如氨基基團(tuán)這樣的具有Bronsted堿特性的取代基來說，所述基團(tuán)在水中的解離常數(shù)可通過公式1所示平衡公式的平衡常數(shù)(公式2)計算得到。
(公式1)其中R＝H或有機(jī)取代基，如烷基或芳基。
K=[NHR3+][OH-][NR3]]]>(公式2)在使用所述堿性硅烷偶聯(lián)劑的情況下，所述硅烷偶聯(lián)劑通過接頭與具有酸性官能團(tuán)的探針形成離子性結(jié)合。酸性官能團(tuán)的例子包括巰基(-SH)，磺基(-SO3-)，和羧基(-COOH)。具體地講，氨基基團(tuán)與巰基的組合提供了相對較強(qiáng)的離子鍵，正如在以下文獻(xiàn)中所披露的J.Colloid Interface Sci.，195(1997)338。
相反，存在這樣一種方法，其中，用具有諸如羧基或巰基的酸性基團(tuán)或可以由它衍生的官能團(tuán)作為第二官能團(tuán)的硅烷偶聯(lián)劑處理固相載體，并且，通過接頭與具有堿性官能團(tuán)的探針離子性結(jié)合。不過，對于巰基來說，它傾向于通過二硫鍵二聚體化，因此優(yōu)選阻止二聚體化的發(fā)生。
另外，在將具有核酸的核酸探針用于本發(fā)明的場合下，比較有利的是，任意一個酸性基團(tuán)優(yōu)選是具有的酸性比構(gòu)成所述核酸探針的磷酸基團(tuán)更強(qiáng)的官能團(tuán)。這樣可以提供一種即使在磷酸基和氨基解離的條件下也能夠保持固定在所述固相上的探針。就是說，即使在進(jìn)行雜交時的劇烈處理的場合下，也可以提供能夠有正確分析結(jié)果的優(yōu)選的芯片。
應(yīng)當(dāng)指出的是，本發(fā)明的硅烷偶聯(lián)劑是指這樣的化合物，它具有能夠與有機(jī)化合物(如樹脂)起反應(yīng)的有機(jī)官能團(tuán)，并且具有能夠通過硅氧烷鍵與無機(jī)化合物(如玻璃)結(jié)合的部分。
所述基質(zhì)的形狀沒有特別的限制。不過，以DNA芯片為例，考慮到檢測方法和裝置的多樣性，所述基質(zhì)優(yōu)選是平板形式的。另外，所述平板材料優(yōu)選是具有高的表面光滑度的平板材料，具體地講，大小為1英寸×3英寸，厚度為大約0.7-1.5mm的平板。
在用硅烷偶聯(lián)劑處理所述基質(zhì)的表面時，優(yōu)選事先洗滌所述表面。作為洗滌方法，有多種洗滌方法是已知，例如用水洗滌，用化學(xué)溶液洗滌，用等離子體(plasma)洗滌，和用UV臭氧洗滌。不過，作為能夠簡單地和均勻地洗滌基質(zhì)表面的方法，優(yōu)選用化學(xué)溶液洗滌。合適的洗滌方法可以根據(jù)所述基質(zhì)的類型而改變。例如，在將玻璃用作基質(zhì)時，可以采用這樣的方法，其中，用具有預(yù)定濃度的氫氧化鈉水溶液充分洗滌基質(zhì)表面，以便除去附著在所述基質(zhì)上的污染物。具體地講，提供加熱到大約60℃的1mol/l氫氧化鈉的水溶液，并且在所述水溶液中擦拭所述基質(zhì)的表面，或在將所述水溶液噴淋在所述表面上時進(jìn)行刷洗，以便明顯除去附著在所述基質(zhì)上的污物或污染物。在除去污物之后，用水充分洗去多余的氫氧化鈉。最后，通過以下方法除去水分，例如其中將諸如氮?dú)獾亩栊詺怏w吹在所述基質(zhì)表面上的方法。
作為涂敷硅烷偶聯(lián)劑的方法，可以使用浸入方法(浸泡方法)，旋涂方法，噴涂方法，和水表面鑄造方法等。具體地講，優(yōu)選能夠進(jìn)行簡單和均勻處理的浸泡方法。在這種情況下，所述處理優(yōu)選是按以下方式進(jìn)行的。就是說，將洗滌過的基質(zhì)浸泡在濃度為0.1-2.0wt％的硅烷偶聯(lián)劑水溶液中，并且在反應(yīng)結(jié)束之后，將多余的含有所述硅烷偶聯(lián)劑的溶液洗掉。不過，所述水溶液的濃度和涂敷方法沒有特別的限制。
另外，優(yōu)選從所述基質(zhì)上除去所述多余的硅烷偶聯(lián)劑，并且通過在大約100-120℃的溫度下加熱使它干燥。
以氨基硅烷偶聯(lián)劑為例，固定在上述基質(zhì)上的硅烷偶聯(lián)劑中所包含的堿性氨基基團(tuán)伴隨著與巰基形成的氫鍵，所述巰基是通過接頭或所述氨基基團(tuán)的質(zhì)子化導(dǎo)入所述探針的酸性取代基，從而它們能夠通過離子鍵彼此相互作用。這使得能夠?qū)⑺鎏结樄潭ㄔ谒龌|(zhì)上。為此，理想的是所述硅烷偶聯(lián)劑中所包含的氨基基團(tuán)具有某種程度的堿性。
可以通過NMR光譜方便地觀察導(dǎo)入所述探針內(nèi)的酸性取代基形式的巰基基團(tuán)與堿性的氨基基團(tuán)的相互作用。因此，為了方便地評估具有適合導(dǎo)入到基質(zhì)表面上的堿性的氨基基團(tuán)，可以使用NMR光譜。就是說，當(dāng)將模擬已經(jīng)導(dǎo)入了巰基的探針的烷基硫醇(例如丙硫醇)與被認(rèn)為適于固定探針的氨基硅烷偶聯(lián)劑或模擬氨基硅烷偶聯(lián)劑的胺化合物(如N-丙基乙二胺)在諸如氧化氘的質(zhì)子溶劑中混合并且觀察NMR光譜時，可以在代表所述胺化合物的信號的化學(xué)偏移值中觀察明顯的低場偏移。另一方面，在代表硫醇的信號的化學(xué)偏移值中觀察到了顯著的高場偏移。另外，二維NMR光譜的測定使它可以觀察上述胺化合物和烷基硫醇之間的相互作用。相當(dāng)于具有所述改變的胺化合物的所述氨基基團(tuán)是具有適合固定其中已導(dǎo)入了巰基基團(tuán)的探針的堿性的基團(tuán)。另外，通過直接評估所使用的胺化合物的堿性強(qiáng)度，可以選擇所述氨基基團(tuán)。
另外，用于本發(fā)明的探針包括蛋白(包括復(fù)合蛋白)，核酸，糖鏈(包括糖綴合物)，脂類(包括綴合的脂類)，以及類似的生物聚合物。具體地講，所述探針包括酶，激素，外激素，抗體，抗原，半抗原，肽，合成肽，DNA，合成DNA，RNA，合成RNA，PNA，合成PNA，神經(jīng)節(jié)苷脂，和凝集素等。在介質(zhì)中所含有的探針的量如下。就是說，例如，對于核酸探針來說，優(yōu)選對核酸探針的量進(jìn)行調(diào)整，以便在所述介質(zhì)中所包含的2聚體-500聚體、特別是2聚體-80聚體核酸的濃度為0.05-500μmol/l，特別是0.5-50μmol/l。
當(dāng)?shù)谝还倌軋F(tuán)被導(dǎo)入探針時，它是通過接頭導(dǎo)入的。在這里，術(shù)語“接頭”表示存在于所述探針和第一官能團(tuán)之間，并且將所述探針連接在第一官能團(tuán)上的物質(zhì)。所述接頭沒有特別的限制，只要它能實(shí)現(xiàn)所述目的就行。優(yōu)選亞甲基鏈或聚醚鏈。另外，優(yōu)選具有1-20個原子的線性接頭。
為了將第一官能團(tuán)導(dǎo)入所述探針，在與所述探針起反應(yīng)的官能團(tuán)和第一官能團(tuán)之間提供具有接頭的化合物，并且所述化合物能與所述探針起反應(yīng)。在這種情況下，為了防止第一官能團(tuán)參與與所述探針的反應(yīng)，優(yōu)選用保護(hù)基團(tuán)保護(hù)第一官能團(tuán)，并且在與所述探針的反應(yīng)結(jié)束之后除去第一官能團(tuán)的保護(hù)基團(tuán)。
具體地講，例如，當(dāng)將巰基基團(tuán)導(dǎo)入自動合成的探針的5′-末端時，在通過DNA自動合成儀合成時可以使用5′-Thiol-Modifier C6(由Glen Research生產(chǎn))等。另外，在導(dǎo)入氨基基團(tuán)時，在通過DNA自動合成儀合成時可以使用5′Amino-Modifier 5(由Glen Research生產(chǎn))等。
應(yīng)當(dāng)指出的是，如果能夠有效導(dǎo)入包括巰基基團(tuán)的第一官能團(tuán)，則導(dǎo)入方法和接頭的類型沒有特別的限制。
本發(fā)明的堿性官能團(tuán)和酸性官能團(tuán)的組合實(shí)現(xiàn)了與通過完全共價鍵不同的靜態(tài)鍵將探針固定在固相上。在本發(fā)明的堿性官能團(tuán)和酸性官能團(tuán)的組合中，重要的是，固定在所述固相上的探針在分析期間不會解離。例如，當(dāng)核酸分子固定在探針上并且要檢測與靶核酸的雜交反應(yīng)時，重要的是，所述探針一直是穩(wěn)定地結(jié)合在所述固相上的，即使是在雜交時和雜交之后的洗滌步驟中的pH，鹽濃度和溫度條件下也是如此。為此，通常通過共價鍵在所述探針和所述固相之間形成相對強(qiáng)的鍵。不過，作為本發(fā)明人研究的結(jié)果，業(yè)已發(fā)現(xiàn)了通過形成相對較強(qiáng)的靜態(tài)鍵，而不是共價鍵，可以實(shí)現(xiàn)這一目的?；谶@一發(fā)現(xiàn)實(shí)現(xiàn)了本發(fā)明。
另外，優(yōu)選使用官能團(tuán)的組合，就是說，使用解離常數(shù)為1.0×10-12或更高的酸性官能團(tuán)和解離常數(shù)為1.0×10-6或更高的堿性官能團(tuán)。
為了提供探針，通過諸如噴墨方法，針點(diǎn)方法和針環(huán)方法等將所述探針溶解或分散在含水介質(zhì)中所制備的含水液體點(diǎn)在具有堿性基團(tuán)的基質(zhì)上。
不過，本發(fā)明并不局限于上述方法，相反，可以使用采用光學(xué)平板印刷術(shù)的方法。另外，所述斑點(diǎn)可以具有各種形狀，如圓形，矩形，和多角形。所述斑點(diǎn)的直徑優(yōu)選為5μm-500μm。
對于形成斑點(diǎn)的方法來說，噴墨方法是特別優(yōu)選的，因?yàn)樵谏鲜龈鞣N形成斑點(diǎn)的方法中，它能夠形成高密度和精確的斑點(diǎn)。噴墨方法表示這樣一種方法，其中，將含有探針的溶劑裝載在非常細(xì)的噴頭中。然后，對所述噴頭尖附近的部分進(jìn)行即時加壓或加熱，以便從所述噴頭尖噴出精確的極少數(shù)量的含有所述探針的溶劑，并且讓所述溶劑飛到基質(zhì)的表面上，以便將含有所述探針的溶劑結(jié)合在所述基質(zhì)的表面上。
在通過噴墨方法形成斑點(diǎn)的方法中，所述探針介質(zhì)中所包含的成分沒有特別的限制，只要所述成分在以探針介質(zhì)的形式從噴墨頭中噴射出來時基本不會對所述探針產(chǎn)生影響就行，并且所述成分具有的介質(zhì)組成使它能夠通過使用噴墨噴頭正常地噴射到基質(zhì)上。例如，當(dāng)所述噴墨噴頭是球罩噴頭(bubble jet head)時，它具有這樣一種機(jī)構(gòu)，其中，所述噴墨噴頭能賦予所述介質(zhì)以熱能，以便噴射所述熱能液體，此時含有甘油、硫代二甘醇、異丙醇和乙炔醇的液體是在所述探針介質(zhì)中所包含的優(yōu)選的成分。更具體地講，優(yōu)選將含有5-10wt％的甘油，5-10wt％的硫代二甘醇，和0.5-1wt％的乙炔醇的液體用作探針介質(zhì)。另外，當(dāng)所述噴墨噴頭是壓電噴頭時，它能通過使用壓電部件噴射介質(zhì)，此時優(yōu)選將含有乙二醇和異丙醇的液體用作包含在所述探針介質(zhì)中的成分。更具體地講，優(yōu)選將含有5-10wt％的乙二醇和0.5-2wt％的異丙醇的液體用作探針介質(zhì)。
在通過噴墨噴頭將由此獲得的探針介質(zhì)噴射到基質(zhì)上時，所述斑點(diǎn)的形狀是圓形的，并且不會延伸到噴射區(qū)。當(dāng)所述探針介質(zhì)以高密度分布時，這些斑點(diǎn)能有效地避免相鄰斑點(diǎn)之間的接合。應(yīng)當(dāng)指出的是，本發(fā)明探針介質(zhì)的特征并不具體局限于上述。
另外，通過預(yù)先將探針和與導(dǎo)入所述探針的有機(jī)官能團(tuán)具有相互作用的硅烷偶聯(lián)劑溶解或分散在含水介質(zhì)中獲得的含水液體可以通過合適的方法與基質(zhì)表面接觸，如噴墨方法或針點(diǎn)方法，以便實(shí)現(xiàn)將所述有機(jī)官能團(tuán)導(dǎo)入所述基質(zhì)，并且同時固定所述探針。
另外，為了減弱所述斑點(diǎn)中探針的干燥，可以將高沸點(diǎn)的物質(zhì)添加到溶解或分散有所述探針的含水液體中。所述高沸點(diǎn)物質(zhì)優(yōu)選是在溶解成分散所述探針的含水液體中可溶、并且粘度不太高的物質(zhì)。所述物質(zhì)的例子包括甘油，乙二醇，二乙二醇，硫代二甘醇，二甲亞砜和低分子量親水聚合物。親水聚合物的例子包括聚乙烯醇，聚乙烯吡咯烷酮，paogen，羧甲基纖維素，羥乙基纖維素，葡聚糖，支鏈淀粉，聚丙烯酰胺，聚乙二醇和聚丙烯酸鈉等。更優(yōu)選的是，將乙二醇或二乙二醇用作高沸點(diǎn)物質(zhì)。所述高沸點(diǎn)物質(zhì)在溶解或分散探針的所述含水液體中的濃度優(yōu)選為0.1-10vol％。所述固相載體在固定了所述探針之后可被放入濕度為90％或以上、溫度為20-50℃的環(huán)境中。
在形成斑點(diǎn)之后，優(yōu)選通過洗滌除去多余的探針。盡管固定所需要的時間可能因?yàn)樘结樀姆N類而改變，在使用經(jīng)氨基硅烷偶聯(lián)劑處理了的固相載體和在它上面導(dǎo)入了巰基基團(tuán)的單鏈DNA探針時，所述探針會在1分鐘之內(nèi)固定。優(yōu)選在經(jīng)過10分鐘或更長時間之后除去多余的探針。
由此獲得的固定了探針的基質(zhì)適合作為探針固定化基質(zhì)用于檢測靶物質(zhì)。
在這里，在靶物質(zhì)的檢測等是通過使用探針固定化基質(zhì)進(jìn)行的場合下，為了提高檢測的精度(S/N比例)，例如，在將所述探針固定到所述固相的表面上之后可以進(jìn)行封閉，以便所述基質(zhì)上的未結(jié)合探針的部分不會結(jié)合在分析物(樣品)中所包含的所述靶物質(zhì)等。封閉是通過例如將基質(zhì)浸泡在0.5-2％牛血清白蛋白的水溶液中大約10分鐘-大約2小時實(shí)現(xiàn)的。
不過，所述封閉操作的最佳方法和條件可以根據(jù)第二官能團(tuán)的類型而改變。例如，當(dāng)氨基基團(tuán)存在于所述基質(zhì)的表面上時，在上述牛血清白蛋白水溶液中進(jìn)行的封閉方法是有效的。另外，可以利用這樣一種方法，其中，用諸如乙酸酐或琥珀酸酐等酸酐處理所述基質(zhì)，以便給氨基基團(tuán)加帽，從而防止所述靶物質(zhì)和氨基基團(tuán)之間的離子鍵合。不過，一般來說，與本發(fā)明的鍵相比，諸如核酸或寡核苷酸之類的靶物質(zhì)和所述基質(zhì)上的氨基基團(tuán)之間的離子鍵是弱鍵，因此，在雜交之后，通過用具有強(qiáng)離子強(qiáng)度的液體洗滌所述基質(zhì)，能夠選擇性地除去所述靶物質(zhì)和基質(zhì)之間的離子鍵。
應(yīng)當(dāng)指出的是，在必要時實(shí)施所述封閉步驟就足夠了。例如，當(dāng)向所述探針固定化基質(zhì)上提供樣品是分別局限在每一個斑點(diǎn)上進(jìn)行的，并且基本上沒有樣品結(jié)合在除了所述斑點(diǎn)以外的部位上時，就沒有必要進(jìn)行所述封閉。當(dāng)樣品還結(jié)合在除了所述斑點(diǎn)以外的部位上時，封閉的必要性將根據(jù)構(gòu)成所述基質(zhì)的材料和第二官能團(tuán)的種類而改變。另一方面，當(dāng)諸如具有堿性基團(tuán)的硅烷偶聯(lián)劑之類的物質(zhì)和含有具有巰基基團(tuán)的探針的探針介質(zhì)被點(diǎn)在由玻璃構(gòu)建成或石英等制成的基質(zhì)上時，不需要進(jìn)行封閉操作。
由此制備的探針固定化基質(zhì)可以根據(jù)它們的用途而被設(shè)計成各種形式。例如，將探針固定化基質(zhì)構(gòu)建成具有包括相同探針的多個斑點(diǎn)或包括不同探針的多個斑點(diǎn)。探針的類型、數(shù)量和排列可以根據(jù)需要適當(dāng)?shù)馗淖儭Ｈ缓髮⑵渲刑结樢愿鞣N方法高密度排列的所述探針固定化基質(zhì)用于檢測靶物質(zhì)和鑒定靶物質(zhì)的堿基序列以及其他目的。例如，在將所述探針固定化基質(zhì)用于檢測其堿基序列已知并且有可能包含在樣品中的靶物質(zhì)的單鏈核酸時，按以下方法進(jìn)行已知的檢測。就是說，將具有互補(bǔ)于作為靶物質(zhì)的單鏈核酸的堿基序列的單鏈核酸用作探針，并提供在固相上排列了含有所述探針的多個斑點(diǎn)的探針固定化基質(zhì)。在所述探針固定化基質(zhì)的每一個斑點(diǎn)上提供含有要檢測的物質(zhì)的樣品，并且使所述探針固定化基質(zhì)處在作為靶物質(zhì)的單鏈核酸與所述探針能彼此雜交的條件下，并且通過已知方法檢測每一個斑點(diǎn)上雜合體的存在與否，例如，通過使用熒光，發(fā)光，電流，或同位素，不過，并不具體局限于這些方法。這樣能夠檢測所述樣品中所述靶物質(zhì)的存在與否。
另外，在將所述探針固定化基質(zhì)用于鑒定包含在樣品中的作為靶物質(zhì)的單鏈核酸的堿基序列時，其操作過程如下。就是說，首先，設(shè)置作為靶物質(zhì)的單鏈核酸的多種候選堿基序列，并且將具有與所述堿基序列互補(bǔ)的相應(yīng)堿基序列的單鏈核酸作為探針點(diǎn)在所述基質(zhì)上。然后，將樣品提供到每一個斑點(diǎn)上，并且將所述探針固定化基質(zhì)放置在作為靶物質(zhì)的所述單鏈核酸與所述探針彼此雜交的條件下。然后，通過諸如熒光檢測之類的已知方法檢測每一個斑點(diǎn)處的雜合體存在與否。這樣可以鑒定作為靶物質(zhì)的單鏈核酸的堿基序列。另外，本發(fā)明的探針固定化基質(zhì)的其他用途可能包括，例如，篩選DNA結(jié)合蛋白能識別的特定堿基序列，以及篩選具有與DNA相結(jié)合的特性的化學(xué)物質(zhì)。
優(yōu)選的是，雜交是通過將其中溶解或分散了標(biāo)記過的樣品核酸片段的含水液體施加到按上述方法制備的DNA芯片上而進(jìn)行的。所述雜交優(yōu)選在室溫至70℃的溫度范圍內(nèi)在2-20小時的時間內(nèi)進(jìn)行。在雜交結(jié)束之后，用由表面活性劑和緩沖溶液組成的混合溶液洗滌所述探針固定化基質(zhì)，以便除去未反應(yīng)的樣品核酸片段。優(yōu)選使用檸檬酸鹽緩沖液，磷酸鹽緩沖液，硼酸鹽緩沖液，Tris緩沖液和Good′s緩沖液等作為所述緩沖溶液。特別優(yōu)選的是使用檸檬酸鹽緩沖液。
用DNA芯片雜交的特征是使用極少量的標(biāo)記過的樣品核酸片段。為此，必須根據(jù)固定在所述固相載體上的DNA片段的鏈長和所述標(biāo)記過的樣品核酸片段的種類而設(shè)定雜交的最佳條件。為了分析基因表達(dá)，優(yōu)選進(jìn)行長時間用雜交，以便能夠充分檢測低水平表達(dá)的基因。為了檢測單堿基錯配(單核苷酸多態(tài)性)，優(yōu)選進(jìn)行短時間的雜交。使用DNA芯片進(jìn)行雜交的另一個特征是，可以通過以下方法進(jìn)行同一DNA芯片上的表達(dá)量比較或定量測定提供分別用不同的熒光物質(zhì)標(biāo)記的兩種類型的樣品核酸片段，并且將所述標(biāo)記過的樣品核酸片段同時用于雜交。
實(shí)施例下面將通過實(shí)施例對本發(fā)明作更詳細(xì)地說明。
(實(shí)施例1)(1)基質(zhì)的制備將作為玻璃基質(zhì)的載玻片浸泡在事先加熱到60℃的1mol/l氫氧化鈉水溶液中10分鐘時間。然后，用流動的純凈水充分漂洗所述載玻片，以便洗滌并且除去附著在所述載玻片上的氫氧化鈉。在充分漂洗之后，將所述載玻片浸泡在純凈水中，并且進(jìn)行超聲波洗滌10分鐘時間。在超聲波洗滌之后，在流動的純凈水中充分漂洗所述載玻片，以便清洗并且除去附著在所述載玻片上的顆粒。然后，通過旋轉(zhuǎn)干燥使所述載玻片干燥。
將當(dāng)氨基硅烷偶聯(lián)劑(商品名稱KBM-603；Shin-Etsu ChemicalCo.，Ltd.)以1wt％的濃度溶解在水中，并且攪拌所述溶液30分鐘時間。將所述載玻片在該水溶液中浸泡30分鐘時間，然后取出并且用水洗滌。將該載玻片放入烘箱中，并且在120℃下干燥1小時時間。
(2)探針的合成在本實(shí)施例中，將具有與待檢測的靶核酸的全部或部分互補(bǔ)的堿基序列、并且通過與所述靶核酸的堿基序列的特異性雜交(交叉反應(yīng))而檢測所述靶核酸的單鏈核酸用作探針。通過使用DNA自動合成儀合成了兩種單鏈核酸，即SEQ ID No1和與SEQ ID No1僅有一個堿基差別的SEQ ID No2。應(yīng)當(dāng)指出的是，通過在用DNA自動合成儀合成時使用Thiol-Modifier(由Glen Research Corporation生產(chǎn))，在兩個單鏈DNA(即SEQ ID No1和SEQ ID No2)的末端導(dǎo)入了巰基基團(tuán)。然后，進(jìn)行常規(guī)的脫保護(hù)，回收DNA，并且通過高效液相層析純化所述DNA，將所獲得的DNA用于以下實(shí)驗(yàn)。
5′HS-(CH2)6-O-PO2-O-ACTGGCCGTCGTTTTACA3′ (SEQ ID No1)5′HS-(CH2)6-O-PO2-O-ACTGGCCCTCGTTTTACA3′ (SEQ ID No2)(3)所述探針的固定將按上述方法合成的兩種類型的DNA片段(SEQ ID No1和SEQ IDNo2)分別溶解在含有7.5wt％的甘油，7.5wt％的尿素，7.5wt％的硫代二甘醇，和1wt％的乙炔醇(商品名稱Acetylenol E100；KawakenFine Chemicals Co.，Ltd.)的水溶液中，使OD值為0.6。應(yīng)當(dāng)指出的是，1OD表示將寡核苷酸溶解在1ml的介質(zhì)中，并且該溶液在260nm的波長下在光線通道長度為1cm的樣品池中的吸光值為1的量。
通過使用球罩噴墨打印機(jī)(bubble jet printer)(商品名稱BJ-F850；由Canon，Inc.生產(chǎn)，進(jìn)行過改進(jìn)，以便可用于平板印刷，球罩噴頭(bubble jet head)和載玻片之間的距離為大約1mm，并且排放量為大約4pl)，將所述含有DNA片段的水溶液分別點(diǎn)在按照(1)中所述的方法制備的載玻片上。在這種場合下，通過15倍放大鏡進(jìn)行的觀察沒有發(fā)現(xiàn)衛(wèi)星斑點(diǎn)(由點(diǎn)在所述固相表面上的液體液滴形成的斑點(diǎn))。
將在它上面點(diǎn)上了含有探針的溶液的載玻片在室溫下放置10分鐘時間，然后用1M NaCl/50mM磷酸鹽緩沖液(pH 7.0)洗滌。
(4)封閉雜交反應(yīng)將牛血清白蛋白溶解在1M NaCl/50mM磷酸緩沖液(pH 7.0)中，并且在室溫下將通過上述制備的DNA芯片在所述溶液中浸泡2小時時間，以便完成封閉反應(yīng)。
通過將若丹明連接在具有互補(bǔ)于SEQ ID No1所示探針的核酸序列的DNA片段5′-末端，并且將所述DNA片段以50mM的濃度溶解在1M NaCl/50mM磷酸緩沖液(pH 7.0)中。在封閉處理之后，將所述DNA芯片浸泡在含有所述DNA片段的溶液中，并且在45℃下放置2小時時間。然后，用1M NaCl/50mM磷酸緩沖液(pH 7.0)洗去未反應(yīng)的DNA片段，并且用純凈水進(jìn)一步洗滌所述DNA芯片。
(5)結(jié)果通過使用熒光掃描儀(商品名稱Gene Pix 4000B；由AxonInstruments，Inc.生產(chǎn))，在532nm波長下對進(jìn)行雜交的DNA芯片實(shí)施熒光測定。結(jié)果表明，每一個斑點(diǎn)大體上是圓形的，并且直徑為45μm。
當(dāng)在400V的PMT和100％的激光功率下測定時，由SEQ ID No1的探針產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度為21,692，而由與SEQ ID No1相比具有一個堿基錯配的SEQ ID No2的探針產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度為13,346。另外，所述斑點(diǎn)周圍背景的熒光強(qiáng)度為419。這清楚地表明了通過本發(fā)明還可以檢測出單堿基錯配。
(實(shí)施例2)(1)以與實(shí)施例1相同的方法制備基質(zhì)，所不同的是，將KBM-903(商品名稱，由Shin-Etsu Chemical Co.，Ltd.生產(chǎn))用作氨基硅烷偶聯(lián)劑。
(2)探針的固定將SEQ ID No1的探針溶解在含有7.5wt％甘油，7.5wt％尿素，7.5wt％硫代二甘醇，和1wt％乙炔醇(商品名稱Acetylenol E100；Kawaken Fine Chemicals Co.，Ltd.)的水溶液中，使OD值為0.6。用與實(shí)施例1相同的方法將該溶液點(diǎn)在相同的載玻片上。
(3)封閉雜交反應(yīng)封閉雜交反應(yīng)是按照與實(shí)施例1所述相同的方法進(jìn)行的。
(4)結(jié)果每一個斑點(diǎn)大體上是圓形的，并且直徑為45μm。在400V的PMT和100％的激光功率下測定時，熒光強(qiáng)度為29,998，而斑點(diǎn)周圍背景的熒光強(qiáng)度為393。
(實(shí)施例3)用與實(shí)施例2相同的方法制備DNA芯片，所不同的是將KBM-602(商品名稱，由Shin-Etsu Chemical Co.，Ltd.生產(chǎn))用作氨基硅烷偶聯(lián)劑，然后進(jìn)行封閉反應(yīng)和雜交反應(yīng)。在所述反應(yīng)之后，觀察熒光。
結(jié)果表明，每一個斑點(diǎn)大體上是圓形的，并且直徑為40μm。當(dāng)在400V的PMT和100％的激光功率下測定時，由SEQ ID No1的探針產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度為20,675。另外在所述斑點(diǎn)周圍的背景的熒光強(qiáng)度為442。
(實(shí)施例4)用與實(shí)施例2相同的方法制備DNA芯片，所不同的是將N-甲基氨基丙基三甲氧基硅烷(由CHISSO CORPORATION生產(chǎn))用作氨基硅烷偶聯(lián)劑，然后進(jìn)行封閉反應(yīng)和雜交反應(yīng)。在所述反應(yīng)之后，觀察熒光。
結(jié)果表明，每一個斑點(diǎn)大體上是圓形的，并且直徑為50μm。當(dāng)在400V的PMT和100％的激光功率下測定時，所述熒光強(qiáng)度為22,246。另外，在所述斑點(diǎn)周圍的背景的熒光強(qiáng)度為212。
(實(shí)施例5)(1)基質(zhì)的制備將作為玻璃基質(zhì)的載玻片在預(yù)先加熱到60℃的1mol/l氫氧化鈉水溶液中浸泡10分鐘。然后，用流動的純凈水充分漂洗所述載玻片，以便洗滌并且除去附著在所述載玻片上的氫氧化鈉。在充分漂洗之后，將所述載玻片浸泡在純凈水中，并且進(jìn)行10分鐘的超聲波洗滌。在超聲波洗滌之后，在流動的純凈水中充分漂洗所述載玻片，以便洗滌并且除去附著在所述載玻片上的顆粒。然后，通過旋轉(zhuǎn)干燥法干燥所述載玻片。
(2)探針的固定將氨基硅烷偶聯(lián)劑KBM-603(商品名稱，由Shin-Etsu ChemicalCo.，Ltd.生產(chǎn))溶解在含有7.5wt％的甘油，7.5wt％的尿素，7.5wt％的硫代二甘醇和1wt％的乙炔醇(商品名稱Acetylenol E100；Kawaken Fine Chemicals Co.，Ltd.)的水溶液中，并攪拌20分鐘。隨后，將合成的DNA片段(SEQ ID NO1)溶解在含有硅烷偶聯(lián)劑的溶液中至OD值為0.6。
通過使用球罩噴墨打印機(jī)(bubble jet printer)(商品名稱BJ-F850；由Canon，Inc.生產(chǎn)，進(jìn)行過改進(jìn)，以便可用于平板印刷)，將所述含有硅烷偶聯(lián)劑和DNA片段的水溶液點(diǎn)在按照上述(1)中所述的方法制備的載玻片上。在這種場合下，通過15倍放大鏡進(jìn)行的觀察沒有發(fā)現(xiàn)衛(wèi)星斑點(diǎn)(通過點(diǎn)在所述固相表面上的液體的液滴形成的斑點(diǎn))。
將在它上面點(diǎn)上了含有硅烷偶聯(lián)劑和探針的溶液的載玻片在室溫下放置20分鐘時間，然后用1M NaCl/50mM磷酸緩沖液(pH 7.0)洗滌。
(3)雜交反應(yīng)通過下述方法合成經(jīng)標(biāo)記的DNA片段，包括將若丹明連接在具有互補(bǔ)于SEQ ID No1所示探針的核酸序列的DNA片段的5′-末端，并且將所述DNA片段以50mM的濃度溶解在1M NaCl/50mM磷酸緩沖液(pH 7.0)中。將所述DNA芯片浸泡在含有所述經(jīng)標(biāo)記的DNA片段的溶液中，并且在45℃下放置2小時。然后，用1M NaCl/50mM磷酸緩沖液(pH 7.0)洗去未反應(yīng)的DNA片段，并且用純凈水進(jìn)一步洗滌DNA芯片。
(4)結(jié)果通過使用熒光掃描儀(商品名稱Gene Pix 4000B；由AxonInstruments，Inc.生產(chǎn))，在532nm波長下對用于雜交的DNA芯片進(jìn)行熒光測定。結(jié)果表明，每一個斑點(diǎn)大體上是圓形的，并且直徑為45μM。當(dāng)在400V的PMT和100％的激光功率下測定時，熒光強(qiáng)度為4831。另外，在所述斑點(diǎn)周圍的背景的熒光強(qiáng)度為84。
這表明，當(dāng)用于導(dǎo)入第二官能團(tuán)的硅烷偶聯(lián)劑和所述探針被同時施加到所述基質(zhì)上時，封閉操作是不必要的。
(實(shí)施例6)(1)基質(zhì)的制備將用作巰基硅烷偶聯(lián)劑的A-189(商品名稱，由Nippon Unicar，Co.Ltd.生產(chǎn))溶解在pH 4的鹽酸水溶液中，使?jié)舛葹?.1wt％，并且攪拌5小時。將所述水溶液旋涂在通過實(shí)施例1所述相同的方法洗滌的載玻片上。所述載波片在110℃的烘箱中干燥30分鐘。
(2)探針的固定將用氨基基團(tuán)修飾過的SEQ ID No3的探針溶解在含有7.5wt％的甘油，7.5wt％的硫代二甘醇和0.01wt％的乙炔醇(商品名稱Acetylenol E100；Kawaken Fine Chemicals Co.，Ltd.)的水溶液中，使它的OD值為0.6。形成斑點(diǎn)的方法與實(shí)施例1所述相同。
5′H2N-(CH2)6-O-PO2-O-ACTGGCCGTCGTTTTACA3′ (SEQ ID No3)(3)封閉雜交反應(yīng)封閉雜交反應(yīng)是以與實(shí)施例1相同的方法進(jìn)行的。
(4)結(jié)果結(jié)果表明，每一個斑點(diǎn)大體上是圓形的，并且直徑為30μm。當(dāng)在700V的PMT和100％的激光功率下測定時，熒光強(qiáng)度為1700。另外，在所述斑點(diǎn)周圍的背景的熒光強(qiáng)度為63。
(實(shí)施例7)(1)基質(zhì)的制備用與實(shí)施例5相同的方法制備基質(zhì)。
(2)探針的固定將巰基硅烷偶聯(lián)劑(商品名稱A-189；由Nippon Unicar，Co.Ltd.生產(chǎn))以0.1wt％的濃度溶解在通過將氫氯酸添加到含有7.5wt％甘油、7.5wt％硫代二甘醇和1wt％乙炔醇(商品名稱Acetylenol E100；Kawaken Fine Chemicals Co.，Ltd.)的pH 4的水溶液中制備的溶液中，并且攪拌1小時。然后，將合成的DNA片段(SEQ ID No3)溶解在含有所述硅烷偶聯(lián)劑的溶液中，使OD值為0.6。然后，將合成的DNA片段(SEQ ID No3)溶解在含有所述硅烷偶聯(lián)劑的溶液中，使OD值為0.6。
通過使用球罩噴墨打印機(jī)(bubble jet printer)(商品名稱BJ-F850；由Canon，Inc.生產(chǎn)，進(jìn)行過改進(jìn)，以便可用于平板印刷)將含有所述硅烷偶聯(lián)劑和所述DNA片段的溶液點(diǎn)在按照上面的(1)所披露的方法制備的載玻片上。在這種場合下，通過15倍放大鏡進(jìn)行的觀察沒有發(fā)現(xiàn)衛(wèi)星斑點(diǎn)(由點(diǎn)在所述固相表面上的液體的液滴形成的斑點(diǎn))。
將在它上面點(diǎn)上了含有所述硅烷偶聯(lián)劑和探針的溶液的載玻片在室溫下放置20分鐘時間，然后在80℃的烘箱中放置30分鐘，并且用1M NaCl/50mM磷酸緩沖液溶液(pH 7.0)洗滌。
(3)雜交反應(yīng)按照與例5相同的方法進(jìn)行雜交反應(yīng)。
(4)結(jié)果通過使用熒光掃描儀(商品名稱Gene Pix 4000B；由AxonInstruments，Inc.生產(chǎn))，在532nm波長下對進(jìn)行雜交的DNA芯片進(jìn)行熒光測定。結(jié)果表明，每一個斑點(diǎn)大體上是圓形的。當(dāng)在400V的PMT和100％的激光功率下測定時，熒光強(qiáng)度為4527，另外，在所述斑點(diǎn)周圍的背景的熒光強(qiáng)度為32。
(實(shí)施例8)使用類似于導(dǎo)入了巰基基團(tuán)的探針的烷基硫醇(1-丙硫醇)和類似于KBM-603和KBM-602中的氨基基團(tuán)部分的胺化合物N-丙基乙二胺，通過NMR光譜觀察在所述氨基硅烷偶聯(lián)劑中所包含的氨基基團(tuán)和所述探針的巰基基團(tuán)之間的相互作用的存在與否。
(1)樣品的制備將溶解在D2O(由Aldrich生產(chǎn))中的N-丙基乙二胺(由AcrossCorp.生產(chǎn))的溶液(600μl)裝入5-mmφNMR管中，將1-丙硫醇(由Tokyo Kasei Kogyo Co.，Ltd.生產(chǎn))以相對N-丙基乙二胺大約1∶1的摩爾比添加進(jìn)去，并且通過1H NMR觀察它的變化。
(2)結(jié)果下面示出了N-丙基乙二胺、1-丙硫醇的化學(xué)位移值和這二者混合之后的位移值。
1H NMR光譜數(shù)據(jù)(400MHz，D2O，室溫)N-丙基乙二胺δ/ppm0.79(丙基的甲基-H)1.37(丙基的β-位置上的亞甲基-H)
2.42(丙基的α-位置上的亞甲基-H)2.51(NH2基的β-位置上的亞甲基-H)2.61(NH2基的α-位置上的亞甲基-H)1-丙硫醇δ/ppm0.87(丙基的甲基-H)1.53(丙基的β-位置上的亞甲基-H)2.45(靠近SH基團(tuán)的亞甲基-H)在將它們混合之后的N-丙基乙二胺δ/ppm0.81(丙基的甲基-H)1.43(丙基的β-位置上的亞甲基-H)2.54(丙基的α-位置上的亞甲基-H)2.63-2.66(NH2基的β-位置上的亞甲基-H)2.68-2.71(NH2基的α-位置上的亞甲基-H)在將它們混合之后的1-丙硫醇δ/ppm0.82(丙基的甲基-H)1.42(丙基的β-位置上的亞甲基-H)2.33(靠近SH基團(tuán)的亞甲基-H)結(jié)果，通過混合這兩種模型化合物-胺和硫醇，觀察到了變化，其中，屬于N-丙基乙二胺的信號的化學(xué)位移發(fā)生了小的場位移，而屬于1-丙硫醇的信號的化學(xué)位移發(fā)生了大的場位移。具體地講，靠近所述氨基基團(tuán)和巰基基團(tuán)的信號位移的量較大，而對于靠近所述氨基基團(tuán)的所述信號觀察到了偶聯(lián)的改變。
(實(shí)施例9)使用類似于導(dǎo)入了巰基基團(tuán)的探針的烷基硫醇(1-丙硫醇)和類似于KBM-903的氨基基團(tuán)部分的胺化合物-丙胺，通過NMR光譜觀察所述氨基硅烷偶聯(lián)劑中的氨基基團(tuán)和所述探針的巰基基團(tuán)之間的相互作用的存在與否。
(1)樣品的制備將溶解在D2O(由Aldrich生產(chǎn))中的丙胺(由Tokyo Kasei KogyoCo.，Ltd.生產(chǎn))的溶液(600μl)裝入5-mmφNMR管中，向該管中添加1-丙硫醇(由Tokyo Kasei Kogyo Co.，Ltd.生產(chǎn))，它與丙胺的摩爾比大約為1∶1，并且通過1H NMR光譜觀察它的變化。
(2)結(jié)果下面分別示出了丙胺、1-丙硫醇的化學(xué)位移值，和將這二者混合之后的化學(xué)位移值。
1H NMR光譜數(shù)據(jù)(400MHz，D2O，室溫)丙胺δ/ppm0.81(丙基的甲基-H)1.37(丙基的β-位置上的亞甲基-H)2.51(丙基的α-位置上的亞甲基-H)1-丙硫醇δ/ppm0.87(丙基的甲基-H)1.53(丙基的β-位置上的亞甲基-H)2.45(與SH基團(tuán)相鄰的亞甲基-H)將它們混合之后的丙胺δ/ppm0.86(丙基的甲基-H)1.50(丙基的β-位置上的亞甲基-H)2.72(丙基的α-位置上的亞甲基-H)將它們混合之后的1-丙硫醇δ/ppm0.84(丙基的甲基-H)
1.45(丙基的β-位置上的甲基-H)2.36(與SH基團(tuán)相鄰的亞甲基-H)結(jié)果，通過混合這兩種模型化合物-胺和硫醇，觀察到了變化，其中，屬于丙胺的信號的化學(xué)位移發(fā)生了小的場位移，而屬于1-丙硫醇的信號的化學(xué)位移發(fā)生了大的場位移。具體地講，靠近所述氨基基團(tuán)和巰基基團(tuán)的信號位移的量較大。
(實(shí)施例10)使用類似于導(dǎo)入了巰基基團(tuán)的探針的烷基硫醇(1-丙硫醇)和類似于N-甲基氨基丙基三甲氧基硅烷中的氨基基團(tuán)部分的胺化合物-N-甲基丙胺，通過NMR光譜觀察所述氨基硅烷偶聯(lián)劑中的氨基基團(tuán)和所述探針的巰基基團(tuán)之間的相互作用的存在與否。
(1)樣品的制備將溶解在D2O(由Aldrich生產(chǎn))溶液(600μl)中的N-甲基丙胺(由Aldrich生產(chǎn))的溶液裝入5-mmφNMR管中，向該管中添加1-丙硫醇(由Tokyo Kasei Kogyo Co.，Ltd.生產(chǎn))，它與N-甲基丙胺的摩爾比大約為1∶1，并且通過1H NMR光譜觀察它的變化。
(2)結(jié)果下面分別示出了N-甲基丙胺、1-丙硫醇的化學(xué)位移值，以及在向N-甲基丙胺中添加1-丙硫醇之后的化學(xué)位移值。
1H NMR光譜數(shù)據(jù)(400MHz，D2O，室溫)N-甲基丙胺δ/ppm0.81(丙基的甲基-H)1.40(丙基的β-位置上的亞甲基-H)2.23(甲基)2.43(丙基的α-位置上的亞甲基-H)1-丙硫醇δ/ppm
0.87(丙基的甲基-H)1.53(丙基的β-位置上的甲基-H)2.45(與SH基團(tuán)相鄰的亞甲基-H)將它們混合之后的N-甲基丙胺δ/ppm0.87(丙基的甲基-H)1.54(丙基的β-位置上的亞甲基-H)2.49(甲基)2.75(丙基的α-位置上的亞甲基-H)將它們混合之后的1-丙硫醇δ/ppm0.84(丙基的甲基-H)1.44(丙基的β-位置上的甲基-H)2.35(與SH基團(tuán)相鄰的亞甲基-H)結(jié)果，通過混合這兩種模型化合物-胺和硫醇，觀察到了變化，其中，屬于N-甲基丙胺的信號的化學(xué)位移發(fā)生了小的場位移，而屬于1-丙硫醇的信號的化學(xué)位移發(fā)生了大的場位移。具體地講，靠近所述氨基基團(tuán)和巰基基團(tuán)的信號的位移量較大。
(實(shí)施例11)以與實(shí)施例1相同的方法洗滌載玻片，并且將N-甲基氨基丙基三甲氧基硅烷(由Chisso Corporation生產(chǎn))以0.3wt％的濃度溶解在水中，并且攪拌該混合物20分鐘。將所述載玻片在所得到的水溶液浸泡20分鐘，然后取出，并且用水洗滌，在120℃的烘箱中干燥1小時。以與實(shí)施例2相同的方法將SEQ ID No1的探針點(diǎn)在所述載玻片上。
將氯化鈉溶解在10-mM磷酸緩沖液中，以便獲得氯化鈉的濃度為0，100，300，500，或1,000mM的稀釋液，用這些溶液洗滌制備的DNA芯片。洗滌方法如下
首先，在所述溶液中用超聲波照射所述DNA芯片2分鐘，用相同的溶液漂洗，并且在相同的溶液中攪拌過夜。
以與實(shí)施例2相同的方法對洗滌過的DNA芯片進(jìn)行封閉和雜交反應(yīng)，然后進(jìn)行熒光觀察。
如圖1所示，它表明了，盡管鹽的濃度發(fā)生了改變，熒光強(qiáng)度并不受影響，因此，可以通過離子鍵穩(wěn)定地固定所述探針。
工業(yè)應(yīng)用性根據(jù)本發(fā)明，提供了一種探針載體，其中，可以通過簡單的方法將探針固定在基質(zhì)上，并且即使在離子強(qiáng)度改變時它也是穩(wěn)定的。
另外，可以通過使用核酸探針作探針，可以生產(chǎn)出能夠檢測甚至是單堿基錯配的DNA芯片。
序列表<110>Canon Kabushiki Kaisha<120>探針載體及其生產(chǎn)方法<130>CFO17416WO<150>JP 2002-211147<151>2002-07-19<150>JP 2003-197920<151>2003-07-16<160>3<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探針<400>1actggccgtc gttttaca 18<210>2<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探針<400>2actggccctc gttttaca 18<210>3<211>18
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>探針<400>3actggccgtc gttttaca 18
權(quán)利要求
1.一種探針載體，在它上面固定了能特異性地結(jié)合靶物質(zhì)的探針，所述探針是通過以下物質(zhì)固定在所述載體上的a)與所述探針結(jié)合的接頭；b)與所述接頭結(jié)合的第一官能團(tuán)；和c)與第一官能團(tuán)結(jié)合的第二官能團(tuán)，其中，第一官能團(tuán)和第二官能團(tuán)的組合包括酸性官能團(tuán)和堿性官能團(tuán)。
2.如權(quán)利要求1的探針載體，其中，所述第一官能團(tuán)和第二官能團(tuán)的組合包括解離常數(shù)為1.0×10-12或更高的酸性官能團(tuán)，和解離常數(shù)為1.0×10-6或更高的堿性官能團(tuán)。
3.如權(quán)利要求1的探針載體，其中，所述探針包括寡核苷酸或核酸。
4.如權(quán)利要求3的探針載體，其中，所述寡核苷酸或核酸在它的3′-末端或5′-末端具有接頭。
5.如權(quán)利要求1的探針載體，其中，所述接頭包括亞甲基鏈或聚醚鏈。
6.如權(quán)利要求1的探針載體，其中，所述酸性官能團(tuán)是巰基基團(tuán)，而所述堿性官能團(tuán)是氨基基團(tuán)。
7.如權(quán)利要求1的探針載體，其中，所述堿性官能團(tuán)是選自下組中的一種伯氨基，仲氨基，以及它們的混合物。
8.如權(quán)利要求1的探針載體，其中，所述探針具有通過用硅烷偶聯(lián)劑處理所述固相載體而導(dǎo)入的第二官能團(tuán)。
9.如權(quán)利要求8的探針載體，其中，所述固相載體是選自下組中的一種玻璃，石英，硅石，以及它們的混合物。
10.如權(quán)利要求1的探針載體，其中，所述第一官能團(tuán)和第二官能團(tuán)的組合是通過彼此的結(jié)合將導(dǎo)致NMR光譜信號發(fā)生共同化學(xué)漂移的偏移的組合。
11.一種檢測方法，包括以下步驟將含有待檢測物質(zhì)的分析物施加到如權(quán)利要求1所述的探針載體上；和檢測所述分析物中與所述探針載體相結(jié)合的待檢測物質(zhì)。
12.采用如權(quán)利要求11的檢測方法的檢測裝置。
13.用于生產(chǎn)如權(quán)利要求1所述的探針載體的裝置。
14.一種將能特異性地結(jié)合靶物質(zhì)的探針固定在固相載體上的方法，包括以下步驟提供具有包括第一官能團(tuán)的接頭的探針；提供具有第二官能團(tuán)的固定基質(zhì)；將所述探針施加在所述固定基質(zhì)上；和讓第一官能團(tuán)和第二官能團(tuán)彼此結(jié)合，其中，第一官能團(tuán)和第二官能團(tuán)的組合包括酸性官能團(tuán)和堿性官能團(tuán)。
15.如權(quán)利要求14的固定探針的方法，其中，所述第一官能團(tuán)和第二官能團(tuán)的組合包括解離常數(shù)為1.0×10-12或更高的酸性官能團(tuán)和解離常數(shù)為1.0×10-6或更高的堿性官能團(tuán)。
16.如權(quán)利要求14的固定探針的方法，其中，所述探針包括寡核苷酸或核酸。
17.如權(quán)利要求16的固定探針的方法，其中，所述寡核苷酸或核酸在它的3′-末端或5′-末端具有接頭。
18.如權(quán)利要求14的固定探針的方法，其中，所述接頭包括亞甲基鏈或聚醚鏈。
19.如權(quán)利要求14的固定探針的方法，其中，所述酸性官能團(tuán)是巰基基團(tuán)，而所述堿性官能團(tuán)是氨基基團(tuán)。
20.如權(quán)利要求14的固定探針的方法，其中，所述堿性官能團(tuán)是選自下組中的一種伯氨基，仲氨基，以及它們的混合物。
21.如權(quán)利要求14的固定探針的方法，其中，所述探針具有通過用硅烷偶聯(lián)劑處理所述固相載體而導(dǎo)入的第二官能團(tuán)。
22.如權(quán)利要求21的固定探針的方法，其中，所述固相載體包括選自下組中的一種玻璃，石英，硅石，以及它們的混合物。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種生產(chǎn)探針載體的方法，其中，將探針固定在基質(zhì)上，該方法包括提供所述基質(zhì)，以及讓導(dǎo)入所述基質(zhì)的堿性基團(tuán)與具有酸性基團(tuán)的探針接觸，以便將所述探針固定在所述基質(zhì)上。該方法能生產(chǎn)探針載體，它減少了將所述探針固定在所述基質(zhì)上所進(jìn)行的步驟數(shù)，并且容易固定所述探針。
文檔編號G01N37/00GK1668925SQ0381709
公開日2005年9月14日 申請日期2003年7月18日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月19日
發(fā)明者石橋亨, 岡田良克, 久家克明 申請人:佳能株式會社