專利名稱：檢測受體寡聚化的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及測量細胞表面分子特別是細胞表面膜受體寡聚化的方法，。
背景技術(shù)：
細胞表面膜成分的相互作用在正常生理學和疾病狀態(tài)下對細胞外信號轉(zhuǎn)送到細胞起重要的作用。特別地，許多類型的細胞表面受體經(jīng)過二聚作用或寡聚化與細胞外活動或信號，如配體-受體結(jié)合轉(zhuǎn)導為細胞反應，如增殖、增加或減少基因表達，或類似反應相關(guān)聯(lián)，如George等人，Nature Reviews Drug Discovery，1808-820(2002)；Mellado等人，Ann.Rev.Immunol.，19397-421(2001)；Schlessinger，Cell，103211-225(2000)；Yarden，Eur.J.Cancer，37S3-S8(2001)。這種信號轉(zhuǎn)導活動在疾病如癌癥中的作用已成為認真研究的對象，并導致開發(fā)了數(shù)種新藥和候選藥物，如Herbst和Shin，Cancer，941593-1611(2002)；Yarden和Sliwkowski，Nature Reviews Molecular Cell Biology，2127-137(2001)。
很多種技術(shù)已用于研究細胞表面受體的二聚作用和寡聚化，包括免疫沉淀反應、化學交聯(lián)、生物發(fā)光共振能量傳遞(BRET)、熒光共振能量傳遞(FRET)和類似技術(shù)，如Price等人，Methods in Molecular Biology，218255-267(2003)；McVey等人，J.Biol.Chem.，1714092-14099(2001)；Salim等人，J.Biol.Chem.，27715482-15485(2002)；Angers等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，973684-3689(2000)。不幸地，盡管受體二聚作用和寡聚化在信號轉(zhuǎn)導過程中很重要，但檢測這種相互作用的技術(shù)難以應用，缺少靈活性，并缺少靈敏性。缺少方便和敏感的分析細胞表面分子寡聚化的技術(shù)大大增加了根據(jù)這種現(xiàn)象開發(fā)新的治療或診斷方法的難度。
鑒于上述原因，檢測或測量細胞表面分析物二聚作用或寡聚化的方便、敏感和成本劃算的技術(shù)的實用性將提高許多領(lǐng)域的技術(shù)，在這些領(lǐng)域中這種測量正在變得日益重要，包括生命科學研究、醫(yī)學研究和診斷學、藥物發(fā)明，等等。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了檢測和/或測量膜-結(jié)合分子寡聚物的方法，特別是細胞膜受體的二聚體和寡聚物。在一個方面，本發(fā)明的方法使用至少兩個對二聚體或寡聚物的不同成員特異的試劑一個成員，在此指裂解探針，具有裂解誘導部分，可導致其緊鄰的敏感鍵的裂解；另一個成員，在此指結(jié)合化合物，具有一個或多個通過可被裂解誘導部分裂解的鍵連接的分子標記。按照本方法，只要這種不同的成員形成二聚體或寡聚物，可裂解鍵就被帶入裂解誘導部分的有效裂解近端，使得分子標記能被釋放。然后分子標記被從反應混合物中分離并量化以供二聚作用或寡聚化的測量。
在另一個方面，本發(fā)明的方法包括以下步驟提供對多個受體類型的第一個受體類型特異的裂解探針，所述裂解探針具有帶有效近端的裂解誘導部分；提供一個或多個各自對多個不同的第二個受體類型特異的結(jié)合化合物，每個結(jié)合化合物具有一個或多個通過可裂解鍵連接的分子標記，不同結(jié)合化合物的分子標記具有不同的分離特性；混合裂解探針、一種或多種結(jié)合化合物和含第一和第二個受體類型的細胞膜，使裂解探針和一種或多種結(jié)合化合物與其各自的受體特異地結(jié)合，一種或多種結(jié)合化合物的可裂解鍵位于裂解誘導部分的有效近端使分子標記被釋放；分離和鑒定釋放的分子標記以測定細胞膜中有或無受體類型寡聚化或寡聚化的量。
在另一個方面，本發(fā)明提供了細胞膜中膜相關(guān)分析物的二聚體的檢測方法，該方法包括以下步驟提供對二聚體的第一個膜相關(guān)分析物特異的結(jié)合化合物，所述二聚體含有第一個膜相關(guān)分析物和第二個膜相關(guān)分析物，所述結(jié)合化合物具有一個或多個各自通過可裂解鍵連接的分子標記，所述一個或多個分子標記各自具有分離特性；提供對第二個膜相關(guān)分析物特異的裂解探針，所述裂解探針具有帶有效近端的裂解誘導部分；混合裂解探針、結(jié)合化合物和細胞膜，使裂解探針特異地與第一個膜相關(guān)分析物結(jié)合，結(jié)合化合物特異地與第二個膜相關(guān)分析物結(jié)合，使得結(jié)合化合物的可裂解鍵處于裂解誘導部分的有效近端，因此分子標記被釋放；分離和鑒定釋放的分子標記以測定細胞膜中有或無二聚體或二聚體的量。
在另一個方面，本發(fā)明提供了描繪細胞表面上眾多受體類型中二聚體發(fā)生頻度的方法。
在另一個方面，本發(fā)明包括實現(xiàn)本發(fā)明方法的試劑盒。在一個實施例中，本發(fā)明的試劑盒包括一種或多種結(jié)合化合物和裂解探針。在另一個實施例中，這一種或多種結(jié)合化合物和裂解探針各自對含二聚體受體的不同抗原決定簇特異，所述受體選自Herl、Her2、Her3和Her4。更特別地，這一種或多種結(jié)合化合物和裂解探針各自對以下二聚體的不同抗原決定簇特異Her1的二聚體、Her2的二聚體、含Her1和Her2的二聚體、含Her1和Her3的二聚體和含Her2和Her3的二聚體。
本發(fā)明提供了檢測或測量膜相關(guān)分析物二聚作用或寡聚化的方法，比當前通用的技術(shù)具有幾個優(yōu)勢，包括但不限于，(1)檢測和/或測量從檢驗混合物中分離的分子標記，大大降低了背景并顯著靈敏性更高；和(2)使用特別設計的易于分離和檢測的分子標記，從而提供了方便的多路性能。
附圖描述

圖1A和1B圖解地說明本發(fā)明方法的一個實施例，測量生物學細胞表面存在受體二聚體。
圖2A-2E圖解地說明本發(fā)明方法的一個實施例，描繪多數(shù)受體類型二聚體的發(fā)生頻度。
圖3A-3F圖示氧化不穩(wěn)定鍵及其各自由單態(tài)氧介導的裂解反應。
圖4A4B圖示可用于構(gòu)建本發(fā)明分子標記的熒光素衍生物。
圖5A圖示結(jié)合標記到抗體上形成標記探針的一般方法學，和用單態(tài)氧得到標記探針的反應，以產(chǎn)生亞磺酸部分作為釋放的標記。圖5B概括了合成熒光素標記的分子標記的化學。
圖6A-J顯示已被設計和合成的標記結(jié)構(gòu)。
圖7A-D圖示圖6中顯示的標記部分的化學合成。
圖8A-8C圖解地說明微流體學裝置以實現(xiàn)電泳分離分子標記的步驟。
圖9A-9E圖示用本發(fā)明的方法對細胞溶解產(chǎn)物檢驗受體雜二聚體的數(shù)據(jù)。
圖10A-10C圖示用本發(fā)明的方法對組織樣本檢驗受體雜二聚體的數(shù)據(jù)。
圖11A和11B圖示本發(fā)明的試驗檢測Her1同型二聚體和磷酸化作用的數(shù)據(jù)。
圖12顯示本發(fā)明試驗的數(shù)據(jù)，顯示兩個不同細胞系上Her2二聚體集合。
圖13A-13B顯示本發(fā)明的試驗探測細胞上Her1和Her3雜二聚體的數(shù)據(jù)。
定義″抗體″是指與另一個分子的特定空間和極性結(jié)構(gòu)特異地結(jié)合，并因此定義為與之互補的免疫球蛋白?？贵w可以是單克隆或多克隆，并能夠用本領(lǐng)域熟知的技術(shù)制備，如免疫宿主并采集血清(多克隆)，或通過制備連續(xù)雜交細胞系并收集分泌的蛋白(單克隆)，或通過克隆和表達核苷酸序列或其誘變型，所述核苷酸序列至少編碼與天然抗體特異結(jié)合所需的氨基酸序列?？贵w可包括完整的免疫球蛋白或其片段，免疫球蛋白包括各種類型和亞型，如IgA、IgD、IgE、IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3、IgM等?？贵w片段可包括Fab、Fv和F(ab′)2、Fab′，和類似片段。此外，適當時可以使用免疫球蛋白集合體、聚合體和共扼物或其片段，只要維持對特定多肽的結(jié)合親合力。
″抗體結(jié)合組合物″是指含有一個或多個抗體的分子或分子復合物，并由抗體產(chǎn)生其結(jié)合特異性?？贵w結(jié)合組合物包括但不限于，抗體對，其中第一個抗體與靶分子特異結(jié)合，第二個抗體與第一個抗體的恒定區(qū)特異結(jié)合；特異地與靶分子結(jié)合的生物素化抗體和用如分子標記或光敏劑成分衍化的抗生物素蛋白鏈菌素；對靶分子特異的抗體和共軛的聚合體如右旋糖苷，后者又是用如分子標記或光敏劑成分衍化的；對靶分子特異的抗體和共軛的珠、或微珠、或其它固相支持物，它們又是用如分子標記或光敏劑或含后者的聚合體成分衍化的。
″抗原決定簇，″或″表位″是指膜相關(guān)分析物表面上單抗體分子結(jié)合的位點；通常膜相關(guān)分析物具有數(shù)個或許多不同的抗原決定簇，與許多不同特異性的抗體反應。當膜相關(guān)分析物是涉及信號轉(zhuǎn)導過程的細胞表面受體時，優(yōu)選的抗原決定簇是受體的磷酸化作用位點。
″結(jié)合部分″是指分子標記能夠直接或間接地與其附著的任何分子，它能夠特異地與膜相關(guān)分析物結(jié)合。結(jié)合部分包括但不限于，抗體，抗體結(jié)合組合物，肽，蛋白特別是分泌蛋白和孤獨分泌蛋白，核酸，和具有達1000道爾頓分子量并含有氫、碳、氧、氮、硫和磷原子的有機分子。
關(guān)于分離柱，″毛細型的″是指平板或微流體學裝置中的毛細管或通道，其分離柱直徑或最大徑在大約25-500微米間，可以有效地將熱分散到整個分離介質(zhì)，從而減少介質(zhì)中的熱對流。
如這里所用，″層析法″或″層析分離″是指或引用分析方法，其中根據(jù)流動相和固定相間一個或多個物理或化學性質(zhì)的差異分布，流動相的流動促進這種化合物的分離，流動相通常是含化合物如分子標記的混合物的液體，固定相通常是固體。形成層析分離分析物如分子標記基礎(chǔ)的一個或多個物理特性包括但不限于分子量、形狀、溶解度、pKa、疏水性、電荷、極性，等。在一個方面，如這里所用的，″高壓力(或性能)液體層析法″(″HPLC″)是指液相層析分離(i)使用長度達300mm，內(nèi)徑達5mm的硬圓柱分離柱，(ii)分離柱中填充有達5μm相同直徑的硬球形顆粒(如硅，氧化鋁，或類似物)組成的固相，(iii)在35℃至80℃溫度范圍和達150巴的柱壓力下進行，和(iv)使用流速范圍為1μL/min至4mL/min。優(yōu)選地，用于HPLC的固相顆粒進一步具有以下特征(i)平均顆粒直徑分布范圍窄，實質(zhì)上所有顆粒直徑在平均值的10％范圍內(nèi)，(ii)具有70至300埃范圍的相同孔徑，(iii)具有50至250m2/g范圍的表面積，和(iv)具有1～5/nm2范圍的鍵合相密度(即每單位面積保留的配體數(shù)目)。典型的分離分子標記的反相層析法介質(zhì)包括顆粒，如硅或氧化鋁，其表面上已結(jié)合了保留配體，如苯基、氰基，或選自包括C8至C18的脂肪族基團。關(guān)于本發(fā)明的層析法包括″毛細電層析法″(″CEC″)和相關(guān)的技術(shù)。CEC是液相層析技術(shù)，其中液體被通過毛細型柱的電滲流驅(qū)動，如內(nèi)徑范圍為30至100μm。CEC公開于Svec，Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.761-47(2002)；Vanhoenacker等人，Electrophoresis，224064-4103(2001)；和類似文獻中。CEC柱可使用常規(guī)反相HPLC所用的相同固相材料，另外可使用所謂″整體式″非特定充填物。在某些形式的CEC中，壓力以及電滲驅(qū)動含分析物的溶劑通過柱。
如這里所用的，術(shù)語″試劑盒″是指運送材料的任何輸送系統(tǒng)。就反應實驗而言，這種輸送系統(tǒng)包括可以從一個地點到另一個地點儲藏、轉(zhuǎn)運或交付反應試劑(如，在適當容器中的探針、酶，等)和/或支持材料(如，緩沖液，進行實驗的書面說明書等)的系統(tǒng)。例如，試劑盒包括一個或多個裝有相關(guān)反應試劑和/或支持材料的外包裝(如盒子)。這些內(nèi)容物可以一起或分別地交給預定的接受者。例如，第一個容器可含有實驗用的酶，而第二個容器含探針。
術(shù)語″配體″也用在這里指分泌的蛋白或其蛋白，它通過配體-受體相互作用與指定受體結(jié)合。
″膜相關(guān)分析物″是指直接或間接附著在膜上的物質(zhì)、化合物、分子，或它們的成分或部分，特別是生物學膜如哺乳動物細胞或組織的細胞表面膜。附著可以是直接的，例如，當膜相關(guān)分析物具有親脂部分，或附著于另一個具有親脂部分的分子時，能夠?qū)⑵溴^定在膜內(nèi)。附著也可以是間接的，例如，當膜相關(guān)分析物是可溶性配體時，結(jié)合到細胞表面受體上并與之形成穩(wěn)定的復合物。膜相關(guān)分析物可以是，但不限于，肽、蛋白、多核苷酸、多肽、寡核苷酸、有機分子、半抗原、表位、生物學細胞的部分、翻譯后修飾的蛋白、受體、附著于膜成分如受體上的復合物糖、與膜形成穩(wěn)定復合物的可溶性化合物如維生素、激素、細胞因子或類似物?？捎谐^一個分析物與單分子實體相關(guān)，如同一蛋白上不同的磷酸化作用位點。膜相關(guān)分析物包括細胞表面分子，如細胞膜受體。在本發(fā)明的一個方面，膜相關(guān)分析物是細胞膜受體，包括表皮生長因子受體和G-蛋白偶聯(lián)受體。特別地，表皮生長因子受體包括Her1、Her2、Her3和Her4受體，如Yarden(引用如上)；Yarden和Sliwkowski(引用如上)。關(guān)于膜相關(guān)分析物的″二聚體″是指兩個膜相關(guān)分析物的穩(wěn)定的、通常非共價的聯(lián)合。膜相關(guān)分析物的二聚體可因與配體的相互作用而形成，即配體誘導的二聚作用，如Schlessinger，Cell，110669-672(2002)。關(guān)于膜相關(guān)分析物的″寡聚物″是指至少兩個膜相關(guān)分析物的穩(wěn)定的、通常非共價的聯(lián)合。
″多肽″指由氨基酸殘基組成的一類化合物，氨基酸殘基通過酰胺鍵去除一個氨基酸羧基和另一個氨基酸氨基間的水而化學連接在一起。多肽是氨基酸殘基的聚合體，它可含有大量的這種殘基。通常，除由較少數(shù)量氨基酸組成外，肽與多肽相似。肽有時被稱作寡肽。在多肽和肽之間沒有明確的區(qū)別。為方便起見，在此公開物和權(quán)利要求中，術(shù)語″多肽″一般將用于指肽和多肽。氨基酸殘基可以是天然的或合成的。
″蛋白″指多肽，通常由生物學細胞合成，折疊成限定的三維結(jié)構(gòu)。蛋白在分子量上一般從大約5,000至大約5,000,000或以上，更常見的從大約5,000至大約1,000,000分子量，并可包括翻譯后修飾，如乙?；Ⅴ；?、ADP-核糖基化、酰胺化、核黃素共價附著、亞鐵血紅素部分共價附著、核苷酸或核苷酸衍生物共價附著、脂質(zhì)或脂質(zhì)衍生物共價附著、磷脂酰肌醇共價附著、交聯(lián)、環(huán)化、二硫鍵形成、脫甲基化、形成共價交聯(lián)、形成胱氨酸、形成焦谷氨酸化合物、甲?；ⅵ?羧基化、糖基化、GPI錨形成、羥基化、碘化、甲基化、肉豆蔻?；?、氧化、磷酸化作用、異戊二烯化、外消旋作用、selcnoylation、硫酸化、和泛醌化，如Wold，F(xiàn)，翻譯后蛋白修飾透視和前景，1-12頁，見蛋白的翻譯后共價修飾，B.C.Johnson，主編，Academic Press，New York，1983。為了例證而非限制，蛋白包括，細胞因子或白介素，酶如激酶、蛋白酶。半乳糖苷酶等等，魚精蛋白，組蛋白，白蛋白，免疫球蛋白，硬蛋白，磷蛋白，粘蛋白，色蛋白，脂蛋白，核蛋白，糖蛋白，T-細胞受體，蛋白多糖，未分類蛋白如生長激素、促乳激素、胰島素、胃蛋白酶，人血漿中發(fā)現(xiàn)的蛋白，凝血因子，血型檢定因子，蛋白激素，癌癥抗原，組織特異抗原，肽激素，營養(yǎng)標識，組織特異抗原，和合成的肽。
術(shù)語″樣本″是指一些要檢測或測量的，懷疑含有膜相關(guān)分析物的物質(zhì)。如這里所用的，該術(shù)語包括標本(如，活檢或醫(yī)學標本)或培養(yǎng)物(如，微生物學培養(yǎng)物)。也包括生物學和環(huán)境樣本。樣本可包括合成來源的標本。生物學樣本可以是動物包括人的液體、固體(如，糞便)或組織，以及液體和固體的食物和飼料產(chǎn)品和成分，如奶制品、蔬菜、肉類和肉類副產(chǎn)品，和廢物。生物學樣本可包括取自患者的材料，包括但不限于培養(yǎng)物、血液、唾液、腦脊液、胸膜液體、乳汁、淋巴、痰、精液、針吸物，等。生物學樣本可取自所有家畜的各種家族，以及未馴服或野生的動物，包括但不限于，如有蹄類動物、熊、魚、嚙齒動物，等。環(huán)境樣本包括環(huán)境材料如表面物質(zhì)、土壤、水和工業(yè)樣本，以及取自食物和奶制品加工機械、裝置、設備、器具的樣本，一次性和非一次性類。這些實例并不解釋為限制可用于本發(fā)明的樣本類型。特別地，生物學樣本包括固定的生物學標本，如用固定劑處理的患者活檢標本，包埋在石蠟中的生物學標本，冷凍的生物學標本，涂片，和類似標本。
關(guān)于分離分子標記的″分離圖表(separation profile)″是指表、圖、曲線、條形圖，或其它表現(xiàn)信號強度數(shù)據(jù)對應分子標記相關(guān)參數(shù)如保留時間、面積等的表示方法，它提供了實驗中產(chǎn)生的各型分子標記數(shù)量的讀數(shù)或測量值。分離圖像可以是電泳圖譜、層析圖、電層析圖、質(zhì)譜圖，或相似的表現(xiàn)依賴于所用分離技術(shù)的數(shù)據(jù)的圖像。關(guān)于分離圖像的″峰″或″帶″或″區(qū)″是指分離的化合物集中的區(qū)域。不同的分子標記具有發(fā)射光譜獨特的不同熒光標記，例如，如果在多個波長采集和記錄數(shù)據(jù)，則單次實驗可有多個分離圖像。在一個方面，釋放的分子標記通過電泳遷移率差異形成電泳圖譜而被分離，其中不同的分子標記相當于電泳圖譜上分離的峰。在電泳圖譜上測量相鄰峰的差別或缺少重疊是″電泳的分辨率，″它可被視為相鄰峰最大值之間的距離除以該峰兩個標準差之較大者的4倍。優(yōu)選地，相鄰峰的分辨率至少為1.0，更優(yōu)選地，至少為1.5，最優(yōu)選地，至少為2.0。在特定的分離和檢測系統(tǒng)中，所需的分辨率可通過選擇多個分子標記來獲得，其成員電泳遷移率的差異至少有解析峰的數(shù)量，該數(shù)量依賴于幾個本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的因素，包括信號檢測系統(tǒng)，熒光部分的屬性，標記的擴散系數(shù)，有或無篩選基質(zhì)，電泳裝置的特性如有或無通道、分離通道的長度，等。
關(guān)于一個分子與另一個分子如靶分析物的結(jié)合化合物或探針的″特異的″或″特異性″結(jié)合，是指探針與靶之間識別、接觸并形成穩(wěn)定的復合物，以及探針與其它分子實質(zhì)上較少的識別、接觸或形成復合物。在一個方面，關(guān)于第一個分子與第二個分子″特異的″結(jié)合是指第一個分子與反應或樣本中的另一個分子達到識別并形成復合物的程度，它與第二個分子形成最大數(shù)量的復合物。在一個方面，此最大數(shù)量至少是第一個分子形成的所有這種復合物的50％。一般地，涉及特異結(jié)合活動的分子在其表面或空穴中有一些區(qū)域，在分子相互結(jié)合間產(chǎn)生特異的識別。特異結(jié)合的實例包括抗體-抗原相互作用、酶-底物相互作用、在多核苷酸和/或寡核苷酸中形成雙重體或三重體、受體-配體相互作用，等。如這里所用的，關(guān)于特異性或特異結(jié)合的″接觸″是指兩個分子足夠接近，致使弱的非共價化學相互作用，如范德華力、氫連接、離子和疏水相互作用等，控制著分子的相互作用。如這里所用的，關(guān)于兩個或多個分子的″穩(wěn)定復合物″是指這種分子形成非共價連接集合體，如通過特異結(jié)合，在實驗條件下從熱動力學上優(yōu)于非集合狀態(tài)。
如這里所用的，關(guān)于多個熒光標記的術(shù)語″光譜可分辨的″是指標記的熒光發(fā)射光帶十分清楚，即完全無重疊，使各自附著標記的分子標志可以通過標準的光電探測系統(tǒng)，如使用帶通濾波器和光電倍增管系統(tǒng)等，根據(jù)各自標記產(chǎn)生的熒光信號而被區(qū)分，例如以下文獻中描述的系統(tǒng)美國專利Nos.4,230,558；4,811,218，或類似系統(tǒng)，或Wheeless等人，21-76頁，見流式細胞計數(shù)儀器和數(shù)據(jù)分析(Academic Press，NewYork，1985)。
術(shù)語″分泌的蛋白″或″可溶的蛋白″指(i)在細胞內(nèi)表達，(ii)從細胞內(nèi)分泌到細胞外基質(zhì)，如，典型地需要從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)經(jīng)細胞膜直接表達蛋白的引導序列，和(iii)作用于受體，典型地是細胞表面受體，以影響或啟動某些細胞活動或活性，它可以是細胞內(nèi)活動包括細胞增殖或刺激，細胞表面活動，或細胞-細胞相互作用活動。
如這里所用的，術(shù)語″標記的探針″指用于本發(fā)明的與細胞膜表面上靶分子即膜相關(guān)分析物結(jié)合的探針，它含有一個或多個經(jīng)可裂解鍵與探針結(jié)合劑連接的分子標記。如這里所用的，″標記的探針″與″結(jié)合化合物″所用意思相同。
發(fā)明詳述在一個方面，本發(fā)明關(guān)注于通過從與膜相關(guān)分析物和裂解探針形成穩(wěn)定復合物的結(jié)合化合物中選擇性地釋放分子標記來檢測樣本中存在一個或多個膜相關(guān)分析物二聚體或寡聚物和/或其數(shù)量的方法。發(fā)明此方面的重要特色包括在緊鄰裂解探針的該復合物的結(jié)合化合物中有限制地裂解分子標記，而實質(zhì)上不裂解不形成該復合物的結(jié)合化合物的分子標記。即，裂解探針含有裂解誘導部分，可導致其緊鄰的某些鍵裂解。如下面更充分公開的，這種局部裂解是通過使用這里稱作″敏化劑″的裂解誘導部分實現(xiàn)的，它可誘導產(chǎn)生活性物質(zhì)，即可擴散的、短壽的活性化學實體，該活性物質(zhì)能夠與分子標記的可裂解鍵反應使之從結(jié)合化合物中釋放。
本發(fā)明一個實施例的說明圖解地顯示在圖1A和1B中。具有分子標記″mT1″和″mT2″的結(jié)合化合物(100)與具有光敏劑″PS″的裂解探針(102)與生物學細胞(104)結(jié)合。具有分子標記″mT1″的結(jié)合化合物對細胞表面受體R1(106)特異，具有分子標記″mT2″的結(jié)合化合物對細胞表面受體R2(108)特異。細胞表面受體R1和R2呈現(xiàn)為單體，如(106)和(108)，在細胞表面膜(112)上為二聚體(110)。這些實驗組分在適合的結(jié)合緩沖液中孵育后，在結(jié)合化合物和其各自受體靶之間，以及在裂解探針和其受體靶之間可以形成(114)穩(wěn)定的復合物。如圖所示，優(yōu)選地結(jié)合化合物和裂解探針各自含有抗體結(jié)合組合物，它使分子標記和裂解誘導部分特異地靶向膜成分。在一個方面，這種抗體結(jié)合組合物是單克隆抗體，在該實施例中，結(jié)合緩沖液可包括常規(guī)ELISA技術(shù)或類似技術(shù)使用的緩沖液。在結(jié)合化合物與裂解探針形成穩(wěn)定復合物(116)后，測定混合物被照明(118)以誘導光敏劑(120)產(chǎn)生單態(tài)氧。單態(tài)氧迅速地與測定混合物成分反應使其有效地接近(122)，由于分子標記可裂解鍵的裂解是空間受限的，所以只有正好位于有效近端內(nèi)的分子標記被釋放(124)。如圖所示，釋放的分子標記僅僅是與R1-R2二聚體和裂解探針形成穩(wěn)定復合物的結(jié)合化合物上者。釋放的分子標記(126)從測定混合物中移出并按照分離特征分離(128)，因而在分離圖像(132)中形成清楚的峰(130)。按照本發(fā)明，這種移出和分離可以是相同的步驟?？蛇x擇地，照明前可去除結(jié)合緩沖液并用更適合分離的緩沖液替換，即分離緩沖液。例如，典型地，結(jié)合緩沖液具有的鹽濃度可降低某些分離技術(shù)將分子標記分開成獨立峰的性能，如毛細電泳。在一個實施例中，這種緩沖液交換可通過膜過濾完成。
圖2A-2E圖解本發(fā)明的另一個實施例，以描繪多個受體類型中的二聚作用。圖2A概括了這種實驗的基本步驟。要檢測細胞表面受體二聚體的細胞膜(200)與結(jié)合化合物集合(202)、(204)和裂解探針(206)結(jié)合。膜餾分(200)在其細胞膜中含有三種不同類型的單體受體分子(″1，″″2，″和″3″)，它們聯(lián)合形成三種不同的雜二聚體1-2，1-3，和2-3。三個抗體試劑(202)和(204)與膜餾分(200)結(jié)合，每個抗體試劑對三個受體分子之一具有結(jié)合特異性，其中抗體(206)對受體分子1特異，抗體(204)對受體分子2特異，抗體(202)對受體分子3特異。第一個受體分子的抗體與光敏劑分子，標記的PS共價偶聯(lián)。第二和第三個受體分子的抗體，通過可被光敏劑實體產(chǎn)生的活性物質(zhì)裂解的鍵，分別與兩個不同的標記，標記的T2和T3連接。
混合后，抗體可以結(jié)合(208)到膜表面上的分子上。光敏劑被激活(210)，在距敏化劑分子可作用距離內(nèi)裂解標記和抗體間的鍵，從而釋放標記到實驗介質(zhì)中。然后分離(212)反應中的物質(zhì)，如通過毛細電泳，如圖所示。如圖2A底部所示，標記T2和T3被釋放，通過電泳分離將顯示兩條對應于這些標記的帶。由于設計的標記具有已知的電泳遷移率，每個條帶可以唯一的確定為實驗中所用的標記之一。
如圖2A所示，存在于細胞膜上的三個不同雜二聚體中只有兩個將與含光敏劑的抗體和含標記的抗體結(jié)合，因此只有這兩類會產(chǎn)生釋放的標記。但是，需要多個實驗來測量不同二聚體的相對數(shù)量。圖2B提供了列舉5種不同實驗組合的表。
圖2C是每個實驗組成的說明性結(jié)果。實驗I表現(xiàn)了完整實驗的結(jié)果，如圖2A所述。實驗II中省略了與光敏劑連接的對受體分子1特異的抗體。此實驗不產(chǎn)生信號，表明實驗I中獲得的T2和T3信號需要光敏劑試劑。相似地，實驗V顯示標記信號需要存在膜。實驗III和Ⅳ顯示每個標記試劑不需要存在其它被裂解物。當一起考慮這些結(jié)果時，可以得出關(guān)于膜中受體雜二聚體是否存在及其組成的結(jié)論，如圖2C中所示，即存在1-2和1-3雜二聚體。此外，每個標記的相對信號強度可以評估每個雜二聚體的相對數(shù)量。
但是，以此實驗所用的試劑組合不能做出關(guān)于2-3雜二聚體存在的結(jié)論。無論復合物是否存在，不會獲得表現(xiàn)此復合物的信號，因為不會有光敏劑與之連接。為了得出關(guān)于三個單體所有可能的二聚體組合的結(jié)論，要么必須使用第四個能夠定位于所有可能的含單體1、2和/或3的寡聚物的試劑，要么本實驗所用的三個結(jié)合試劑必須與標記和敏化劑分子偶聯(lián)成不同的組合。后一個方法圖解于圖2D和2E。三個抗體試劑間三種可能的光敏劑和標記分配組合列于圖2D左側(cè)的表中。第一個組合包括與對1號單體特異的抗體偶聯(lián)的光敏劑，與圖2A-2C圖示中所用的組合相同，并與圖2C具有相同的二聚體組合。第二個組合包括與對2號單體特異的抗體偶聯(lián)的光敏劑，總體圖像給出了相同編號的雜二聚體1-2，加上雜二聚體2-3的值。第三個組合包括與對3號單體特異的抗體偶聯(lián)的光敏劑，總體圖像給出了相同編號的雜二聚體1-3和2-3，如前兩個組合所獲得的。這些結(jié)果可以組合產(chǎn)生圖2E給出的全部雜二聚體總體概貌。
如上提到的，本發(fā)明的另一個方面關(guān)注于測定細胞膜中細胞表面分子一個或多個寡聚復合物的形成?？杀粶y定的復合物包括由兩個或以上單一分子物質(zhì)組成的同型-寡聚物，和由兩個或以上不同分子物質(zhì)組成的雜-寡聚物。優(yōu)選的細胞表面分子種類包括受體，特別是G-蛋白偶聯(lián)受體家族成員和表皮生長因子受體家族成員。
本發(fā)明的方法包括使至少兩個細胞表面分子與兩個不同的結(jié)合劑接觸，第一個經(jīng)可裂解鍵與標記接合，其中標記含有探測基團，第二個與裂解劑接合，當鍵位于對反應有效的裂解劑附近時，裂解劑能夠裂解可裂解鍵。此反應區(qū)域被稱作裂解劑的″有效近端″。通過裂解劑釋放標記指示了標記探針在裂解探針有效近端內(nèi)的位置。優(yōu)選的第一和第二結(jié)合劑成分是抗體分子，更優(yōu)選地是單克隆抗體。優(yōu)選的探測基團是熒光團。優(yōu)選的裂解劑實施例是能被激活產(chǎn)生活性裂解物質(zhì)的敏化劑分子。更優(yōu)選地，裂解劑包括光敏劑，它被光激活產(chǎn)生可裂解氧化不穩(wěn)定連接的氧化劑，后者將標記接合在標記探針的第一個結(jié)合劑上。
在本發(fā)明的另一個方面，當需要測定多個細胞表面復合物的形成或由不同分子物質(zhì)組成的單一細胞表面復合物的形成時，本方法使用多個第一結(jié)合劑，每個接合不同的標記，因而形成多個標記探針。其中每個標記將含有探測基團和遷移率調(diào)節(jié)劑，提供了在眾多標記中區(qū)分每個可釋放標記與其它可釋放標記的方法。區(qū)分釋放標記的一個優(yōu)選方法是通過電泳物理分離，其中遷移率調(diào)節(jié)劑賦予了電泳遷移率的差異。優(yōu)選的電泳方式包括毛細電泳，包括常規(guī)毛細電泳和在微流體卡上分離。其它優(yōu)選的區(qū)分方法包括根據(jù)標記探測基團光學性質(zhì)差異的光譜解析，和根據(jù)標記質(zhì)量差異通過質(zhì)譜分析的物理分離。
本發(fā)明的另一個方面關(guān)注于測定化合物對細胞膜表面寡聚復合物形成的影響。這些方法包括制備兩個細胞膜、標記探針和裂解探針的組合，其中化合物添加于兩個組合之一。在孵育使標記探針裂解后，檢測每個組合釋放的標記的量，并比較兩個混合物。本發(fā)明進一步提供了測定化合物對多個細胞表面復合物形成影響的方法。
在另一個方面，本發(fā)明包括測定細胞膜中由第一和第二個細胞表面分子組成的寡聚復合物形成的方法，該方法包括以下步驟(a)在結(jié)合條件下混合(i)細胞膜，(ii)由第一結(jié)合劑和至少一個標記分子組成的標記探針，第一結(jié)合劑能夠特異地結(jié)合第一個細胞表面分子，標記分子含有探測基團，所述標記經(jīng)可裂解鍵被接合到第一結(jié)合劑上，和(iii)由第二結(jié)合劑和裂解劑組成的裂解探針，第二結(jié)合劑能夠特異地結(jié)合第二個細胞表面分子，當位于有效近端內(nèi)時裂解劑能夠裂解可裂解鍵，其中當細胞膜內(nèi)形成了寡聚復合物并被標記探針和裂解探針結(jié)合時，標記探針的至少一個可裂解鍵位于裂解劑的有效近端內(nèi)；(b)在使位于裂解劑有效近端內(nèi)的可裂解鍵裂解的條件下孵育混合物，從而從標記探針中釋放標記；和(c)檢測釋放的標記，因此測定寡聚復合物的形成。
在另一個方面，本發(fā)明包括測定一個或多個寡聚復合物形成的方法，每個寡聚復合物由細胞膜內(nèi)第一和第二個細胞表面分子組成，該方法包括以下步驟(a)在結(jié)合條件下混合(i)細胞膜，(ii)多個標記探針，每個標記探針包含第一結(jié)合劑和一組標記中的至少一個標記分子，第一結(jié)合劑能夠特異地結(jié)合一組第一個細胞表面分子中的一個，其中所述標記含有探測基團和遷移率調(diào)節(jié)劑，提供了從集合中區(qū)分每個標記與所有其它標記的方法，所述標記經(jīng)可裂解鍵被接合到第一結(jié)合劑上，和(iii)由第二結(jié)合劑和裂解劑組成的裂解探針，第二結(jié)合劑能夠特異地結(jié)合第二個細胞表面分子，當位于有效近端內(nèi)時裂解劑能夠裂解可裂解鍵，其中當細胞膜內(nèi)形成了寡聚復合物并被標記探針和裂解探針結(jié)合時，標記探針的至少一個可裂解鍵位于裂解劑的有效近端內(nèi)；(b)在使位于裂解劑有效近端內(nèi)的可裂解鍵裂解的條件下孵育混合物，以從標記探針中產(chǎn)生釋放的標記；(c)按照區(qū)分的方法分離釋放的標記；和(d)檢測分離的標記，因此測定每個寡聚復合物的形成。
在另一個方面，本發(fā)明包括測定化合物對細胞膜中含有第一和第二個細胞表面分子的寡聚復合物形成影響的方法，該方法包括以下步驟(a)在結(jié)合條件下制備兩個混合物，含(i)細胞膜，(ii)含有第一結(jié)合劑和至少一個標記分子的標記探針，第一結(jié)合劑能夠特異地結(jié)合第一個細胞表面分子，標記分子含有探測基團，所述標記經(jīng)可裂解鍵被接合到第一結(jié)合劑上，和(iii)含有第二結(jié)合劑和裂解劑的裂解探針，第二結(jié)合劑能夠特異地結(jié)合第二個細胞表面分子，當位于有效近端內(nèi)時裂解劑能夠裂解可裂解鍵，其中當細胞膜內(nèi)形成了寡聚復合物并被標記探針和裂解探針結(jié)合時，標記探針的至少一個可裂解鍵位于裂解劑的有效近端內(nèi)；(b)添加所述化合物到兩個混合物之一中；(c)在使位于裂解劑有效近端內(nèi)的可裂解鍵裂解的條件下孵育混合物，從而從標記探針中釋放標記；(d)檢測和鑒定步驟(c)中兩個組合各自釋放的標記量；和(e)比較兩個混合物釋放的標記量，從而測定化合物對寡聚復合物形成的影響。
在另一個方面，本發(fā)明包括測定化合物對多個寡聚復合物的任一或全部形成的影響的方法，每個寡聚復合物由細胞膜中第一和第二個細胞表面分子組成，該方法包括以下步驟(a)在結(jié)合條件下制備兩個混合物，含(i)細胞膜，(ii)多個標記探針，每個標記探針由第一結(jié)合劑和一組標記中的至少一個標記分子組成，第一結(jié)合劑能夠特異地結(jié)合多個寡聚復合物的第一個細胞表面分子之一，其中所述標記含有探測基團和遷移率調(diào)節(jié)劑，提供了從集合中區(qū)分每個標記與所有其它標記的方法，所述標記經(jīng)可裂解鍵被接合到第一結(jié)合劑上，和(iii)由第二結(jié)合劑和裂解劑組成的裂解探針，第二結(jié)合劑能夠特異地結(jié)合多個寡聚復合物的第二個細胞表面分子之一，當位于有效近端內(nèi)時裂解劑能夠裂解可裂解鍵，其中當細胞膜內(nèi)形成了寡聚復合物并被標記探針和裂解探針結(jié)合時，標記探針的至少一個可裂解鍵位于裂解劑的有效近端內(nèi)；(b)添加所述化合物到兩個混合物之一中；(c)在使位于裂解劑有效近端內(nèi)的可裂解鍵裂解的條件下孵育混合物，從而從標記探針中釋放標記；(d)按照區(qū)分的方法分離釋放的標記；(e)檢測和鑒定每個分離的步驟(c)中兩個混合物各自釋放的標記量；和(f)比較兩個混合物中釋放的每個標記的量，從而測定化合物對寡聚復合物形成的影響。
含目標膜相關(guān)分析物的樣本可來自大范圍的各種來源，包括細胞培養(yǎng)物，動物或植物組織，微生物，患者活檢組織，或類似物。用常規(guī)技術(shù)制備本發(fā)明實驗的樣本，它依賴于取得樣本的來源。制備分析用細胞膜的指導可以在標準專題論文中發(fā)現(xiàn)，如Sambrook等人，分子克隆，第二版(Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York，1989)；Innis等人主編，PCR方案(AcademicPress，NewYork，1990)；Berger和Kimmel，″分子克隆技術(shù)指導，″Vol.152，酶學方法(Academic Press，New York，1987)；Ohlendieck，K.(1996).蛋白純化方案；分子生物學方法，Humana Press Inc.，Totowa，NJ.Vol 59293-304；方法手冊5，″信號轉(zhuǎn)導″(Biosource International，Camarillo，CA，2002)；或類似文獻。對于哺乳動物組織培養(yǎng)細胞，或類似來源，目標膜相關(guān)分析物樣本可通過常規(guī)的細胞溶解技術(shù)制備(如0.14M NaCl，1.5mM MgCl2，10mM Tris-Cl(pH 8.6)，0.5％Nonidet P-40，需要時蛋白酶和/或磷酯酶抑制劑)。對于活檢組織和醫(yī)學標本Bancroft JD & Stevens A主編.組織學技術(shù)理論和實踐(Churchill Livingstone，Edinburgh，1977)；Pearse，組織化學.理論和應用.第4版.(Churchill Livingstone，Edinburgh，1980)。
如下面更充分描述的，通過分離和鑒定釋放的分子標記測定目標膜相關(guān)分析物。可以使用各種廣泛的分離技術(shù)，能夠根據(jù)要分離的分子間一個或多個物理、化學或光學的差異區(qū)分分子，包括但不限于電泳遷移率、分子量、形狀、溶解度、pKa、疏水性、電荷、電荷/質(zhì)量比、極性，或類似特性。在一個方面，多數(shù)分子標記在電泳遷移率和光學檢測特性上不同，并通過電泳分離。在另一個方面，多數(shù)分子標記在分子量、形狀、溶解度、pKa、疏水性、電荷、極性上不同，并通過常相或反相HPLC、離子交換HPLC、毛細電層析法、質(zhì)譜分析、氣相層析法，或類似技術(shù)分離。
本發(fā)明的另一個方面是提供一套分子標記，在它們從結(jié)合化合物中釋放后，通過所用的分離技術(shù)可分開成明顯的條帶或峰。其中分子標記在化學上可以是各異的；但是，為方便起見，分子標記套通常是化學相關(guān)的。例如，它們可以全是肽，或它們可以是由相同基本構(gòu)件或單體組成的不同組合，或它們可以是用相同的基本骨架合成的，用不同的取代給予不同的分離特性，如下面更充分描述的。多數(shù)分子標記的數(shù)量可依幾個因素而不同，包括所用的分離方式，在分子標記上為檢測所用的標記，結(jié)合部分的靈敏性，可裂解鍵裂解的效率，等。在一個方面，多數(shù)分子標記的數(shù)量范圍從2至數(shù)十，如30。在另一個方面，多個的數(shù)量范圍可以從2至20，2至10，3至20，3至10，4至30，4至10，5至20，或5至10。
分子標記和可裂解鍵在一個實施例中，分子標記通過可裂解鍵與活性物質(zhì)如單態(tài)氧的反應而從結(jié)合化合物或標記探針中裂解，活性物質(zhì)是由裂解誘導部分產(chǎn)生的，如Singh等人，國際專利公開WO 01/83502和WO 02/95356。
本發(fā)明的一個方面包括提供多個不同結(jié)合化合物的混合物，其中每一個不同的結(jié)合化合物具有一個或多個經(jīng)可裂解鍵連接的分子標記。結(jié)合化合物、可裂解鍵和分子標記的特性可在很寬的范圍那變化。結(jié)合化合物可包括抗體結(jié)合組合物，抗體，肽，細胞表面受體的肽或非肽配體，蛋白，寡核苷酸，寡核苷酸類似物如肽核酸，植物血凝素，或能夠與目的膜相關(guān)分析物特異的結(jié)合或形成復合物的任何其它分子整體。在一個方面，能夠被以下結(jié)構(gòu)式表示的結(jié)合化合物含有一個或多個分子標記附著在分析物特異的結(jié)合部分上。
B-(L-E)k其中B是結(jié)合部分；L是可裂解鍵；E是分子標記。優(yōu)選地，在非多核苷酸分析物的同類實驗中，可裂解鍵L是氧化不穩(wěn)定鍵，更優(yōu)選地，是可被單態(tài)氧裂解的鍵?！?(L-E)k″部分表示單一結(jié)合化合物可有多個分子標記經(jīng)可裂解鍵連接。在一個方面，k是大于或等于1的整數(shù)，但在其它實施例中，k可以大于數(shù)百，如100至500，或k大于數(shù)百至數(shù)千之多，如500至5000。在本發(fā)明的組成內(nèi)，通常多數(shù)不同類型的結(jié)合化合物具有不同的分子標記E?？闪呀怄I如氧化不穩(wěn)定鍵，和分子標記E，經(jīng)過常規(guī)化學方法連接到B上。
優(yōu)選地，B是抗體結(jié)合組合物。這種成分用各種市售對膜相關(guān)分析物特異的單克隆和多克隆抗體是容易形成的。特別地，對表皮生長因子受體特異的抗體公開在以下專利中，在此引入以供參考5,677,171；5,772,997；5,968,511；5,480,968；5,811,098.美國專利6,488,390公開了對G-蛋白偶聯(lián)的受體特異的抗體CCR4，在此引入以供參考。美國專利5,599,681公開了對蛋白磷酸化作用位點特異的抗體，在此引入以供參考。
當L對氧化不穩(wěn)定時，L優(yōu)選地是硫醚或其硒類似物；或含碳-碳雙鍵的烯烴，其中雙鍵裂解成橋氧基釋放分子標記E。例證性的硫醚鍵公開在Willner等人，美國專利5,622,929中，在此引入以供參考。例證性的烯烴包括二乙烯基硫、乙烯醚、烯胺、在碳原子上用a-次甲基(CH，具有至少一個氫原子的碳原子)取代的亞胺，其中乙烯基可以是環(huán)狀的，雜原子可以成環(huán)狀，或在環(huán)狀烯烴的碳原子上取代，將有至少一個和高達4個雜原子結(jié)合到烯烴碳原子上。得到的1，2-二噁二酮可自發(fā)地分解，通過加熱至室溫以上，通常低于大約75℃，通過與酸或堿反應，或通過有或無光敏劑情況下的光活化。這些反應描述在以下典型的文獻中Adam和Liu，J.Amer.Chem.Soc.94，1206-1209，1972，Ando等人，J.C.S.Chem.Comm.1972，477-8，Ando等人，Tetrahedron 29，1507-13，1973，Ando等人，J.Amer.Chem.Soc.96，6766-8，1974，Ando和Migita，ibid.97，5028-9，1975，Wasserman和Terao，Tetra.Lett.21，1735-38，1975，Ando和Watanabe，ibid.47，4127-30，1975，Zaklika等人，Photochemistry and Photobiology30，35-44，1979，和Adam等人，Tetra.Lett.36，7853-4，1995。又見，美國專利no.5,756,726。
通過單態(tài)氧與活化烯烴的反應得到形成1，2-二惡二酮，在烯烴的一個碳原子上用分子標記取代，在其它碳原子上用結(jié)合部分取代。見，例如，美國專利No.5,807,675。這些可裂解鍵可被以下結(jié)構(gòu)式描述
-W-(X)nCα＝Cβ(Y)(Z)-其中W可以是鍵，雜原子如O，S，N，P，M(預計形成穩(wěn)定共價鍵的金屬)，或功能基團如羰基、亞氨基等，可以與X或Cα結(jié)合；至少一個X是脂肪族的、芳香族的、脂環(huán)族的或雜環(huán)的并經(jīng)雜原子如N，O，或S與Cα結(jié)合，其它X可以相同或不同，此外可以是氫、脂肪族的、芳香族的、脂環(huán)族的或雜環(huán)的，通常是芳香族的或芳香雜環(huán)的，其中一個X可和Y一起與其連接的碳原子形成環(huán)，通常是雜環(huán)，一般除氫以外是大約1至20個碳原子，通常1至12，更常見地1至8，一個X會有0至6個雜原子，通常是0至4，而其它X會有至少一個雜原子和高達6個雜原子，通常1至4個雜原子；Y在X的定義范圍內(nèi)，通常經(jīng)雜原子與Cβ連接，如所指出，可以和X一起形成雜環(huán)；Z通常會是芳香族的，包括雜環(huán)芳香族的，大約4至12個碳原子，通常4至10，和0至4個雜原子，如上所述，與Cβ直接連接或經(jīng)雜原子連接，如上所述；n為1或2，依賴于分子標記是否與Cα或X連接；其中Y和Z之一會有功能基團與結(jié)合部分結(jié)合，或被連接到結(jié)合部分上，如通過作為或包括鍵基團，到結(jié)合部分T上。
優(yōu)選地，選擇W，X，Y，和Z使裂解時分子標記E位于下面描述的大小范圍限制內(nèi)。
例證性的可裂解鍵包括S(分子標記)-3-硫丙烯酸，N(分子標記)，N-甲基4-氨基-4-丁烯酸，3-羥丙烯醛，N-(4-羧基苯)-2-(分子標記)-咪唑，噁唑，和噻唑。
還感興趣的是N-烷基吖啶衍生物，在位置9上用下面結(jié)構(gòu)式的二價基團取代-(CO)X1(A)-其中X1是雜原子，包括O，S，N，和Se，通常是前三個之一；和A是至少2個碳原子，通常不超過6個碳原子被分子標記取代的鏈，其中優(yōu)選地其它價的A被氫飽和，盡管該鏈可被其它基團取代，如烷基、芳基、雜環(huán)基等，A通常不超過10個碳原子。
還感興趣的是雜環(huán)化合物，如二雜環(huán)戊二烯，作為例子被咪唑、噻唑、噁唑等取代，其中的環(huán)通常被至少一個芳香族基團取代，在某些情況下必須水解來釋放分子標記。
還感興趣的是碲(Te)衍生物，其中Te鍵合至為Te原子提供氫原子β的乙烯基上，其中乙烯基是脂環(huán)族環(huán)或雜環(huán)的一部分，可有橋氧基，優(yōu)選地與芳香族環(huán)融合，其它價Te與分子標記鍵合。所述環(huán)可以是香豆素、苯并惡嗪、四氫萘等。
幾個優(yōu)選的可裂解鍵及其裂解產(chǎn)物圖示于圖3A-F。顯示在圖3A中的噻唑可裂解鍵，″-CH2-噻唑-(CH2)n-C(＝O)-NH-蛋白″，產(chǎn)生具有″-CH2-C(＝O)-NH-CHO″部分的分子標記。優(yōu)選地，n的范圍從1至12，更優(yōu)選地，從1至6。圖3B顯示的噁唑可裂解鍵，″-CH2-噁唑-(CH2)n-C(＝O)-NH-蛋白″，產(chǎn)生具有″-CH2-C(＝O)O-CHO″部分的分子標記。烯烴可裂解鍵(圖3C)連同上面描述的結(jié)合化合物實施例″B-L-M-D″一起顯示，D是熒光素染料。烯烴可裂解鍵也可用于其它實施例。圖示的烯烴鍵的裂解產(chǎn)生″R-(C＝O)-M-D″形式的分子標記，其中″R″可以是上面提供的分子標記E一般描述內(nèi)的任何取代。優(yōu)選地，R是供電子基團，如Ullman等人，美國專利6,251,581；Smith和March，March′s高級有機化學反應，原理，和結(jié)構(gòu)，第5版(Wiley-Interscience，New York，2001)；等。更優(yōu)選地，R是具有1-8個碳原子和0至4個雜原子的供電子基團，雜原子選自O，S，和N。進一步優(yōu)選地，R是-N(Q)2，-OQ，p-[C6H4N(Q)2]，呋喃基，n-烷基吡咯基，2-吲哚基，等，其中Q是烷基或芳基。Li進一步提到圖3C的烯烴可裂解鍵，取代″X″和″R″相當于上面描述可裂解鍵L的結(jié)構(gòu)式的取代″X″和″Y″。特別地，圖3C中的X優(yōu)選嗎啉代，-OR′，或-SR″，其中R′和R″是具有1-8個碳原子和0至4個雜原子的脂肪族、芳香族、脂環(huán)族或雜環(huán)，雜原子選自O，S.和N.。優(yōu)選的硫醚可裂解鍵圖示在圖3D中，有″-(CH2)2-S-CH(C6H5)C(＝O)NH-(CH2)n-NH-″形式，其中n的范圍從2至12，更優(yōu)選地，2至6范圍。圖3D中顯示的醚可裂解鍵類型可作為圖3E和3F顯示的前體化合物連接結(jié)合部分T和分子標記E。為接合結(jié)合部分T的氨基，通過常規(guī)化學方法轉(zhuǎn)換末端羥基為NHS酯。與氨基反應并接合后，去除Fmoc保護基團以產(chǎn)生游離胺，然后與分子標記的NHS酯反應。
當通過氣相層析法或質(zhì)譜分析進行多個分子標記分離時，分子標記E在本發(fā)明中可包括以下文獻描述的電聲標記Zhang等人，Bioconjugate Chem.，131002-1012(2002)；Giese，Anal.Chem.，2165-168(1983)；美國專利4,650,750；5,360,819；5,516,931；5,602,273；等。
分子標記E優(yōu)選地是對活性物質(zhì)，特別是單態(tài)氧穩(wěn)定的水溶性有機化合物，包括檢測或報告基團。另外，E在大小和結(jié)構(gòu)上可有很大變化。在一個方面，E的分子量范圍從大約50至大約2500道爾頓，更優(yōu)選地，從大約50至大約1500道爾頓。E的優(yōu)選結(jié)構(gòu)更充分地描述于下。E可含有檢測基團以產(chǎn)生電化學、熒光，或產(chǎn)色的信號。在應用質(zhì)量進行檢測的實施例中，E沒有用于檢測的單獨部分。優(yōu)選地，檢測基團產(chǎn)生熒光信號。
選擇多個分子標記，使每一個相對于同一集合的其它成員具有獨特的分離特性和/或獨特的光學特性。在一個方面，在一套本領(lǐng)域常規(guī)的標準分離條件下，如電壓、柱壓力、柱型、流動相、電泳分離介質(zhì)等，層析或電泳分離的特征是保留時間。在另一個方面，光學特性是熒光特性，如發(fā)射光譜、熒光壽命、在指定波長或波段下的熒光強度、或類似特性。優(yōu)選地，熒光特性是熒光強度。例如，多個分子標記中的每一個具有相同的熒光發(fā)射特性，但每一個會根據(jù)保留時間而相互不同。在另一方面，兩個或以上的多個分子標記可有相同的保留時間，但它們會有獨特的熒光性質(zhì)，如光譜可分辨的發(fā)射光譜，使得多個標記中的所有成員可通過分子分離和熒光測量聯(lián)合而被區(qū)別開。
優(yōu)選地，釋放的分子標記通過電泳分離及探測基團的熒光性而被檢測。在這些實施例中，具有實質(zhì)上相同熒光性質(zhì)的分子標記具有不同的電泳遷移率，因此在分離條件下形成清晰峰的電泳圖譜。優(yōu)選地，本發(fā)明的多個分子標記通過常規(guī)的毛細電泳裝置分離，無論有或無常規(guī)的篩選基質(zhì)。典型的毛細電泳裝置包括Applied Biosystems(FosterCity，CA)310、3100和3700型；Beckman(Fullerton，CA)model P/ACE MDQ；AmershamBiosciences(Sunnyvale，CA)MegaBACE 1000或4000；SpectruMedix遺傳分析系統(tǒng)；和類似裝置。電泳遷移率與q/M2/3成比例，其中q是分子上的電荷，M是分子的質(zhì)量。理想地，在測定條件下最接近的電泳標記間的遷移率差異至少大約0.001，通常0.002，更通常地至少大約0.01，可以是0.02或以上。優(yōu)選地，在這種常規(guī)裝置中，多個分子標記大電泳遷移率至少相差1％，更優(yōu)選地，至少在1％至10％范圍內(nèi)。
在一個方面，分子標記E是(M，D)，其中M是遷移率修飾部分，D是探測部分。符號″(M，D)″用來表明M和D部分的順序可以是任一個部分能夠與可裂解鍵L相鄰。即，″B-L-(M，D)″指定以下兩個形式結(jié)合化合物的如何一個″B-L-M-D″或″B-L-D-M.″。
探測部分D可以是熒光標記或染料，產(chǎn)色標記或染料，電化學標記，或類似物。優(yōu)選地，D是熒光染料。本發(fā)明所用的典型熒光染料包括水溶性的若丹明染料、熒光素、4，7-二氯熒光素、苯并氧雜蒽染料和能量傳遞染料，公布在以下文獻中分子探針和研究試劑手冊，第8版，(Molecular Probes，Eugene，2002)；Lee等人，美國專利6,191,278；Lee等人，美國專利6,372,907；Menchen等人，美國專利6,096,723；Lee等人，美國專利5,945,526；Lee等人，Nucleic Acids Research，252816-2822(1997)；Hobb，Jr.，美國專利4,997,928；Khanna等人，美國專利4,318,846；Reynolds，美國專利3,932,415；Eckert等人，美國專利2,153,059；Eckert等人，美國專利2,242,572；Taing等人，國際專利出版物WO02/30944；等。更特異的典型熒光染料包括5-和6-羧基若丹明6G；5-和6-羧基X-若丹明，5-和6-羧基四甲基若丹明、5-和6-羧基熒光素、5-和6-羧基-4，7-二氯熒光素、2′，7′-二甲氧基-5-和6-羧基-4，7-二氯熒光素、2’，7′-二甲氧基-4′，5′-二氯-5-和6-羧基熒光素、2′，7′-二甲氧基-4′，5′-二氯-5-和6-羧基-4，7-二氯熒光素、1′，2′，7′，8′-二苯并-5-和6-羧基-4，7-二氯熒光素、2’，7’-二苯并-4’，5’-二氯-5-和6-羧基-4，7-二氯熒光素、2′，7′-二氯-5-和6-羧基-4，7-二氯熒光素、和2′，4′，5′，7′-四氯-5-和6-羧基-4，7-二氯熒光素。最優(yōu)選地，D是熒光素或熒光素衍生物。典型的可用于本發(fā)明的熒光素染料圖示在圖4A-4B中。
遷移率-修飾部分M的大小和成分在一個鏈中可以從一個鍵變化至大約100個原子，通常不超過大約60個原子，更通常地不超過大約30個原子，其中原子是碳、氧、氮、磷、硼和硫。一般地，當不是鍵時，遷移率-修飾部分有大約0至40，更通常地大約0至30個雜原子，除了上面指出的雜原子外可包括鹵素或其它雜原子。除氫以外的原子總數(shù)量一般少于大約200個原子，通常少于大約100個原子。當有酸根存在時，依遷移率-修飾部分所在基質(zhì)的pH，酸根可締合各種陽離子。酸可以是有機或無機的，包括羧酸、硫逐羧酸、硫代羧酸、羥氨酸、磷酸、亞磷酸、膦酸、亞膦酸、亞磺酸、硼酸、硝酸、亞硝酸，等。對于陽性電荷，取代包括氨基(包括銨)、膦、锍、钖，等，其中取代通常是大約1-6個碳原子的脂肪族，每個雜原子的碳原子總數(shù)量通常少于大約12，通常少于大約9。側(cè)鏈包括胺、銨鹽、羥基，包括酚基，羧基，酯，酰胺，磷酸鹽，雜環(huán)。M可以是同型寡聚物或雜合寡聚物，具有相同或不同化學特性的不同單體，如核苷酸和氨基酸。
在另一個方面，(M，D)部分是從產(chǎn)生組合文庫所用的化學骨架中構(gòu)建的。例如，以下文獻描述用于產(chǎn)生不同遷移率修飾部分的骨架化合物類肽(PCT Publication No WO91/19735，Dec.26，1991)，編碼的肽(PCT Publication WO 93/20242，Oct.14 1993)，隨機生物-寡聚物(PCT Publication WO 92/00091，Jan.9，1992)，苯二氮(U.S.Pat.No.5,288,514)，diversomeres如乙內(nèi)酰脲、苯二氮和二肽(Hobbs DeWitt，S.等人，Proc.Nat.Acad.Sci.U.S.A.906909-6913(1993)，vinylogous多肽(Hagihara等人.J.Amer.Chem.Soc.1146568(1992))，具有β-D-葡萄糖骨架的非肽肽類似物(Hirschmann，R.等人，J.Amer.Chem.Soc.1149217-9218(1992))，小化合物文庫的同功有機合成(Chen，C.等人.J.Amer.Chem.Soc.1162661(1994))，寡氨基甲酸酯類(Cho，C.Y等人.Science 2611303(1993))，肽基膦酸酯(Campbell，D.A.等人，J.Org.Chem.59658(1994))；Cheng等人，美國專利6,245,937；Heizmann等人，″黃嘌呤作為分子多樣性的骨架″，Mol.Divers.2171-174(1997)；Pavia等人，Bioorg.Med.Chem.，4659-666(1996)；Ostresh等人，美國專利5,856,107；Gordon，E.M.等人，J.Med.Chem.371385(1994)；和類似文獻。優(yōu)選地，在此方面，D是骨架上的取代，M是剩余的骨架。
M也可包括通過已知的聚合體原單位合成法制備的聚合體鏈。形成選擇長度的含聚乙烯氧化物鏈的方法是熟知的，如Grossman等人，美國專利5,777,096。可以理解，這些涉及將限定大小的多亞單位聚合體單位直接或經(jīng)連接基團相互連接的方法可應用于很多種聚合體，如聚醚類(如，聚乙烯氧化物和聚丙烯氧化物)，聚酯類(如，聚乙醇酸，聚乳酸)，多肽類，寡糖類聚亞安酯，聚酰胺，聚磺酰胺，聚亞砜，聚膦酸酯，及其阻斷共聚物，包括由通過帶電或不帶電連接基團連接的多種亞單位組成的聚合體。除同型聚合體以外，根據(jù)本發(fā)明使用的聚合體鏈包括選擇長度的共聚物，如，與聚丙烯單位交替的聚乙烯氧化物單位聚合體。如另一個實施例，選擇長度和氨基酸成分(即，含天然存在的或人造的氨基酸殘基)的多肽，作為同型聚合體或混合聚合體。
在另一個方面，分子標記E在釋放后被定義為以下結(jié)構(gòu)式A-M-D其中A是-C(＝O)R，其中R是具有1至8個碳原子和包括O、S和N的0至4個雜原子的脂肪族、芳香族、脂環(huán)族或雜環(huán)族；-CH2-C(＝O)-NH-CHO；-SO2H；-CH2-C(＝O)O-CHO；-C(＝O)NH-(CH2)n-NH-C(＝O)C(＝O)-(C6H5)，其中n的范圍從2至12；D是探測基團，優(yōu)選熒光染料；和M如上所述，以A-M-D的總分子量范圍從大約100至大約2500道爾頓為條件。
在另一個方面，D是熒光素，A-M-D的總分子量范圍從大約100至大約1500道爾頓。
在另一個方面，M可從小分子合成，所述小分子具有使分子相互連接的功能基團，通常以線性鏈方式。這種功能基團包括羧酸、胺類和羥基或硫醇基。根據(jù)本發(fā)明，遞電荷部分可從核心鏈上懸吊有一個或多個側(cè)基。側(cè)基具有與標記或另一個遞電荷部分分子連接的功能基團。作為例子，所用功能基團的反應得到的一般功能基團是在要連接的分子間形成共價鍵。這種功能基團是二硫化物、氨基化合物、硫代酰胺、二巰基化合物、乙醚、尿素、硫脲、胍、偶氮、硫醚、羧酸酯，以及含硫和磷的酯類和酰胺類，如磺酸鹽、磷酸酯、磺酰胺、硫酯等，和類似物。
連接分子標記到結(jié)合部分上在文獻中可以發(fā)現(xiàn)大量共價連接分子標記與結(jié)合化合物如抗體的指南，如Hermanson，生物連接技術(shù)，(Academic Press，New York，1996)，等。在本發(fā)明的一個方面，一個或多個分子標記直接或間接地連接到結(jié)合化合物的普通活性基團上。普通的活性基團包括胺、硫醇、羧酸酯、羥基、乙醛、酮和類似基團，并可通過商業(yè)獲得的交聯(lián)劑連接到分子標記上，如Hermanson(如上引用)；Haugland，熒光探針和研究產(chǎn)品手冊，第9版(Molecular Probes，Eugene，OR，2002)。在一個實施例中，分子標記的anNHS-酯與結(jié)合化合物上的游離胺起反應。
在圖1C所示的優(yōu)選實施例中，結(jié)合化合物包括生物素化的抗體(140)作為結(jié)合部分。分子標記(144)通過抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素橋與結(jié)合部分(140)連接。優(yōu)選地，在操作中，結(jié)合部分(140)首先與膜相關(guān)分析物反應，其后加入抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素(146)形成混合物(148)。在混合物(148)中加入(150)生物素化的分子標記以形成結(jié)合化合物(152)。
一旦每個結(jié)合化合物分別由不同的分子標記衍化，它與其它結(jié)合化合物聯(lián)合形成多元的結(jié)合化合物。通常，每個不同種類的結(jié)合化合物在組成中以相同的比例出現(xiàn)；但是，按設計選擇可以改變比例，使得根據(jù)特定實施例或?qū)嶒灥脑竿蛐枨?，一個或一部分特定結(jié)合化合物以較高或較低的比例出現(xiàn)?？捎绊戇@種設計選擇的因素包括但不限于，抗體對特定靶標的親合力和活動性，靶標的相對普及性，分子標記探測部分的熒光特性，和類似因素。
產(chǎn)生活性物質(zhì)的裂解誘導部分裂解誘導部分，或裂解劑，是優(yōu)選地通過氧化產(chǎn)生能夠裂解可裂解鍵的活性物質(zhì)的基團。優(yōu)選地，活性物質(zhì)是具有短期活性的化學物質(zhì)，使得其裂解誘導作用僅限于其產(chǎn)生部位的附近。要么活性物質(zhì)固有短壽，使其不因超出其產(chǎn)生的附近而產(chǎn)生顯著的背景，要么使用清除劑以有效地清除活性物質(zhì)，使得超過其產(chǎn)生部位的短距離就不可能得到與可裂解鍵的反應。例證性的活性物質(zhì)包括單態(tài)氧、過氧化氫、NADH，和羥自由基、苯氧基自由基、過氧化物，和類似物質(zhì)。例證性的致氧化活性物質(zhì)的淬滅劑包括多烯類、類胡蘿卜素類、維生素E、維生素C、酪氨酸的氨基酸-吡咯N-共扼物、組氨酸和谷胱甘肽，等，如Beutner等人，Meth.Enzymol.，319226-241(2000)。
裂解誘導部分和可裂解鍵的一個重要考慮是，當與靶蛋白結(jié)合時它們不要相距太遠而使敏化劑產(chǎn)生的活性物質(zhì)擴散并在能夠與可裂解鍵反應前失掉其活性。相應地，可裂解鍵優(yōu)選地在1000nm內(nèi)，優(yōu)選地在結(jié)合裂解誘導部分的20-200nm內(nèi)。此裂解誘導部分的有效范圍在此稱作其“有效近端”。
活性物質(zhì)發(fā)生器包括酶類，如產(chǎn)生氫過氧化物的氧化酶，如葡萄糖氧化酶、氧雜蒽氧化酶、D-氨基酸氧化酶、NADH-FMN氧化還原酶、半乳糖氧化酶、甘油磷酸氧化酶、肌氨酸氧化酶、膽堿氧化酶和醇氧化酶，產(chǎn)生羥自由基的辣根過氧化物酶，產(chǎn)生NADH或NADPH的各種脫氫酶，產(chǎn)生氨以引起局部高pH的尿素酶。
敏化劑是能夠誘導產(chǎn)生活性中間體或物質(zhì)，通常是單態(tài)氧的化合物。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明使用的敏化劑是光敏劑。其它在本發(fā)明范疇的敏化劑包括在熱、光、電離輻射或化學活化激發(fā)下會釋放單態(tài)氧分子的化合物。此類化合物中最知名的成員包括內(nèi)過氧化物如1，4-二羧乙基-1，4-萘內(nèi)過氧化物，9，10-二苯蒽-9，10-內(nèi)過氧化物和5，6，11，12-四苯萘5，12-內(nèi)過氧化物。這些化合物被加熱或直接吸收光釋放了單態(tài)氧。更多的敏化劑公布在以下文獻中Di Mascio等人，F(xiàn)EES Lett.，355287(1994)(過氧化物酶和加氧酶)；Kanofsky，J.Biol.Chem.2585991-5993(1983)(乳過氧化物酶)；Pierlot等人，Meth.Enzymol.，3193-20(2000)(內(nèi)過氧化物的熱溶解)；和類似文獻。
結(jié)合劑與裂解誘導部分的附著可以是直接或間接的，共價的或非共價的，可通過熟知的文獻中普遍使用的技術(shù)來完成。見，例如，″Immobilized Enzymes，″Ichiro Chibata，Halsted Press，New York(1978)；Cuatrecasas，J.Biol.Chem.，2453059(1970)。大量的功能基團可獲得或被合并。功能性基團包括羧酸，醛，氨基基團，氰基基團，乙烯基，羥基基團，巰基等。多種化合物連接的方式是為人所熟知的，在文獻中已被充分地說明(見上)。根據(jù)被連接的化合物的特性，距離對特殊結(jié)合特性的作用等，連接基團與結(jié)合劑的長度可大幅變化。
需要有多個裂解誘導部分附著于結(jié)合劑以增加，例如所產(chǎn)生的活性核素的數(shù)量。可使用一種多官能團材料來完成上述目的，這種材料通常為聚合的，具有多個功能基團，例如羥基、氨基、巰基、羧基、烯基、醛等，作為連接的位點?？蛇x擇性的使用一種支持物。支持物可具有任何一種形狀，如顆粒包括珠、膠片、薄膜、管、孔、條、桿等。對于摻入光敏劑的支持物，支持物的表面優(yōu)選是親水的或能夠產(chǎn)生親水性的，支持物的主體是親水的。支持物在其應用的介質(zhì)中是可懸浮的。作為說明而非限制的可懸浮支持物的實例，是聚合材料如膠乳，脂質(zhì)雙分子層，油滴，細胞和水凝膠。其他的支持物組合物包括玻璃，金屬，聚合物，如硝化纖維，醋酸纖維素，聚(氯乙烯)，聚丙烯酰胺，聚丙烯酸酯，聚乙烯，聚丙烯，聚(4-甲丁烯)，聚苯乙烯，聚甲基丙烯酸酯，聚(對苯二甲酸亞乙酯)，尼龍，聚(乙烯丁酸鹽)，等；使用其本身或與其他材料結(jié)合。結(jié)合劑與支持物的附著可以是直接的或間接的，共價的或非共價的，可通過為人所熟知的，上面所討論的文獻中普遍使用的技術(shù)來完成。見，例如，″ImmobilizedEnzymes，″Ichiro Chibata，見前。支持物的表面通常是多官能團的，或能夠被多官能團化或能夠與靶結(jié)合部分結(jié)合的，或通過共價或特異的或非特異性的非共價相互作用的類似情況。
裂解誘導部分可通過共價或非共價附著于支持物的表面或摻入進支持物的主體內(nèi)而與支持物相關(guān)聯(lián)。與表面的連接可如上面所述完成。裂解誘導部分可被加入至支持物的主體內(nèi)，在制備支持物過程中或之后。通常，裂解誘導部分與支持物相關(guān)聯(lián)，其量必須達到活性元素的必需量。通常裂解誘導部分的量通過經(jīng)驗確定。
光敏劑作為裂解誘導部分如上面所提到的，根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的裂解誘導部分是可產(chǎn)生單態(tài)氧的光敏劑。如在此所使用的，“光敏劑”是指一種光吸收分子，當被光活化時，可將分子氧轉(zhuǎn)變?yōu)閱螒B(tài)氧。光敏劑可直接或間接通過共價或非共價連接被附著于特殊類型的結(jié)合劑。構(gòu)建這樣的組合物，特別是抗體作為結(jié)合劑的指導可在文獻中獲得，例如在光動力學治療，免疫診斷和類似技術(shù)的領(lǐng)域中。下面是一些實例的參考文獻Ullman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，5426-5430(1994)；Strong等人，Ann.New York Acad.Sci.，745297-320(1994)；Yarmush等人，Crit.Rev.Therapeutic Drug Carrier Syst，10197-252(1993)；Pease等人，美國專利5,709,994；Ullman等人，美國專利5,340,716；Ullman等人，美國專利6,251,581；McCapra，美國專利5,516,636和類似文獻。
同樣，就適合用于本發(fā)明中的光敏劑的特性和選擇在文獻中也有指導。下面是實例的參考文獻Wasserman和R.W.Murray.Singlet Oxygen.(Academic Press，New York，1979)；Baumstark，Singlet Oxygen，Vol.2(CRC Press Inc.，Boca Raton，F(xiàn)L 1983)；和Turro，Modern Molecular Photochemistry(University Science Books，1991)。
光敏劑是通過用光激發(fā)可產(chǎn)生單態(tài)氧的感光劑。光敏劑包括染料和芳香族化合物，通常是由共價鍵合原子組成的化合物，通常使用多個共軛的雙或三鍵?；衔锏湫偷卦诖蠹s200至大約1,100nm波長范圍內(nèi)吸收光，通常大約300至大約1,000nm，優(yōu)選大約450至大約950nm，在其最大吸光度時激發(fā)波長下，其吸光系數(shù)超過大約500M-1cm-1，優(yōu)選大約5,000M-1cm-1，更優(yōu)選的是大約50,000M-1cm-1。在無氧情況下吸收光后產(chǎn)生的激發(fā)態(tài)壽命通常為至少大約100毫微秒，優(yōu)選至少大約1毫秒。通常，根據(jù)本發(fā)明壽命必須足以能夠裂解試劑中的連接。這種試劑正常以下面所討論的濃度存在。光敏劑激發(fā)態(tài)通常與其基態(tài)具有不同的自旋量子數(shù)(S)，通常為三重態(tài)(S＝1)，基態(tài)通常為單態(tài)(S＝0)。優(yōu)選光敏劑具有很高的系統(tǒng)間過度產(chǎn)物產(chǎn)量。也就是，光敏劑的光激發(fā)通?？僧a(chǎn)生三重態(tài)，效率至少為大約10％，希望至少大約40％，優(yōu)選超過大約80％。
選擇的光敏劑是相對不感光的，優(yōu)選不與單態(tài)氧有效反應。幾種結(jié)構(gòu)特征存在于大多數(shù)可用的光敏劑中。大多數(shù)光敏劑具有至少一個，經(jīng)常有三個或更多個共軛的雙鍵或三鍵，具有剛性結(jié)構(gòu)，經(jīng)常是芳烴結(jié)構(gòu)。它們經(jīng)常至少含有可促進系統(tǒng)間過度的一個基團，如羰基或亞胺基或選自元素周期表3-6行的重原子，特別是碘或溴，或它們具有延伸的芳烴結(jié)構(gòu)。
對于光敏化的光敏劑有大量類型的光源可用來產(chǎn)生單態(tài)氧?？墒褂枚嗌蛦紊庠?，只要該光源具有足夠的強度在特殊的時間周期內(nèi)產(chǎn)生足夠的單態(tài)氧。照射的長度依賴于光敏劑的特性，可裂解連接的特性，照射光源的功率，及其與樣品的距離等等。通常，照射的周期小于大約1微秒大約10分鐘，通常在大約1毫秒的范圍內(nèi)大約60秒。照射的強度和長度應該足以能夠激發(fā)至少大約0.1％的光敏劑分子，通常至少大約30％的光敏劑分子，優(yōu)選基本上所有的光敏劑分子。實例的光源包括，為了說明而非限制，激光，如氦氖激光，氬激光，YAG激光，He/Cd激光，和紅寶石激光；光電二極管；汞，鈉和氙氣燈；白熾燈如，鎢和鎢/鹵素；閃光燈和類似物。
可用于本發(fā)明中的光敏劑實例是具有上述特性的光敏劑，列舉在下面的參考文獻中Turro，Modern Molecular Photochemistry(在上面引用)；Singh和Ullman，美國專利5,536,834；Li等人，美國專利5,763,602；Ullman等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，5426-5430(1994)；Strong等人，Ann.New York Acad.Sci.，745297-320(1994)；Martin等人，Methods Enzymol.，186635-645(1990)；Yarmush等人，Grit.Rev.Therapeutic DrugCarrier Syst，10197-252(1993)；Pease等人，美國專利5,709,994；Ullman等人，美國專利5,340,716；Ullman等人，美國專利6,251,581；McCapra，美國專利5,516,636；Wohrle，Chimia，45307-310(1991)；Thetford，European patent publ.0484027；Sessler等人，SPIE，1426318-329(1991)；Madison等人，Brain Research，52290-98(1990)；Polo等人，Inorganica Chimica Acta，1921-3(1992)；Demas等人，J.Macromol.Sci.，A251189-1214(1988)；和類似文獻。實例的光敏劑在表1a中列舉。
表1a實例的光敏劑

在某些實施例中，光敏劑部分包括一個支持物，如上所述就裂解誘導部分而言。光敏劑可與支持物結(jié)合，通過共價或非共價附著于支持物的表面或如上所述加入進支持物的主體中。通常，光敏劑與支持物結(jié)合，其量必須能形成必需量的單態(tài)氧。通常，光敏劑的量通過經(jīng)驗來確定。用作光敏劑的光敏劑優(yōu)選是相對非極性的，保證當光敏劑被加入進，例如膠乳微粒中形成光敏劑小珠時，被分散進親脂的成分中，例如Pease等人，美國專利5,709,994中所公開的。例如，光敏劑玫瑰紅通過膠乳上的氯甲基基團共價附著在0.5微米的膠乳珠上，形成一種酯連接基團，如J.Amer.Chem.Soc.，973741(1975)中所述。
在本發(fā)明的一個方面，特殊類型的試劑含有是一種抗體的第一個結(jié)合試劑，和是一種光敏劑的裂解誘導部分，這樣光敏劑與抗體共價連接，例如使用熟知的技術(shù)，如在Strong等人(上面所引用的)；Yarmush等人(上面所引用的)；或類似文獻中所述?？蛇x擇地是，特殊類型的試劑包括一種固相支持物，例如一個珠子，光敏劑共價或非共價地附著其上，抗體直接或通過功能化聚合物，如氨基葡聚糖等附著其上，優(yōu)選共價結(jié)合。
實例的細胞表面分子膜相關(guān)分析物包括可形成二聚或寡聚復合體的細胞表面分子。涉及信號轉(zhuǎn)導的細胞表面受體是特別關(guān)心的，包括但不限于，酶相關(guān)受體和G-蛋白偶聯(lián)受體。二聚體或寡聚體包括不同的細胞表面受體，即，具有不同分子結(jié)構(gòu)的細胞表面受體，例如不同的基本氨基酸序列。如在此所使用的，“受體類型”就二聚體或寡聚體而言，其含義是參與形成二聚體或寡聚體的多個不同細胞表面分子之一。例如，雜二聚體，如Her2-Her3雜二聚體，由兩個不同的受體類型(Her2和Her3)組成，同型二聚體，如Her1-Her1同型二聚體，由單一受體類型(Her1)組成。
所有酶相關(guān)受體在本發(fā)明的范圍內(nèi)被認為是一種可能的寡聚細胞表面復合體內(nèi)的亞單位。目標酶相關(guān)受體包括具有內(nèi)在酶活性的幾種類型，包括那些具有酪氨酸激酶活性，酪氨酸磷酸酶活性，鳥苷酸環(huán)化酶活性和絲氨酸/蘇氨酸活性的受體。其他的目標酶相關(guān)受體可形成具有細胞內(nèi)酪氨酸激酶的蛋白-蛋白復合體。酪氨酸激酶相關(guān)受體的實例包括但不限于，Her受體家族，胰島素受體，IGF-1受體，PDGF受體，F(xiàn)GF受體，VEGF受體，HGF和SC受體，神經(jīng)營養(yǎng)因子受體家族，和NGF受體。酪氨酸磷酸酶相關(guān)受體的實例包括，例如，CD45蛋白。鳥苷酸環(huán)化酶相關(guān)受體的實例包括，例如鈉尿肽。絲氨酸/蘇氨酸激酶相關(guān)受體的實例包括，例如，激活素受體和轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)受體。
所有的GPCR在在本發(fā)明的范圍之內(nèi)，被認為是一種可能的寡聚細胞表面復合體內(nèi)的亞單位。目的G-蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)包括那些可作為第二信使調(diào)節(jié)腺苷酸環(huán)化酶活性產(chǎn)生cAMP的受體，包括激素受體、腎上腺素能受體和著嗅劑受體，2)可活化的磷脂酶-Cγ(PLC-γ)的受體，和3)光感受器。使用本發(fā)明的方法研究的GPCR家族包括，例如，A類受體(視紫紅質(zhì)樣)，包括乙酰膽堿、血管緊張素、鴉片劑、生長激素釋放抑制激素、多巴胺和緩激肽受體，C類受體，包括代謝型谷氨酸、Ca2+-感應和GABAb受體、cAMP-偶聯(lián)受體以及許多其他的受體。已知可形成寡聚體的GPCR受體實例包括，例如毒蕈堿性m3受體、血管緊張素ATI受體、GABAb。
膜和細胞實施本發(fā)明中使用的膜可從細胞中獲得，如細胞膜、核膜、線粒體膜或其他細胞內(nèi)膜，或可人工生成，其例證是微胞和脂質(zhì)體。在所述的方法中使用的細胞可以是任何來源的，包括原核細胞、真核細胞、或古細菌，但優(yōu)選含有親脂性的膜。細胞可以是活細胞或死細胞。如果從多細胞生物體中獲得，細胞可以是任何類型細胞。因此，細胞可以是培養(yǎng)的細胞系或原代分離物，細胞可以是哺乳動物的，兩棲動物的，植物的，酵母的，細菌的，螺旋原蟲的，或原生動物的。細胞可以是例如，人、鼠、大鼠、倉鼠、雞、鶉、羊或狗的細胞。細胞可以是正常細胞，被突變的細胞，被遺傳改造的細胞，腫瘤細胞，可分泌抗體的陽性雜交瘤和類似細胞。特別注意的是從差別表達(過度表達或過低表達)致病基因的細胞類型獲得的膜。如對本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員很明顯的是，多種細胞系，如CHO，例如可從公共或私人的儲存庫中獲得。最大的存放機構(gòu)是American Type Culture Collection(http//www.atcc.org)，可提供來自大量生物體和組織樣品的已被完全定性的細胞系的各種收集標本。
來自多細胞生物體的實例細胞系包括嗜酸細胞、腺細胞、松果體細胞、脂肪細胞、成釉細胞、星形細胞、基(干)細胞、嗜堿細胞、肝細胞、神經(jīng)元、表面隆起細胞、C細胞、心肌細胞、泡心細胞、主細胞、軟骨細胞、克拉細胞、柱狀上皮細胞、體黃體細胞、蛻膜細胞、樹突、內(nèi)分泌細胞、內(nèi)皮細胞、腸內(nèi)分泌細胞、嗜酸性粒細胞、紅細胞、球外系膜細胞、胎兒成纖維細胞、胎兒紅細胞、成纖維細胞、濾泡細胞、神經(jīng)節(jié)細胞、巨Bctz細胞、杯形細胞、毛細胞、內(nèi)毛細胞、I型毛細胞、肝細胞、內(nèi)皮細胞、萊迪希細胞、脂肪細胞、肝實質(zhì)細胞、淋巴細胞、溶菌酶分泌細胞、巨噬細胞、肥大細胞、巨核細胞、黑素細胞、系膜細胞、單核細胞、肌上皮細胞、肌樣細胞、頸粘液細胞、神經(jīng)細胞、中性粒細胞、少突膠質(zhì)細胞、卵母細胞、成骨細胞、骨軟骨細胞、破骨細胞、骨細胞、支柱細胞、sulcal cells、甲狀旁腺細胞、泌酸細胞、胃蛋白酶原分泌細胞、外膜細胞、松果體細胞、垂體細胞、漿細胞、血小板、足細胞、精母細胞、浦肯野細胞、錐體細胞、紅細胞、網(wǎng)織紅細胞、許旺細胞、賽爾托利細胞、柱狀細胞、骨骼肌細胞、平滑肌細胞、生長激素釋放抑制激素細胞、腸內(nèi)分泌細胞、精細胞、精原細胞、精子、星狀細胞、Deiter支持細胞、Hansen支持細胞、表面細胞、表面上皮細胞、表面粘液細胞、汗腺細胞、T淋巴細胞、膜黃體細胞、胸腺細胞、胸腺上皮細胞、甲狀腺細胞、移行上皮細胞、I型肺泡細胞、II型肺泡細胞。
細胞膜也可從與特殊疾病或特殊疾病階段有關(guān)的細胞類型中獲得。與特殊疾病或疾病階段的關(guān)聯(lián)可通過細胞在一個或多個生物學過程中的異常行為來確定，如細胞周期調(diào)節(jié)，細胞分化，凋亡，化學趨化，細胞活動性和細胞骨架重排。疾病細胞也可通過存在與引起疾病有關(guān)的病原體而證實(例如，HIV對于AIDS和HBV對于乙型肝炎)。涉及特殊類型細胞的異常功能的疾病類型包括但不限于自體免疫性疾病、癌癥、肥胖、高血壓、糖尿病、神經(jīng)元和/或肌肉變性疾病、心臟病、內(nèi)分泌紊亂、及其任何組合。腫瘤細胞的實例類型包括腺瘤、癌、纖維腺瘤、成釉細胞瘤、星形細胞瘤、間皮瘤、膽管癌、膽管瘤、軟骨瘤、軟骨肉瘤、脊索癌、絨毛膜癌、顱咽管瘤、囊腺癌、囊腺瘤、無性細胞瘤、室鼓膜瘤、上皮癌、紅細胞白血病、纖維腺瘤、纖維瘤、纖維肉瘤、神經(jīng)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)細胞瘤、神經(jīng)節(jié)瘤、成神經(jīng)節(jié)細胞瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、粒細胞白血病、血管瘤、血管外皮細胞瘤、血管肉瘤、蟄伏脂肪瘤、組織細胞瘤、焦化棘皮瘤、平滑肌瘤、平滑肌肉瘤、脂肪瘤、脂肪肉瘤、黃體瘤、淋巴管瘤、淋巴管肉瘤、淋巴瘤、髓母細胞瘤、黑素瘤、腦膜瘤、間皮瘤、骨髓脂肪瘤、腎母細胞瘤、成神經(jīng)細胞瘤、神經(jīng)成肌細胞瘤、牙瘤、少突神經(jīng)膠質(zhì)瘤、骨軟骨瘤、骨瘤、骨肉瘤、乳頭狀瘤、副神經(jīng)節(jié)瘤、嗜鉻細胞瘤、松果體瘤、垂體細胞瘤、成視網(wǎng)膜細胞瘤、橫紋肌肉瘤、肉瘤、神經(jīng)鞘瘤、精原細胞瘤、畸胎瘤、泡膜細胞瘤和胸腺瘤。
細胞系也可用編碼細胞表面分子的基因轉(zhuǎn)染。而且，內(nèi)源表達細胞表面分子的細胞也可被轉(zhuǎn)染以研究內(nèi)源和外源分子之間的相互作用。優(yōu)選進行轉(zhuǎn)染的細胞是那些轉(zhuǎn)染良好和產(chǎn)生高水平的被表達的轉(zhuǎn)染基因產(chǎn)物的細胞。一些優(yōu)秀的細胞系含有內(nèi)源性表達的細胞表面受體，許多可用于轉(zhuǎn)染，包括，例如CHO-K1(中國倉鼠卵巢)細胞，HEK-293(人胚腎)細胞，K562(人慢性骨髓性白血病)細胞，MDA MB-231(人乳癌)細胞，MCR-7細胞，HeLa(人宮頸癌)細胞和COS-7猴腎細胞。培養(yǎng)和保養(yǎng)這些細胞系的方法在本領(lǐng)域中是為人所熟知的。
在本發(fā)明的另一個方面，膜含有脂質(zhì)體?！爸|(zhì)體”是含有一個或多個脂質(zhì)雙分子層的自主組裝結(jié)構(gòu)。脂質(zhì)體通常由磷脂雙分子層組成，盡管其他分子，如膽固醇或脂肪酸也可包含在雙分子層結(jié)構(gòu)中。脂質(zhì)體的磷脂成分包括與多種甘油磷酸鹽或硅酮衍生物構(gòu)成的頭部連接的疏水脂質(zhì)尾部。因此脂質(zhì)體正?？蓮膬尚灾愔苽洌信c一個或兩個非極性(疏水)?；湽矁r連接的極性(親水)頭基區(qū)。在疏水?；満退橘|(zhì)之間強力排斥性接觸通常被認為可誘導脂質(zhì)分子重排，這樣極性的頭基重新朝向水介質(zhì)，而?；溨匦鲁螂p分子層的內(nèi)部。形成了一種非常穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)，其中?；湵挥行У乇Ｗo與水介質(zhì)接觸。因此脂肪酸尾之間的疏水作用可在水溶液中形成脂質(zhì)體雙分子層。在更復雜的脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)中，一個或多個脂質(zhì)雙分子層可包繞含水區(qū)室，含有兩性脂質(zhì)分子的兩個反向單層。因此脂質(zhì)體是含有包裹水相的完全封閉的雙分子層膜。因此，脂質(zhì)體可以是任何類型的多層囊泡(同心的膜雙分子層，每個都被水分子層分隔)或單層囊泡(具有單層膜的雙分子層)。
根據(jù)Bangham等人(1965)J.Mol.Biol.13238-252的方法制備脂質(zhì)體，其中磷脂懸浮在有機溶劑中，然后蒸發(fā)干燥，在反應管中留下磷脂的蠟樣沉積物。然后加入合適量的水相，混合物膨脹，得到的含有多層囊泡的脂質(zhì)體通過機械的方法被分散。得到的膜雙分子層結(jié)構(gòu)是脂質(zhì)的疏水(非極性)″尾″朝向雙分子層的中心，而親水(極性)的“頭”朝向水相。這種技術(shù)提供了開發(fā)超聲降解的小單層囊泡的基礎(chǔ)，后者由Papahadjopoulos和Miller(1967)Biochim.Biophys.Acta.135624-638描述。通常，在水溶液中的磷脂混合物將自發(fā)結(jié)合形成脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)，盡管控制脂質(zhì)體大小和形狀的技術(shù)在本領(lǐng)域中是已知的。
方法下面的對方法和特異條件和原料的一般討論是為了說明而非限制。本領(lǐng)域中的一個普通專業(yè)技術(shù)人員將要理解在此所述的方法如何適應其他的應用，特別是使用不同的細胞類型和細胞表面分子。
在實施本發(fā)明的方法過程中，制備測定組件的組合，包括被測定的細胞，標記探針和被解離的探針。通常，測定組件可以任何順序被組合。但在某些應用中，加樣的順序是相關(guān)的。例如，希望監(jiān)測競爭結(jié)合，如在定量測定中。或希望監(jiān)測一種組裝復合體的穩(wěn)定性。在這些應用中，在一些階段中要安排一些反應，在完整混合物被組合之前，或裂解反應被啟動之前需要孵育。
每種試劑的量通常通過經(jīng)驗確定。在測定中使用的細胞數(shù)可通過每個細胞表面的靶復合體的預測數(shù)量和用來監(jiān)測測定信號的分離和檢測手段來確定。通常，提供的標記探針和裂解探針數(shù)量相對于樣品細胞中靶分子的期望值摩爾數(shù)是過量的，通常摩爾數(shù)過量至少1.5，更期望過量大約10倍，或更多。在特殊的應用中，根據(jù)結(jié)合試劑的親和力和在單個細胞上存在的靶分子的期望數(shù)，可使用更高或更低的濃度。當要確定化學化合物對寡聚細胞表面復合體的效應時，根據(jù)被監(jiān)測的效應在加入探針之前，同時或之后向細胞加入化合物。
測定混合物組合在一起，并在一定條件下孵育，該條件可允許探針與細胞表面分子的結(jié)合，通常是在水介質(zhì)中，通常是在生理性pH(相當于細胞培養(yǎng)時的pH)，由濃度范圍在大約10至200mM的緩沖液來維持。可使用常規(guī)的緩沖液，如果需要可使用其他常規(guī)添加劑，如鹽類，生長培養(yǎng)基，穩(wěn)定劑等等。一般應用生理性和恒定的溫度。孵育溫度一般范圍在大約4°至70℃，普遍從大約15°至45℃，更普遍地從25°至37°。
在組合測定混合物并孵育使探針與細胞表面分子結(jié)合后，處理混合物以活化裂解劑，從標記的探針中切除標記，這些探針位于裂解劑的有效接近范圍內(nèi)，從細胞表面釋放相應的標記進入溶液中。這種處理的本質(zhì)依賴于裂解劑的作用機制。例如，當光敏劑用作裂解劑時，裂解作用的活化包括在所使用的特殊敏化劑所適合的光波長下照射混合物。
在裂解后，分析樣品以測定已被釋放的標記的特性。當應用使用多種標記探針的測定時，通常在檢測前分離被釋放的探針。在為測定設計標記的過程中確定分離和檢測的方法。分離的優(yōu)選模式是采用電泳，根據(jù)其電泳遷移率的已知差異分離多種標記。
分離釋放的分子標記如上面所述，通過一種以一種或多種物理，化學和/或光學特性為基礎(chǔ)區(qū)別分子標記的分離技術(shù)來為分離作用設計分子標記(在此是指“分離特性”)。也如上所述，本發(fā)明多個實施例可使用的分離技術(shù)包括正向或逆向HPLC，離子交換HPLC，毛細管電色譜，質(zhì)譜，氣相色譜，和類似方法。優(yōu)選被選擇的分離技術(shù)能夠定量信息以及關(guān)于是否存在分子標記的定性信息(和相應的分析物)。在一個方面，可使用一種液相分離技術(shù)以便含有分子標記的溶液，例如緩沖液，反應溶劑或類似物被處理以分離個別種類的分子標記。通常，這種分離伴隨著分子標記從起始混合物沿一個路程形成的差動行程，直至形成可區(qū)別的峰或區(qū)帶，分別對應于分子標記各自濃度增加的區(qū)域。這種路程可被液流，電場，磁場或類似物所限定。特殊分離技術(shù)的選擇依賴于幾種因素包括使用該技術(shù)的費用和方便性，規(guī)定分子標記的化學特性時該技術(shù)的分辨率，被分離的分子標記的數(shù)量，應用檢測模式的類型和類似因素。優(yōu)選，分子標記被電泳分離形成電泳圖譜，其中被分離的分子標記以獨特的峰來表示。
A.電泳分離電泳的方法為人所熟知，大量的指導可使本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠做出多種設計選擇以形成和分離特殊的多個分子標記。下列是電泳的一些實例參考文獻Krylov等人，Anal.Chem.，72111R-128R(2000)；P.D.Grossman和J.C.Colburn，毛細管電泳理論和實踐，Academic Press，Inc.，NY(1992)；美國專利5,374,527；5,624,800；5,552,028；ABI PRISM 377 DNA測序儀用戶指南，Rev.A，1995年1月，第2章(Applied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)；和類似文獻。在一個方面，分子標記通過毛細管電泳分離。在普通專業(yè)技術(shù)人員的范圍內(nèi)的設計選擇包括但不限于從幾種市售型號中選擇儀器，選擇操作條件包括分離介質(zhì)類型和濃度，pH，所需的分離時間，溫度，電壓，毛細管類型和尺寸，檢測模式，要分離的分子標記的數(shù)量，和類似條件。
在本發(fā)明的一個方面，在電泳分離的過程中或之后，通過記錄被分離化合物的熒光信號和遷移時間(或遷移距離)，或通過構(gòu)建分子標記的相對熒光和遷移順序圖(例如，電泳圖譜)來檢測或鑒別分子標記。為了實施這些檢測，分子標記通過標準的方法被照射，例如，高密度水銀蒸氣燈，激光或類似物。分子標記可典型地被He-Ne氣體激光器或固態(tài)二極管激光器產(chǎn)生的激光照射。然后通過光敏感探測器，例如光電倍增管，電荷偶聯(lián)裝置，或類似裝置來檢測熒光信號。實例的電泳檢測系統(tǒng)將在其他地方描述，例如，美國專利Nos.5,543,026；5,274,240；4,879,012；5,091,652；6,142,162；或類似專利。在另一個方面，分子標記可通過電泳檢測，例如，如美國專利No.6,045,676所述。
電泳分離涉及分子根據(jù)遷移性的差異在電場中的遷移和分離。多種形式的電泳分離包括，例如但不限于，自由區(qū)帶電泳，凝膠電泳，等電點聚焦，等速電泳，毛細管電色譜，和膠束電動色譜。毛細管電泳涉及電分離，優(yōu)選通過電動流，包括電泳，雙電泳和/或電滲流，在試管或通道中傳導，其橫斷面尺寸為大約1至大約200微米，通常為大約10至100微米。毛細管可以是由硅，石英，玻璃或塑料組成的晶片或薄膜中的一個獨立的長毛細管或通道。
在毛細管電分離中，一等分含有分子標記的反應混合物通過將該等分樣品導入進一個電分離通道中進行電分離，該通道是其中進行擴增反應和其他反應的毛細管裝置的一部分或與其連接。然后將電位施加于包含在通道中的電導介質(zhì)中以完成組合物中各組分的遷移。通常，根據(jù)本領(lǐng)域已知的實踐經(jīng)驗，施加的電位足以完成所需組分的電分離。本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員將能夠?qū)τ糜诒景l(fā)明指定的一組試劑確定合適的電位和/或被切除標記的性質(zhì)，反應介質(zhì)的性質(zhì)，等等。電分離的參數(shù)包括介質(zhì)的參數(shù)，通常優(yōu)化電位對所需組分完成最大的分離。這可用經(jīng)驗來獲得，并包含在專業(yè)技術(shù)人員的范圍內(nèi)。
檢測可通過任何一種與毛細管電泳柱分析相關(guān)的已知方法來進行，包括美國專利Nos.5,560,811(11列，19-30行)，4,675,300，4,274,240和5,324,401中所示的方法，其相關(guān)公開書在此在此引入以供參考。在電泳領(lǐng)域中的那些專業(yè)技術(shù)人員將認識到可使用很寬范圍的電位或場強，例如可使用10至1000V/cm的場，更典型的具有大約200至大約600V/cm。市售系統(tǒng)的電壓上限為大約30kV，毛細管長度為大約40至大約60cm，得到的最大場為大約600V/cm。對于DNA，一般包被毛細管以減少電滲流，毛細管的注射端維持在負電位。
為了方便檢測，全部裝置采用可透光的塑料材料裝配，一般可允許透過的光波長范圍為大約180至大約1500nm，普遍為大約220至大約800nm，更普遍為大約450至大約700nm，以獲得較低的傳輸損失。合適的材料包括熔凝石英，塑料，石英，玻璃等等。
在本發(fā)明的一個方面，通過電泳在一個微流體裝置中分離分子標記，如圖16A-16C圖解所示。微流體裝置的描述可見許多國內(nèi)和國外專利許可證和已公布的專利申請。例如，見美國專利nos.5,750,015；5,900,130；6,007,690；和WO 98/45693；WO99/19717和WO 99/15876。為了方便，通常不超過5μl的一等分樣品被轉(zhuǎn)移至微流體裝置的樣品容器中，直接通過電泳或風動噴射至集成系統(tǒng)中或通過注射器，毛細管或類似物。進行分離的條件是常規(guī)的，并根據(jù)產(chǎn)物的特性而變化。
通過圖解，圖8A-8C顯示了上面應用詳細說明的該類型微流體裝置中的微通道網(wǎng)絡100，可進行樣品負載和電泳分離上述測定中產(chǎn)生的探針和標記樣品。簡言之，該網(wǎng)絡包括一個主要的分離通道102，末端分別連接容器的上游和下游104，106。主通道在軸向偏移位置與末端終止于容器110的側(cè)通道108和末端終止于容器114的側(cè)通道112相交叉。兩個側(cè)向通道之間的偏移形成了在主通道中的一個樣品負載區(qū)帶116。
在操作中，測定混合物置于樣品容器110中，見圖8A的圖解。正如所提到的，測定混合物含有一個或多個靶細胞，表面結(jié)合了裂解劑，一種或多種蛋白探針，和選擇性的分子標記標準品。測定反應，涉及最初的探針與靶細胞的結(jié)合，然后在結(jié)合探針的細胞中裂解探針連接子，可在樣品容器110中進行，或可選擇性的，測定反應在另一個反應容器中進行，被反應的樣品組分被加入至樣品容器中。
為了將被釋放的分子標記填入樣品負載區(qū)帶，對容器110，114施加電場，其方向在圖8B中標明，其中所述的負電荷的被釋放分子標記被從容器110中吸入進負載區(qū)帶116中，而不帶電荷或正電荷的樣品組分仍然保留在樣品容器中。負載區(qū)帶中被釋放的標記現(xiàn)在可通過常規(guī)的電泳進行分離，通過對容器104，106施加電場，其方向在圖8C中標明。
從得到的電泳圖樣中，可鑒別分子標記和相應的被分析物。其過程一般通過在分離通道的下游末端附近放置一個熒光探測器，構(gòu)建被分離分子標記的電泳圖譜，首先如上確定分離特性(在這種情況下，為電泳遷移率)，第二是測量信號強度，例如峰高和峰區(qū)域，作為與每種探針相關(guān)的標記相對量的測量指標。可探測探針的檢測和定量的方法是為人所熟知的。在一個優(yōu)選的方法中，分子標記是熒光標記的。標準的熒光發(fā)射源對準分離介質(zhì)下游部分的一個檢測區(qū)帶，該區(qū)帶的熒光發(fā)射被一個標準的光檢波器測量。被記錄的信號高度或區(qū)域?qū)悠分械漠a(chǎn)物和底物濃度提供了一種測量指標。
具有上述的檢測信息，現(xiàn)在可能將每個被檢測的分子標記分配給探針集合中的一個特殊探針，并比較每個可檢測探針的相對水平，作為其相對的底物轉(zhuǎn)變或配體結(jié)合的測量指標。
B.色譜分離在本發(fā)明的一個方面，通過根據(jù)一種或多種物理特性的色譜為分離設計多個分子標記，上述特性包括但不限于分子量，形狀，溶解度，pKa，疏水性，電荷，極性或類似特性。可根據(jù)柱型，固相，流動相或類似參數(shù)選擇色譜分離技術(shù)，然后選擇多個分子標記，在單次操作中可被分離形成不同的峰或區(qū)帶。幾個因素確定了被選擇用于本發(fā)明的HPLC技術(shù)，包括被探測的分子標記數(shù)量(即，數(shù)量的大小)，將要在測定中產(chǎn)生的每個分子標記的估計量，用于多元測定候選物的一組合成分子標記的可利用率和易用性，應用的檢測模態(tài)，和HPLC裝備儀器，柱和溶劑的可利用率，強度，成本和易用性。通常偏向于適合分析有限量樣品和提供最高分辨率分離的柱和技術(shù)。進行這些選擇的指導可見一些文獻，例如Snyder等人，Practical HPLC Method Development，(John Wiley & Sons，New York，1988)；Millner，″High Resolution ChromatographyA Practical Approach″，Oxford University Press，New York(1999)，Chi-San Wu，″Column Handbook for Size ExclusionChromatography″，Academic Press，San Diego(1999)，和Oliver，″HPLC ofMacromoleculesA Practical Approach，Oxford University Press″，Oxford，England(1989)。特別的是，現(xiàn)有一些在指定條件下為系統(tǒng)開發(fā)和優(yōu)化色譜分離的步驟，如柱型，固相和類似條件，例如Haber等人，J.Chromatogr.Sci.，38386-392(2000)；Outinen等人，Eur.J.Pharm.Sci.，6197-205(1998)；Lewis等人，J.Chromatogr.，592183-195和197-208(1992)；和類似文獻。
在一個方面，分子標記候選物的初始選擇取決于通常通過被選擇的柱和固定相分離的分子的物理化學特性。然后初始選擇可根據(jù)經(jīng)驗來改進，通過使用上述文獻中所述的常規(guī)優(yōu)化方法，對于一個特殊實施例的分離目標可以更合適的候選分子標記來替換。在一個方面，本發(fā)明的分離目標包括(i)在少于60分鐘的分離時間內(nèi)將多個分子標記分離為可區(qū)分的峰或區(qū)帶，更優(yōu)選的是在少于40分鐘內(nèi)，仍然更優(yōu)選在10至40分鐘的范圍內(nèi)，(ii)形成峰或區(qū)帶，這樣任何電偶的分辨率為至少1.0，更優(yōu)選至少1.25，仍更優(yōu)選的為至少1.50，(iii)在分離過程中的柱壓低于150巴，(iv)分離溫度在25℃至90℃的范圍內(nèi)，優(yōu)選在35℃至80℃的范圍內(nèi)，和(v)可區(qū)分的峰多數(shù)在5至30的范圍內(nèi)，所有的峰均在同一個色譜圖中。如在此所使用的，“分辨率”就兩個峰或區(qū)帶而言是指兩個峰或區(qū)帶中心之間的距離除以平均堿基峰寬，例如Snyder等人(上面已引用)。
使用色譜法根據(jù)其色譜特性來分離分子標記。一種色譜特性是，例如在規(guī)定條件下分子標記在特殊色譜介質(zhì)上的保留時間，或在一個特殊的條件下，在此條件下分子標記可從特殊的色譜介質(zhì)上洗脫。分子標記的一種色譜特性也可以是分子標記的洗脫順序，或洗脫方式，所述的分子標記包含在采用特殊色譜介質(zhì)在規(guī)定條件下用色譜分離的一組或一系列分子標記內(nèi)。分子標記的一種色譜特性由分子標記的物理特性和其與色譜介質(zhì)和流動相的相互作用決定。色譜的規(guī)定條件包括特殊的流動相溶液，柱的幾何學，包括柱直徑和長度，pH，流速，柱的工作壓力和溫度，和其他參數(shù)，這些參數(shù)可發(fā)生變化獲得所需的分子標記的分離。分子標記或分子標記的色譜特性可采用多種色譜方法來檢測。
在單個實驗中檢測的一組分子標記通常是一組化學性質(zhì)相關(guān)的分子，在質(zhì)量，電荷，質(zhì)量-電荷比例，可檢測標記如不同的熒光基團或同位素標記，或其他獨特特征等方面有差異。因此，當為在一個樣品中分離分子標記選擇合適的色譜介質(zhì)時，一組分子標記中分子標記的化學特性和分子標記間的特殊差異都要被考慮。
通過液相色譜分離分子標記是以分子標記的物理特性為基礎(chǔ)，如分子標記的電荷，大小和疏水性，或功能特性如分子標記與如染料，凝集素，藥物，肽類和其他配體在親合基質(zhì)上結(jié)合的能力。多種色譜介質(zhì)適合進行分子標記的分離，根據(jù)分子標記的電荷，大小，疏水性和其他色譜特性。特殊的色譜介質(zhì)的選擇依賴于所應用的分子標記的特性。
分離的分子標記可采用多種分析方法檢測，包括檢測分子標記的內(nèi)在性質(zhì)，如吸光度，熒光或電化學特性，以及檢測與分子標記附著的檢測基團或部分。盡管不需要，在色譜分離后，多種檢測基團或部分可被附著在分子標記上以便于檢測。
使用液相色譜的檢測方法是為人所熟知的，可從商業(yè)渠道獲得，適合進行自動和高通量采樣。選擇分析分子標記的檢測方法要根據(jù)分子標記是否含有一個檢測基團或部分，如使用檢測基團或部分，則根據(jù)使用的可檢測基團的類型，分子標記和可檢測基團的物理化學性質(zhì)?；跓晒?，電解質(zhì)導電性，折射率和蒸發(fā)光散射的檢測方法可用來檢測多種類型的分子標記。
多種光學檢測儀可用來檢測液相色譜分離的分子標記。采用紫外(UV)/可見光光譜檢測儀檢測核酸，多肽，肽類和其他大分子和小分子的方法是為人所熟知的，使UV/可見光檢測成為HPLC分析最廣泛應用的檢測方法。當使用透明極性液體的流動相時，也可使用紅外分光光度計來檢測大分子和小分子。
可變波長和二極管矩陣檢測儀代表了市售的兩種類型UV/可見光分光光度計。一些可變波長UV檢測儀的一種很有用的特性是能夠進行光譜掃描和在多個波長下準確的吸光度讀數(shù)，同時其峰穿過流動池。二極管矩陣技術(shù)的其他優(yōu)勢是在兩個或多個波長下可測量吸光度，可計算這些吸光度測量值的比例。在多個波長下的這種吸光度定量分配在確定是否一個峰代表一個或多個分子標記時是特別有用的。
熒光檢測劑也可用來檢測熒光分子標記，如那些含有熒光檢測基團和本身有熒光的標記。熒光強度一般相對是很高的，當分子標記含有熒光基團時，較其他光譜檢測方法有較大的優(yōu)勢。盡管分子標記本身具有可檢測到的熒光，但當分子標記含有一個合適的熒光檢測基團時，就可能在樣品中檢測單個分子標記。
電化學檢測方法也可用于檢測由HPLC分離的分子標記。電化學檢測基于在合適的電極上分子標記氧化或還原反應產(chǎn)生的電流。因為電流的水平直接與分子標記濃度成比例，因此如果需要，可對電化學檢測進行定量。
汽化光散射檢測是基于當穿過多色光束的通路時微粒產(chǎn)生光子散射的能力。來自HPLC的液體流出物首先被霧化，得到的含有分子標記的氣霧直接通過一條光束。產(chǎn)生的信號與樣品中存在的分子標記的量成比例，不依賴于可檢測基團如發(fā)色基團，熒光基團或電活化基團的存在與否。因此，對于汽化光散射檢測不需要分子標記上存在檢測基團或部分。
質(zhì)譜法也可用來檢測由HPLC分離的分子標記。質(zhì)譜儀可分辨具有很小質(zhì)量差異的離子，可以很高程度的準確性和敏感性來測量離子的質(zhì)量。質(zhì)譜法在本領(lǐng)域中是為人所熟知的(見Burlingame等人，Anal.Chem.70647R-716R(1998)；Kinter和Sherman，Protein Sequencing and Identification Using Tandem Mass SpectrometryWiley-Interscience，New York(2000))。
采用任何檢測方法獲得的數(shù)據(jù)分析，如光譜重疊合法和定量分析可以是人工或計算機輔助的，可采用自動的方法來執(zhí)行。多種計算機程序可用來測定峰積分，峰面積，高度和保留時間。這種計算機程序可很方便地用來定量或定性地確定分子標記的存在。與HPLC一起使用的計算機程序和相應檢測儀在本領(lǐng)域中為專業(yè)技術(shù)人員所熟知，通?？捎墒惺鄣腍PLC和檢測儀系統(tǒng)提供。
多種市售的系統(tǒng)非常適合進行分子標記的高通量分析。本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員可確定合適的裝置，如自動樣品制備系統(tǒng)和自動注入系統(tǒng)，可用于分子標記的自動HPLC分析。自動的方法可用于分子標記的高通量分析，例如，當大量樣品被處理時或本發(fā)明的方法用于靶分析物的多元應用中時。適合與本發(fā)明一起使用的實例HPLC測試設備系統(tǒng)是Agilent 1100系列HPLC系統(tǒng)(Agilent Technologies，Palo Alto，CA)。
本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員應了解為可靠的分析分子標記所需使用的質(zhì)量控制測量指標，特別是當以高通量模式進行分析時。這種質(zhì)量控制測量指標包括使用外和內(nèi)參照標準品，分析色譜峰形，評價儀器性能，驗證試驗方法，例如確定線性范圍，回收樣品，樣品的溶液穩(wěn)定性和測量的準確性。
C.質(zhì)譜法分離質(zhì)譜法在本領(lǐng)域中是為人所熟知的(見Burlingame等人，Anal.Chem.70647R-716R(1998)；Kinter和Sherman，Protein Sequencing and Identification UsingTandem Mass Spectrometry Wiley-Interscience，New York(2000))。與質(zhì)譜法相關(guān)的基本過程是從樣品中產(chǎn)生氣相離子，并測量其質(zhì)量。
氣相離子的移動可采用質(zhì)譜儀產(chǎn)生的電磁場來精確控制。離子在這些電磁場中的移動與離子的m/z成比例，這就形成了測量m/z的基礎(chǔ)，因此可測量樣品的質(zhì)量。離子在電磁場中的移動可使離子被限制和聚焦，可解釋質(zhì)譜法的高敏感性。在測定m/z的過程中，離子被高效率地傳輸至可記錄這些離子到達的微粒檢測儀上。在每個m/z上的離子數(shù)量由圖上的峰表示，其中x軸是m/z，y軸是相對豐度。不同的質(zhì)譜儀有不同的分辨率水平，也就是分辨質(zhì)量非常接近的離子之間的峰的能力。分辨率規(guī)定為R＝m/deltam，其中m是離子質(zhì)量，delta m是在質(zhì)譜上兩個峰之間的差異。例如，具有1000分辨率的質(zhì)譜儀可分辨具有100.0m/z的離子和具有100.1m/z的離子。
現(xiàn)在有幾種類型的質(zhì)譜儀，或可使用多種配置。通常，一個質(zhì)譜儀具有以下主要部件樣品入口，離子源，質(zhì)量分析儀，檢測器，真空系統(tǒng)，和儀器控制系統(tǒng)，和數(shù)據(jù)系統(tǒng)。樣品入口，離子源和質(zhì)量分析儀之間的差異通?？梢?guī)定儀器的類型及其性能。例如，入口可以是毛細血管柱液體色譜源或可以是一個直探頭或平臺，如可用于基質(zhì)輔助激光解吸作用中。普遍的離子源是，例如電噴射，包括納滴噴射和微滴噴射或基質(zhì)輔助的激光解吸作用。質(zhì)量分析儀的實例包括四極濾質(zhì)器，離子阱質(zhì)量分析儀和時間-飛行質(zhì)量分析儀。
離子形成過程是質(zhì)譜分析的起始點?，F(xiàn)在有幾種電離法，電離法的選擇依賴于要被分析的樣品。例如，為了分析多肽，需要一種相對緩和的電離步驟如電噴射電離(ESI)。對于ESI，含有樣品的溶液在很高的電位下通過一個細針，建立一個強電場，產(chǎn)生高度帶電荷液滴的細小飛沫，這些飛沫被導入進質(zhì)譜儀中。其他的電離步驟包括，例如快速原子轟擊(FAB)，使用中性原子的高能量束沖擊固體樣品產(chǎn)生解吸作用和電離作用?；|(zhì)輔助激光解吸電離(MALDI)是一種使用激光脈沖來沖擊樣品的方法，該樣品已經(jīng)在吸收UV的化合物基質(zhì)上被結(jié)晶。其他在本領(lǐng)域中已知的電離步驟包括，例如，等離子體和輝光放電，等離子體解析電離，共振電離，和次級電離。標記報告子可在從被標記探針上切除之前，之中或之后被電離。
電噴射電離(ESI)具有幾種特性，可用于在此所述的發(fā)明中。例如，ESI可用于生物分子如很難電離或汽化的多肽。另外，ESI的效率非常高，可為高度敏感的測定提供一定的基礎(chǔ)。而且，ESI從溶液中產(chǎn)生了帶電荷的分子，可很方便地分析溶液中的標記報告子。相反，電離步驟如MALDI需要在電離之前對樣品結(jié)晶。
由于ESI可直接從溶液中產(chǎn)生帶電荷的分子，因此可與來自液相色譜系統(tǒng)的樣品相容。例如，質(zhì)譜儀為液相色譜系統(tǒng)，如HPLC提供了一個入口，這樣餾分從色譜柱流進質(zhì)譜儀中。液相色譜和質(zhì)譜儀的這種在線排列有時也稱為LC-MS。LC-MS系統(tǒng)可用于，例如，在質(zhì)譜儀分析前從被切斷的標記報告子中分離未切斷或部分切斷的標記報告子。另外，色譜可用來在質(zhì)譜儀分析之前從標記報告子樣品中去掉鹽類或其他緩沖液成分。例如，使用逆向HPLC柱，在線或離線對樣品脫鹽可用來增加電離過程的效率，因此可提高質(zhì)譜儀的檢測敏感度。
現(xiàn)在有多種質(zhì)量分析儀，可與不同的離子源相配對。如本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員所知，不同的質(zhì)量分析儀具有不同的優(yōu)勢，如在此所述。質(zhì)譜儀和選擇進行檢測的方法依賴于特殊的測定，例如，當為了檢測要產(chǎn)生小量離子可使用更敏感的質(zhì)量分析儀。幾種類型的質(zhì)量分析儀和質(zhì)譜儀如下所述。
四極質(zhì)譜儀使用四極濾質(zhì)器或分析儀。這種類型的質(zhì)量分析儀由4個棒組成，以兩組電連接的兩個棒進行排列。rf和dc電壓組合施加于每對棒上，可產(chǎn)生場，因為從濾質(zhì)器的開頭移動至末端，因此可產(chǎn)生離子擺動。這些場的結(jié)果是在一對棒中產(chǎn)生高通濾質(zhì)器，在另一對棒中產(chǎn)生低通濾質(zhì)器。高通和低通濾波器之間的交叉形成了一個指定的m/z，可通過兩個濾波器，并橫穿四極的全長。這種m/z被選擇并在四極濾質(zhì)器中保持穩(wěn)定，而所有其他的m/z具有不穩(wěn)定的軌跡，不能保留在濾質(zhì)器中。通過傾斜所施加的場形成質(zhì)譜，這樣增加的m/z被選擇以通過濾質(zhì)器并到達檢測儀。
另外，也可安裝四極，通過施加一個僅有rf的場以限制和發(fā)射所有m/z的離子。這可使四極在質(zhì)譜儀的區(qū)域內(nèi)作為一個透鏡或聚焦系統(tǒng)發(fā)揮作用，在此需要離子透射不需要濾質(zhì)器。如下面進一步所述這可用于串聯(lián)質(zhì)譜儀中。
四極質(zhì)量分析儀，以及在此所述的其他質(zhì)量分析儀可被程序化，以分析指定的m/z或質(zhì)量范圍。質(zhì)譜儀的這種特性可用于在此所述的發(fā)明。因為被切斷的標記報告自的質(zhì)量范圍在測定之前就已經(jīng)知道，因此質(zhì)譜儀可被程序化以發(fā)射被計劃的正確質(zhì)量范圍的離子，而排除了更高或更低質(zhì)量范圍的離子。選擇質(zhì)量范圍的能力可減低測定中的背景噪聲，因此可增加信號/噪聲比。另外，指定的質(zhì)量范圍可被用來排除分析任何未切斷或部分切斷的被標記探針，它們較完全被切斷的被標記探針(標記報告子)具有更大的質(zhì)量。因此，質(zhì)譜儀可完成固有的分離步驟以及對標記報告子的檢測和鑒定。
離子阱質(zhì)譜儀使用了一種離子阱質(zhì)量分析儀。在這些質(zhì)量分析儀中，施加場以便一開始就俘獲所有m/z的離子，并在質(zhì)量分析儀中振蕩。離子從離子源中通過一個聚焦裝置如一種八極透鏡系統(tǒng)進入離子阱中。在通過一個電極激發(fā)和噴射至檢測儀之前離子的陷獲發(fā)生在陷阱區(qū)。通過連續(xù)施加電壓，增加振蕩的幅度，這樣可將m/z增加的離子從陷阱中彈出，并進入檢測儀中，從而完成質(zhì)量分析。與四極質(zhì)譜儀相比，所有離子保留在質(zhì)量分析儀的場中，除了那些被選擇m/z的離子。離子阱的一個優(yōu)勢是具有非常高的敏感性，只要仔細限制在一個時間被陷獲的離子數(shù)量。離子數(shù)量的控制可通過改變離子被注入陷阱中的持續(xù)時間來完成。離子阱的質(zhì)量分辨率與四極濾質(zhì)器相似，盡管離子阱具有很低的m/z限制。
時間飛行質(zhì)譜儀使用了一種時間飛行質(zhì)量分析儀。對于這種m/z分析的方法，離子通過在一個電場(通過高電壓產(chǎn)生)中加速首先被給予了固定量的動能。在加速后，離子進入無場或“漂移”區(qū)，在此以一定的速度移動，其速度與其m/z成反比。因此，具有很低m/z的離子較具有很高m/z的離子移動更為迅速。測定在無場區(qū)的長度內(nèi)離子移動需要的時間，并用來計算離子m/z。
在這種類型的質(zhì)量分析中要注意的一點是一組被研究的離子要在同一時間內(nèi)被導入進分析儀中。例如，這種類型的質(zhì)量分析很適合電離技術(shù)象MALDI，可以很短的精確脈沖產(chǎn)生離子。另一個要注意的是要控制動能量有變化的離子產(chǎn)生的速度分布。應用更長的飛行管，離子反射鏡或更高的加速電壓有助于盡量減小速度分布的效應。時間飛行質(zhì)量分析儀較四極或離子阱質(zhì)量分析儀具有更高水平的敏感性和更寬的m/z范圍。使用這種類型的質(zhì)量分析儀也可快速獲取數(shù)據(jù)，因為不需要質(zhì)量分析儀掃描。
合成測定試劑在本發(fā)明方法中使用的試劑采用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的常規(guī)化學技術(shù)合成。下面的文獻可為合成本發(fā)明的試劑提供指導國際專利申請WO 00/66607；WO 01/83502；WO 02/95356；WO 03/06947；和美國專利6,322,980和6,514,700。更特殊的是，圖5A總結(jié)了將一個標記與具有游離氨基基團的抗體或其他結(jié)合試劑共軛結(jié)合的方法學，得到的共軛物與單態(tài)氧反應產(chǎn)生亞磺酸部分成為被釋放的標記。圖5B概述了合成FAM衍生標記試劑的化學方法。圖6A-J顯示了幾種標記試劑，大多數(shù)使用5-或6-羧基熒光素(FAM)作為起始材料。這些標記分子的制備方法如下1.通過Pro13制備Pro2，Pro4，和Pro6采用5步法來制備羧基熒光素衍生的標記部分，也就是Pro2，Pro4，Pro6，Pro7，Pro8，Pro9，Pro10，Pro11，Pro12，和Pro13。第一步涉及5-或6-FAM與N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和1，3-二環(huán)己基碳化二亞胺(DCC)在DMF(二甲基甲酰胺)中反應產(chǎn)生相應的酯類，然后用多種二胺處理產(chǎn)生所需的酰胺，化合物1。將化合物1用N-琥珀酰亞胺酰碘乙酸鹽(succinimidyl iodoacetate)處理可提供所需要的碘乙酰胺衍生物，它不能被分離，但可進一步在三乙胺的存在下與3-巰基丙酸反應。最后，如上所述，得到的β-硫代酸(化合物2)被轉(zhuǎn)變?yōu)槠銷HS酯。各種標記部分從5-或6-FAM和一種二胺開始合成。對于每個被合成的標記部分，F(xiàn)AM的區(qū)域異構(gòu)體和二胺內(nèi)“X”的化學個體在下面的表中被標明。很明顯，二胺，X，具有范圍很大的其他形式，如上面在遷移性調(diào)節(jié)物部分的討論中所述。
標記部分FAMXPro25-FAMC(CH3)2Pro45-FAM無碳原子Pro65-FAM(CH2)8Pro75-FAMCH2OCH2CH2OCH2Pro85-FAMCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2Pro95-FAM1，4-苯基Pro10 6-FAMC(CH3)2Pro11 6-FAM無碳原子Pro12 6-FAMCH2OCH2CH2OCH2Pro13 6-FAMCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2化合物1的合成向在無水DMF(5mL)中攪拌的5-或6-羧基熒光素(0.5mmol)溶液中加入N-羥基琥珀酰亞胺(1.1當量)和1，3-二環(huán)己基碳化二亞胺(1.1當量)。大約10分鐘后，一種白色固體(二環(huán)己基尿素)開始形成。反應混合物在室溫下在氮氣中攪拌過夜。TLC(薄層色譜；9∶1 CH2Cl2-MeOH)顯示起始原料完全消失。
上述混合物的上清液逐滴加入至攪拌的DMF(10mL)中的二胺(2-5當量)溶液。從TLC(40∶9∶1 CH2Cl2-MeOH-H2O)中很明顯，反應瞬間完成。在低壓的條件下去除溶劑。在Iatrobeads硅石上對形成的殘留物進行閃爍色譜得到所需的胺(化合物1)，收率為58-89％。1HNMR(300MHz，DMSO-d6)的化合物1與指定的結(jié)構(gòu)一致。
化合物2的合成向胺(化合物1)(0.3mmol)中連續(xù)加入無水DMF(10mL)和N-琥珀酰亞胺酰碘乙酸鹽(1.1當量)。得到的混合物在室溫下被攪拌直至獲得清亮的溶液。TLC(40∶9∶1 CH2Cl2-MeOH-H2O)顯示反應完成。
然后上述的反應溶液用三乙胺(1.2當量)和3-巰基丙酸(3.2當量)處理?；旌衔镌谑覝叵聰嚢柽^夜。在低壓的條件下去除溶劑，然后通過閃爍色譜得到β-硫代酸(化合物2)，收率為62-91％。以其1NMR(300 MHZ，DMSO-d6)為基礎(chǔ)指定化合物2的結(jié)構(gòu)。
通過Pro13合成Pro2，Pro4和Pro6向被攪拌的無水DMF(2mL)中的β-硫代酸(化合物2)(0.05 mmol)溶液中加入N-羥基琥珀酰亞胺(1.5當量)和1，3-二環(huán)己基碳化二亞胺(1.5當量)?；旌衔镌谑覝叵略诘獨庵袛嚢?4-48h(直至所有的起始原料發(fā)生反應)。反應混合物在低壓條件下被濃縮，然后通過閃爍色譜純化得到靶分子，收率為41-92％。
2.制備Pro1
向被攪拌的無水DMF(2mL)中的5-碘乙酰胺熒光素(化合物4)(24mg，0.047mmol)溶液中加入三乙胺(8μL，0.057mmol)和3-巰基丙酸(5μL，0.057mmol)。得到的溶液在室溫下攪拌1.5h。TLC(40∶9∶1 CH2Cl2-MeOH-H2O)顯示反應完成。隨后，加入N-羥基琥珀酰亞胺(9mg，0.078mmol)和1，3-二環(huán)己基碳化二亞胺(18mg，0.087mmol)。反應混合物在室溫下在氮氣中攪拌19h，在此時間，TLC顯示起始原料完全消失。在低壓條件下去除溶劑，隨后采用25∶1和15∶1的CH2Cl2-MeOH作為洗脫劑進行閃爍色譜得到Pro1(23mg，83％)。
3.制備Pro3向被攪拌的無水DMF(2mL)中的6-碘乙酰胺熒光素(化合物5)(26mg，0.050mmol)中加入三乙胺(8μL，0.057mmol)和3-巰基丙酸(5μL，0.057mmol)。得到的溶液在室溫下攪拌1.5h。TLC(40∶9∶1 CH2Cl2-MeOH-H2O)顯示反應完成。隨后，加入N-羥基琥珀酰亞胺(11mg，0.096mmol)和1，3-二環(huán)己基碳化二亞胺(18mg，0.087mmol)。反應混合物在室溫下在氮氣中攪拌19h，在此時間，TLC顯示起始原料完全消失。在低壓條件下去除溶劑，隨后采用30∶1和20∶1的CH2Cl2-MeOH作為洗脫劑進行閃爍色譜得到Pro3(18mg，61％)。
4.合成Pro5向被攪拌的無水DMF(5mL)中的5-(溴苯基)熒光素(化合物6)(40mg，0.095mmol)中加入三乙胺(15μL，0.108mmol)和3-巰基丙酸(10μL，0.115mmol)。得到的溶液在室溫下攪拌2天。TLC(40∶9∶1 CH2Cl2-MeOH-H2O)顯示反應完成。反應溶液在低壓條件下被脫水。最后，采用30∶1和25∶1的CH2Cl2-MeOH作為洗脫劑進行閃爍色譜得到β-硫代酸(化合物7)(28mg，66％)。
向無水DMF(2mL)的酸(化合物7)(27mg，0.060mmol)溶液中加入N-羥基琥珀酰亞胺(11mg，0.096mmol)和1，3-二環(huán)己基碳化二亞胺(20mg，0.097mmol)。反應混合物在室溫下在氮氣中攪拌2天，在此時間TLC(9∶1 CH2Cl2-MeOH)顯示起始原料完全消失。在低壓條件下去除溶劑，隨后采用30∶1的CH2Cl2-MeOH進行閃爍色譜得到Pro5(24mg，73％)。
5.合成Pro14向5-氨基乙酰氨基熒光素(化合物8)(49mg，0.121mmol)中順序加入無水DMF(4mL)和N-琥珀酰亞胺酰碘乙酸鹽(52mg，0.184)。得到清亮的溶液，TLC(40∶9∶1CH2Cl2-MeOH-H2O)顯示起始原料完全消失。
然后上述的反應溶液用三乙胺(30μL，0.215mmol)和3-巰基丙酸(30μL，0.344mmol)處理。得到的混合物攪拌2h。在低壓條件下去除溶劑，然后使用20∶1和15∶1的CH2Cl2-MeOH作為洗脫劑進行閃爍色譜得到β-硫代酸(化合物9)(41mg，62％)。在1NMR(300MHz，DMSO-d6)的基礎(chǔ)上指定結(jié)構(gòu)。
向被攪拌的無水DMF(2mL)中的化合物9(22mg，0.04mmol)溶液中加入N-羥基琥珀酰亞胺(9mg，0.078mmol)和1，3-二環(huán)己基碳化二亞胺(16mg，0.078mmol)。得到的溶液在室溫下在氮氣中攪拌大約24h。反應混合物在低壓條件下濃縮，殘留物通過閃爍色譜純化，采用30∶1和20∶1的CH2Cl2-MeOH作為洗脫劑，得到Pro14(18mg，70％)。
6.合成Pro15，Pro20，Pro22，和Pro28產(chǎn)生標記Pro15，Pro20，Pro22，和Pro28的NHS酯的合成圖分別在圖7 A-D中顯示。所有試劑和反應條件在本領(lǐng)域中是常規(guī)的，其進行過程與上述的反應相似。
標記分子與抗體的共軛作用通常使用兩種不同的方法進行共軛作用。第一種方法涉及標記分子與抗體的直接附著，第二種方法涉及標記分子與葡聚糖附著，然后再與抗體附著。第二種方法提供了信號擴增的手段，產(chǎn)生一種含有多個標記分子的被標記抗體試劑，都可被一種單一的敏化劑分子所釋放。
1.Pro1標記分子與抗體的直接共軛標記分子被合成一個NHS酯末端，可與抗體的伯胺反應形成一個穩(wěn)定的酰胺連接，得到一個在抗體表面上隨機附著的標記分子。以前的共軛標記-抗體分子已經(jīng)證明每個抗體用直至含有6至12個NHS酯的分子修飾一般不引起抗原結(jié)合活性的降低。NHS酯和抗體即使更高的比例可能僅有活性的輕微丟失。
步驟1.純化的鼠單克隆抗體9E10(可識別氨基酸序列EQKLISEEDL，對c-myc特異，來自Roche Diagnostics，Indianapolis，IN)在1XPBS(0.1M磷酸鈉，0.15MNaCl，pH7.2)中被稀釋至2mg/mL。
2.含有NHS酯的Pro1分子被溶解在DMF(二甲基甲酰胺)中至終濃度10至20nmols/μLDMF之間。
3.500μL被稀釋的9E10抗體(6.5nmol)與1，5，25，或50μL Pro1標記試劑(分別為14，68，340和680nmol)混合。(見圖6A.)4.溶液在冰上避光反應2小時。
5.Pro1共軛的鼠抗c-myc通過在0.1XPBS(10mM磷酸鈉，15mMNaCl，pH7.2)中在4℃透析20h進行純化。
2.Pro1-葡聚糖與抗體的共軛在這第二種方法中，基本上如上所述標記分子首先通過酰胺鍵附著于含有胺的葡聚糖上。多克隆和一些單克隆抗體在抗體的Fc部分中含有糖類。這些多糖可被高碘酸鹽氧化形成反應性的醛殘基。含有氨基葡聚糖的標記然后與被氧化抗體的醛殘基通過形成Schiff堿基而共軛在一起。這種連接通過用氰基硼氫鈉還原為仲胺連接而被進一步穩(wěn)定。
為了與標記分子共軛，含有50至500個氨基基團的非常大的氨基葡聚糖(分子量為500,000)可允許與抗體連接的標記數(shù)目明顯增加，可進行信號擴增。由于葡聚糖通過抗體FC部分上的糖類被偶聯(lián)，因此它可完全能從抗原結(jié)合位點上被去除，這樣將不影響結(jié)合活性。
Pro1標記分子與氨基葡聚糖共軛的步驟1.氨基葡聚糖(500,000mw，具有500個胺/mole葡聚糖)溶解在90％DMF中至終濃度2mg/mL(2nmol胺/μL)。
2.含有標記分子的NHS酯在DMF(二甲基甲酰胺)中溶解至終濃度10至20nmol/μLDMF。
3.500μL氨基-葡聚糖(1000nmol胺)與500,1000，或2000nmol Pro1標記試劑混合。
4.溶液在冰上避光反應2小時。
5.標記-共軛的氨基-葡聚糖在0.1XPBS(10mM磷酸鈉，15mMNaCl，pH7.2)中在4℃透析20小時進行純化。
6.在14,000xg離心5分鐘去掉沉淀物。
用高碘酸鈉氧化抗體的步驟1.500μL(2.8nmol)純化的鼠單克隆抗體9E10(可識別氨基酸序列EQKLISEEDL，對c-myc特異，來自Roche Diagnostics，Indianapolis，IN)在10mM高碘酸鈉(Aldrich)的存在下被氧化。
2.溶液在室溫下避光反應30分鐘。
3.加入乙二醇至終濃度100mM，在室溫下孵育10分鐘。
4.然后被氧化的抗體在0.1XPBS(10mM磷酸鈉，15mMNaCl，pH7.2)中在4℃透析2小時進行純化。
將高碘酸鹽氧化的抗體與Pro1共軛的氨基葡聚糖共軛的步驟1.54μL(300pmol)氧化的鼠單克隆抗體9E10與300pmol Pro1-共軛的氨基葡聚糖在200mM碳酸鈉，pH9.5的存在下混合。
2.溶液在室溫下避光反應2小時。
3.加入氰基硼氫鈉(在1NNaOH中新配制)至終濃度50mM，在室溫下反應30分鐘。
4.加入50mM乙醇胺，pH9.6阻斷未反應的醛，在室溫下反應30分鐘。
5.然后Pro1-共軛的鼠抗c-myc在0.1XPBS(10mM磷酸鈉，15mMNaCl，pH7.2)中在4℃透析20小時進行純化。
光敏劑分子與結(jié)合試劑的共軛作用敏化劑分子可通過多種方法和構(gòu)型與抗體共軛。例如，活化的敏化劑，如用例如NHS酯，醛或磺酰氯活化的次亞甲藍或酞菁染料，與抗體中的氨基基團反應。然后這些共軛物被直接用于多種測定中。多個活化的敏化劑分子也可與抗體偶聯(lián)，例如通過使用一種含有20-200個敏化劑和200-500個氨基基團，與高碘酸鹽氧化的抗體分子偶聯(lián)的氨基葡聚糖-敏化劑共軛物，產(chǎn)生一種抗體-葡聚糖-敏化劑共軛物。產(chǎn)生這些試劑的步驟如上面標記-抗體試劑的描述。
對于本實例，敏化劑共軛物將使用純化的鼠單克隆抗體12CA5來產(chǎn)生，該抗體可識別氨基酸序列YPYDVPDYA，對血細胞凝集素特異，來自Roche Diagnostics，Indianapolis，IN，與用NHS酯活化的次亞甲藍偶聯(lián)，產(chǎn)生次亞甲藍-共軛的鼠抗-HA。
實例中使用的材料來源抗體Her-1 EGFR.1Labvision，Ab-3H11 Labvision，Ab-5H9B4 Labvision，Ab-15Her-2 N12 Labvision，Ab-4N29 Labvision，Ab-73B5 Labvision，Ab-15He-3 H3.90.6 Labvision，Ab-4SGP1 Labvision，Ab-8兔Ab Labvision，Ab-11Her-4 H4.77.1 6 Labvision，Ab-1HFK-1 Labvision，Ab-4小鼠MAb SantaCruz，C-7兔Ab Santa Cruz，C-18磷酸化-Tyr PY20 BD BiosciencesPT-100Cell SignalingPY69 BD Biosciences抗-Her-1(Y1068)1H12 Cell Signaling抗-Her-2(Y1248)PN2A Labvision，Ab-18細胞系所有細胞均購自ATCC。
人類組織所有快速冷凍組織樣品購自William Bainbridge Genome Foundation(Seattle，WA)或Bio Research Support(Boca Raton，F(xiàn)L)，并在供應商處由Intitutional ResearchBoard(IRB)認可。
實施例1監(jiān)測GABABR1/GABAβR2雜寡聚化的測定γ-氨基丁酸B(GABA)B受體，G-蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)，可通過GABA介導對腦膜上高活性GTP酶活性的刺激，以調(diào)節(jié)鉀和鈣通道。位于細胞表面上的這種受體的活性形式，已顯示是一種雜寡聚體，含有兩個受體，GABABR1和GABABR2，均為III類GPCR，具有35％的序列同一性(Jones等人，1998，Kaupmann等人，1998，White等人，1998，Milligan，2001)。
GABAB受體的雜寡聚化可采用本發(fā)明的方法來監(jiān)測。首先，產(chǎn)生抗原決定簇標記的GABABR1和GABABR2受體，并轉(zhuǎn)染進HEK293T細胞，如White等人，(1998)。
用GABABR1和GABABR2編碼序列轉(zhuǎn)染HEK293T細胞的步驟1.編碼Myc抗原決定簇(使用單克隆抗體9E10)的cDNA在框內(nèi)與編碼GABABR1的cDNA5’末端融合，去掉本身固有的信號序列，替換以CD33。
2.編碼HA抗原決定簇(使用單克隆抗體12CA5)的cDNA在框內(nèi)與編碼GABABR2的cDNA5’末端融合，去掉本身固有的信號序列，并替換以T8。
3.HEK293T細胞培養(yǎng)在含有10％胎牛血清和2mM谷氨酰胺的DMEM培養(yǎng)基中。細胞在60mm培養(yǎng)皿中生長至60-80％匯合，使用10μLlipofectamine試劑(LifeTechnologies)，用1.5μg每種GABABcDNA嵌合體轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后48-72小時收集細胞。
監(jiān)測寡聚化的步驟1.在50mMTris-HCl，pH7.4中GABABR1和GABABR2-轉(zhuǎn)染的HEK293T細胞(105細胞)，與5-20nM每種Pro1-共軛的鼠抗c-myc抗體和次甲基藍共軛的鼠抗-HA抗體避光混合在一起。產(chǎn)生三種對照樣品，該對照中缺少細胞，抗-c-myc抗體，或抗-HA抗體三者其中之一。
2.混合物在37℃避光孵育30分鐘，進行結(jié)合。
3.通過離心樣品，去掉上清液去除未結(jié)合的抗體，然后用含有50mM Tris-HCl，pH7.4，和ROX T8標準品(from PE Biosystems)的交換緩沖液將沉淀球中的細胞重新懸浮，在緩沖液中稀釋至1∶2000。
4.然后用一個發(fā)光二極管在680nm照射樣品5分鐘以活化敏化劑進行裂解作用。
5.樣品再次離心，收集上清液，在測定過程中它含有任何被釋放的標記分子。
6.在ABI3100毛細管電泳儀或CLARA plastic LabCardTM裝置(ACLARABioSciences，Inc.Mountain View，CA)上，通過毛細管電泳分離被釋放的標記。在ABI3100上被釋放標記的分離條件如下50μm毛細管，47cm長，36cm檢測終點(end-to-detection)；分離緩沖液，POP-4；在3.0kV注射80s；分離電壓，15kV。
實施例2分析細胞溶解產(chǎn)物的Her-2雜二聚化和受體磷酸化在本實施例中，在用多種濃度的上皮細胞生長因子(EGF)和heregulin(HRG)處理后，在來自幾種細胞系的細胞溶解產(chǎn)物中測定Her1-Her2和Her2-Her3雜二聚體和磷酸化狀態(tài)。使用三種結(jié)合化合物和一種可解離的探針如下述進行測定。
樣品制備1.血清饑餓的乳癌細胞系在使用前培養(yǎng)過夜。
2.用EGF和/或HRG在培養(yǎng)基中37℃刺激細胞系10分鐘。對于除BT20外的所有細胞系(例如，MCF-7，T47D，SKBR-3)EGF/HRG的實施例劑量為0，0.032，0.16，0.8，4，20，100nM，對于BT20的最大劑量要超過500nM，因為使用100n MEGF不能達到飽和。
3.吸出培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移至冰上，原位向被溶解的細胞中加入裂解緩沖液。
4.刮除和轉(zhuǎn)移溶解產(chǎn)物至microfuge管中。在冰上孵育30分鐘。在14,000rpm，4℃，微量超速離心10min。(離心是選擇性的)5.收集上清液作為溶解產(chǎn)物，等分樣品儲存在-80℃?zhèn)溆谩?br> 測定測定設計如圖9A中所圖解說明的，根據(jù)裂解探針(902)和結(jié)合化合物(904)，(906)，和(908)的結(jié)合作用比例測定Her2-Her3雜二聚體(900)。表示為“PS”的光敏劑與可解離的探針(902)通過親和素-生物素連接附著在一起，結(jié)合的化合物(904)，(906)和(908)分別用分子標記Pro14，Pro10和Pro11標記。結(jié)合化合物(904)對Her3上的磷酸化位點是特異的。
總測定體積是40μl。溶解物體積用裂解緩沖液調(diào)整至30μl。抗體在裂解緩沖液中稀釋至10μl。一般每個反應使用相當于～5000至15000個細胞的溶解產(chǎn)物。檢測的限度是相當于～1000個細胞的溶解產(chǎn)物。
步驟反應中混合前的結(jié)合化合物的終濃度(即，分子標記或生物素-抗體共軛物)Pro4_抗-Her-20.1μg/mlPro10_Ab11抗-Her-10.05-0.1μg/mlPro11_抗-Her-30.1μg/mlPro2_PT100抗磷酸化-Tyr0.1μg/ml生物素_抗-Her-21-2μg/ml1.向96檢測孔中，加入10μl抗體混合物至30μl溶解產(chǎn)物中，并在RT下孵育1小時。
2.向檢測孔中加入2μl抗生蛋白鏈菌素衍化的裂解探針(最終2μg/孔)并孵育45分鐘。
3.向96孔濾板(Millipore MAGVN2250)中加入150μl PBS和1％BSA，并在RT下孵育1小時進行封閉。
4.真空抽吸甩干濾板。將測定反應傳遞至濾板上，并使用真空甩干。
5.加入200μl沖洗緩沖液，并使用真空甩干。重復一次。
6.加入200μl發(fā)光緩沖液，并使用真空甩干。重復一次。
7.加入30μl發(fā)光緩沖液，并照射20分鐘。
8.將每個反應中的10μl轉(zhuǎn)移至CE測定板上用ABI3100CE裝置，22cm毛細管進行分析(注射條件5kV，75秒，30℃；運轉(zhuǎn)條件600秒，30℃)。
測定緩沖液如下裂解緩沖液(新鮮配制并在冰上儲存)終濃度μl 儲存液1％TritonX-100 1000 10％20mM Tris-HCl(pH7.5)200 1M100mM NaCl 200 5M50mM NaF500 1M50mM Naβ-甘油磷酸 1000 0.5M1mM Na3VO4100 0.1M5mM EDTA100 0.5M10μg/ml抑胃肽 100 1mg/ml1片(每10ml)Roche完全蛋白酶抑制劑(#1836170) N/A N/A水6500 N/A總計10ml沖洗緩沖液(儲存在4℃)終濃度ml儲存液1％NP-405010％IxPBS 5010x150mM NaCl 155M5mM EDTA5 0.5M水380 N/A總計500ml發(fā)光緩沖液終濃度μl 儲存液0.005xPBS 50 1xCE std 3 100x10mMTris-HCl(pH8.0) 0.1M10pM A160 1nM10pM A315 1nM10pM HABA 1nM水10,000N/A總計10ml
數(shù)據(jù)分析1.對每個分子標記根據(jù)CE參考標準品A315標準化相對的熒光單位(RFU)信號。
2.從相應的分子標記信號中減去“無溶解產(chǎn)物”背景對照的RFU。
3.使用生物素-抗Her-2以相應RFU與測定孔Pro抗Her-2的RFU的度量比例報告Her-1或Her-3的雜二聚化。
4.使用生物素-抗Her-2以Pro2_PT100抗磷酸化-Tyr的RFU與Pro4_抗Her-2的RFU度量比例報告Her-1，2，3的受體磷酸化。測定的結(jié)果在圖9B-9H中圖示。圖9B顯示了在MCF-7細胞上隨EGF濃度增加Her1-Her2雜二聚體增加的數(shù)量，而隨HRG濃度的增加相同的二聚體數(shù)量顯示基本上沒有變化。圖9C顯示了Her2-Her3雜二聚體的相反結(jié)果。也就是，在MCF-7細胞上Her2-Her3雜二聚體根據(jù)HRG濃度的增加而增加，而隨EGF濃度的增加，相同二聚體的數(shù)量顯示基本上沒有變化。圖9D和9E分別顯示了在SKPR-3細胞和BT-20細胞上隨著EGF濃度的增加，Her1-Her2雜二聚體增加的數(shù)量。
實施例3分析組織溶解產(chǎn)物中的Her2雜二聚化和受體磷酸化在本實施例中，在人乳癌標本的組織溶解產(chǎn)物中測定Her1-Her2和Her2-Her3雜二聚體和磷酸化狀態(tài)。
樣品的制備1.快速冰凍的組織在凍結(jié)狀態(tài)下通過切割被機械性破壞。
2.將組織轉(zhuǎn)移至microfuge管中，并加入3x組織體積的裂解緩沖液(見附件I)，然后通過渦流在緩沖液中粉碎組織。
3.在冰上孵育30分鐘，間歇渦流混合。
4.在14,000rpm，4℃離心20分鐘。
5.收集上清液作為溶解產(chǎn)物，使用小試樣管，采用BCAassay(Pierce)測定總蛋白濃度。
6.將剩余物等分儲存在-80℃?zhèn)溆谩?br> 測定設計1.總測定體積為40μl。
2.在40，20，10，5，2.5，1.25，0.63，0.31μg的系列總當量的連續(xù)滴定下檢測溶解產(chǎn)物，用裂解緩沖液中調(diào)整體積至30μl。系列滴定的數(shù)據(jù)證實了二聚化或磷酸化信號的特異性。
3.由在裂解緩沖液中稀釋的eTag-抗體組成的通用抗體混合物在下列的濃度下使用。
4.每個受體各自的生物素-抗體被分別地加入至反應中。
5.用每種組織溶解產(chǎn)物進行三個eTag測定，每個都使用一種與要被測定的特異受體二聚化作用對應的不同的生物素-抗體。
6.每種受體的表達水平在含有與受體特異的生物素-抗體的不同測定中被確定。
7.僅在含有生物素-抗Her-2的測定中按度量比例確定二聚化和磷酸化信號。
測定對照MCF-10A和MCF-7細胞系分別用作定性陰性和陽性對照。細胞系不用或用100nMEGF或100nMHRG刺激。當替換組織樣品時，裂解緩沖液被包括為背景對照。
在反應中預先混合抗體的終濃度通用抗體混合物Pro4_抗-Her-20.1ug/mlPro10_抗-Her-10.05ug/mlPro11_抗-Her-30.1ug/mlPro2_抗磷酸化-Tyr.0.01ug/ml個別生物素抗體生物素_抗-Her-12ug/ml生物素_抗Her-22ug/ml生物素_抗-Her-32ug/ml步驟1.通過將生物素抗體加入至通用抗體混合物中制備抗體反應混合物。
2.向96孔測定孔中，加入10μl通用反應混合物至30μl溶解產(chǎn)物中，并在RT下孵育1小時。
3.向測定孔中加入2μl抗生蛋白鏈菌素衍化的裂解探針(最終2μg/孔)，并孵育45分鐘。
4.向96孔濾板(Millipore MAGVN2250)中加入150μl PBS和1％BSA，并在RT下孵育1小時進行阻斷。
5.通過真空抽吸甩干濾板。將測定反應轉(zhuǎn)移至濾板中，使用真空甩干。
6.加入200μl沖洗緩沖液，并使用真空甩干。重復一次。
7.加入200μl發(fā)光緩沖液，并使用真空甩干。重復一次。
8.加入30μl發(fā)光緩沖液，并照射20分鐘。
9.將10μl每種反應液轉(zhuǎn)移至CE測定板中，使用ABI3100毛細管電泳裝置，用22cm毛細管(注射條件5kV，75秒，30℃；運轉(zhuǎn)條件600秒，30℃)進行分析。
數(shù)據(jù)分析1.根據(jù)CE參考標準品A315標準化每個分子標記的RFU信號。
2.確定RFU的極限值(二聚化或磷酸化各一個)，在此下，不能計算比例，因為信號太低而不可靠。在極限值下，RFU信號在被檢測的溶解產(chǎn)物系列稀釋度下是無法滴定的?？墒褂么罅空＝M織測定該值，其中期望缺少二聚化和磷酸化信號或信號最低。這些值也代表了正常組織上二聚化或磷酸化的基礎(chǔ)水平，腫瘤組織將可與其比較。
3.對于少數(shù)正常組織，如果其RFU值在極限值上，測定個別的RFU水平和被檢測的Her-1或Her-3雜二聚化或磷酸化峰的度量比例讀數(shù)。這些樣品代表了一些異常值，在評分時應該用作相應腫瘤組織樣品的供體對比對照。
4.對于顯示可滴定RFU信號的所有腫瘤樣品，使用來自組織溶解產(chǎn)物滴定系列的每個Her-1，Her-2，Her-3或磷酸化的最低信號作為背景。從最高劑量溶解產(chǎn)物(例如，40ug)的分子標記信號中減去這個背景，產(chǎn)生特異的RFU信號。如果在滴定系列中沒有信號劑量反應，所有信號(通常非常低)被認為是背景，沒有特異的信號被用作度量比例分析。
5.以其相應的特異RFU與來自Pro4抗Her-2的特異RFU的度量比例報告Her-1或Her-3的雜二聚化。如果沒有獲得特異的RFU，二聚化是陰性的。
6.以來自Pro2抗磷酸化-Tyr的特異RFU與來自Pro4抗Her-2的特異RFU的度量比例報告Her-1，2，3的受體磷酸化。如果沒有獲得特異的RFU，磷酸化是陰性的。
在圖10A-10C中顯示的數(shù)據(jù)代表了使用本發(fā)明的測定法檢測的多個患者的乳腺組織樣品。10個腫瘤陣品中的9個免疫組織化學(DAKO Herceptest)顯示的臨床Her-2狀態(tài)是陰性的，表明沒有檢測到Her-2的染色，或小于10％的腫瘤細胞染色，或在超過10％腫瘤細胞的細胞膜上有微弱和僅剛可察覺的染色。本發(fā)明的測定法在正常和腫瘤組織上檢測到Her-1，Her-2，和Her-3的表達。Her1和Her2的雜二聚化作用以及Her2和Her3的雜二聚化作用僅在腫瘤組織上檢測到，但在任何正常組織上檢測不到。
實施例4分析細胞溶解產(chǎn)物的Her1或Her2均二聚化和受體磷酸化樣品的制備基本上如實施例2中所述進行。通過用EGF或TGFα處理細胞系誘導Her1均二聚化。對于沒有配體的Her2的均二聚化，過度表達Her2的未刺激SKBR-3或MDA-MD-453細胞可與表達較低水平的Her2的未刺激MCF-7細胞相比較。
測定設計對受體特異的單克隆抗體單獨與分子標記或生物素共軛(然后通過親和素橋與光敏劑連接)，這樣在本實施例中可解離的探針和結(jié)合化合物競爭結(jié)合相同的抗原決定簇?？墒褂昧硪粋€結(jié)合化合物，它含有一個可識別受體上重疊抗原決定簇的第二抗體，這樣可產(chǎn)生一個度量比例信號作為均二聚化作用的測量指標。在一個樣品中來自第二抗體的信號也提供了一種受體總量的測量指標。受體的總量在單獨的測定孔中測定。受體的磷酸化可與均二聚化或總受體量一起定量。
步驟測定體積為40ul，大體的步驟與實施例2相似。對每個樣品設立兩個測定孔，A和B，單獨對受體的均二聚化和總量進行定量。
對于Her1-Her1同型二聚體的定量在測定孔A中抗體混合物的終濃度
Pro12_抗-Her-10.05-0.1ug/ml生物素_抗-Her-11-2ug/ml在測定孔B中抗體混合物中的終濃度Pro10_抗-Her-10.05-0.1ug/mlPro2_抗磷酸化-Tyr.0.1ug/ml生物素_抗-Her-11-2ug/ml對于Her2-Her2同型二聚體的定量在測定孔A中抗體混合物中的終濃度Pro4_抗-Her-10.05-0.1ug/ml生物素_抗-Her-11-2ug/ml測定孔B中抗體混合物中的終濃度Pro4_抗-Her-10.05-0.1ug/mlPro2_抗磷酸化-Tyr.0.1ug/ml生物素_抗-Her-11-2ug/ml數(shù)據(jù)分析1.根據(jù)CE參考標準品A315標準化每個分子標記的RFU信號。
2.從相應的分子標記信號中減去“無溶解產(chǎn)物”背景對照的RFU。
3.以測定孔A的相應標準化RFU與相應測定孔B中總受體量的標準化RFU的度量比例報告Her-1或Her-2同型二聚化。
4.以測定孔B的Pro PT100抗磷酸化Tyr的標準化RFU與相同測定孔B中總受體量的標準化RFU的度量比例報告Her-1或Her-2同型二聚體。
測定的結(jié)果在圖11A-11B和圖12中圖示。圖11A顯示BT-20細胞上Her1-Her1同型二聚體的量隨著EGF的濃度增加而增加。圖11B顯示了BT-20細胞中Her1磷酸化的量隨著EGF濃度的增加而增加。Her2-Her2同型二聚體的檢測可通過比較細胞表面上表達Her2的SKBR-3細胞的信號與表達較低Her2水平的MCF-7的信號而確定。如在圖12中的圖所示，MCF-7細胞沒有檢測到特異的可滴定Her2-Her2同型二聚體信號，而SKBR-3細胞的Her2-Her2同型二聚體信號明顯超過MCF-7細胞的信號。
實施例5分析細胞溶解產(chǎn)物的Her1-Her3雜二聚化和受體磷酸化如下制備樣品1.在使用前血清饑餓的乳癌細胞系培養(yǎng)過夜。
2.用HRG在培養(yǎng)基中在37℃刺激細胞系10分鐘。T47D的HRG實施例劑量為0，0.032，0.16，0.8，4，20，100nM。
3.吸取培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)移至冰上，加入裂解緩沖液在原位溶解細胞。
4.刮除和轉(zhuǎn)移溶解產(chǎn)物至microfuge管中。在冰上孵育30分鐘。在14,000rpm，4℃，微量超速離心10分鐘。(離心是選擇性的)5.收集上清液為溶解產(chǎn)物，等分儲存在-80℃?zhèn)溆谩?br> 測定設計總測定量為40ul。溶解產(chǎn)物量用裂解緩沖液調(diào)整至30ul?？贵w在裂解緩沖液稀釋至5ul。一般每個反應中使用相當于～5000至50000個細胞的溶解產(chǎn)物。反應中混合前抗體的終濃度為Pro10_Ab11抗-Her-10.05-0.1ug/mlPro11_抗-Her-30.1ug/mlPro2_PT100抗磷酸化-Tyr.0.1ug/ml生物素抗-Her-31-2ug/ml1.向96測定孔中，加入5ul抗體混合物至30ul溶解產(chǎn)物中，并在RT下孵育1小時。
2.向測定孔中加入5ul抗生蛋白鏈菌素衍生的分子前(最終4ug/孔)，并孵育45分鐘。
3.向96孔濾板(Millipore MAGVN2250)中加入含有％BSA的150ulPBS，并在RT下孵育1小時進行封閉。
4.通過真空吸甩干濾板。將測定反應轉(zhuǎn)移至濾板中，使用真空甩干。
5.加入200ul沖洗緩沖液，使用真空甩干。重復一次。
6.加入200ul發(fā)光緩沖液，使用真空甩干。重復一次。
7.加入30ul發(fā)光緩沖液，并照射20分鐘。
8.將每個反應中的10ul轉(zhuǎn)移至CE測定板中，采用ABI3100毛細管電泳裝置，使用22cm毛細管進行分析(注射條件5kV，425秒，30℃；運轉(zhuǎn)條件600秒，30℃)。
數(shù)據(jù)分析1.根據(jù)CE參考標準品A315標準化每個eTag報告子的RFU信號。
2.從相應的eTag報告子信號中減去“無溶解產(chǎn)物”背景對照的RFU。
3.以Her-1衍生的Pro10 RFU與來自抗Her-3的Pro11 RFU的度量比例來報告雜二聚化。
4.以Pro2 PT100抗磷酸化Tyr的RFU與使用生物素抗Her-3從測定孔獲得的Pro11抗Her-3RFU的度量比例報告Her1/3的受體磷酸化。
測定的結(jié)果在圖13A和13B中圖示。數(shù)據(jù)顯示Her1-Her3雜二聚化和二聚體磷酸化隨著HRG濃度的增加而增加。
權(quán)利要求
1.一種檢測細胞膜中膜相關(guān)分析物二聚體的方法，該法包括以下步驟提供對二聚體中第一個膜相關(guān)分析物特異的結(jié)合化合物，所述的二聚體包括第一個膜相關(guān)分析物和第二個膜相關(guān)分析物，結(jié)合化合物具有一個或多個分子標記，每個都通過一個可裂解鍵附著在其上，所述的一個或多個分子標記每個都具有一種分離特性；提供對第二個膜相關(guān)分析物特異的裂解探針，裂解探針含有一個具有有效近端的裂解誘導部分；將裂解探針，結(jié)合化合物和細胞膜混合，這樣裂解探針與第一個膜相關(guān)分析物特異結(jié)合，結(jié)合化合物與第二個膜相關(guān)分析物特異結(jié)合，使結(jié)合化合物的可裂解鍵位于裂解誘導部分的有效近端之內(nèi)，使分子標記可被釋放；和分離和鑒定被釋放的分子標記以確定在細胞膜中是否存在二聚體或二聚體的含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的第一個膜相關(guān)分析物和所述的第二個膜相關(guān)分析物均是所述的細胞膜中的受體，所述的一個或多個分子標記的所述分離特性是電泳遷移率。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述的分離和檢測步驟進一步包括在一種分離緩沖液中電泳分離所述的釋放分子標記。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述的裂解探針的裂解誘導部分是光敏劑，其中所述的裂解探針和所述的結(jié)合化合物每個都包括一個抗體結(jié)合組合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述的細胞表面受體選自表皮生長因子受體和G蛋白偶聯(lián)受體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述的細胞表面受體選自Her1，Her2，Her3，或Her4。
7.一種檢測細胞膜中由第一個膜相關(guān)分析物和第二個膜相關(guān)分析物組的二聚體的方法，該法包括以下步驟提供一種或多種對二聚體的不同抗原決定簇特異的結(jié)合化合物；每個結(jié)合化合物含有一個或多個分子標記，每個都通過一個可裂解鍵附著在其上，不同結(jié)合化合物的分子標記具有不同的分離特性；提供對二聚體的一個抗原決定簇特異的一種裂解探針，該抗原決定簇不同于一種或多種結(jié)合化合物特異的抗原決定簇，裂解探針含有一個具有有效近端的裂解誘導部分；將裂解探針，一種或多種結(jié)合化合物和細胞膜混合在一起，使分別與其抗原決定簇特異結(jié)合的裂解探針和一種或多種結(jié)合化合物以及一種或多種結(jié)合化合物的可裂解鍵位于裂解誘導部分的有效近端之內(nèi)，這樣分子標記被釋放；和分離和鑒定釋放的分子標記，以確定細胞膜上是否存在二聚體或二聚體的量。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述的第一個膜相關(guān)分析物和所述的第二個膜相關(guān)分析物都是細胞表面受體，其中所述的一種或多種結(jié)合化合物中至少一個對所述二聚體的磷酸化位點是特異的。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中所述的分離特性是電泳遷移率，所述的分離和鑒定步驟包括電泳分離所述的釋放分子標記，在電泳圖譜中形成各種不同的峰。
10.根據(jù)根據(jù)權(quán)利要求7，8或9所述的方法，其中所述的第一個膜相關(guān)分析物和所述的第二個膜相關(guān)分析物每個都選自表皮生長因子受體和G蛋白偶聯(lián)受體。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中所述的第一個膜相關(guān)分析物和所述的第二個膜相關(guān)分析物每個都選自Her1，Her2，Her3或Her4。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述的二聚體是雜二聚體，其中所述的裂解探針和一種或多種結(jié)合化合物每個都包括一種抗體結(jié)合組合物。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中所述的雜二聚體包括Her2和Her3。
14.根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法，其中所述的二聚體是Her1的同型二聚體，其中所述的裂解探針和一種或多種結(jié)合化合物每個都包括一種抗體結(jié)合組合物。
15.一種檢測細胞膜中多個受體類型的寡聚化的方法，該方法包括以下步驟提供對多個第一個受體類型特異的一個裂解探針，裂解探針含有一個具有有效近端的裂解誘導部分；提供對多個不同的第二個受體類型每個都特異的一種或多種結(jié)合化合物，每個結(jié)合化合物含有一個或多個分子標記，每個都通過一個可裂解鍵附著在其上，不同結(jié)合化合物的分子標記具有不同的分離特性；將裂解探針，一種或多種結(jié)合化合物和細胞膜混合，使分別與其受體特異結(jié)合的裂解探針和一種或多種結(jié)合化合物以及一種或多種結(jié)合化合物的可裂解鍵位于裂解誘導部分的有效近端之內(nèi)，這樣分子標記被釋放；和分離和鑒定被釋放的分子標記以確定在細胞膜中是否存在受體類型的寡聚化或寡聚化的量。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中所述的分離特性是電泳遷移率，所述的分離和鑒定步驟包括電泳分離所述的被釋放分子標記，在電泳圖譜中形成各種不同的峰。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述的裂解探針的裂解誘導部分是光敏劑。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述的的第一個受體類型和所述的第二個受體類型選自表皮生長因子受體和G蛋白偶聯(lián)受體。
19.在一個生物學樣品中檢測含有第一個受體類型和第二個受體類型的二聚體的方法，該法包括以下步驟提供對二聚體的不同抗原決定簇特異的一種或多種結(jié)合化合物，每個結(jié)合化合物含有一個或多個分子標記，每個都通過一個可裂解鍵附著在其上，不同結(jié)合化合物的分子標記具有不同的分離特性，使在分離過程中在分離分布圖中形成各種不同的峰；提供一種含有一種具有有效近端的裂解誘導部分的裂解探針，裂解探針對與一種或多種結(jié)合化合物的抗原決定簇不同的二聚體的一個抗原決定簇是特異的，其條件是所述的抗原決定簇中至少一個位于第一個受體類型上，所述抗原決定簇中至少一個位于第二個受體類型上；形成一種含有裂解探針，一種或多種結(jié)合化合物和生物學樣品的測定混合物，這樣分別與其抗原決定簇特異結(jié)合的裂解探針和一種或多種結(jié)合化合物以及一種或多種結(jié)合化合物的可裂解鍵位于裂解誘導部分的有效近端之內(nèi)，這樣分子標記被釋放；和分離和鑒定被釋放的分子標記以確定生物學樣品中是否存在二聚體或二聚體的量。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述的分離特性是電泳遷移率，所述的分離和鑒定步驟包括電泳分離所述的被釋放分子標記，以在電泳圖譜中形成不同的峰。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述的形成步驟包括在結(jié)合緩沖液中孵育所述的裂解探針，所述的一種或多種結(jié)合化合物，和所述的生物學樣品，并在分離所述的被釋放分子標記之前，用分離緩沖液更換結(jié)合緩沖液。
22.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述的裂解誘導部分是一種敏化劑，其中所述的形成步驟包括誘導所述的敏化劑產(chǎn)生活性物質(zhì)，它在所述的其有效近端之內(nèi)裂解所述的可裂解鍵。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其中所述的敏化劑是一種光敏劑，其中所述的活性物質(zhì)是單態(tài)氧。
24.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述的裂解探針和所述的一種或多種結(jié)合化合物每個都含有一個抗體結(jié)合組合物。
25根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述的抗原決定簇中至少一個是所述第一個受體類型或所述第二個受體類型的磷酸化位點。
26.根據(jù)根據(jù)權(quán)利要求19，20，21，22，23，25，或25所述的方法，其中所述的第一個受體類型和所述的第二個受體類型選自表皮生長因子受體和G蛋白偶聯(lián)受體。
27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的方法，其中所述的一種或多種結(jié)合化合物是在2至10個范圍內(nèi)的多個結(jié)合化合物。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述的第一個受體類型和所述的第二個受體類型各自選自Her1、Her2、Her3或Her4。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述的二聚體是雜二聚體或同型二聚體，含有選自Her1、Her2、Her3或Her4的受體類型。
30.根據(jù)權(quán)利要求29所述的方法，其中所述的二聚體是Her1-Her1同型二聚體、Her1-Her2雜二聚體、Her1-Her3雜二聚體、或Her2-Her3雜二聚體。
全文摘要
本發(fā)明提供了檢測細胞膜表面分子形成寡聚復合物的方法。這些方法使用各自與細胞表面分子特異結(jié)合的標記探針對并裂解探針。標記的探針包括與第一個結(jié)合化合物經(jīng)可裂解鍵連接的分子標記，裂解探針包括第二個結(jié)合劑和裂解誘導部分，當后者位于規(guī)定的鍵附近時可以裂解鍵。兩個探針與已形成寡聚復合物的細胞表面分子結(jié)合導致分子標記從結(jié)合化合物中釋放，提供復合物形成的一種檢測指標。
文檔編號G01N33/567GK1672054SQ03817888
公開日2005年9月21日 申請日期2003年7月17日 優(yōu)先權(quán)日2002年7月25日
發(fā)明者張睴波英, 施一寧, S·皮達帕斯伊, R·杜瓦, S·辛格 申請人:阿克拉若生物科學公司