專利名稱：根據(jù)PTHrP預(yù)測和診斷骨骼疾病的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及預(yù)測、診斷和治療疾病的方法和材料。尤其是，本發(fā)明涉及預(yù)測、診斷和治療骨骼疾病的方法和材料。本發(fā)明還涉及篩選出對骨骼疾病的治療，尤其是針對骨質(zhì)疏松癥具有治療潛力的化合物的系統(tǒng)和方法。
背景技術(shù)：
骨骼疾病會發(fā)生在所有年齡的婦女，男人和兒童身上。從幼年到老年，骨骼疾病正嚴重影響著北美數(shù)百萬人的生活質(zhì)量。每年，僅在美國，骨骼疾病中的骨質(zhì)疏松癥、佩吉特氏病(Paget′s disease)、成骨不全和多骨髓瘤就折磨著3千萬人，導致生活無法自理、殘疾、病痛和死亡。在美國，每年與骨骼疾病相關(guān)的急性和長期護理的費用大約為200億美元。隨著人口老齡化，預(yù)計到2020年，這些費用會達到600到800億美元。如果不進行干涉，包括診斷方法的改進，尤其是對前期發(fā)病預(yù)后性癥狀的檢查和有力的預(yù)防治療，慢性病，例如骨質(zhì)疏松癥將會使急性和長期護理費用的負擔延續(xù)到下個世紀，并使我們控制衛(wèi)生保健費用的努力付之東流。
由于骨密度降低導致的骨質(zhì)疏松癥和相關(guān)的骨折在老齡個體中很常見，并且產(chǎn)生了與此類疾病相關(guān)的大量衛(wèi)生保健費用和負擔。盡管骨質(zhì)疏松癥有多種病因，但是80％的根本病因在于遺傳?？墒?，目前沒有商業(yè)化的檢測手段能用來確定個體具有易患骨質(zhì)疏松癥的體質(zhì)。通常，只有當疾病已經(jīng)發(fā)展到了明顯程度之后，患者才能被診斷出骨質(zhì)疏松癥。無法提供骨骼疾病和/或骨骼疾病誘因的早期檢測，使得該類疾病的治療費用不斷攀升。
近來，申請人和其它研究者的實驗研究提供了重要的證據(jù)，表明在骨骼的成骨細胞(造骨細胞)中表達的一種蛋白質(zhì)，被稱為甲狀旁腺素相關(guān)蛋白(PTHrP)，對造骨細胞的適當恢復(fù)、增生、分化和功能發(fā)揮十分重要，這些過程對于保持合適的骨密度和防止骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生非常關(guān)鍵(Horwitz等.JClin Endocrinol Meta.，F(xiàn)ebruary 2003，88(2)569-575)。
申請人獲得的大量證據(jù)歸納如下發(fā)現(xiàn)PTHrP基因失活的小鼠純合子(Karaplis等.，(1994)Genes Dev.8，277-289；Amizuka等，(1994)J.Cell Biol.126，1611-1623)具有軟骨發(fā)育障礙骨骼異常以及改變的軟骨內(nèi)骨化，這在緊接著的圍產(chǎn)期的死亡時候達到了頂點。另一方面，PTHrP基因失活的小鼠雜合體(在基因組中缺失一個拷貝PTHrP基因的基因敲除小鼠，而正常的小鼠有2個拷貝)出生時候的表型是正常的，但是發(fā)育到3個月的時候出現(xiàn)了與早期的骨質(zhì)疏松癥癥狀一致的特征(Amizuka等，(1996)Developmental Biol.175，166-176)。骨質(zhì)疏松癥的嚴重形式與骨骼中PTHrP表達的降低相關(guān)，特征是骨小梁(trabecular bone)的體積和連接性顯著下降(各項異性程度降低和結(jié)構(gòu)模型指數(shù)增加)，這些所觀察到的現(xiàn)象是人骨質(zhì)疏松癥的顯著特征。
同樣地，已證明PTHrP的水平與骨質(zhì)疏松癥相關(guān)聯(lián)。但是，還需要有改進的方法和系統(tǒng)對骨骼疾病的發(fā)病機理進行表征，以便對這類疾病的機理有深入的認識，并且開發(fā)出與此相關(guān)的靈敏診斷方法和治療方法。此外，在疾病發(fā)生前還需要能有改進的方法來檢測骨骼疾病和/或確定遺傳性誘因的方法，以便能夠?qū)疾€體實施基因型特異性的個性化治療和/或?qū)嵤╊A(yù)防方案來改善個體的健康狀況。
發(fā)明目的本發(fā)明的目的在于提供一種診斷個體骨骼疾病的方法。
本發(fā)明的進一步目的在于提供一種對個體的骨骼疾病的誘因和易感性進行表征的方法。
本發(fā)明的再一個目的是提供對一個經(jīng)診斷個體的骨骼疾病和/或疾病誘因進行選擇性治療的方法。
本發(fā)明的又一個目的在于提供一種篩選用于治療骨骼疾病的新療法。
本發(fā)明的概述根據(jù)本發(fā)明的實施方式，骨骼疾病的指示子已得到表征。尤其是，骨骼疾病的遺傳指示子已在PTHrP基因內(nèi)得到表征。特別地，根據(jù)本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方式，骨質(zhì)疏松癥的遺傳指示子已在PTHrP基因內(nèi)得到了表征。此外，本發(fā)明的指示子為骨骼疾病的誘因，例如骨質(zhì)疏松癥的誘因的鑒定和/或治療提供了一種新的診斷和治療靶點。另外，根據(jù)本發(fā)明鑒定到的骨骼疾病的指示子為調(diào)節(jié)PTHrP基因的表達提供了一個新的靶點，而PTHrP基因的表達與為需要治療的個體提供治療和/或預(yù)防方案有關(guān)。根據(jù)本發(fā)明一個實施方式的記載，骨骼疾病的指示子出現(xiàn)在PTHrP基因內(nèi)含子的數(shù)目可變的串聯(lián)重復(fù)區(qū)域(VNTR)中。優(yōu)選的，內(nèi)含子位于PTHrP基因外顯子VI和VII之間。本發(fā)明的PTHrP基因優(yōu)選指代哺乳動物PTHrP基因。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式，PTHrP基因指鼠科的PTHrP基因。更優(yōu)選，本發(fā)明的PTHrP基因是指人的PTHrP基因。
根據(jù)本發(fā)明一個實施方式，本發(fā)明的指示子是在PTHrP基因VNTR區(qū)域內(nèi)的遺傳片段。優(yōu)選地，該遺傳片段根據(jù)等位基因的長度被表征為骨骼疾病的指示子或有骨骼疾病誘因的指示子。更優(yōu)選地，本發(fā)明的遺傳指示子根據(jù)預(yù)先確定的PTHrP基因VNTR區(qū)域內(nèi)的重復(fù)序列的數(shù)目而被表征。本發(fā)明的一個實施方式確定了骨骼的遺傳指示子在PTHrP基因的VNTR區(qū)域內(nèi)包含至少一個9-mer核苷酸序列。優(yōu)選地，遺傳指示子包含兩個或兩個以上9-mer核苷酸重復(fù)序列。
術(shù)語“遺傳指示子”表示所研究的基因內(nèi)的標記，用來為個體發(fā)生疾病的遺傳誘因和/或發(fā)生疾病的可能性提供指示。優(yōu)選的，本發(fā)明的遺傳指示子是指PTHrP基因內(nèi)的標記，用來為個體發(fā)生骨骼疾病的遺傳誘因和/或可能性提供指示。
術(shù)語“等位基因”是指遺傳片段的可選擇形式或所感興趣的基因區(qū)域，其根據(jù)本發(fā)明用來提供遺傳指示子。優(yōu)選地，本發(fā)明的等位基因的形式為PTHrP基因的數(shù)目可變的串聯(lián)重復(fù)(VNTR)區(qū)域。
術(shù)語“診斷”是指根據(jù)或至少部分根據(jù)疾病的遺傳指示，鑒定哺乳動物的疾病狀態(tài)或鑒定疾病發(fā)生的誘因或易感性。
術(shù)語“骨骼疾病狀態(tài)”是指在患病個體疾病的嚴重程度。
術(shù)語“個體”是指哺乳動物。優(yōu)選地，哺乳動物是小鼠。更優(yōu)選地，哺乳動物是人。
根據(jù)本發(fā)明的一個技術(shù)方案，本發(fā)明提供了一種診斷個體的骨骼疾病和/或疾病誘因的方法，該方法包括(a)從所述的個體中獲得生物樣品，該樣品適合用來檢測所述個體的甲狀旁腺素相關(guān)肽(PTHrP)的基因；(b)在所述個體的PTHrP基因中篩選出骨骼疾病的一個或多個遺傳指示子；(c)根據(jù)步驟(b)中的結(jié)果診斷所述個體的骨骼疾病和/或骨骼疾病的誘因。本發(fā)明的生物樣品優(yōu)選包括所述個體的DNA，籍此樣品能適于用來擴增和/或檢測包含于其中的DNA。
本發(fā)明的一個或多個遺傳指示子包括所述PTHrP基因內(nèi)的一個區(qū)域。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式，本發(fā)明的一個或多個遺傳指示子可包含所述PTHrP基因內(nèi)的數(shù)目可變的串聯(lián)重復(fù)(VNTR)區(qū)域。此外，本發(fā)明的一個或多個遺傳指示子可包含所述PTHrP基因內(nèi)的數(shù)目可變的串聯(lián)重復(fù)(VNTR)區(qū)域，該區(qū)域根據(jù)等位基因的長度而被確定。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實施方式，遺傳指示子是具有預(yù)先確定長度的PTHrP基因的數(shù)目可變的串聯(lián)重復(fù)(VNTR)區(qū)域的片段，其中遺傳指示子與骨骼疾病狀態(tài)和/或?qū)趋兰膊〉囊赘行韵嚓P(guān)。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式，骨骼疾病優(yōu)選是骨質(zhì)疏松癥。
對本發(fā)明PTHrP基因中感興趣的區(qū)域優(yōu)選為VNTR區(qū)域。更優(yōu)選，該區(qū)域在核苷酸序列中包含數(shù)目可變的串聯(lián)重復(fù)片段。此外，根據(jù)本發(fā)明的實施方式，遺傳指示子優(yōu)選為VNTR區(qū)域內(nèi)的PTHrP基因片段，長度為252-460個堿基對。
根據(jù)本發(fā)明進一步優(yōu)選的實施方式，遺傳指示子包括PTHrP基因在VNTR區(qū)域內(nèi)的片段，堿基對的長度為252bp，288bp，332bp，356bp，378bp，393bp，414bp或460bp。本發(fā)明的基因指示子還可以包含PTHrP基因內(nèi)的至少一個9-mer核苷酸序列的核苷酸重復(fù)片段。更優(yōu)選地，本發(fā)明的9-mer核苷酸序列可進一步指代數(shù)目可變的串聯(lián)重復(fù)片段(VNTR)，該重復(fù)片段選自GTATATATA和ATATATATA。
根據(jù)本發(fā)明的一個技術(shù)方案，該方案提供了一種診斷個體對骨骼疾病的易感性的方法，所述的個體具有PTHrP基因，該方法包括(a)獲得生物樣品，該樣品適合用來從所述個體中篩選出骨骼疾病的一個或多個遺傳指示子；(b)從生物樣品中篩選出所述個體PTHrP基因中對骨骼疾病具有易感性的一個或多個遺傳指示子；和(c)根據(jù)步驟(b)中的結(jié)果診斷所述個體對骨骼疾病的易感性；其中，當檢測到對骨骼疾病具有易感性的一個或多個遺傳指示子時，所述的個體就被診斷為有患骨骼疾病的風險。
根據(jù)本發(fā)明的另一個技術(shù)方案，本發(fā)明對患有骨骼疾病或?qū)趋兰膊【哂幸赘行缘幕颊咛峁┝艘环N治療方法，所述的個體具有PTHrP基因，該方法包括(a)鑒定所述患者PTHrP基因在數(shù)目可變的串聯(lián)重復(fù)(VNTR)區(qū)域內(nèi)檢測到的變化，(b)采用與所述患者的基因型譜相對應(yīng)的療法選擇性地治療患者；其中，根據(jù)所述基因的VNTR區(qū)域內(nèi)所檢測到的變化來鑒定基因型譜。
根據(jù)本發(fā)明進一步的技術(shù)方案，還提供了一個分離的核酸，它的核苷酸序列包含一個或多個重復(fù)的GTATATATA或ATATATATA，其中所述的核苷酸序列具有和PTHrP基因區(qū)域互補的片段。本發(fā)明分離的核酸可用作骨骼疾病遺傳指示子的探針?；蛘?，本發(fā)明分離到的核酸還可用作與針對骨骼疾病而提供的治療和預(yù)防方法有關(guān)的治療劑。
根據(jù)本發(fā)明的另一個技術(shù)方案，本發(fā)明提供了用來診斷個體的骨骼疾病和/或個體患骨骼疾病風險的商用試劑盒，該試劑盒包括(a)試劑，用來在所述個體的PTHrP基因中檢測骨骼疾病和/或?qū)趋兰膊∮幸赘行缘闹辽僖粋€遺傳指示子；(b)說明書，用來確定所述的至少一個遺傳指示子并聯(lián)系骨骼疾病的診斷和/或預(yù)測。
在實施方式中，本發(fā)明的骨骼疾病是一種代謝作用的骨骼疾病。更優(yōu)選的，本發(fā)明的骨骼疾病包括，但不限于骨質(zhì)疏松癥、骨軟化病、骨硬化癥、佩吉特氏病和腎性骨質(zhì)營養(yǎng)不良。
在實施方式中，本發(fā)明遺傳指示子的確定包括采用本領(lǐng)域公知的方法，例如PCR方法擴增PTHrP基因的VNTR區(qū)域。
本發(fā)明進一步包括使用遺傳指示子來(a)診斷個體的骨骼疾病；(b)確定個體是否有患骨骼疾病的誘因；或(c)同時進行(a)和(b)兩種用途。
本發(fā)明進一步提供了治療具有PTHrP基因的個體的方法，包括從個體中篩選出骨骼疾病的遺傳指示子；根據(jù)對PTHrP基因中一個或多個遺傳指示子的鑒定，來確定個體的基因型譜；以及，如果個體的基因型譜表明具有患骨骼疾病的風險，則對個體的骨骼疾病進行選擇性治療。本發(fā)明的實施方式中，對個體的選擇性治療包括開發(fā)對個體進行的基因型特異性治療方法，以適合個體的基因型譜。本發(fā)明的基因型譜優(yōu)選是PTHrP特異性的基因型譜。
根據(jù)本發(fā)明的另一個技術(shù)方案，提供了一種轉(zhuǎn)基因的非人哺乳動物純合子，該純合子在造骨細胞中缺失了PTHrP基因，但在非造骨細胞中沒有缺失PTHrP基因。優(yōu)選地，本發(fā)明轉(zhuǎn)基因的非人哺乳動物適合用來研究骨骼疾病的發(fā)展、治療和預(yù)防。該轉(zhuǎn)基因的非人哺乳動物可進一步用于篩選對骨骼疾病有治療和預(yù)防作用的化合物和/或制劑上。
根據(jù)本發(fā)明的另一個技術(shù)方案，還提供了一個單鏈核酸，它的核苷酸序列包含一個或多個重復(fù)的GTATATATA或ATATATATA，其中所述的核苷酸序列具有和PTHrP基因區(qū)域互補的片段。
根據(jù)本發(fā)明的另一個技術(shù)方案，還提供了一個至少包含GTATATATA或ATATATATA的單鏈寡核苷酸，用來鑒定能調(diào)節(jié)PTHrP表達的候選化合物。
根據(jù)本發(fā)明的另一個技術(shù)方案，還提供了一個包含兩個或兩個以上GTATATATA或ATATATATA序列的重復(fù)片段的單鏈寡核苷酸，用來鑒定能調(diào)節(jié)PTHrP表達的候選化合物。
根據(jù)本發(fā)明的另一個技術(shù)方案，還提供了一個包含SEQ ID NO1或其互補序列的單鏈寡核苷酸，用來鑒定能調(diào)節(jié)PTHrP表達的候選化合物。
根據(jù)本發(fā)明的另一個技術(shù)方案，還提供了一個分離的核酸，該核酸包含在嚴格條件下能與雜交探針雜交的序列，該雜交探針的核苷酸序列由SEQ IDNO1或其互補序列構(gòu)成。
在實施方式中，非人哺乳動物的體細胞包括造骨細胞特異性的PTHrP破壞機制，例如下面將要提到的Cre-LoxP技術(shù)，它能在造骨細胞中特異性地損壞PTHrP基因或部分該基因，而不損壞非造骨細胞中的PTHrP基因。在實施方式中，這種機制包括(a)處于造骨細胞特異性啟動子(例如，類型1的膠原質(zhì)啟動子)控制下的Cre重組酶基因；和(b)在PTHrP基因和其部分(例如外顯子4)側(cè)翼的loxP位點(PTHrP flox/flox)(He等.Endocrinology)。
進一步，本發(fā)明包括一個轉(zhuǎn)基因的非人哺乳動物，遺傳工程技術(shù)使之在造骨細胞中缺失了PTHrP，但沒有在非造骨細胞中缺失PTHrP基因，因而該動物成為了雜合子。通過這種方式得到的動物與本發(fā)明公開的純合體造骨細胞特異的基因敲除小鼠相似。本發(fā)明涉及的雜合體造骨細胞特異的基因敲除小鼠也為骨骼疾病的發(fā)展、治療和預(yù)防提供了一個有用的研究模型。尤其是，雜合體造骨細胞特異的基因敲除小鼠更適于篩選對骨骼疾病的治療和/或預(yù)防有效的化合物和/或試劑。例如，在雜合體造骨細胞特異的小鼠模型中，造骨細胞特異的化合物由于它們調(diào)節(jié)PTHrP基因表達的能力而被篩選出來。
將本說明書中引用的所有文獻都列于此以作參考，就好像是專門和分別列出了每一個出版物、專利申請或授權(quán)的專利的全部內(nèi)容以作參考一樣。


下面結(jié)合附圖進行的詳述使本發(fā)明的進一步的特征和優(yōu)點變得明顯。附圖中，圖1對正常(左邊樣品)和雜合的PTHrP(+/-)小鼠(右邊樣品)進行微CT分析的結(jié)果，表明在突變的動物上骨小梁的下降程度。
圖2在正常和雜合的PTHrP(+/-)小鼠中所測得的骨體積對總體積的比值(BV/TV)。B.V.骨體積；Tb.N，骨小梁的數(shù)目；Tb.Th.，骨小梁的厚度。
圖3在野生型和雜合PTHrP(+/-)小鼠中，對描述骨的3-D結(jié)構(gòu)的特征小梁間隔(Tb.Sp.)、各向異性程度(DA)、總體積(TV)和結(jié)構(gòu)模型指數(shù)(SMI)的分析結(jié)果。
圖4通過鈣黃綠素染色和隨后的四環(huán)素染色(14天后)，分析野生型和雜合的PTHrP(+/-)小鼠的骨。兩條線之間的距離(圖形C和D)可用來計算骨生成的速率，在突變小鼠中該距離明顯消失。
圖5對分化為造骨細胞的分析。抽取野生型(左)和雜合PTHrP(+/-)(右)動物的骨髓，培養(yǎng)并誘導分化成造骨細胞(成骨細胞)，接著用能與鈣化的基質(zhì)結(jié)合的茜素紅染色。
圖6根據(jù)本發(fā)明的實施方式中造骨細胞的PTHrP特異性失活的小鼠的制備過程圖示。
圖7分析對照小鼠(PTHrPflox/floxPTHrP++)以及在造骨細胞中缺失了PTHrP的突變小鼠(PTHrP flo/flox/ostColl-)的骨骼。
圖8通過染色凋亡細胞的核而分析對照小鼠(左圖)以及在造骨細胞中缺失了PTHrP的突變小鼠(右圖)的造骨細胞。
圖9來自不同種的PTHrP基因的結(jié)構(gòu)。
圖10PTHrPVNTR區(qū)域的252bp等位基因。與用于PCR擴增的寡核苷酸引物相對應(yīng)的區(qū)域已被劃線。串聯(lián)重復(fù)片段(G/A TATATATA)見黑體表示。
圖11PTHrP等位基因在一般人群中廣泛存在。圖中顯示，19個患骨質(zhì)疏松癥的雄性待測受試者中有16個(即，84％的受試者)具有252bp的等位基因。
優(yōu)選實施方式的詳細表述骨質(zhì)疏松癥和其它骨骼疾病是一種在老齡人群中具有高發(fā)病率和死亡率的常見疾病。對個體患骨骼疾病如骨質(zhì)疏松癥的可能風險進行早期預(yù)測的簡單測試在目前是非常需要的，并且可根據(jù)本發(fā)明的實施方式而有效提供。如下面進一步討論的，本發(fā)明表明，PTHrP基因的數(shù)目可變的串聯(lián)重復(fù)(VNTR)區(qū)域的長度用作骨骼疾病的新指示子。此外，本發(fā)明進行了一項研究，在四組具有正常骨礦物密度(BMD)和低骨礦物密度的患者中，檢測骨礦物密度方面PTHrP基因的VNTR區(qū)域長度的可預(yù)測值，這四組患者為(1)骨質(zhì)疏松癥的男性患者，(2)患骨質(zhì)疏松癥的絕經(jīng)前婦女，這兩組患者骨質(zhì)疏松癥的病因都在于遺傳，(3)健康男性，(4)沒有骨質(zhì)疏松癥跡象的健康的絕經(jīng)前婦女?，F(xiàn)有的假說是，PTHrP基因的VNTR區(qū)域的各種等位基因在骨骼的微環(huán)境內(nèi)引起PTHrP蛋白的各種表達。尤其是，如下文中進一步討論的，PTHrP蛋白表達的下降會引起骨骼形成的下降，因而導致如前所述的骨礦物密度的降低。本發(fā)明通過對遺傳指示子的鑒定來確定患骨骼疾病的個體基因型譜，從而在此基礎(chǔ)上給出適于個體基因型的基因型特異性的治療方案。
間歇性地在體內(nèi)施用甲狀旁腺素相關(guān)肽(PTHrP)對骨骼形成具有合成代謝的作用(Stewart等.J.Bone Miner Res151517，2000)。PTHrP的合成代謝作用在分子和細胞水平的確切基礎(chǔ)目前還不清楚，試圖采用PTHrP敲除的小鼠來研究該機理，但由于在本發(fā)明之前這些小鼠在圍產(chǎn)期的死亡而使得這一努力白費。為了克服上述困難，在此使用了一個新系統(tǒng)，它能在造骨細胞中使PTHrP選擇性失活。尤其是，使用Cre-介導的重組在小鼠造骨細胞中選擇性破壞PTHrP表達。
根據(jù)本發(fā)明，已通過幾種方式證實了這一點，包括傳統(tǒng)的組織形態(tài)測定、骨密度測定(在患者中使用DEXA)以及更先進的技術(shù)，包括對骨進行特定的計算機化微X線斷層顯像(mCT)。文中所述的研究中所使用的轉(zhuǎn)基因小鼠在造骨細胞中選擇性除去PTHrP基因，但是在其它細胞中沒有除去該基因。這些小鼠表現(xiàn)出早熟，以及嚴重的骨質(zhì)疏松癥。根據(jù)本發(fā)明可以推斷出，在骨微環(huán)境尤其是造骨細胞中，PTHrP的表達水平對防止骨質(zhì)疏松癥非常關(guān)鍵。此外，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物進一步為研究骨骼疾病提供了一個新系統(tǒng)，該骨骼疾病與實際的人疾病狀態(tài)的表型非常一致。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物還能作為研究候選的治療方案效果，例如，化合物和/或試劑在治療、預(yù)防和緩解骨骼疾病進程上的效果的新模型。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實施方式，提供了一種用來評價和/研究候選療法的系統(tǒng)，該療法能在哺乳細胞中調(diào)節(jié)PTHrP的表達。在本發(fā)明中，造骨細胞缺失了PTHrP基因的造骨細胞特異性的PTHrP敲除小鼠可以是純合體或雜合體。
在此，對患有骨骼疾病的人PTHrP的研究顯示了人PTHrP基因的特異性區(qū)域(在此稱為數(shù)目可變的串聯(lián)重復(fù)(VNTR)區(qū)域)在調(diào)節(jié)PTHrP的表達方面有作用。根據(jù)本發(fā)明，PTHrP基因的VNTR區(qū)域被鑒定為骨骼疾病的一個新的標記物。尤其是，本發(fā)明骨骼疾病和/或?qū)趋兰膊【哂幸赘行缘倪z傳指示子可包含PTHrP基因或其部分基因的VNTR區(qū)域。
當提到存在VNTRs時，在本研究之前，并沒有任何與該序列相關(guān)的作用和功能研究。在普通人群中，該區(qū)域在個體中的長度變化范圍為252到460個核苷酸。本發(fā)明觀察到，具有更長VNTR區(qū)域的等位基因比具有更短VNTR區(qū)域的等位基因能更有效表達PTHrP。因此VNTR區(qū)域可作為PTHrP基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)區(qū)域，原因可能是轉(zhuǎn)錄因子和其它蛋白能結(jié)合到該區(qū)域。
本發(fā)明的一個實施方式提供了一個新的寡核苷酸。根據(jù)一個優(yōu)選的實施方式，本發(fā)明的寡核苷酸是一個造骨細胞特異的寡核苷酸。優(yōu)選地，本發(fā)明的寡核苷酸包括至少一個在此申請中公開的9-mer的核苷酸序列。更優(yōu)選，本發(fā)明的寡核苷酸包括本申請公開的至少兩個9-mer核苷酸序列的重復(fù)片段。本發(fā)明的寡核苷酸能用在鑒定新的治療靶點。本發(fā)明的寡核苷酸可通過本領(lǐng)域公知的技術(shù)獲得。此外，根據(jù)本發(fā)明的實施方式，以及根據(jù)本領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)雜交的公知方法，例如下文所采用的例子，從而可使本發(fā)明的寡核苷酸被用作雜交探針。
在分析一些被診斷為由于遺傳缺陷而患有骨質(zhì)疏松癥的男性受試者的過程中，根據(jù)本發(fā)明鑒定到19個患者中有16個具有高風險的等位基因，即，在PTHrP基因中包含一個更短的含VNTR的區(qū)域，且在骨骼的微環(huán)境下可能使PTHrP表達下降，這與造骨細胞中的低水平PTHrP和發(fā)展為早熟以及嚴重的骨質(zhì)疏松癥的傾向有關(guān)這一動物發(fā)現(xiàn)相一致。因而，根據(jù)本發(fā)明，骨骼疾病和/或具有骨骼疾病誘因的遺傳指示子可以是一個PTHrP基因的一個等位基因，該PTHrP基因所包含的一個VNTR區(qū)域比一般人群中的更短。更優(yōu)選地，本發(fā)明的實施方式鑒定了VNTR的長度與骨骼疾病的誘因或骨骼疾病的嚴重性之間的比例關(guān)系。例如，所研究個體的PTHrP基因中的VNTR區(qū)域越長，個體患骨骼疾病的可能性則越??；而VNTR區(qū)域越短，個體患骨骼疾病的可能性則越大?；蛘撸景l(fā)明的實施方式還提供了一種對個體骨骼疾病的嚴重性進行診斷的方法，當患有骨骼疾病或骨骼疾病癥狀的個體在PTHrP基因的VNTR區(qū)域具有更短的等位基因時，則該個體與具有更長等位基因的個體相比，被診斷為患有更嚴重的骨骼疾病。進一步，可根據(jù)本發(fā)明的基因型特征，選擇性地治療個體的骨骼疾病或骨骼疾病的誘因。
表征PTHrP基因的等位基因而鑒定個體具有患骨骼疾病危險的遺傳檢測，尤其是鑒定患骨質(zhì)疏松癥誘因的遺傳檢測均沒有在本發(fā)明之前的研究中被提到。
特別是，本發(fā)明中記載了PTHrP基因的特定等位基因，也被稱為遺傳指示子，與骨骼疾病的關(guān)聯(lián)性。根據(jù)本發(fā)明，PTHrP基因的等位基因被鑒定為骨骼疾病的遺傳指示子和/或具有骨骼疾病誘因的遺傳指示子。本發(fā)明的等位基因部分是根據(jù)PTHrP基因染色體區(qū)域(本文中稱為含VNTR的區(qū)域)的大小來定義的，并且進一步是根據(jù)該區(qū)域所包含的VNTRs的數(shù)目來定義的。高危險的等位基因，是代謝性骨骼疾病具有更高危險性的指示，它是包含更少數(shù)目VNTR的更短的一種含VNTR的區(qū)域。在實施方式中，骨骼疾病更優(yōu)選是一種代謝性骨骼疾病。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實施方式，代謝性骨骼疾病可選自骨質(zhì)疏松癥、骨軟化病、骨胳硬化癥、佩吉特氏病和腎性骨質(zhì)營養(yǎng)不良。
每個VNTR序列可包含RTATATATA上文說明每個VNTR的第一個位置可以是G或A，也就是，VNTR可以包含GTATATATA或ATATATATA。
相應(yīng)地，本發(fā)明提供了一種包含一個或多個上述核苷序列重復(fù)的核苷酸序列和/或寡核苷酸。本發(fā)明分離的核苷酸序列和/或寡核苷酸可被用作骨骼疾病遺傳指示子的檢側(cè)試劑，例如雜交探針。此外，本發(fā)明的這些技術(shù)方案可以用作鑒定化合物的探針，這些化合物對骨骼疾病或其誘因具有治療或預(yù)防潛能。或者，本發(fā)明的核酸序列和/或寡核苷酸可被施用在體內(nèi)，作為骨骼疾病的優(yōu)選治療和/或預(yù)防治療方案或治療組分。本發(fā)明核酸序列和/或寡核苷酸可采用本領(lǐng)域公知的方法來制備或分離到，例如這些方法記載在Sambrook等.(1989，Molecular Cloning-A Laboratory Manual，Cold SpringHarbour Laboratories)；Ausubel等.(1994，Current Protocols in MolecularBiology，Wiley，New York)；以及Glick等.(1994 MolecularBiotechnology-Principles and Applications ofRecombinant DNA，ASM，Washington，D.C.)中。當用作雜交探針時，本發(fā)明的核酸序列和/或寡核苷酸優(yōu)選在本領(lǐng)域公知的或下文示例的嚴格雜交條件下與核酸雜交。
本發(fā)明鑒定了PTHrP基因VNTR區(qū)域的等位基因與PTHrP表達水平之間的相關(guān)性。例如，本發(fā)明顯示，在PTHrP基因中的等位基因包含更長的含VNTR區(qū)域時，PTHrP的表達水平較高。此外，在PTHrP基因VNTR區(qū)域的重復(fù)數(shù)目增加與PTHrP的高水平表達相關(guān)，并因此達到更好的骨形成。相應(yīng)地，本發(fā)明的一個技術(shù)方案提供了一種鑒定與PTHrP低水平表達相關(guān)的遺傳指示子(即，高危險的等位基因)的基因分型檢測，以便能給出指示說明具有遺傳指示子的個體存在患骨骼疾病的危險。另外，本發(fā)明提供了一種鑒定與PTHrP高水平表達相關(guān)的遺傳指示子(即，低危險性的等位基因)的檢測方法，以便能給出指示說明具有該遺傳指示子的個體患骨骼疾病的危險性很低。例如，根據(jù)本發(fā)明，PTHrP基因中含VNTR區(qū)域的252bp的等位基因與骨骼疾病正相關(guān)。
根據(jù)本發(fā)明的一個技術(shù)方案，遺傳指示子是根據(jù)長度來表征的，在遺傳組合物包含該指示子的個體中確定疾病或非疾病狀態(tài)時，長度具有基因型基礎(chǔ)。
根據(jù)本發(fā)明的實施方式，疾病的嚴重程度可以根據(jù)本發(fā)明遺傳指示子來確定。
本發(fā)明可用于對被鑒定為具有患骨骼疾病危險的個體進行診斷和/或治療。例如，這些個體會表現(xiàn)出骨骼疾病或相關(guān)病癥的一種或多種癥狀，或具有一個或多個與骨骼疾病或相關(guān)病癥關(guān)聯(lián)的危險因子。根據(jù)流行病學標準，例如性別、年齡、社會經(jīng)濟因素或家族史來鑒定個體患骨骼疾病的危險，在此基礎(chǔ)上可以得出評價，即，所研究的個體比其它人群更易患骨骼疾病。內(nèi)科醫(yī)生診斷骨骼疾病一般是根據(jù)總的癥狀表現(xiàn)、病史、家族史、藥物治療、體格檢查、成像方法(骨礦物密度的測定)和確定骨骼的完整性的各種血液和尿樣測試。
本發(fā)明的技術(shù)方案通過為其中預(yù)先確定的遺傳指示子而評價PTHrP基因(受試者中存在的PTHrP等位基因的性質(zhì))，從而提供了診斷和預(yù)測代謝性骨骼疾病的方法。在鑒定本發(fā)明的遺傳指示子時，與骨骼疾病有關(guān)的個體基因型譜能得到表征。本發(fā)明的受試者優(yōu)選是哺乳動物，更優(yōu)選是人。本發(fā)明的受試者可以是具有患代謝性骨骼疾病危險的受試者。
在實施方式中，遺傳指示子是根據(jù)存在于PTHrP基因的等位基因中的含VNTR區(qū)域的PTHrP的性質(zhì)而被表征的。
相應(yīng)地，本發(fā)明提供了一種診斷或預(yù)測骨骼疾病的方法，該方法包括a)從所述個體中獲得一個生物樣品，所述的樣品適合用于檢測患者的甲狀旁腺素相關(guān)肽(PTHrP)基因；b)在所述個體的PTHrP基因中篩選出針對骨骼疾病的一個或多個遺傳指示子；和c)根據(jù)步驟b)的結(jié)果診斷所述個體患骨骼疾病的危險性。因而，根據(jù)本發(fā)明鑒定到的遺傳指示子的特征能診斷骨骼疾病或說明患者具有骨骼疾病的誘因。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的實施方式，本發(fā)明的遺傳指示子是根據(jù)長度來確定的。更優(yōu)選地，本發(fā)明的遺傳指示子包含PTHrP基因中的含VNTR區(qū)域。根據(jù)本發(fā)明的實施方式，PTHrP基因中的含VNTR區(qū)域的突變體在本文中也被稱為等位基因或等位基因突變體。在一個實施方式中，遺傳指示子出現(xiàn)在PTHrP基因內(nèi)含子的數(shù)目可變的串聯(lián)重復(fù)(VNTR)區(qū)域中。在一個實施方式中，內(nèi)含子位于PTHrP基因的外顯子VI和VII之間。在本發(fā)明的一個實施方式中，遺傳指示子的表征是基于PTHrP基因的等位基因中VNTR的數(shù)目(例如，9-mer的核苷酸序列的3個重復(fù))。在本發(fā)明的另一個實施方式中，遺傳指示子的表征是基于鑒定包含PTHrP基因的數(shù)目可變的串聯(lián)重復(fù)(VNTR)區(qū)域的等位基因，該等位基因選自252bp，288bp，332bp，356bp，378bp，393bp，414bp和460bp長度的等位基因?？梢圆捎酶鞣N本領(lǐng)域公知的方法鑒定PTHrP基因(或其上的遺傳指示子)。例如，包含VNTR區(qū)域的等位基因可以通過PCR擴增該區(qū)域得到PCR產(chǎn)物，然后檢查所獲得的PCR產(chǎn)物的長度而得以鑒定?？刹捎煤线m的寡核苷酸引物來進行擴增，例如圖10所示的引物，其購自SHELDON BIOTECH，Montreal，PQ。
等位基因的鑒定可以通過例如直接對PTHrP基因或其區(qū)域，如含VNTR的區(qū)域進行測序。另一種鑒定PTHrP的方法可以是限制性片段長度多態(tài)性分析(RFLP)，例如，PCR擴增包含PTHrP基因或其區(qū)域如含VNTR區(qū)域的核苷酸序列，得到PCR產(chǎn)物，用限制性酶消化PCR產(chǎn)物得到限制性消化產(chǎn)物；例如通過凝膠電泳來檢測得到的限制性消化產(chǎn)物的長度。其它的方法可以在優(yōu)化的雜交條件下使用等位基因特異性探針的雜交，因而能檢測到等位基因的差異。還可使用微陣列方法，如美國專利5,858,659(Sapolsky et al.；January12，1999)或6,223,127(Berno；April 24，2001)中所述的方法。
在實施方式中，從受試者的生物樣品，例如從受試者的組織或體液中鑒定PTHrP等位基因。合適的組織或體液包括但不限于血液、血漿、淋巴細胞、上皮細胞、造骨細胞、骨髓基質(zhì)細胞和成纖維細胞。本發(fā)明的生物樣品包括DNA。優(yōu)選地，可以從本發(fā)明生物樣品中檢測出和/或擴增個體的DNA。采用本領(lǐng)域公知的方法進行DNA擴增和檢測，在并入本文作為參考的文獻中列舉了其中的一些方法。
在實施方式中，在鑒定樣品中的PTHrP基因之前，先從樣品中純化包含了PTHrP基因或部分該基因的核酸。在實施方式中，在確定PTHrP等位基因是否存在之前，先擴增純化得到的核酸。在實施方式中，用引物擴增純化得到的核酸，該引物能擴增PTHrP基因或該基因片段。在某些實施方式中，通過采用能與含VNTR區(qū)域的兩端(即，5’端和3’端)序列雜交的引物，例如圖10所示的引物的PCR方法進行擴增。
本發(fā)明進一步涉及使用上述的PTHrP基因的等位基因來診斷和/或預(yù)測骨骼疾病。根據(jù)優(yōu)選的實施方式，本發(fā)明提供了一個雜交探針，該探針的序列與PTHrP基因的等位基因的至少一個9-mer核苷酸序列同源。
本發(fā)明進一步提供了實施上述診斷和/或預(yù)測骨骼疾病的方法的商用包裝或試劑盒，該商業(yè)包裝或試劑盒包含合適的上述試劑(例如引物或探針)，以及說明書，以說明采用此類商業(yè)包裝以診斷和/或預(yù)測對骨骼疾病的易感性的方法。
因此，本發(fā)明進一步提供了一種商用包裝或試劑盒來診斷和/或預(yù)測骨骼疾病。本發(fā)明的商業(yè)包裝或試劑盒包含試劑，該試劑用來檢測受試者PTHrP基因中骨骼疾病的遺傳指示子；還包括說明書，用來確定所述的遺傳指示子是骨骼疾病和/或骨骼疾病易感性的陽性或陰性指示子。更優(yōu)選地，本發(fā)明的包裝或試劑盒還包含將預(yù)定的遺傳指示子與疾病嚴重性程度和/或易感性程度相關(guān)聯(lián)的定量關(guān)聯(lián)信息。
在一個技術(shù)方案中，本發(fā)明提供了一種治療患有骨骼疾病或骨骼疾病易感性的病人的方法，該病人具有PTHrP基因，該方法包括(a)根據(jù)在所述基因的數(shù)目可變的串聯(lián)重復(fù)(VNTR)區(qū)域中測到的變化來表征患者的PTHrP基因；(b)根據(jù)所述基因的VNTR區(qū)域中測得的變化，采用個體特異性的治療方案治療患者。
PTHrP基因的變化可以是外顯子VI和VII之間的內(nèi)含子處VNTR區(qū)域的長度。因而，該變化可以作用本發(fā)明合適的遺傳指示子。本發(fā)明的高危險性等位基因(或遺傳指示子)的存在可以例如被用作骨骼疾病易感性或誘因的指示子，或更嚴重的骨骼疾病的指示子。更優(yōu)選地，本發(fā)明提供了一種根據(jù)個體的基因型選擇性治療骨骼疾病和/或疾病誘因的方法。也就是，本發(fā)明提供了針對骨骼疾病的基因型特異性的治療或預(yù)防方案。在實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的遺傳指示子來表征個體的基因型，并在此基礎(chǔ)上設(shè)計出相應(yīng)的治療或預(yù)防方案。例如，根據(jù)本發(fā)明的實施方式，具有PTHrP基因的252bp等位基因的個體所接受的治療與具有PTHrP基因的460bp等位基因的個體所接受的治療是不同的。
可以根據(jù)本發(fā)明的各種技術(shù)方案治療病人的骨骼疾病。例如，對病人骨骼疾病的治療包括采用有效量的化合物或藥物向病人給藥。有效量的藥物可以是治療有效量或預(yù)防有效量。“治療有效量”指在一定劑量和一定時間內(nèi)能達到所需的治療效果，例如減輕骨骼疾病的跡象和癥狀，和/或使骨骼結(jié)構(gòu)損傷延遲出現(xiàn)的有效量。治療有效量會根據(jù)各種因素例如疾病狀態(tài)、年齡、性別和個體的體重，以及治療能在個體中引起所需反應(yīng)的能力而變化。劑量方案可作調(diào)整以便產(chǎn)生最優(yōu)的治療反應(yīng)。治療有效量也是使治療有益效果遠遠超過治療毒害效果的用量?！邦A(yù)防有效量”是指在一定用量和一定時間內(nèi)能達到所需的預(yù)防效果，例如減輕骨骼疾病的跡象和癥狀，以及使骨骼結(jié)構(gòu)損傷延遲出現(xiàn)的有效量。預(yù)防有效量可以在疾病出現(xiàn)前或疾病的早期階段在受試者上施用，預(yù)防有效量可能在某些情況下比治療有效量多或少。
治療骨骼疾病的藥物例如包括FDA批準的治療各種程度骨骼疾病的藥物，例如能減輕患者骨骼疾病的跡象和癥狀，以及使骨骼結(jié)構(gòu)損傷延遲出現(xiàn)。這些藥物包括如雌激素、阿侖膦酸鹽(alendronate)，利塞膦酸鹽(residronate)，降鈣素和甲狀旁腺素。
本發(fā)明一個技術(shù)方案使用了PTHrP核酸進行基因治療。可以通過治療上可接受的基因治療載體傳遞PTHrP核酸，來修飾患者的PTHrP等位基因譜。例如，基因治療可以用低危險的PTHrP等位基因來替代高危險的PTHrP等位基因，或促進PTHrP蛋白的表達。
基因治療載體可以是例如腺相關(guān)病毒載體(AAV)。這種載體例如包括5’反向末端重復(fù)區(qū)(ITR)；啟動子，如具有造骨細胞特異性增強子的CMV增強子-啟動子；內(nèi)含子；3’非編碼區(qū)(3’-UTR)；多聚腺苷酸信號，如SV40多聚腺苷酸信號；和3’-ITR。對于基因治療的載體，給藥的劑量很大程度上依賴于被治療的受試者的病情和個體大小，以及治療的配方、治療的頻率和給藥途徑。根據(jù)用藥的初始反應(yīng)和臨床判斷來指導連續(xù)治療方案，包括劑量、配方和頻率。優(yōu)選的非腸道給藥采用注射給藥至組織空隙間，但是在一些特定的給藥條件下也需要其它非腸道給藥途徑，如吸入氣霧劑。在一些方法中，采用合適的用量將水性載體中包含基因和基因傳遞系統(tǒng)的配方注射到組織中。組織目標可以是特異性的，例如肌肉或肝臟組織，或幾種組織的聯(lián)合，例如肌肉和肝臟組織。代表性的組織目標可包括肝臟、骨骼肌、心肌、脂肪沉積物、腎、肺、血管內(nèi)皮、表皮和/或造血細胞和骨細胞。本發(fā)明的核酸可傳遞到體內(nèi)的細胞中，采用例如直接的DNA注射方法，受體介導的DNA攝入，病毒介導的轉(zhuǎn)染或非病毒轉(zhuǎn)染和基于脂質(zhì)體的轉(zhuǎn)染方法，所有的這些方法都涉及到使用基因治療載體。直接注射用來將裸DNA引入體內(nèi)細胞中(參見如Acsadi等.(1991)Nature 332815-818；Wolff et al.(1990)Science 2471465-1468)。將DNA注射至體內(nèi)細胞中可能需要使用傳遞工具(例如“基因槍”)。這種工具是可以商業(yè)購得的(如BioRad的15)。裸DNA還可與陽離子例如賴氨酸形成配位復(fù)合物而導入細胞中，該復(fù)合物與細胞表面受體的配體相偶聯(lián)(參見例如Wu，G.和Wu，C.H.(1988)J.Biol.Chem.26314621；Wilson等.(1992)J.Biol.Chem.267963-967；以及U.S.Pat.No.5,166,320)。DNA-配體復(fù)合物與受體的結(jié)合能通過受體介導的內(nèi)吞作用來促進DNA的攝入。與腺病毒殼體結(jié)合的DNA-配體復(fù)合物能用來阻止復(fù)合物被細胞內(nèi)溶酶體降解，這是由于腺病毒殼體能破壞內(nèi)涵體從而將物質(zhì)釋放到細胞質(zhì)中(參見如Curiel等.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 888850；Cristiano etal.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 902122-2126)。缺陷型逆轉(zhuǎn)錄病毒能用作基因治療的載體(為查閱起鑒，請參見Miller，A.D.(1990)Blood 76271)。在Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel，F(xiàn).M.等.(eds.)GreenePublishing Associates，(1989)，Sections 9.10-9.14和其它標準實驗手冊中，可以找到制備重組逆轉(zhuǎn)錄病毒和用這些病毒在體外或體內(nèi)感染細胞的30種方法。合適的逆轉(zhuǎn)錄病毒的例子包括pLJ、pZIP、pWE和pEM，它們都是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的。合適的包裝病毒系的例子包括.psi.Crip、.psi.Cre、.psi.2和.psi.Am。逆轉(zhuǎn)錄病毒已被用來將多種基因?qū)朐S多不同類型的體內(nèi)和/或體外細胞中，包括上皮細胞、內(nèi)皮細胞、淋巴細胞、成肌細胞、肝細胞、骨髓細胞(參見例如Eglitis等，(1985)Science 2301395-1398；Danos和Mulligan(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 856460-6464；Wilson等.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 853014-3018；Armentano等.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8761416145；Huber等.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8880398043；Ferry等.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8883778381；Chowdhury等.(1991)Science 2541802-1805；van Beusechem等.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 897640-7644；Kay等.(1992)Human Gene Therapy 3641-647；Dai等.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8910892-10895；Hwu等.(1993)J.Immunol.1504104-4115；U.S.Pat.No.4,868,116；U.S.Pat.No.4,980,286；PCT申請WO 89/07136；PCT申請WO 89/02468；PCT申請WO89/05345；以及PCT申請WO 92/07573)。
當用作基因治療的載體時，可對腺病毒的基因組進行操作使它包含PTHrP核酸，但是該病毒喪失了在一個正常的漸退的病毒生命周期中復(fù)制的能力。參見，Berkner等.(1988)BioTechniques 6616；Rosenfeld等.(1991)Science 252431-434；以及Rosenfeld等.(1992)Cell 68143-155。合適的腺病毒載體來源于本領(lǐng)域公知的腺病毒株Ad型5 dl324或其它腺病毒株(例如，Ad2，Ad3，Ad7等)，它們是本領(lǐng)域公知的。重組腺病毒非常有優(yōu)勢，因為它們無需分裂細胞而成為有效的基因傳遞載體，并能感染多種細胞類型，包括導管上皮細胞(Rosenfeld等.(1992)cited supra)，內(nèi)皮細胞(Lemarchand等.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 896482-6486)，肝細胞(Herz和Gerard(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9028122816)和肌細胞(Quantin等.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 892581-2584)。
腺相關(guān)病毒(AAV)可以在基因治療上作為傳遞DNA的基因治療載體。AAV是一種天然產(chǎn)生的缺陷病毒，它需要其它病毒例如腺病毒或皰疹病毒為有效的復(fù)制和生命周期作為協(xié)助病毒(Muzyczka等.Curr.Topics in Micro.and Immunol.(1992)15897-129)。AAV可以用來將DNA整合至不分裂的細胞中(參見如Flotte等.(1992)Am.J.Respir.Cell.Mol.Biol.7349-356；Samulski等.(1989)J.Virol.633822-3828；以及McLaughlin等.(1989)J.Virol.6219631973)。例如在Tratschin等.(1985)Mol.Cell.Biol.53251-3260中記載的AAV載體可用來將DNA引入到細胞里(參見例如Hermonat等.(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 816466-6470；Tratschin等.(1985)Mol.Cell.Biol.42072-2081；Wondisford等.(1988)Mol.Endocrinol.232-39；Tratschin等.(1984)J.Virol.51611619；以及Flotte等.(1993)J.Biol.Chem.2683781-3790)。Lentiviral基因治療載體也可適用于本發(fā)明。
基因治療的一般方法是本領(lǐng)域公知的，例如可參見Anderson等的U.S.Pat.No.5,399,346。在Baetge等人的PCT公開文獻95/05452中記載了一種生物相容性膠囊傳遞的遺傳材料。將基因轉(zhuǎn)移到造血細胞中的方法也已有報道，可以參見Clapp，D.W.等.，Blood 781132-1139(1991)；Anderson，Science288627-9(2000)；和Cavazzana-Calvo et al.，288669-72(2000)。
本發(fā)明進一步涉及轉(zhuǎn)基因的非人哺乳動物，用于研究骨骼疾病及其機制。更優(yōu)選地，本發(fā)明的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物可以造骨細胞特異性方式來研究PTHrP的作用，非人哺乳動物在造骨細胞中特異性地具有破壞的/失活的PTHrP基因(或部分該基因)。對于破壞的PTHrP基因，本發(fā)明的非人轉(zhuǎn)基因哺乳動物的造骨細胞可以是純合體或雜合體。此外，本發(fā)明的非人哺乳動物可用來篩選對調(diào)節(jié)PTHrP的表達和/或治療、預(yù)防或延緩骨骼疾病病變?yōu)橛行У幕衔锖?或藥劑。當采用能增加PTHrP表達的化合物對需要骨骼形成或修復(fù)的病人進行治療時，造骨細胞產(chǎn)生PTHrP的作用將被刺激，從而導致骨骼形成和修復(fù)。因此，根據(jù)本發(fā)明實施方式鑒定到的能調(diào)節(jié)PTHrP表達的化合物可用于治療骨骼疾病、骨斷裂、骨損傷、骨骼發(fā)育不全和其它需要產(chǎn)生PTHrP的病癥。
在實施方式中，非人哺乳動物的體細胞包括PTHrP基因破壞機制，例如使特定地在造骨細胞中的PTHrP基因、部分該基因或與該基因?qū)嵸|(zhì)相同的核酸序列被去除/被剪切或失活?！疤囟ǖ卦谠旃羌毎小痹诖耸侵冈谠旃羌毎腥コ蚴Щ?，而在非造骨細胞中基本不去除或失活。在實施方式中，哺乳動物是嚙齒動物，優(yōu)選是小鼠。
在實施方式中，上面提到的PTHrP基因破壞機制包括(a)Cre重組酶基因造骨細胞特異的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域，例如啟動子；和(b)在PTHrP基因或其部分基因側(cè)翼的loxP位點。在一個實施方式中，造骨細胞特異性的啟動子是類型1的膠原蛋白啟動子。
在下述的實施例中，這些動物能用于研究骨骼組織中許多PTHrP依賴性的表型，并且具有上文所述的應(yīng)用。例如，這些動物能用于研究骨骼疾病、骨形成、骨斷裂、骨損傷和骨骼疾病治療方法的發(fā)現(xiàn)和開發(fā)。尤其是，本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物尤其能用來篩選可能的治療化合物和/或藥劑，該化合物和/或藥劑能有效用來治療、預(yù)防和改善骨骼疾病和/或骨骼的病情。本發(fā)明的轉(zhuǎn)基因非人哺乳動物在這一點上是很有優(yōu)勢的，因為它提供了一種能用于長時間研究的活的動物，并且還提供了一種造骨細胞中純合的空白PTHrP-/-對照，用來研究與PTHrP功能有關(guān)的骨骼發(fā)育和疾病。例如，PTHrPflox/flox/ostCre小鼠用實驗制劑或單獨用載體處理一到兩個月，然后處死，用多種技術(shù)檢查小鼠的骨骼，這些技術(shù)包括BMD、組織學、組織形態(tài)測量學和免疫組織化學等。與用載體處理的動物相比，實驗動物骨密度和骨微結(jié)構(gòu)的增加是非常重要的。
盡管在此公開了本發(fā)明的多種實施方式，但是根據(jù)本領(lǐng)域公知的方法所作的改變修飾也屬于本發(fā)明的范圍。這些修飾包括，為了達到相同的結(jié)果而采用實質(zhì)上相同的方法做的等同替換。數(shù)值范圍包括范圍內(nèi)的數(shù)字。在權(quán)利要求中，所用的“包含”是開放式寫法，等同于“包含，但不限于”。
下面的實施例用來闡述本發(fā)明的各種實施方式，但不是用來限制本發(fā)明公開的較寬的技術(shù)方案。
實施例實施例1對PTHrP(+/-)雜合小鼠的分析在PTHrP(+/-)動物中評價骨損失的程度，將骨骼從這些動物中取出并用微CT分析。用一個分辨率為18μm3的μCT 20系統(tǒng)(Scanco USA，Inc.Wayne，PA)對骨骼進行掃描。從每個樣品中獲得一系列的圖像。采用10個感興趣的手選體積進行三維分析，來計算骨小梁形態(tài)特征參數(shù)。圖1是從正常小鼠(左邊樣品)和雜合體小鼠(右邊樣品)中所選的具有代表性的圖，再次顯示了突變小鼠中骨小梁含量發(fā)生下降。
圖2為按照上述分析的測定骨骼體積(BV/TV)，顯示在突變動物中體積下降了50％，而骨小梁的數(shù)目(Tb.N)和厚度(Tb.Th.)沒有改變。
圖3顯示，骨小梁之間的空隙顯著增加了，而其它的參數(shù)例如DA(各項異性程度)和SMI(結(jié)構(gòu)模型指數(shù))、描述骨骼3-D結(jié)構(gòu)的特征都表明在突變小鼠中存在骨質(zhì)疏松變化。
為了確定骨骼數(shù)量下降的原因，在處死前4天，分別給小鼠腹膜內(nèi)注射鈣黃綠素(20mg/kg動物體重)和土霉素(30mg/kg動物體重)。取出每個動物的股骨和脛骨，在甲基丙烯酸甲基酯(該化合物能整合到新沉積的骨中，發(fā)出綠色熒光)中進行非脫鈣處理，14天后給同樣的動物注射四環(huán)素(發(fā)出橙紅色光)。如圖4所示，兩條線(圖形C和D)之間的距離可以用來計算骨形成的速率，在突變小鼠中該速率明顯減少。
為了確定圖5所示的PTHrP(+/-)小鼠的骨骼形成減少的原因，從正常(左)和突變(右)的動物中抽出骨髓，并培養(yǎng)，分化成造骨細胞(骨形成細胞)。用1ml的MEM介質(zhì)從兩端沖洗骨髓，制得了細胞培養(yǎng)物。收集粘連細胞，并以104個細胞/35mm培養(yǎng)皿的密度鋪在包含胎牛血清、抗生素(100ug/ml的pen G、50ug/ml的慶大霉素、和0.3ug/ml的兩性霉素B)、50ug/ml的抗壞血酸、10-9M地塞米松和10mM Na-R-甘油磷酸酯的MEM介質(zhì)上，促進礦物化的骨節(jié)形成。每2-3天更換介質(zhì)，共培養(yǎng)20天。最后，將細胞固定并用堿性磷酸酶染色。使用解剖顯微鏡對集落進行定量?？梢钥吹?，突變小鼠的骨髓不能像正常小鼠一樣輕易分化成造骨細胞。因此，造骨細胞的分化受損。
實施例2使小鼠的造骨細胞中的PTHrP選擇性失活在雜合體PTHrP(+/-)小鼠中，PTHrP基因從體內(nèi)的每個細胞包括造骨細胞，hondrocytes，和軟骨形成細胞中被去除。由于骨是由軟骨形成的，因此有可能觀察到異常的軟骨形成，而不是骨骼形成的受損。
為了排除這種可能性，使用Cre-LoxP系統(tǒng)來得到僅僅在造骨細胞中缺失PTHrP的小鼠(如圖6所示)，該系統(tǒng)需要兩只小鼠一只在PTHrP基因側(cè)翼連有LoxP序列，第二只在造骨細胞特異性的啟動子(類型1的膠原蛋白)下表達Cre重組酶的轉(zhuǎn)基因小鼠(He等.(2001)Endocrinology 142(5)2070-7)。交配時，PTHrP基因僅僅從造骨細胞中被去除。所有的其它細胞都是正常的。尤其是，攜帶有處于類型1的膠原蛋白啟動子(Col I)控制下的位點特異性重組酶基因(Cre)的小鼠與PTHrP floxed小鼠(PTHrPflox/flox)交配，該PTHrPflox/flox小鼠的兩個PTHrP等位基因的外顯子4的側(cè)面都連接有l(wèi)oxP位點，交配后產(chǎn)生了造骨細胞中缺乏PTHrP表達的小鼠(PTHrpflox/flox；crecolI)。
如圖7所示，上面的骨小梁圖中顯示了造骨細胞發(fā)育早熟。小梁處的圖(黑色)襯出功能性造骨細胞。相比之下，突變細胞(右下)沒有顯示出大量的健康造骨細胞。因此，造骨細胞中PTHrP的缺失導致造骨細胞功能下降和骨形成的減少。
如圖8所示，在野生型樣品的骨中，缺失PTHrP的造骨細胞并不十分明顯，因為它們由于凋亡而死亡了(左圖)。如右圖所示，在造骨細胞缺失PTHrP的突變動物中(2個月大)，采用特異性試驗對造骨細胞的凋亡細胞核的染色是非常明顯的，(中心區(qū)，右圖)，但在野生型樣品中并不明顯(左圖)。
這些發(fā)現(xiàn)表明PTHrP對于正常造骨細胞的發(fā)育是關(guān)鍵的，因為它的缺失導致造骨細胞生成的減少以及早期的凋亡。最后的結(jié)果是骨形成的減少和骨質(zhì)疏松的過早產(chǎn)生。
與同窩出生的野生型PTHrPflox/flox對照小鼠相比，進一步確定了6星期的PTHrPflox/flox；cresolI小鼠的血清鈣、PTH和1，25二羥維生素D3水平和甲狀旁腺尺寸是正常的。另一方面，用PIXImus比重計測量，發(fā)現(xiàn)與野生型小鼠相比，6星期的PTHrPflox/flox；cresolI小鼠的股骨和脛骨的骨密度下降了6.33％和6.00％。骨小梁的體積也受到了影響，與同窩出生的野生小鼠相比，在新生的PTHrPflox/flox；cresolI小鼠的股骨和脛骨中分別下降了33.33％和35.50％，在6周的PTHrPflox/flox；cresolI小鼠中下降了33.90％和47.00％。組織形態(tài)學分析顯示，與野生型小鼠相比，6周齡的PTHrPflox/flox；cresolI小鼠中的造骨細胞數(shù)目和表面、骨樣厚度、骨小梁厚度都大大減少了。
與野生型對應(yīng)物小鼠相比，在6周齡P-/floxcresolI小鼠股骨的干骨后端測量類型1的膠原蛋白、骨鈣素(osteocalcin)，和骨橋蛋白(osteopontin)染色的陽性區(qū)域而確定的免疫組化進一步證實這一點。與6周齡的野生型小鼠相比，雙重鈣黃綠素標記的組織形態(tài)學證實骨形成速度也下降了。此外，與野生型小鼠相比，6周齡P-/flox，cresolI小鼠中造骨細胞的數(shù)目和表面也顯著減少了。因此這些結(jié)果顯示，PTHrP至少部分通過自分泌方式表現(xiàn)出合成代謝作用，并能調(diào)節(jié)或刺激造骨細胞形成和新生。
根據(jù)本發(fā)明，上述的方法適合用來產(chǎn)生雜合的造骨細胞特異性PTHrP破壞的小鼠。
實施例3比較骨質(zhì)疏松癥和健康受試者之間的PTHrP基因序列人PTHrP基因的結(jié)構(gòu)尤其參見圖9，并進一步被Yasuda T.等.inJ BiolChem.1989 May 5；264(13)7720-5)所公開。箭頭所指的DNA區(qū)域包含VNTR，即數(shù)目可變的串聯(lián)重復(fù)片段，該重復(fù)片段已在上文記載，但是沒有提到任何它的功能(Pausova Z.等.Genomics.1993 17(1)243-4)。
如圖10所示，采用針對劃線區(qū)域的寡核苷酸引物，可以從基因組DNA中PCR擴增到含VNTR的序列。根據(jù)個體DNA中含有的這些重復(fù)片段的數(shù)目，串聯(lián)重復(fù)片段的數(shù)目(G/ATATATATA)n可產(chǎn)生各種長度的擴增DNA。
如圖11所示，在普通人群中存在各種VNTRs，長度在252bp至460bp之間。清楚的是，雖然還公開了一些更短的重復(fù)片段，但最常見的是252bp至378bp的VNTRs。
然后檢測了19個骨質(zhì)疏松癥男性患者受試者的PTHrP VNTR區(qū)域。這些患者診斷為患有先天的骨質(zhì)疏松癥，即，很可能由于遺傳原因?qū)е碌墓琴|(zhì)疏松癥。如圖11所示，在病人樣本中，16/19(84％)具有252bp等位基因，比普通人群中出現(xiàn)的頻率(32％)高得多，這說明在特定的個體中，短的VNTRs在確定具有患骨質(zhì)疏松癥更高危險性上非常重要。
材料和方法研究設(shè)計本研究選擇具有骨質(zhì)疏松癥臨床表現(xiàn)并且發(fā)現(xiàn)有低或正常骨質(zhì)量密度的病人，還與病人簽訂了研究同意書。根據(jù)呈現(xiàn)的陽性家族病史并排除了第二種病因后，診斷出了由于遺傳原因?qū)е碌墓琴|(zhì)疏松癥。記錄腰脊柱(L2-4)，股骨頸部和股骨轉(zhuǎn)子T-(與年輕成人相比的BMD)和Z-(與年齡匹配的對照相比的BMD)數(shù)值。并且還需獲得基準特征，例如年齡、身高、體重、鈣攝入和25(OH)維生素D水平。從每個病人上收集血液樣品(10cc)。從血液細胞中分離DNA，通過PCR檢測PTHrP VNTR。然后用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測擴增的DNA片段的長度。
根據(jù)法律的規(guī)定為病人保密。如果病人有要求，他們可以在研究的任何時候退出。病人參加該研究是無成本無報酬的。
排除標準具有骨骼疾病病史的病人或正在進行影響骨骼更新的藥物治療的病人將從本研究中被排除。已經(jīng)在進行骨質(zhì)疏松治療的病人不被允許加入本研究。
病人的風險與本研究有關(guān)的風險是極小的。這些風險與抽血有關(guān)，包括疼痛、淤傷或偶爾的昏暈。
病人的益處病人將得到對骨質(zhì)疏松癥的檢查，并且病人也會得到適當?shù)碾S訪以及對他們BMD的下降進行治療。
相關(guān)性PTHrP VNTR遺傳標記物可以作為診斷工具，用來評價個體患骨質(zhì)疏松癥和骨質(zhì)疏松的骨折的危險性。我們已知，BMD T-數(shù)值為-2.5，它被廣泛用作骨質(zhì)疏松癥的治療閾值，該數(shù)值在實際患有骨折的群體中僅鑒定到很小比例的個體。骨脆弱或骨損失的遺傳標記物可用在BMD測定之前和BMD測定之時協(xié)助對具有骨折危險性的個體進行早期預(yù)防治療。
統(tǒng)計分析對BMD上的VNTR長度的預(yù)測值進行了一個探索性研究。記錄每個病人的VNTR長度。同樣，BMD的2個標記物，即腰脊柱和股骨頸骨將受到記錄。
統(tǒng)計學的目的在于說明，VNTR長度和BMD的兩個預(yù)測因子變量之間具有統(tǒng)計學顯著性關(guān)系。結(jié)果測定為反應(yīng)Y＝VNTR長度，連續(xù)測定值預(yù)測因子X1＝腰脊柱，X2＝股骨頸部，X3＝股骨轉(zhuǎn)子，三個都是連續(xù)變量。
這種關(guān)系會受到原始特征的控制，例如年齡、身高、體重、鈣攝入和25(OH)維生素D水平。性別將是另一個對照變量，但是具有一定范圍的骨質(zhì)疏松水平。
總共有80人參加了該研究兩組男性，每組20人他們是正常的和患骨質(zhì)疏松癥的；兩組絕經(jīng)期前的女性，每組20人她們是正常的和患骨質(zhì)疏松癥的。
下面進行協(xié)方差分析Y＝X1+X2+X3+年齡+身高+體重+鈣+維生素+性別+骨質(zhì)疏松水平(性別)將所有不重要的基準特征從分析中去除，接著根據(jù)縮減的模型得到結(jié)論。按照SAS版本8.12進行所有的分析。X1、X2和X3的回歸系數(shù)的統(tǒng)計顯著性可表示可能的預(yù)測值，這將在進一步的研究中得到確認。
實施例4開發(fā)造骨細胞特異的寡核苷酸我們最近發(fā)現(xiàn)，包含VNTR的GTATATATA序列的下述寡核苷酸(SEQ IDNO.1)5′-TATATACGTATATATATATACGTATATATATACGTA-3′當與細胞核提取物孵育時會被核蛋白結(jié)合。尤其是，當我們將VNTR寡核苷酸與COS細胞核提取物(非骨來源的細胞系)孵育時，沒有產(chǎn)生與任何核蛋白的特異性結(jié)合。但是，當我們將VNTR寡核苷酸與ROS細胞核提取物(骨來源的細胞系)孵育時，與許多核蛋白都有特異性結(jié)合。
這些蛋白的確切性質(zhì)還有待于確定。但是，該特定區(qū)域?qū)THrP的表達非常關(guān)鍵，并且，與寡核苷酸序列(SEQ ID NO.1)結(jié)合的蛋白會促使骨骼疾病的新的治療方法和診斷標記物的發(fā)現(xiàn)。
本發(fā)明還包括一種核酸，在適度嚴格或優(yōu)選在嚴格條件下，該核酸與所有或部分SEQ ID NO.1的寡核苷酸序列、或其互補序列雜交。嚴格的條件是與序列有關(guān)的，并且在不同的情況下是不同的。長序列雜交尤其需要在更高的溫度下進行。關(guān)于核酸雜交的廣泛指南可參見Tijssen，Techniques inBiochemistry and Molecular Biology--Hybridization with NucleicProbes，″Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays″(1993)(Elsevier Science，Inc.，New York)。一般地，所選的嚴格條件比確定的離子強度和pH下特定序列的熱解鏈溫度(Tm)要低5-10℃。Tm是指在特定的離子強度和pH下，50％的目標序列與完全匹配的探針結(jié)合時的溫度。通常，嚴格條件是鹽濃度小于大約1.0M鈉離子，優(yōu)選為0.01-1.0M鈉離子濃度(或其它鹽)，pH7.0-8.3，并且對于短探針(例如10-50個核苷酸)需要溫度至少為大約30℃，對于長探針(例如，大于50個核苷酸)需要至少大約60℃。嚴格條件還可通過加入去穩(wěn)定劑如甲酰胺來實現(xiàn)。對于選擇性的或特異性的雜交，陽性信號是背景的至少兩倍，優(yōu)選是背景雜交的10倍。示意性的嚴格雜交條件可以是如下50％甲酰胺，5×SSC，1％SDS，在42℃下孵育，或者5×SSC，1％SDS，在65℃下孵育，接著用0.2×SSC和0.1％SDS在65℃下洗滌。根據(jù)本發(fā)明的目的，合適的“適度嚴格條件”包括，例如在5×SSC、0.5％SDS和1.0mM EDTA(pH 8.0)的溶液中預(yù)沖洗，在50℃-65℃的5×SSC中雜交過夜，接著在65℃用0.5×和0.2×SSC(含0.1％SDS)沖洗兩次，共20分鐘。這種雜交DNA序列也屬于本發(fā)明保護的范圍。
本發(fā)明的實施方式僅僅是用于示意性的。本發(fā)明要求保護的范圍是由所附的權(quán)利要求書所確定。
序列表<110>麥吉爾大學<120>根據(jù)PTHrP預(yù)測和診斷骨骼疾病<130>9-16408-1PCT<150>60/384,122<151>2002-05-31<160>1<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>36<212>DNA<213>人工序列<223>對人工序列的描述寡核苷酸<400>1tatatacgta tatatatata cgtatatata tacgta 3權(quán)利要求
1.診斷個體的骨骼疾病的方法，該方法包括a)從所述的個體中獲得生物樣品，該樣品適合用來檢測所述個體的甲狀旁腺素相關(guān)肽(PTHrP)的基因；b)在所述個體的PTHrP基因中篩選出骨骼疾病的一個或多個遺傳指示子；c)根據(jù)步驟(b)中的結(jié)果診斷所述個體的骨骼疾病。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述篩選出一個或多個遺傳指示子的步驟包括篩選出所述PTHrP基因內(nèi)數(shù)目可變的串聯(lián)重復(fù)(VNTR)區(qū)域。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，進一步包括根據(jù)長度確定所述PTHrP基因內(nèi)的數(shù)目可變的串聯(lián)重復(fù)(VNTR)區(qū)域；其中所述VNTR區(qū)域的長度與診斷骨骼疾病或骨骼疾病的誘因有關(guān)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述VNTR區(qū)域的長度為252bp到460bp。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述的VNTR區(qū)域包括數(shù)目可變的串聯(lián)重復(fù)片段。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中所述VNTR區(qū)域的長度為252bp，288bp，332bp，356bp，378bp，393bp，414bp或460bp。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中PTHrP基因中數(shù)目可變的串聯(lián)重復(fù)片段(VNTR)包含九個核苷酸重復(fù)片段；其中所述的九個核苷酸的重復(fù)片段選自GTATATATA和ATATATATA。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中確定數(shù)目可變的串聯(lián)重復(fù)(VNTR)區(qū)域進一步包括測定PTHrP基因內(nèi)具有數(shù)目可變的九個核苷酸重復(fù)片段的等位基因，其中所述的九個核苷酸重復(fù)片段選自GTATATATA和ATATATATA。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的骨骼疾病選自骨質(zhì)疏松癥、骨軟化病、骨質(zhì)減少、骨胳硬化癥、佩吉特氏病和腎性骨質(zhì)營養(yǎng)不良。
10.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中確定數(shù)目可變的串聯(lián)重復(fù)(VNTR)區(qū)域包括擴增VNTR區(qū)域。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中所述的篩選步驟包括特異性針對所述的一個或多個所需的遺傳指示子的探針。
12.PTHrP基因的等位基因作為骨骼疾病和/或骨骼疾病的誘因指示子的應(yīng)用。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的應(yīng)用，其中所述的等位基因選自含PTHrP基因VNTR區(qū)域的等位基因。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的應(yīng)用，其中所述的PTHrP基因中的VNTR區(qū)域包含數(shù)目可變的九個核苷酸重復(fù)片段，其中所述的九個核苷酸重復(fù)片段選自GTATATATA和ATATATATA。
15.根據(jù)權(quán)利要求12所述的應(yīng)用，其中所述的等位基因選自252bp，288bp，332bp，356bp，378bp，393bp，414bp和460bp的等位基因。
16.一種診斷個體對骨骼疾病易感性的方法，所述個體具有PTHrP基因，該方法包括從所述的個體中獲得生物樣品，該樣品適合用來篩選出骨骼疾病的一個或多個遺傳指示子；篩選所述生物樣品，從所述個體的PTHrP基因中得到骨骼疾病的一個或多個遺傳指示子；根據(jù)步驟(b)中的結(jié)果診斷所述個體的骨骼疾??；其中當檢測到骨骼疾病的一個或多個遺傳指示子時，則所述個體被診斷為對骨骼疾病具有易感性。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中，根據(jù)所檢測到的一個或多個遺傳指示子的特征來確定個體對骨骼疾病的易感性程度。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中，所述的一個或多個遺傳指示子包含PTHrP基因內(nèi)含子中數(shù)目可變的串聯(lián)重復(fù)(VNTR)區(qū)域。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中，所述的一個或多個遺傳指示子的特征包含根據(jù)長度確定所述PTHrP基因中的VNTR區(qū)域；其中所述VNTR區(qū)域的長度與個體對骨骼疾病的易感性程度相關(guān)。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中，所述VNTR區(qū)域的長度為252bp到460bp。
21.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中，所述的VNTR區(qū)域包括數(shù)目可變的串聯(lián)重復(fù)片段。
22.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中所述VNTR區(qū)域的長度為252bp，288bp，332bp，356bp，378bp，393bp，414bp或460bp。
23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的方法，其中所述的PTHrP基因中數(shù)目可變的串聯(lián)重復(fù)片段(VNTR)包含九個核苷酸重復(fù)片段；其中所述的九個核苷酸重復(fù)片段選自GTATATATA和ATATATATA。
24.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中確定數(shù)目可變的串聯(lián)重復(fù)(VNTR)區(qū)域進一步包括測定PTHrP基因內(nèi)具有數(shù)目可變的九個核苷酸重復(fù)片段的等位基因，其中所述的九個核苷酸重復(fù)片段選自GTATATATA和ATATATATA。
25.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中確定數(shù)目可變的串聯(lián)重復(fù)(VNTR)區(qū)域包括擴增VNTR區(qū)域。
26.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述的篩選步驟包括特異性針對所述的一個或多個所需的遺傳指示子的探針。
27.對患有骨骼疾病或具有骨骼疾病易感性的病人進行治療的方法，所述病人具有PTHrP基因，該方法包括鑒定所述患者PTHrP基因中數(shù)目可變的串聯(lián)重復(fù)(VNTR)區(qū)域內(nèi)檢測到的變化；根據(jù)所述基因的VNTR區(qū)域中所檢測到的變化，采用治療方案對病人進行選擇性治療。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述的治療方案是一種基因型特異性的治療方案。
29.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述的治療方案隨時間而改變。
30.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述的治療方案包括調(diào)節(jié)PTHrP基因的表達來影響造骨細胞的活性。
31.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述的治療方案包括增強PTHrP基因的VNTR區(qū)域。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的方法，其中增強所述PTHrP基因的VNTR區(qū)域包括在體內(nèi)將一個或多個拷貝的數(shù)目可變的串聯(lián)重復(fù)片段(VNTR)傳遞至所述的基因。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的方法，其中所述的數(shù)目可變的串聯(lián)重復(fù)片段包含九個核苷酸重復(fù)片段；其中所述的九個核苷酸重復(fù)片段選自GTATATATA和ATATATATA。
34.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述的VNTR區(qū)域位于PTHrP基因的內(nèi)含子中。
35.用來診斷和/或預(yù)測個體患骨骼疾病的商用試劑盒，該試劑盒包括試劑，用來在所述個體的PTHrP基因中檢測骨骼疾病和/或?qū)趋兰膊〉囊赘行缘闹辽僖粋€遺傳指示子；說明書，用來確定所述的至少一個遺傳指示子并由此與骨骼疾病的診斷和/或預(yù)測相聯(lián)系。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中用來檢測至少一個遺傳指示子的所述試劑包括檢測PTHrP基因的數(shù)目可變的串聯(lián)重復(fù)(VNTR)區(qū)域內(nèi)所發(fā)生變化的試劑。
37.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，進一步包括用來確定所述至少一個遺傳指示子長度的試劑。
38.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，進一步包括用來擴增PTHrP基因的VNTR區(qū)域的試劑。
39.根據(jù)權(quán)利要求35所述的方法，其中用于檢測的試劑包括特異性針對PTHrP基因VNTR區(qū)域的探針。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的方法，其中所述的探針是特異性針對九個核苷酸重復(fù)片段的探針，其中所述的九個核苷酸重復(fù)片段選自GTATATATA和ATATATATA。
41.轉(zhuǎn)基因的純合體非人哺乳動物，其中PTHrP基因在造骨細胞中受損，但在其它非造骨細胞中未受損。
42.根據(jù)權(quán)利要求41所述的非人哺乳動物，其中所述哺乳動物的體細胞包含能夠特異性地在造骨細胞中破壞PTHrP基因，而不在非造骨細胞中破壞PTHrP基因的PTHrP基因破壞機制。
43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的非人哺乳動物，其中造骨細胞特異性的PTHrP破壞機制包括處于造骨細胞特異性的啟動子控制下的Cre重組酶基因；和與PTHrP基因或該基因的一部分的側(cè)面連接的loxP位點。
44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的非人哺乳動物，其中所述的造骨細胞特異性啟動子是類型1的膠原蛋白啟動子。
45.根據(jù)權(quán)利要求43所述的非人哺乳動物，其中所述PTHrP基因的一部分是PTHrP基因的外顯子4。
46.根據(jù)權(quán)利要求41所述的非人哺乳動物，其中所述的哺乳動物是小鼠。
47.權(quán)利要求41所述的非人哺乳動物在研究骨骼發(fā)育和骨骼疾病上的用途。
48.權(quán)利要求41所述的非人哺乳動物在篩選化合物和/或制劑上的應(yīng)用，該化合物或制劑對骨骼疾病具有治療和/或預(yù)防作用，和/或能夠減緩骨骼疾病的發(fā)展。
49.單鏈核酸，具有包含一個或多個GTATATATA或ATATATATA重復(fù)片段的核苷酸序列，其中，所述的核苷酸序列能與PTHrP基因區(qū)域互補。
50.權(quán)利要求49所述的單鏈核酸用作骨骼疾病和/或骨骼疾病誘因的指示子。
51.根據(jù)權(quán)利要求50所述的單鏈核酸，其中所述的核苷酸序列的長度為252，288，332，356，378，393，414或460個核苷酸。
52.至少包含GTATATATA或ATATATATA的單鏈寡核苷酸在鑒定能調(diào)節(jié)PTHrP表達的候選化合物中的應(yīng)用。
53.包含兩個或兩個以上GTATATATA或ATATATATA重復(fù)片段的單鏈寡核苷酸在鑒定能調(diào)節(jié)PTHrP表達的候選化合物中的應(yīng)用。
54.包含SEQ ID No1或其互補序列的單鏈寡核苷酸在鑒定能調(diào)節(jié)PTHrP表達的候選化合物中的應(yīng)用。
55.權(quán)利要求54所述的寡核苷酸在鑒定能在體內(nèi)調(diào)節(jié)PTHrP表達的蛋白質(zhì)中的應(yīng)用。
56.分離的核酸，包含在嚴格條件下能與雜交探針雜交的序列，所述雜交探針的核苷酸序列由SEQ ID NO1或其互補序列構(gòu)成。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種診斷個體的骨骼疾病和/或?qū)趋兰膊〉囊赘行缘姆椒?。該方法包括從所述的個體中獲得生物樣品，篩選生物樣品以在所述個體的PTHrP基因中得到骨骼疾病的一個或多個遺傳指示子，根據(jù)檢測到的遺傳指示子的特性來診斷個體的疾病。本發(fā)明的遺傳指示子優(yōu)選包括PTHrP基因的遺傳片段。更優(yōu)選地，PTHrP基因的遺傳片段包括含VNTR的區(qū)域。本發(fā)明進一步提供了一種轉(zhuǎn)基因的非人哺乳動物用作骨骼疾病和/或病癥的研究，該哺乳動物的PTHrP基因或尤其是造骨細胞中的PTHrP基因的部分被破壞或失活。
文檔編號G01N33/15GK1671866SQ03818116
公開日2005年9月21日 申請日期2003年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2002年5月31日
發(fā)明者安德魯·卡拉普利斯, 大衛(wèi)·多爾特茲曼 申請人:麥吉爾大學