專利名稱：彎曲菌的聚糖和糖肽的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及如下領(lǐng)域，即具有生物活性的糖蛋白和糖蛋白的聚糖部分，和用于對抗彎曲菌屬細(xì)菌的疫苗、抗體和抗體片段。
背景技術(shù)：
彎曲菌是一種重要的食物傳染病原菌，存在于包括家禽在內(nèi)的禽畜產(chǎn)品中。因此，需要提供對抗該病原菌在人體內(nèi)的有害效應(yīng)的策略。從禽畜體內(nèi)消除這些病原菌可以作為一種減少人群感染率以及減少受感染的飼養(yǎng)動物發(fā)病的方法。糖基化的蛋白，特別是這些化合物的某些聚糖部分代表了免疫策略的可行靶，所述免疫策略是用于減少或消除這些生物體在禽畜中的存在，這樣做是為了減少人們在食用或處理動物產(chǎn)品時受污染的危險，也能減少人們因源自禽畜肥料的細(xì)菌的糞便釋放而受污染的危險。糖蛋白及其片段如聚糖部分也可提供針對彎曲菌感染的疫苗和抗體制劑的基礎(chǔ)。
提供對研究蛋白質(zhì)糖基化具有普適性的研究工具也是合乎需要的。蛋白質(zhì)的糖基化曾經(jīng)被認(rèn)為是真核生物特有的現(xiàn)象，但是，現(xiàn)在已經(jīng)清楚，在古細(xì)菌域和真細(xì)菌域，該現(xiàn)象都是普遍存在的(1、2)。已經(jīng)在多種原核生物中鑒定出了N-型和O-型糖苷鍵，其中在古細(xì)菌中，很明顯是N-連接的糖占優(yōu)勢，而在真細(xì)菌中，迄今為止所鑒定的糖蛋白中O-型連接單元占優(yōu)勢(1、2)。此外，與真核糖蛋白中所觀察到的N-和O-連接相比，細(xì)菌中的這兩種連接可與更廣范圍的糖一起形成連接。
本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，某些糖肽和聚糖部分形成了用以對抗彎曲菌屬細(xì)菌中多種菌株的疫苗和抗體的有效基礎(chǔ)，這是由于在多個菌株和種類中，所述糖肽和聚糖部分以不變的(或幾乎不變的)形式廣泛存在于這些細(xì)菌的表面上。這一聚糖還作為彎曲菌的多個表面糖蛋白的一個成分而存在，因而增強(qiáng)了其作為免疫靶的價值。
最近，在腸道病原體空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni)中鑒定出了一個基因座位，其有可能參與了多種蛋白質(zhì)的糖基化。這為革蘭氏陰性細(xì)菌中廣泛存在的蛋白質(zhì)糖基化的途徑提供了第一個證據(jù)(3)。這一座位被稱為pgl(因參與蛋白質(zhì)的糖基化而得名)，這一座位之內(nèi)的基因的突變導(dǎo)致多種蛋白質(zhì)的免疫原性丟失。還顯示這些蛋白質(zhì)的聚糖部分能被來自實(shí)驗(yàn)感染的人類志愿者的抗血清所識別(3)。通過pgl的突變使所述聚糖部分去除，在體外會導(dǎo)致粘附和侵入的降低，在體內(nèi)會導(dǎo)致小鼠建群(mouse colonization)的丟失(4)，這間接表明蛋白質(zhì)的糖基化影響這一生物體的毒力性質(zhì)。
本發(fā)明人鑒定并表征了空腸彎曲菌菌株NCTC(國立典型培養(yǎng)物保藏中心)11168中的蛋白質(zhì)的翻譯后修飾，所述菌株的整個基因組序列已由Parkhill等人進(jìn)行了描述(6)。在這些蛋白質(zhì)中，能在2D凝膠(雙向凝膠)上產(chǎn)生多個斑點(diǎn)的蛋白質(zhì)是PEB3或稱Cj0289c，其為空腸彎曲菌的一種主要的抗原蛋白，由Pei等人最先進(jìn)行了描述(7)。當(dāng)純化之后并用1D SDS-PAGE(單向十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳)進(jìn)行分析時，會發(fā)現(xiàn)兩條分子量相差約1500Da(道爾頓)的帶，這兩條帶的N-末端序列都與真正的PEB3相一致。與我們對PEB3的觀察相一致的是，Linton等人(8)使用GalNAc特異的凝集素即大豆凝集素，從空腸彎曲菌中鑒定出兩個推定的糖蛋白，其中一個是PEB3，另一個是推定的周質(zhì)蛋白Cj1670c，他們將該蛋白命名為CgpA?；谠S多其它推定的糖蛋白與凝集素結(jié)合的能力，作者還觀察到這些其它的推定糖蛋白，但是，沒有鑒定這些蛋白質(zhì)。而且，蛋白質(zhì)與凝集素的結(jié)合也受pgl座位的基因的突變的影響。此外，我們已證明了基因pglB的突變特異地影響已鑒定的糖蛋白的糖基化，該基因pglB與釀酒酵母(Saccharomyces cerevisae)中N-連接的寡糖基轉(zhuǎn)移酶的STT3亞單位具有同源性，這種同源性間接表明了其在糖蛋白的生物合成中的作用(3、9)。
此外，碳水化合物參與所有生命域的各種功能。盡管總的來說，在細(xì)菌菌株和相關(guān)的菌種之間，糖蛋白及它們的抗原性表面聚糖中的聚糖部分存在著高度差異，但并非總是這樣，這些例外提供了供基于抗體或疫苗的策略來清除細(xì)菌之用的合適的優(yōu)秀候選物。特別地，彎曲菌糖蛋白的聚糖部分就是一個這樣的碳水化合物。最近，我們致力于表征這種重要的食物傳染病原體空腸彎曲菌的糖組(glycome)，結(jié)果我們闡明了所有表面聚糖的結(jié)構(gòu)，即脂寡糖(LOS)、莢膜多糖(CPS)、N-連接的聚糖和O-連接的聚糖(5、12-15)。
本發(fā)明人證明，本說明書中描述的七糖至少在幾種彎曲菌菌種中是普遍存在的，也在許多包括作為重要的人病原體和獸病原體的菌種的菌株中普遍存在，而且，所述七糖還是多種糖蛋白的成分，這些糖蛋白包括Cj編號為0114、0200c、0289c、0367c等的糖蛋白。這一聚糖部分還具有強(qiáng)烈的免疫原性，因此，這一聚糖(和相關(guān)的片段以及糖肽)在作為主動免疫用的疫苗用于對抗彎曲菌屬的多種菌株和菌種時是優(yōu)秀的候選物，并且，其也是用作適合以人體內(nèi)的或動物體內(nèi)的彎曲菌為靶的抗體或抗體片段的基礎(chǔ)的優(yōu)選候選物。
這里所使用的“禽畜(livestock)”包括哺乳動物和家禽。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種聚糖，該聚糖可以單獨(dú)存在或與寡肽、氨基酸和/或免疫原性偶聯(lián)物相連。
按照本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供一種包含七糖的化合物，所述七糖具有下式I的結(jié)構(gòu)GalNAc-α1，4-GalNAc-α1，4-[Glc-β1，3]GalNAc-α1，4-GalNAc-α1，4-GalNAc-α1，3-Bac，其中，Bac是2，4-二乙酰氨基-2，4，6-三脫氧-D-吡喃型葡萄糖。式I也包括上述化合物的具有免疫活性的片段?！懊庖呋钚浴笔侵高@些片段可包含用于對抗彎曲菌的疫苗的活性成分，或者是指可以提供能特異地與所述化合物結(jié)合的抗體或抗體片段，并且這些抗體或抗體片段能中和施用了這些抗體或抗體片段的生物體內(nèi)的彎曲菌。這些聚糖可以以分離的形式提供或者以與寡肽或氨基酸相連接的形式提供以形成新的糖肽。氨基酸可以包含天冬酰胺以形成N-連接的糖肽。這些聚糖或糖肽可以從革蘭氏陰性細(xì)菌得到或從其分離和純化而來。這一糖蛋白聚糖部分也可以提供如下文所討論的治療劑和方法的基礎(chǔ)。
按照本發(fā)明的另外一個方面，本發(fā)明提供了檢測細(xì)菌的糖蛋白的聚糖部分的方法，該方法包括對所述樣品進(jìn)行高分辨魔角旋轉(zhuǎn)核磁共振(HR-MAS NMR)波譜分析。該方法可以從該聚糖部分的來源直接檢測聚糖部分而不需要純化蛋白質(zhì)。
按照本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供一種藥物組合物，該藥物組合物包含式I七糖和生理學(xué)上可接受的載體。優(yōu)選所述藥物組合物還可以包含具有免疫原性的偶聯(lián)物，該偶聯(lián)物與所述聚糖或糖肽或其片段和/或免疫刺激劑相連。這樣的藥物組合物可用作免疫人或動物的疫苗，以對抗由彎曲菌屬病原體所引起的疾病。這些疾病例如胃腸感染、格-巴綜合征(GBS)和米勒費(fèi)歇爾(Miller Fisher)綜合征、關(guān)節(jié)炎和菌血癥。所述疫苗可以通過一次或一次以上的注射或通過其它醫(yī)學(xué)上可接受的方法施用。
按照本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了與式I聚糖部分相互作用并特異性結(jié)合的抗體或抗原結(jié)合性抗體片段。當(dāng)將這些抗體或片段施用給動物或人受者時，它們可以中和一種或一種以上的彎曲菌。這些抗體可以通過多種已知的方法得到，其中包括從先前已經(jīng)用上述七糖或糖肽免疫過的動物的血清中分離得到，或者制備專門針對所述化合物的鼠單克隆抗體。另一方式是通過重組DNA(脫氧核糖核酸)技術(shù)，例如通過如下方式得到這些抗體或抗體片段，即克隆一組域抗體(domain antibody，“dAb”)基因庫，該域抗體基因庫是先從駱駝科動物(Camelid)中分離，然后在噬菌體庫中表達(dá)而得到；淘選并在噬菌體中表達(dá)對七糖、糖肽或其片段有親和力的dAb序列。優(yōu)選的駱駝科動物選自雙峰駝(Camelus bactriamus)、單峰駝(Camelus dromaderius)、羊駝(LamapPaccos)、駝羊(Lama ggGlama)和小羊駝(Lama vVicugna)。替換性地，另一方法可以包括篩選單鏈抗體片段(scFv)的噬菌體庫。本發(fā)明還提供一種藥物組合物，該藥物組合物包含上述抗體或其抗原結(jié)合片段，以及生理學(xué)上可接受的載體。這樣的藥物組合物可以用作動物或人的治療劑。
合適的抗體片段包括Fab片段(抗原結(jié)合片段)(盡管需要指出的是，既然駱駝科動物產(chǎn)生不含有輕鏈的獨(dú)特類型的抗體，習(xí)慣術(shù)語如“Fab”可能需要修改)，所述Fab片段包括用上述技術(shù)或用其它常規(guī)技術(shù)單獨(dú)制備，而不是直接從完整的抗體得來的片段。
按照本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了減少禽畜體內(nèi)彎曲菌屬細(xì)菌的存在的方法。所述方法包括給禽畜施用能與式I聚糖部分相互作用和結(jié)合的抗體或抗原結(jié)合性抗體片段。當(dāng)以足夠的量施用所述抗體時，所述抗體能中和來自動物體系的所有的或絕大部分的病原性彎曲菌生物體，或者能防止細(xì)菌的集落形成，從而能防止動物通過以下任一種方式感染人體食用或處理動物產(chǎn)品，或者經(jīng)由動物廢物污染。施用方法可以包括給禽畜、優(yōu)選家禽喂食含有抗體或抗原結(jié)合片段的飼料或水。清除病原體或減少它們在禽畜體內(nèi)的存在構(gòu)成了一種防止病原體接觸人體的方式，這樣就可以預(yù)防人們患上由這些病原體所引起的疾病。因此，本發(fā)明還提供了一種用于防止由彎曲菌屬病原體在人體內(nèi)引起彎曲菌感染的方法，該方法包括通過給禽畜施用上述抗體或其抗原結(jié)合片段，來從禽畜體內(nèi)清除病原體。
抗體或抗體片段可以被添加到動物飼料或水中，或者也可以替代性地以動物飼料植物經(jīng)過遺傳修飾的產(chǎn)物而存在，所述遺傳修飾能使所述植物表達(dá)所述抗體或抗體片段。
另一方面，本發(fā)明提供了治療人體或動物體內(nèi)由彎曲菌屬病原體所引起的疾病的方法，該方法包括給人體施用上述抗體或其抗原結(jié)合片段。上述抗體或其抗原結(jié)合片段可以用于制備藥物以治療動物或人體中由彎曲菌屬病原體引起的疾病。
另一方面，本發(fā)明提供了防止地下水被彎曲菌屬病原體污染的方法，所述彎曲菌屬病原體污染的出現(xiàn)是禽畜的細(xì)菌的糞便釋放以及之后糞便物進(jìn)入水源的結(jié)果。所述方法包括通過給禽畜施用上述抗體或其抗原結(jié)合片段來清除或減少源自禽畜的這種病原體的存在。這也構(gòu)成了一種防止病原體接觸人體的方式，因而，就可以預(yù)防人們患上由這些病原體所引起的疾病。
本發(fā)明的抗體和抗體片段也可以用作診斷工具，以用來檢測人體和動物體內(nèi)彎曲菌的存在，以及檢測采集自環(huán)境例如水的樣品或肥料樣品中彎曲菌的存在。


圖1.PEB3的純化和分析。a)甘氨酸提取物在MonoS柱上的陽離子交換色譜結(jié)果。含有PEB3的級分通過SDS-PAGE條帶的N-末端測序鑒定、按照說明合并、透析和冷凍干燥。b)使用較窄的0-0.2M NaCl梯度用MonoS柱將合并的物質(zhì)進(jìn)行再分級。插圖顯示級分30和31的SDS-PAGE分析結(jié)果，這兩個級分已經(jīng)由SDS-PAGE條帶的N-末端測序鑒定為含有PEB3的級分。
圖2.對來自PEB3的陽離子交換色譜純化的級分進(jìn)行ESI-MS(電噴霧離子化-質(zhì)譜)分析。a)在透析之后，圖1中級分31的ESI-MS結(jié)果，以及從該譜得到的經(jīng)過重建的分子質(zhì)量分布圖。b)在25,454和28,376Da處的峰被分別鑒定為PEB3和PEB4。需要進(jìn)一步分析以鑒定26,861Da處的第三峰為糖基化的PEB3。c)從pglB突變體同樣純化得到的PEB3的ESI-MS結(jié)果和經(jīng)過重建的質(zhì)量分布圖，d)顯示缺少PEB3的糖基化形式。
圖3.PEB3經(jīng)胰蛋白酶消化的糖肽的MS/MS(串聯(lián)質(zhì)譜)分析。a)m/z(質(zhì)荷比)1057.9的雙質(zhì)子化的糖肽離子的產(chǎn)物離子譜。譜中顯示了由于寡糖殘基的序列丟失而產(chǎn)生的碎片離子。插圖顯示了肽的序列。b)m/z 937.4的糖肽碎片離子的第二代產(chǎn)物離子譜。當(dāng)糖肽進(jìn)入質(zhì)譜儀后，其就會因前端碰撞誘導(dǎo)的解離(錐孔電壓＝100伏)被打成碎片。在m/z605.3處觀察到b3+228碎片離子這一結(jié)果證實(shí)了該寡糖是N-連接的。
圖4.SBA(大豆凝集素)的親和色譜產(chǎn)物的2D(雙向)凝膠分析。該蛋白質(zhì)在2D-PAGE(雙向-聚丙烯胺凝膠電泳)上在兩個pH值范圍內(nèi)分離，a)pH4-7和b)pH6-11，然后進(jìn)行銀染色。由Cj編號標(biāo)示這些斑點(diǎn)通過它們的胰蛋白酶消化產(chǎn)物的質(zhì)譜分析來確定它們所代表的物質(zhì)。已鑒定的蛋白質(zhì)的全部清單如表I所示。
圖5.對SBA的親和色譜產(chǎn)物進(jìn)行鏈霉蛋白酶消化，并對來自消化產(chǎn)物的糖肽進(jìn)行純化。a)鏈霉蛋白酶消化產(chǎn)物在200目BioGel P4上的體積排阻色譜。b)從P4得到的合并產(chǎn)物在BioGel P2精細(xì)級上的再分級。在上述兩步分級中，通過質(zhì)譜鑒定含有糖蛋白的級分，并且如短線所示按說明將其合并。c)由上述B得到的級分10的ESI-MS譜。在m/z 770.5處的雙質(zhì)子化的離子(MH22+)對應(yīng)于與天冬酰胺(Asn)相連的七糖。也可以觀察到許多較大的離子，這是由于附加了另一個氨基酸殘基的結(jié)果。譜圖上顯示了主要的含有聚糖的離子的氨基酸組成。
圖6.糖肽的結(jié)構(gòu)和1H譜。a)糖肽的推測結(jié)構(gòu)。b)在用P2柱(D2O，35℃，1mM氘化的EDTA(乙二胺四乙酸))進(jìn)行最終純化之后的譜圖。標(biāo)記了4.4至5.4ppm之間區(qū)域的端基異構(gòu)糖的共振。
圖7.對糖肽進(jìn)行的1D(一維)選擇性NMR(核磁共振)實(shí)驗(yàn)。a)一維TOCSY(全相關(guān)譜)(g1f2，15Hz(赫茲)，144ms(毫秒))，b)一維TOCSY(e1f1，25Hz，144ms)，c)一維TOCSY(d1，20Hz，144ms)，d)一維TOCSY(b6，50Hz，66ms)，其中，*是肽共振，e)一維TOCSY(b1c1，40Hz，151ms)，f)一維TOCSY(a1，25Hz，144ms)，g)一維NOESY(核歐沃豪斯效應(yīng)相關(guān)譜)(g1f2，15Hz，400ms)，h)一維NOESY(f1，10Hz，400ms)，i)一維NOESY(e1，10Hz，400ms)，j)一維NOESY(d1，20Hz，400ms)，k)一維NOESY(b1c1，40Hz，400ms)，1)一維NOESY(a1，40Hz，400ms)。
圖8.pgl座位和pglB突變體的表征。a)空腸彎曲菌NCTC 11168的常見蛋白質(zhì)糖基化物座位的基因概圖?；疑^表示那些與奈瑟氏球菌屬(Neisseria spp)pgl座位的基因同源的基因。座位下面所示的pglB的突變是使用pEAp26構(gòu)建的。b)至e)空腸彎曲菌野生型與同基因pglB突變體的雙向凝膠分析。b)和d)分別為在對野生型和突變體進(jìn)行免疫印跡之前所作的2D凝膠的膠體考馬斯染色分析。c)和e)分別為用野生型和突變體的HS2血清型血清進(jìn)行的蛋白質(zhì)的免疫檢測。箭頭指示的是那些在凝膠的遷移和/或免疫反應(yīng)性方面有差異的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)被切割下來用作質(zhì)譜指紋鑒定。由Cj編號顯示這些斑點(diǎn)所代表的物質(zhì)。左邊顯示的是以kDa(千道爾頓)表示的分子量蛋白質(zhì)標(biāo)記物的質(zhì)量。
圖9.在來自多種彎曲菌屬菌株的HR-MAS質(zhì)子NMR譜中檢測N-連接的聚糖。該譜的上面顯示的是N-連接的聚糖的結(jié)構(gòu)。a)空腸彎曲菌NCTC11168中純化的N-連接的聚糖的譜圖，其顯示了標(biāo)記為a至g的端基異構(gòu)共振。對如下菌種的全細(xì)胞進(jìn)行使用10毫秒CPMG濾器(filter)的HR-MAS NMR波譜分析，b)空腸彎曲菌NCTC11168，c)空腸彎曲菌NCTC11168kpsM-，d)空腸彎曲菌HS19血清株，e)大腸彎曲菌(C.coli)HS30血清株，和f)空腸彎曲菌NCTC11168 pglB-。垂直的點(diǎn)線表示與a)的共振相比，b)至e)中的共同的共振。4.8ppm處的HOD共振達(dá)到了飽和并已被數(shù)字過濾。
圖10.空腸彎曲菌HS19細(xì)胞和純化的N-連接的聚糖的選擇性NMR實(shí)驗(yàn)的比較?？漳c彎曲菌HS19的HR-MAS譜為a)、c)、e)、g)，純化的N-連接的聚糖的NMR譜為b)、d)、f)、h)。a)NOESY[a1，90Hz，250ms]。b)NOESY[a1，40Hz，400ms]。c)NOESY[b1c1，60Hz，250ms]。d)NOESY[b1c1，40Hz，400ms]。e)NOESY[d1e1f1，90Hz，250ms]。f)NOESY[d1，20Hz，400ms]和NOESY[e1f1，25Hz，400ms]的加和。g)TOCSY[g1f2，72Hz，47ms]。h)TOCSY[g1f2，15Hz，33ms]。
圖11.給出了空腸彎曲菌NCTC11168中純化的N-連接的聚糖的譜圖以用于比較，其顯示了標(biāo)記為a至g的端基異構(gòu)共振，并用垂直的點(diǎn)線表示共同的共振。
圖12.在使用或不使用氯化鈷的情況下進(jìn)行高分辨魔角旋轉(zhuǎn)NMR，以顯示N-連接的Pgl聚糖的表面暴露情況。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例描述了本發(fā)明的聚糖部分的分離和鑒定。
通用的實(shí)驗(yàn)方法細(xì)菌菌株和質(zhì)粒按常規(guī)方法在米勒海頓瓊脂上培養(yǎng)空腸彎曲菌NCTC11168，其生長條件為37℃，微需氧條件(10％CO2、5％O2、85％N2)。大腸桿菌(E.coli)菌株DH10B(Invitrogen公司)用作克隆實(shí)驗(yàn)的宿主菌株，將所得的克隆物于37℃培養(yǎng)在Luria S-gal(Luria S-半乳糖)瓊脂(Sigma公司)或MH(米勒海頓)瓊脂上。需要的時候加入抗生素，使其達(dá)到如下所示的最終濃度卡那霉素30μg/mL和氨芐青霉素150μg/mL。質(zhì)粒pPCR-Script Amp(Stratagene公司)用作克隆載體。
糖蛋白抽提物的制備將過夜培養(yǎng)的兩塊平板上的細(xì)胞重懸浮在10mL米勒海頓肉湯培養(yǎng)基中，并用來接種1升的MH培養(yǎng)基。將培養(yǎng)物在37℃、微需氧生長條件下以150rpm的轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)24小時。通過在10,000×g離心15分鐘從12升培養(yǎng)基收集細(xì)菌細(xì)胞并立即將其冷凍在-75℃。將冷凍的細(xì)胞塊置于0.2M甘氨酸鹽酸緩沖液(pH2.2)中的冰上解凍(13)，然后，輕柔攪拌提取15分鐘。在10,000×g條件下離心15分鐘使提取物澄清，然后用純水進(jìn)行透析(Milli-Q系統(tǒng)，Millipore(密理博)公司)并冷凍干燥。
PEB3的純化和分析如以前(7)所描述的那樣，用陽離子交換色譜從甘氨酸提取物中純化PEB3蛋白質(zhì)，使其達(dá)到同質(zhì)。在KTA ExplorerLC系統(tǒng)(Amersham Biosciences公司)上使用Pharmacia MonoS HR 5/5柱。監(jiān)測柱洗脫物在280nm處的紫外吸收，通過在Mini Protean II平板凝膠(BioRad Laboratories)上進(jìn)行SDS-PAGE分析(21)來檢查各級分。按照LeGendre等人(22)所述將蛋白質(zhì)從SDS凝膠上轉(zhuǎn)移至ProBlotTMPVDF(聚偏二氟乙烯)膜(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司(Applied Biosystems Inc.))上，然后在491型Procise蛋白質(zhì)測序系統(tǒng)(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司)上對單個蛋白質(zhì)進(jìn)行N-末端測序。
通過電噴霧離子化質(zhì)譜確定所選擇的各級分的蛋白質(zhì)分子量分布圖，所使用的儀器是Applied Biosystems公司的Sciex Q-Star混合四極桿飛行時間質(zhì)譜儀。首先將各級分充分透析以除去鹽類，然后調(diào)節(jié)至30％甲醇和0.2％的甲酸中。將溶液以1μL/分鐘的流速注入，采集m/z600＞2000范圍內(nèi)的譜圖。
經(jīng)胰蛋白酶消化的肽的分析用修飾過的胰蛋白酶(普洛麥格(Promega)公司)將選定的各級分在50mM碳酸氫銨中于37℃下消化過夜，用毛細(xì)管液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜來分析，使用的儀器是與Q-TOF2混合四極桿飛行時間質(zhì)譜儀(Micromass)相連的毛細(xì)管HPLC(高效液相色譜)系統(tǒng)(CapLC，Waters)。將大約250 ng的每種消化物注入0.3×150mm PepMap C18毛細(xì)管液相色譜柱(Dionex/LC-Packings)，通過梯度洗脫(在45分鐘內(nèi)，用5-90％乙腈，0.2％的甲酸洗脫)來分離。將質(zhì)譜儀設(shè)定在自動串聯(lián)質(zhì)譜采樣模式下進(jìn)行操作，得到了兩重、三重和四重電荷的離子的譜。
在4.6mm×250mm Jupiter C18液相色譜柱(Phenomenex公司)上對胰蛋白酶消化物進(jìn)行更大規(guī)模的分離。然后，將含有糖肽的級分以1μL/分鐘的流速注入Q-TOF2質(zhì)譜儀的微電噴霧界面。在進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析之前，通過前端碰撞誘導(dǎo)的解離(錐孔電壓從正常的40伏增加至100伏)將糖肽打成碎片。用這種方式產(chǎn)生的單電荷碎片離子的串聯(lián)質(zhì)譜碰撞偏移量是20-25伏(實(shí)驗(yàn)室參考坐標(biāo)系)。為了進(jìn)行采用Rademaker等人的方法(23)的β消除實(shí)驗(yàn)，將約一半含有糖肽的級分蒸干，并且溶解在25％的氫氧化銨水溶液中。將溶液放置在室溫下過夜，再一次蒸發(fā)干燥，重新溶解在水中。然后，通過如上所述的注入—質(zhì)譜檢測所述溶液。
總糖蛋白的純化和分析用SBA凝集素/瓊脂糖(Sigma-Aldrich有限公司)親和色譜從甘氨酸提取物中分離糖蛋白。將冷凍干燥的甘氨酸提取物重懸浮在PBS(100mM NaCl，50mM磷酸鈉，pH7.5)中，然后使其經(jīng)過預(yù)先用PBS平衡好的SBA/瓊脂糖柱。用10倍柱體積的PBS洗柱，用含有0.1M GalNAc的PBS洗脫結(jié)合的糖蛋白。合并含有糖蛋白的級分，用Milli-Q水進(jìn)行透析并冷凍干燥。
通過SDS-PAGE，在12.5％的均勻的聚丙烯酰胺凝膠上分離糖蛋白(21)。使用預(yù)制的IEF(等電聚焦)條帶進(jìn)行2D-PAGE，所述的等電聚焦條帶包含固定的線性pH梯度pH3-10、pH4-7(伯樂公司(BioRadLaboratories))或pH6-11(安瑪西亞生物科學(xué)(Amersham Biosciences))。按照生產(chǎn)商的說明書將蛋白質(zhì)溶解在樣品緩沖液中，利用等電聚焦在預(yù)制的等電聚焦條帶上進(jìn)行分離，然后在第二方向進(jìn)行SDS-PAGE，第二方向電泳使用的是均勻的12.5％的平板凝膠，大小是20×20厘米。用Bio-Safe的膠體G-250考馬斯藍(lán)染色液(伯樂公司(BioRad Laboratories))對凝膠進(jìn)行染色或進(jìn)行銀染(23)。為進(jìn)行隨后的凝集素探查，將所述凝膠電印跡至PVDF膜上，電印跡的條件是在含有10％甲醇的pH11的10mM 3-(環(huán)己氨)-1-丙烷磺酸緩沖液中，以50伏電印跡1小時。在Milli-Q水中洗膜，并在含有0.05％吐溫20和2％封閉緩沖液(Roche MolecularBiochemicals(羅氏分子生化試劑公司))的Tris(三(羥甲基)氨基甲烷)緩沖鹽水(100mM NaCl，50mM Tris，pH7.5)中于室溫下使膜封閉2小時。封閉之后，進(jìn)一步用含有濃度為10μg/mL的SBA-堿性磷酸酶偶聯(lián)物(EY Laboratories公司)的上述封閉溶液于室溫下孵育印跡1小時。用含有0.05％吐溫20的Tris鹽水洗滌印跡3次，然后用氮藍(lán)四唑氯化物(NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽(BCIP)使該印跡顯色，顯色緩沖液是0.1M NaCl，0.1M Tris，pH9.5，含有50mM MgCl2。
雙向凝膠斑點(diǎn)的質(zhì)譜分析將蛋白質(zhì)斑點(diǎn)切下，然后用比例為1∶1的30mM的鐵氰化鉀和100mM的硫代硫酸鈉進(jìn)行脫色(24)。用去離子水充分沖洗凝膠斑點(diǎn)，用乙腈收縮，用含有Promega的經(jīng)過修飾的胰蛋白酶(10ng/μL)的50mM碳酸氫銨重新溶脹，并且加入足夠的50mM碳酸氫銨以覆蓋凝膠片(通常為30μL)。將試管密封，并于37℃孵育過夜。除去消化液，并用50μL的5％乙酸，然后用50μL含有5％乙酸的50％甲醇水溶液抽提凝膠片。將提取物與消化液合并，并濃縮至大約10μL。
使用MALDI-LR(基質(zhì)輔助激光解吸電離-低分辨)質(zhì)譜儀(Micromass)對來自強(qiáng)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的肽抽提物進(jìn)行MALDI-TOFMS(基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時間質(zhì)譜)質(zhì)譜分析。將大約0.5μL的MALDI基質(zhì)溶液(10mg/mL的α-氰基-4-羥基-肉桂酸溶于50％乙腈，0.2％TFA(三氟乙酸)中)沉積在目標(biāo)板上，使其干燥。用C18ZipTipsTM(Millipore)柱對肽提取物進(jìn)行脫鹽，然后將肽提取物直接沉積在基質(zhì)斑點(diǎn)上。進(jìn)行MALDI-TOFMS譜的自動采樣。使用肽標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為外標(biāo)，并使用胰蛋白酶自消化肽作為內(nèi)標(biāo)對譜圖進(jìn)行校正。使用Mascot DaemonTM(MatrixScience)，以批處理模式對空腸彎曲菌NCTC11168基因組序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行數(shù)據(jù)庫檢索。
使用Q-TOF2質(zhì)譜儀對來自弱蛋白質(zhì)斑點(diǎn)的提取物進(jìn)行納米液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析。將全部樣品注入0.3×5mm C18微型預(yù)柱腔中(Dionex/LC-Packings)。肽保留在柱上而樣品溶液被洗下成為廢液。然后將捕獲器(trap)與75μM×150mm的C18納米系列柱(Dionex/LC-Packings)相連，用CapLC泵提供的梯度分離肽(15-75％乙腈，0.2％甲酸分離30分鐘，流速約為300nL/min)。將質(zhì)譜儀設(shè)定為以如上所述的自動模式來獲取串聯(lián)質(zhì)譜圖。如同MALDI-TOFMS分析所描述的那樣進(jìn)行數(shù)據(jù)庫檢索。
糖肽的制備將冷凍干燥的總糖蛋白(5mg)溶解在250μL含有2mM CaCl2的100mM Tris pH8.0溶液中，如以前所述(31)用鏈霉蛋白酶進(jìn)行消化。將消化物于10,000×g微量離心15分鐘，將所得上清液過BioGel P4，200目(BioRad Laboratories)柱(1×120cm)。使柱在水環(huán)境中運(yùn)行，通過折射率監(jiān)測柱洗脫物。在API 3000三級四極桿質(zhì)譜儀(Applied Biosystems/Sciex)上通過ESIMS和先驅(qū)離子掃描質(zhì)譜(m/z 204的HexNAc氧鎓離子的先驅(qū)離子)篩選各級分。將發(fā)出HexNAc離子特征的級分合并起來并冷凍干燥。通過1×120cm的BioGel P2精細(xì)級柱進(jìn)一步純化糖肽，如上所述監(jiān)測并篩選各級分。
NMR譜使用Varian Inova 600MHz核磁共振儀利用標(biāo)準(zhǔn)的Varian軟件獲取所有的譜圖。使用梯度為4mm的間接探測高分辨魔角旋轉(zhuǎn)納米核磁共振探頭(Varian)，所述探頭具有寬帶去耦線圈。使樣品以3KHz旋轉(zhuǎn)，用干燥的氮?dú)庾鳛轵?qū)動氣和載氣。旋轉(zhuǎn)速率不是計(jì)算機(jī)控制的，而是在設(shè)定值的上下10赫茲的范圍內(nèi)保持恒定。在25℃和35℃條件下將40μL D2O溶液中的樣品記載下來以便產(chǎn)生更尖銳的峰。由于體積小，所以無法得知pH值。加入氘化的EDTA(乙二胺四乙酸，CDN Isotopes公司)以螯合金屬離子并且使桿菌胺(bacillosamine)和氨基酸的峰變得更尖銳。盡管從P4柱獲得的糖肽分離物包含一些氨基酸和糖雜質(zhì)，所得的譜圖仍具有足夠高的質(zhì)量，這使得在15mM的氘化EDTA存在下，糖肽能夠進(jìn)行完全的共振歸屬。由于存在著分離的糖肽因進(jìn)一步純化而導(dǎo)致體積減少的危險，所以要用這一樣品繼續(xù)進(jìn)行許多NMR結(jié)構(gòu)工作。通過對糖肽進(jìn)行額外的NMR實(shí)驗(yàn)確認(rèn)了所得到的結(jié)構(gòu)，所述額外實(shí)驗(yàn)中的糖肽已經(jīng)經(jīng)過P2柱純化、冷凍干燥并且溶解在含有1mM氘化的EDTA的40μL D2O中。在抑制4.78ppm(25℃)和4.67ppm(35℃)的HDO信號的條件下進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。如以前所述(32)進(jìn)行了二維實(shí)驗(yàn)(COSY(同核化學(xué)位移相關(guān)譜)、TOCSY、NOESY、HMQC(異核多量子相關(guān))、HMBC(異核多鍵相關(guān)))的采樣和處理。以外部丙酮為2.23ppm進(jìn)行1H譜的定標(biāo)。以外部丙酮的甲基共振為31.07ppm來進(jìn)行13C的定標(biāo)。表1中的1H和13C的化學(xué)位移是測量質(zhì)子譜以及測量HMQC和HMBC譜中的C-H交叉峰得到的。如以前所述(25、26)，以30-151毫秒的不同自旋鎖定時間進(jìn)行一維TOCSY實(shí)驗(yàn)，并以400-800毫秒的不同混合時間進(jìn)行一維NOESY實(shí)驗(yàn)。將選擇性的實(shí)驗(yàn)描述為1D EXP(選定的自旋、選擇性激發(fā)帶寬、混合時間)，其中，EXP是指TOCSY或NOESY。
已表明，在RF(射頻)和磁場均勻性都存在下，對液態(tài)樣品使用魔角旋轉(zhuǎn)(MAS)會顯著地影響TOCSY實(shí)驗(yàn)中混合序列的性能，并且能使性能降低(27、28)。使用絕熱的(WURST)混合序列可以消除這些影響(27、29)。對標(biāo)準(zhǔn)的二維TOCSY和一維TOCSY序列進(jìn)行了修改，以使絕熱的WURST-2(寬帶、勻速且光滑切斷)脈沖取代MLEV-17或DIPSI-2混合序列。絕熱的(WURST-2)混合具有單一的絕熱倒置脈沖長度TP＝1/MAS旋轉(zhuǎn)速率，調(diào)制深度為8，絕熱性(adiabicity)為2。典型地，對于WURST-2脈沖，掃描帶寬是24kHz，Tp＝0.333ms(在MAS旋轉(zhuǎn)速率為3000±10Hz時)，B1(最大)＝8.51kHz，B1(RMS(均方根))＝4.77kHz。
GC-MS(氣相色譜一質(zhì)譜)分析通過在氣液色譜-質(zhì)譜中表征丁-2-基糖苷，歸屬P2產(chǎn)物的Glc和GalNAc組分的對映異構(gòu)體的構(gòu)型(21)。使用惠普(Hewlett-Packard)色譜儀分析衍生物，所述色譜儀裝配有30m的DB-17毛細(xì)管柱(以每分鐘3.5℃的速度將溫度從180℃升到260℃)，用Varian Saturn II質(zhì)譜儀得到了電子碰撞模式的譜圖。
pglB突變體的構(gòu)建和表征為了構(gòu)建pglB突變體，用PCR(聚合酶鏈反應(yīng))從空腸彎曲菌NCTC11168中擴(kuò)增Cj112lc至Cj1126c基因，使用的引物為Cj1121cF(5’-ACTCACTATTGCCATTAAGATAAGC-3’)和Cj1126cR(5’-AAAACCCTTATTTAGTTTTGTTTGC-3’)。用Pfu聚合酶將PCR產(chǎn)物補(bǔ)齊，然后按照生產(chǎn)商的說明將其連接至pPCR-Script Amp(Stratagene)中。將連接混合物電轉(zhuǎn)化進(jìn)入電轉(zhuǎn)化感受態(tài)的大腸桿菌DH10B細(xì)胞中，用氨芐青霉素在LB S-半乳糖瓊脂(Sigma-Aldrich)平板上選擇。將pILL600(37)的平末端卡那霉素抗性盒子插入到pglB上補(bǔ)平的XbaI限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)，產(chǎn)生了pEAp26。用測序的方法來確定所述盒子的插入方向，所用的引物為ckanB引物(5’-CCTGGGTTTCAAGCATTAG-3’)。用末端化學(xué)法和AmpliTaq循環(huán)測序試劑盒(Applied Biosystems)進(jìn)行DNA測序，在Applied Biosystems的373 DNA測序儀上進(jìn)行分析。將突變的質(zhì)粒DNA電轉(zhuǎn)化進(jìn)入空腸彎曲菌NCTC11168(32)中，通過PCR對具有卡那霉素抗性的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行表征，以確認(rèn)引入的質(zhì)粒DNA已經(jīng)通過雙交換事件整合進(jìn)入所述轉(zhuǎn)化子中。
用0.2M的pH2.2的甘氨酸溶液(10)從空腸彎曲菌的完整細(xì)胞提取蛋白質(zhì)，然后用水進(jìn)行透析。用2D-PAGE對樣品進(jìn)行分析，使用的是11cm的pH3-10的ReadyStrip IPG條帶(BioRad Laboratories)和預(yù)制的12×8cm的8-16％梯度的標(biāo)準(zhǔn)平板凝膠(BioRad Laboratories)。用膠體考馬斯藍(lán)對凝膠進(jìn)行染色，照相，然后通過水洗進(jìn)行部分脫色。以207mA的電流持續(xù)1小時將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，使用的儀器是Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell(BioRad)。將膜封閉過夜之后，用1∶500稀釋的HS2血清型的血清對膜進(jìn)行檢測，之后使用1∶5000稀釋的山羊抗兔抗血清(Sigma-Aldrich)進(jìn)行檢測，用NBT/BCIP(RocheMolecular Biochemicals)進(jìn)行顯色。
檢測彎曲菌屬細(xì)胞的聚糖的實(shí)驗(yàn)程序細(xì)菌菌株和生長條件從人腸炎病例中分離得到空腸彎曲菌NCTC11168(HS2)(46)，隨后，由Parkhill等人進(jìn)行了測序(6)。從ATCC(美國典型微生物保藏中心)得到了空腸彎曲菌血清株HS1(ATCC 43429)、HS2(ATCC 43430)、HS3(ATCC 43431)、HS4(ATCC43432)、HS10(ATCC 43438)、HS19(ATCC 43446)、HS36(ATCC43456)和HS41(ATCC 43460)；從鹿特丹的Erasmus大學(xué)醫(yī)學(xué)中心的Peggy Godschalk博士處得到了空腸彎曲菌HS23；從Health Canada得到了空腸彎曲菌OH4382和OH4384；以及從NCTC得到了大腸彎曲菌HS30(NCTC 12532)。按常規(guī)方法在米勒海頓瓊脂(Difco)上培養(yǎng)所有的彎曲菌屬菌株，其條件為37℃和微需氧。在含有30μg/mL卡那霉素的米勒海頓瓊脂上培養(yǎng)空腸彎曲菌NCTC11168突變體。
位點(diǎn)特異性突變的構(gòu)建和表征已有文章描述了空腸彎曲菌NCTC11168kpsM(12)和pglB(13)突變體的構(gòu)建。
用于HR-MAS NMR的細(xì)胞的制備從一個瓊脂平板上收集過夜培養(yǎng)的空腸彎曲菌(約1010個細(xì)胞)，將其懸浮在1mL用D2O配制的10mM鉀鹽緩沖鹽水中(pH7)，其中含有10％(重量/體積)的疊氮化鈉。將懸浮液在室溫下孵育1小時，以殺死細(xì)菌。通過離心(7500×g離心兩分鐘)使細(xì)胞成團(tuán)，再用D2O配制的含有10mM鉀鹽的緩沖鹽水將細(xì)胞洗滌一次。加入20μL的D2O重懸細(xì)胞團(tuán)粒，然后取40μL懸浮液放入轉(zhuǎn)子中用于分析。
HR-MAS NMR譜用Varian Inova 600MHz核磁共振譜儀進(jìn)行HR-MAS實(shí)驗(yàn)，該核磁共振譜儀裝配有以前描述的Varian的納米-NMR探頭(12、13)。將40μL樣品的譜以3KHz進(jìn)行旋轉(zhuǎn)，并在室溫(21℃)下進(jìn)行記錄。在抑制4.8ppm處的HOD信號的條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。用Carr-Purcell-Meiboom-Gill(CPMG)脈沖序列[90-(τ-180-τ)n-采集](34)去掉來自脂質(zhì)和固體類似物的寬線，得到了細(xì)菌細(xì)胞的質(zhì)子譜。CPMG脈沖的總持續(xù)時間(n*2τ)是10ms，將τ設(shè)定為(1/MAS旋轉(zhuǎn)速率)。如以前所述(25、35)，用30-150ms的不同自旋鎖定時間進(jìn)行一維選擇性TOCSY實(shí)驗(yàn)，用100-400ms的混合時間進(jìn)行選擇性NOESY實(shí)驗(yàn)。為了在MAS條件下使用，對TOCSY序列進(jìn)行了修改，用絕熱的WURST-2脈沖(13)代替DIPSI-2混合序列。將選擇性的實(shí)驗(yàn)描述為EXP[選定的自旋，選擇性激發(fā)帶寬，混合時間]，其中，EXP是指TOCSY或NOESY。典型地，可以使用256至1024瞬態(tài)(15分鐘至1小時)獲得細(xì)菌細(xì)胞的質(zhì)子譜。對于N-連接的聚糖共振的選擇性實(shí)驗(yàn)，TOCSY和NOESY的時間均在1至8小時之間變化，所述聚糖在細(xì)菌細(xì)胞中作為次要組分存在。
實(shí)施例實(shí)施例1 PEB3的純化和表征通過肽質(zhì)量指紋圖譜，在甘氨酸提取物的雙向凝膠中鑒定出PEB3蛋白(Cj0289c)，它是聚焦在pH值9-10范圍內(nèi)的一組斑點(diǎn)的一個組分(結(jié)果未顯示)。用陽離子交換色譜從提取物中純化出PEB3，隨后使用較窄的NaCl梯度在同一色譜柱上進(jìn)行再分級，結(jié)果得到出現(xiàn)在三個級分中的PEB3(圖1)。SDS-PAGE分析顯示有兩個條帶，將這兩個條帶轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，隨后確定了它們的N-末端序列。經(jīng)過10個循環(huán)的測序鑒定出較低質(zhì)量的物質(zhì)是PEB3，而較高質(zhì)量的物質(zhì)為更豐富的組分，其是具有少量對應(yīng)于PEB4(Cj0596)序列的PEB3。
圖2a)和b)顯示了31號級分的質(zhì)譜和經(jīng)過重建的分子質(zhì)量分布圖。在重建的分子質(zhì)量分布圖中可以觀察到三個峰。25,454Da和28,376Da的峰分別與PEB3(25,453Da，Cj0289c)和PEB4(28,377Da，Cj0596)的預(yù)期分子質(zhì)量很好地吻合，都沒有信號肽。為了鑒定質(zhì)量為26,861Da的蛋白質(zhì)，對該級分的胰蛋白酶消化產(chǎn)物進(jìn)行了CapLC-MS/MS(毛細(xì)管液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜)分析。除了一個肽之外，鑒定出的所有的肽都可歸屬于PEB3或PEB4，這與N-末端序列的數(shù)據(jù)一致。未鑒定的離子經(jīng)過串聯(lián)質(zhì)譜分析(圖3a)，清楚地鑒定出它是一種糖肽。在該譜中可以觀察到由順序丟失的HexNAc(203Da)和單個Hex(162Da)組成的系列碎片。鑒定出經(jīng)胰蛋白酶消化的肽是PEB3的68DFNVSK73。該糖肽寡糖部分的殘基質(zhì)量是1406Da，這與圖2b所觀察到的PEB3和未知蛋白質(zhì)峰的分子量之差很好地吻合。因此，由此可見，該級分中的PEB3蛋白質(zhì)有大約50％被由5個HexNAc、1個Hex和1個殘基質(zhì)量為228Da的罕見糖構(gòu)成的單一寡糖所修飾。而且，MS/MS譜分析顯示所述寡糖通過228Da的糖部分連接在所述肽上。
實(shí)施例2 糖肽鍵的表征與寡糖連接的PEB3的胰蛋白酶消化肽同時包含用于N-連接和O-連接的位點(diǎn)，即天冬酰胺(Asn)和絲氨酸(Ser)。因此，必須進(jìn)行進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)以確定所述連接的性質(zhì)。此前，我們已使用β-消除從空腸彎曲菌81-176的鞭毛蛋白中去掉了O-連接的碳水化合物(5)。然而，這一方法卻未能在本例中去除寡糖。這表明所述寡糖是N-連接的，這一結(jié)論是由我們第一次提出的。通過對m/z 937.0處的單質(zhì)子化的碎片離子進(jìn)行MS/MS分析確證了這一點(diǎn)，所述單質(zhì)子化的碎片離子是由完整糖肽經(jīng)前端碰撞誘導(dǎo)的解離產(chǎn)生的(圖3b)。這一離子僅由胰蛋白酶消化肽外加所述罕見的228Da糖組成。在m/z 605.1處觀察到一種離子，它僅能歸屬于b3碎片離子外加所述228Da的糖部分。沒有觀察到間接表明該碳水化合物與絲氨酸殘基相連的碎片離子。所有的這些證據(jù)強(qiáng)烈暗示所述寡糖是與肽的Asn70相連的。有趣的是，所述肽包含真核生物N-連接的共有序列段Asn-Xaa-Ser。
實(shí)施例3 糖蛋白的分離和鑒定通過SBA(大豆凝集素)親和色譜從濕重為40克的細(xì)胞的甘氨酸提取物中純化推定的糖蛋白。通過280納米處的紫外吸收度估算出推定的糖蛋白的產(chǎn)量為5毫克。對GalNAc洗脫物進(jìn)行1D-和2D-PAGE(圖4)，確保用這種方式純化的蛋白質(zhì)具有凝集素結(jié)合特性而不是非特異性的結(jié)合特征，用SBA/堿性磷酸酶偶聯(lián)物進(jìn)行了蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)。1DSDS-PAGE后可以看到大約13種蛋白質(zhì)，但是當(dāng)用2D-PAGE分析產(chǎn)物之后，這一數(shù)目大大增加。通過質(zhì)量指紋圖譜和數(shù)據(jù)庫檢索鑒定了1DSDS-PAGE的各單獨(dú)蛋白條帶和2D-PAGE的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)(表I)。在這些鑒定的蛋白中有PEB3(Cj0829c)和以前由Linton等人(8)鑒定的CgpA(Cj1670c)。其pI(等電點(diǎn))與Cj1670c等蛋白表現(xiàn)出的pI相同的這些斑點(diǎn)的垂直圖樣，很可能顯示了不同程度的糖基化，這是由于檢查它們的推測氨基酸序列，即由空腸彎曲菌NCTC11168(6)的全基因組序列獲得的序列，揭示其中存在多個潛在的N-連接糖基化位點(diǎn)，所述位點(diǎn)包含序列段Asn-Xaa-Ser/Thr(表I)。實(shí)際上，用MS/MS分析含有Cj1670c的膠內(nèi)消化提取物顯示，其6個N-連接位點(diǎn)中的3個已被不同程度地占據(jù)(通過capLC-MS/MS檢測了3個Cj1670c糖肽7TDQNITLVAPPEFQKEEVK25、77VLDVSVTIPEKNSSK91和92QESNSTANVEIPLQVAK108。也觀察到了Cj0114的單個糖肽(71LSQVEENNQNIENNFTSEIQK91)和Cj0200c的單個糖肽(1DSLKLEGTIAQIYDNNK17)。而且，所有這些糖肽的聚糖組分的質(zhì)量和組成似乎都與從PEB3觀察得到的一樣。
然而，由2D-PAGE鑒定的某些蛋白質(zhì)，特別是Cj0147c、Cj0169、Cj0332c、Cj0334、Cj0638c、Cj1181c和Cj1534c，在它們的氨基酸序列中并不包含任何這些特異的序列段。這些蛋白質(zhì)非共價地與SBA結(jié)合性蛋白結(jié)合或非特異性地結(jié)合在柱子上。這一結(jié)論由以下事實(shí)所支持，即在進(jìn)行2D PAGE和電印跡實(shí)驗(yàn)后，這些蛋白質(zhì)斑點(diǎn)不能與SBA/堿性磷酸酶偶聯(lián)物反應(yīng)(表I)。
實(shí)施例4 糖肽的制備將混合的糖蛋白樣品進(jìn)行兩輪鏈霉蛋白酶消化，所得產(chǎn)物在BioGelP4柱上通過凝膠過濾進(jìn)行分離(圖5a)。通過質(zhì)譜對包含碳水化合物的級分進(jìn)行定位，并在進(jìn)行了NMR研究(見下文)之后，將樣品通過BioGelP2進(jìn)行再純化(圖5b)。最終純化的樣品主要由與單個Asn連接的寡糖組成(圖5c)。沒有證據(jù)顯示聚糖組分中的任何變化。據(jù)估計(jì)，糖肽的產(chǎn)量大約在200微克。
實(shí)施例5 分離的七糖的制備實(shí)施例4中鑒定出的七糖部分(式I)可以通過已知的方法分離得到。例如，可以使用本領(lǐng)域熟知的酶解或化學(xué)水解方法從實(shí)施例4制備的寡肽中裂解得到氨基酸部分(Asn)?？梢宰⒁獾剑M管本發(fā)明人沒有進(jìn)行上述步驟，但可以用這一步驟來分離該七糖是顯而易見的。該七糖也可以直接從糖蛋白得到，而不用經(jīng)過任何糖肽。這一裂解也可以用酶解或化學(xué)水解進(jìn)行。例如，Patel等(41)就介紹了肼在這一裂解中的用途。
實(shí)施例6 NMR譜使用選擇性的方法，可以用不純的P4樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。為了避免在進(jìn)一步純化過程中損失糖肽，用所述不純的樣品進(jìn)行糖部分的完全共振歸屬。使用P2柱進(jìn)行再次純化之后，通過測量P4和P2純化的樣品的S/N(信/噪)比，判斷出25％的糖肽丟失了。重新對P2純化的樣品進(jìn)行了HMQC實(shí)驗(yàn)以確證使用P4純化的樣品所得到的歸屬。從質(zhì)譜結(jié)果可以看出，所述糖肽由5個HexNAc殘基、1個Hex殘基和1個質(zhì)量為228 Da的未知糖組成。使用化學(xué)分析方法確定了所述HexNAc和Hex殘基的絕對構(gòu)型是 1H和13C NMR數(shù)據(jù)分析表明存在8個端基異構(gòu)的質(zhì)子，已按字母順序進(jìn)行標(biāo)記(圖6)。為進(jìn)行質(zhì)子歸屬，進(jìn)行了一系列的1D TOCSY以用于端基異構(gòu)共振分析(圖7)。在每一個殘基之內(nèi)，使用不同的混合時間來歸屬旋轉(zhuǎn)。然后，使用HMQC和HMBC來歸屬13C共振。NMR歸屬結(jié)果如表II所示。用1D NOESY實(shí)驗(yàn)(圖7)得到如圖(圖6)所示的序列。
殘基g被歸屬為β Glcp。對于g1的1D TOCSY，所用的混合時間為144ms(圖7a)，檢測到了直至H6和H6’共振的所有旋轉(zhuǎn)，這表現(xiàn)出為β-吡喃型葡萄糖特有的大JH，H耦合。g1共振與f2還有重疊，這就使得可以檢測到f1至f4的共振。由于C2至C6的13C和1H化學(xué)位移與β 吡喃型葡萄糖的13C和1H化學(xué)位移相似(36)，所以殘基g為末端。
鑒定出5種殘基(a、c、d、e和f)，都是α GalpNAc。3.6±0.2Hz的J1，2值、強(qiáng)烈的H1-H2 NOE(圖7)以及包括與H4的弱耦合的JH，H耦合譜圖(圖7)，顯示這些單元具有α 吡喃型半乳糖基構(gòu)型。盡管e1和f1端基異構(gòu)共振可以被10Hz的窄帶寬選擇性激發(fā)，但在圖7b中顯示了e1和f1的同時激發(fā)譜。對g1f2進(jìn)行的1D TOCSY，還檢測到f2至f4的共振(圖7a)。在51ppm附近的C2化學(xué)位移顯示了乙酰氨基。使用(C2，H4)HMBC相關(guān)性對5個GalNAc殘基的C2共振進(jìn)行歸屬。使用1D TOCSY-NOESY(H1，H4)來檢測H4和H5間的NOE，由此歸屬了H5共振(25)。然后使用針對H5共振的1D-TOCSY檢測各H6的共振(未顯示)。對P2純化的樣品進(jìn)行整合(圖6b)顯示7個NAc基團(tuán)，其中的5個與5個GalNAc殘基對應(yīng)。將CalNAc單元的13C化學(xué)位移與α GalpNAc的13C化學(xué)位移進(jìn)行比較，顯示殘基a、c、e、f在O-4處相連，這是由于C4向低場偏移(37)。殘基f在O-3處具有分枝點(diǎn)，這是由C3的向低場偏移確定的。由于C2至C6的13C化學(xué)位移與α GalpNAc的13C化學(xué)位移(37)相似，殘基d為末端。
將殘基b歸屬為β 桿菌胺(2，4-二乙酰氨基-2，4，6-三脫氧-β 吡喃型葡萄糖)。對于殘基b和c，端基異構(gòu)共振部分地重疊。對于b1和c1共振的1D TOCSY，混合時間為144ms(圖7e)，可以鑒定到高至1.14ppm處的CH3共振(b6)的寬共振。對于在1.14ppm處的b6的1D TOCSY，混合時間為66ms(圖7d)，觀察到直至b4的峰。進(jìn)行一系列從30ms至144ms的不同混合時間的1D TOCSY，以對這些峰進(jìn)行歸屬。對于殘基b，這些寬峰沒有提供耦合常數(shù)。然而，對于混合時間為144ms的b1的1D TOCSY，可以觀察到直至H6的共振，這與β-Glcp(殘基g)的H1的1D TOCSY相似。因此，這樣的有效的轉(zhuǎn)移是為β-吡喃型葡萄糖基構(gòu)型所特有的長程耦合常數(shù)。圖7k中觀察到的b1-b3和b1-b5 NOE也是β端基異構(gòu)構(gòu)型的典型表現(xiàn)。在55和58ppm的C2和C4的化學(xué)位移為乙酰氨基的信號，這與結(jié)構(gòu)(圖6a)中出現(xiàn)7個NAc基團(tuán)相吻合。在79ppm的C1化學(xué)位移和在5.1ppm的H1表明了N-連接的端基異構(gòu)，這與β-GlcNAc-Asn(20)中發(fā)現(xiàn)的相似。對殘基b的化學(xué)位移與其它結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)的2，4-氨基-2，4，6-三脫氧-β 吡喃型葡萄糖的化學(xué)位移進(jìn)行比較，顯示Bac在O-3處相連，O-3為唯一可能的糖基化位點(diǎn)(38-40)。
如以前對于含有桿菌胺的其它結(jié)構(gòu)的描述一樣(38)，通過NOE獲得殘基b的絕對構(gòu)型。在1.14ppm的CH3共振(b6)和在1.95ppm的NAc之間觀察到強(qiáng)烈的NOE，這是由于位于C6的CH3基團(tuán)與位于C4的NAc-CH3基團(tuán)緊密鄰近。因?yàn)?，位?.95ppm的NAc共振已與其它NAc共振分離，所以其可被選擇性激發(fā)。在這個NAc共振與殘基a的α GalpNAc H1共振之間，觀察到強(qiáng)烈的NOE，這是由于如下顯示的α(1-3)b連接。只有當(dāng)殘基b具有 構(gòu)型，其中位于殘基b的C4的NAc基團(tuán)與殘基a的末端異構(gòu)質(zhì)子緊密鄰近(3)時，才出現(xiàn)這種NOE。如果殘基b具有 構(gòu)型，不可能出現(xiàn)這種NOE，因?yàn)镠1a/4b-NAc質(zhì)子間距離大于5。
通過1D NOESY實(shí)驗(yàn)確定了序列(圖7)。強(qiáng)烈的c1-f4 NOE和較弱的c1-f6和c1-f6’NOE確定了c(1-4)f連接。強(qiáng)烈的d1-c4 NOE和較弱的d1-c6’顯示d(1-4)c序列。e1-a4、f1-e4和g1-f3確定e(1-4)a、f(1-4)e和g(1-3)f連接。a1-b3 NOE(圖7I)確定a-b序列。結(jié)構(gòu)如圖6a所示。這個序列與針對成鍵碳觀察到的糖基化位移相吻合(見上)。
實(shí)施例7 pglB突變體的表征通過盒式誘變構(gòu)建了pglB突變體(圖8)。用HS2血清型血清進(jìn)行的雙向PAGE和蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)證實(shí)了突變體細(xì)胞的甘氨酸提取物在蛋白質(zhì)免疫反應(yīng)性方面的顯著變化(圖8b、e)。有幾種蛋白在雙向凝膠上的遷移性和/或免疫反應(yīng)性發(fā)生了變化，對這幾種蛋白通過質(zhì)量指紋分析進(jìn)行了鑒定(表I)。蛋白質(zhì)的鑒定結(jié)果與SBA凝集素親和色譜的結(jié)果一致，這為與GalNAc凝集素反應(yīng)的蛋白質(zhì)是由Pgl途徑進(jìn)行糖基化的這一結(jié)論提供了進(jìn)一步證據(jù)。由于是用全部甘氨酸提取物進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)，并且實(shí)驗(yàn)是在不同的pH值范圍內(nèi)進(jìn)行的，即圖4和圖8不能直接進(jìn)行比較，所以在這一實(shí)驗(yàn)中不能觀察到全部的SBA反應(yīng)性的蛋白質(zhì)。此外，通過如上所述的離子交換色譜從pglB突變體中純化了PEB3，質(zhì)譜分析表明所述蛋白質(zhì)完全缺乏聚糖(圖2c、d)。
為了證實(shí)pglB突變只影響糖蛋白的糖基化，對該突變體的脂寡糖和莢膜多糖進(jìn)行了分析。對蛋白酶K消化物進(jìn)行了脫氧膽酸鹽-PAGE和質(zhì)譜分析，結(jié)果顯示突變體LOS(脂寡糖)核心的質(zhì)量和野生型LOS核心的質(zhì)量一樣(結(jié)果未顯示)。此外，在脫氧膽酸鹽-PAGE實(shí)驗(yàn)中，在野生型細(xì)胞和等基因突變體細(xì)胞的提取物中可以看見相同的莢膜重復(fù)。為進(jìn)一步證實(shí)莢膜沒有變化，我們用HR-MAS NMR檢查了多糖。與野生型的譜圖相比，突變體的譜圖沒有變化(結(jié)果未顯示)。
實(shí)施例8 通過HR-MAS NMR檢測全細(xì)胞的N-連接的聚糖在完整的彎曲菌屬細(xì)胞的HR-MAS NMR譜(圖9)中，檢測到一系列共同的1H共振。此前，我們使用MS和納米NMR技術(shù)確定了空腸彎曲菌NCTC11168的N-連接聚糖的結(jié)構(gòu)是七糖(13)。正如可在空腸彎曲菌NCTC11168、NCTC11168kpsM-、空腸彎曲菌HS19和大腸彎曲菌HS30的HR-MAS譜所觀察到的那樣，觀察到與純化的N-連接聚糖的端基異構(gòu)共振相匹配的端基異構(gòu)共振，這暗示這一聚糖是所有菌株中共有的(圖9)。在NCTC11168的譜中(圖9b)，與N-連接聚糖相對應(yīng)的共振弱于來自CPS的共振和一些重疊的端基異構(gòu)共振。然而，當(dāng)在NCTC11168kpsM突變體中除去莢膜共振時，能夠很清楚地區(qū)分它們(圖9c)。通過檢查消除蛋白質(zhì)糖基化物的NCTC11168 pglB突變體的譜，可以進(jìn)一步證實(shí)所述共有的聚糖共振歸屬于N-連接的聚糖(3、13)。如同所預(yù)料的那樣，不能在這一突變體的NMR譜中觀察到N-連接聚糖的共振(圖9f)。
使用選擇性的TOCSY和NOESY實(shí)驗(yàn)(圖10)，進(jìn)一步確證推斷的共有聚糖的特性。由于能清楚地觀察到N-連接聚糖的端基異構(gòu)體共振，使用空腸彎曲菌HS19細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。標(biāo)準(zhǔn)的選擇性NOESY實(shí)驗(yàn)是從HS19中的a1共振的選擇性發(fā)射開始的，該實(shí)驗(yàn)與4.21ppm處的共振建立了相關(guān)性(圖10a)。該共振與針對純化的糖肽中的a1共振進(jìn)行的NOESY譜中觀察到的a2共振具有相同的化學(xué)位移(圖10b)。在HS19和純化的N-連接聚糖之間就其它的端基異構(gòu)共振的NOE圖譜進(jìn)行比較，該比較結(jié)果清楚地顯示了在這兩套實(shí)驗(yàn)之間的相似匹配(圖10c-f)。由于NOE實(shí)驗(yàn)揭示殘基內(nèi)和殘基間的相關(guān)性，這一匹配性暗示共有聚糖的序列與此前報(bào)道的純化的N-連接聚糖的序列(13)是一樣的。選擇性的TOCSY實(shí)驗(yàn)用4.5ppm處的g1和f2的重疊共振的發(fā)射來進(jìn)行，結(jié)果產(chǎn)生了與g2和f3共振相對應(yīng)的交叉峰(圖10g)。它們的多重態(tài)形狀和化學(xué)位移與在純化的N-連接的聚糖的相應(yīng)實(shí)驗(yàn)中所觀察的相匹配(圖10h)。由于較強(qiáng)的CPS共振的部分激發(fā)，也能觀察到其它的共振。因此，對細(xì)菌細(xì)胞進(jìn)行選擇性激發(fā)實(shí)驗(yàn)確定了所述的共有的N-連接聚糖的原位性質(zhì)。
圖11顯示在各種彎曲菌的HR-MAS質(zhì)子NMR譜中檢測N-連接聚糖。在該譜的上面顯示N-連接聚糖的結(jié)構(gòu)。為了進(jìn)行比較，顯示空腸彎曲菌NCTC11168中的純化的N-連接的聚糖的譜圖，其中顯示的端基異構(gòu)共振被標(biāo)記為a至g，并用垂直的點(diǎn)線表示共有的共振。顯示了以下菌株的全細(xì)胞的采用10ms的CPMG濾器的HR-MAS NMR譜，所述菌株為大腸彎曲菌HS30(NCTC 12532，分離自布魯塞爾的豬)、大腸彎曲菌423(分離自阿爾伯達(dá)的小雞)和性病胚胎彎曲菌生物型A(C.fetus ssp.Venerealis Biotype A)(NCTC 10354，分離自母牛的陰道粘液)。4.8ppm處的HOD共振達(dá)到飽和并已被數(shù)字過濾。
圖12為在使用或不使用氯化鈷的條件下進(jìn)行高分辨魔角旋轉(zhuǎn)NMR，來顯示N-連接的Pgl聚糖的表面暴露情況。每對譜的上部譜圖是來自添加了氯化鈷(CoCl2)的樣品。它們都經(jīng)過同樣的處理。應(yīng)當(dāng)注意的是，在每對譜中，上部譜的信噪比(S/N)比下部譜的信噪比低得多。由于利用有效的T2濾器獲得所述的譜，因此被CoCl2變寬的譜線會變得較弱。注意到對于kspM突變體，位于3.15ppm附近的峰與位于3ppm附近的峰相比，顯示非常不同的相對強(qiáng)度。位于3.15ppm附近的峰在使用或不使用CoCl2時的絕對S/N大致相同，而位于3ppm附近的峰在在使用或不使用CoCl2時的絕對S/N差異非常大。這表明位于3.15ppm附近的峰很可能是由內(nèi)部組分形成，而與CoCl2無關(guān)。因此，外部殘基的強(qiáng)度顯著降低。對于HS19而言，可以觀察到，有關(guān)3.15ppm峰與3ppm的峰的相對關(guān)系具有與上述相同的結(jié)果。此外，在CoCl2存在時，位于約2.7ppm和約2.85ppm處的天冬氨酸峰(參見Szymanski等人，JBC，2003)消失了，這證實(shí)了暴露于外表面或接觸介質(zhì)的殘基變寬了。由于在CoCl2存在時，N-連接的Pgl聚糖共振(參見Szymanski等人，JBC，2003和圖9)基本消失了，這表明它們也位于細(xì)胞的表面。
抗體和疫苗的制備和施用可以通過常規(guī)方法制備與本發(fā)明的聚糖部分特異性結(jié)合的抗體或其抗原結(jié)合片段。例如，可以針對式I的聚糖(包括片段)制備鼠單克隆抗體，所述式I的聚糖與寡肽或氨基酸或具有免疫原性的偶聯(lián)物選擇性鍵合。另一種策略是淘選來自駱駝科動物淋巴細(xì)胞并能夠表達(dá)dAb抗體片段的先前存在的克隆基因庫，以鑒定和分離能表達(dá)具有免疫原性的片段的基因，所述免疫原性是針對所選定抗原的免疫原性?？梢栽诮?jīng)過修飾的含有這種基因的噬菌體庫中表達(dá)按照上述策略分離的基因。這樣的抗原可以包含如上所述的七糖或所述七糖的片段，這些七糖或七糖的片段按照如上所述與氨基酸、寡肽或其它偶聯(lián)物選擇性鍵合。在授予Casterman等人的美國專利號5,759,808中描述了這種方法。另一種策略是將用于表達(dá)所述選定的抗體或片段的基因整合入適當(dāng)植物的基因組中，然后這種植物可作為禽畜飼料來源。隨后這樣的植物就表達(dá)抗體或抗體片段，當(dāng)禽畜食用這種植物時，該植物就會將適當(dāng)劑量的抗體或片段遞送給動物。
因此，可以看到存在許多方法來產(chǎn)生與本發(fā)明的聚糖特異性結(jié)合的抗體或片段。所述抗體片段可以獨(dú)立制備或產(chǎn)生，而與整個抗體無關(guān)。
也可以由傳統(tǒng)方法制備抗體，即由動物血清分離所述抗體，所述動物是已經(jīng)施用了適當(dāng)劑量的在上述實(shí)施例中鑒定的抗原的動物。例如，在授予Casterman等人的美國專利號5,759,808中描述了這種方法。該參考文獻(xiàn)描述了使用駱駝科動物來產(chǎn)生不含有輕鏈的獨(dú)特型抗體。
上述的抗體或片段可以采用被動免疫的形式與合適的載體一起施用給人或禽畜。當(dāng)施用給諸如禽類的禽畜時，優(yōu)選的方法是以飼料或飲用水來提供抗體或片段，方式可以是以濃縮液混入或提供經(jīng)過修飾后可表達(dá)抗體或抗體片段的植物產(chǎn)物。當(dāng)單獨(dú)提供抗體或片段時，可以在使用前將抗體或片段作為濃縮液與適當(dāng)?shù)妮d體一起提供，以用于與飼料或飲用品混合。
這種施用給禽畜的抗體或片段會對抗該禽畜中彎曲菌的存在，由此防止禽畜將病原體傳播給食用或處理動物產(chǎn)品的人類，以及如上所述防止地下水被動物排泄物污染。
還可以將這些抗體和片段用于通過常規(guī)方法診斷人類或動物中彎曲菌屬細(xì)菌的存在。此外，可以將它們用作分析組分，以確定諸如水、土壤或肥料等樣品中是否存在彎曲菌。
還可以將與氨基酸、寡肽或其它合適的偶聯(lián)物選擇性鍵合的所述七糖或片段與合適的佐劑和免疫刺激劑結(jié)合以作為疫苗施用。為此，采用常規(guī)方式施用單個或一個以上的合適劑量。
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本文使用的縮寫如下Bac，桿菌胺(bacillosamine)、2，4-二乙酰氨基-2，4，6-三脫氧 吡喃型葡萄糖；capLC-MS/MS，毛細(xì)管液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；CE，毛細(xì)管電泳；CPMG，Carr-Purcell-Meiboom-Gill；CPS，莢膜多糖；COSY，相關(guān)波譜學(xué)；DIPSI-2，在存在標(biāo)量相互作用(scalar interaction)下的去耦；ESI-MS，電噴霧離子化質(zhì)譜；GBS，格-巴綜合征；HMBC，異核多鍵相關(guān)；HMQC，異核多量子相關(guān)；
HR-MAS，高分辨魔角旋轉(zhuǎn)；LOS，脂寡糖；LPS，脂多糖；MALDI-TOFMS，基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜；MAS，魔角旋轉(zhuǎn)；MLEV-17，馬爾科姆萊維特氏(Malcolm Levitt′s)去耦循環(huán)；MS，質(zhì)譜；MS/MS，串聯(lián)質(zhì)譜；NOESY，核歐沃豪斯效應(yīng)波譜學(xué)；PVDF，聚偏二氟乙烯；SBA，大豆凝集素；TOCSY，全相關(guān)譜學(xué)；和WURST-2，寬帶、勻速且平滑的切斷。
表I對雙向凝膠上的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定


aSAsn-Xaa-Ser序列段；TAsn-Xaa-Thr序列段。
b在雙向凝膠的蛋白質(zhì)印跡中與SBA的反應(yīng)性。
c在pglB突變體中，在雙向凝膠中的斑點(diǎn)位置變化的和/或免疫反應(yīng)性變化的蛋白。Cj1018c和Cj1643不是由SBA色譜分離得到的。
d由CapLC-MS/MS觀察到的糖肽。
e從一維凝膠上鑒定得到的。
表II空腸彎曲菌的天冬酰胺連接的糖肽的化學(xué)位移(ppm)。
在35℃，于D2O中在600MHz(1H)測定，此時HOD在4.67ppm。外部乙酮的甲基共振在dH2.23ppm和dC31.07pppm處。dC處的誤差為±0.2ppm，dH處的誤差為±0.02ppm。7個NAc共振為dH2.07、2.05、2.04、2.03、2.02、2.02和1.95ppm。NAc-CH3的dC在23.1-23.4ppm。NAc-CO的dC在175-176ppm。

權(quán)利要求
1.一種化合物，該化合物包含下式GalNAc-α1，4-GalNAc-α1，4-[Glc-β1，3]GalNAc-α1，4-GalNAc-α1，4-GalNAc-α1，3-Bac的七糖或其具有免疫活性的片段，其中，Bac為2，4-二乙酰氨基-2，4，6-三脫氧-D-吡喃型葡萄糖。
2.如權(quán)利要求1所述的化合物，該化合物與氨基酸或寡肽相連。
3.如權(quán)利要求2所述的化合物，其中，所述氨基酸是天冬酰胺。
4.如權(quán)利要求1、2或3任一項(xiàng)所述的化合物，該化合物來自糖蛋白，該糖蛋白從彎曲菌屬細(xì)菌中分離并純化得到。
5.如權(quán)利要求4所述的化合物，其中，所述細(xì)菌選自空腸彎曲菌(C.jejuni)、大腸彎曲菌(C.coli)或性病胚胎彎曲菌(C.fetus ssp.Venerealis)。
6.一種檢測細(xì)菌糖蛋白中聚糖部分的方法，所述方法包括對所述樣品進(jìn)行高分辨魔角旋轉(zhuǎn)核磁共振(HR-MAS NMR)波譜分析。
7.一種藥物組合物，該藥物組合物含有權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述的化合物和生理學(xué)上可接受的載體。
8.如權(quán)利要求7所述的藥物組合物，該藥物組合物還含有具有免疫原性的偶聯(lián)物。
9.如權(quán)利要求7或8所述的藥物組合物，該藥物組合物還含有免疫刺激劑。
10.權(quán)利要求7至9任一項(xiàng)所述的藥物組合物在動物或人體中作為疫苗的應(yīng)用。
11.一種抗體或抗體的抗原結(jié)合片段，該抗體或抗體的抗原結(jié)合片段與包含聚糖或其具有免疫活性的片段的化合物特異性結(jié)合，所述聚糖具有下式結(jié)構(gòu)GalNAc-α1，4-GalNAc-α1，4-[Glc-β1，3]GalNAc-α1，4-GalNAc-α1，4-GalNAc-α1，3-Bac，其中，Bac為2，4-二乙酰氨基-2，4，6-三脫氧-D-吡喃型葡萄糖。
12.一種抗體或抗體的抗原結(jié)合片段，該抗體或抗體的抗原結(jié)合片段與權(quán)利要求1至65任一項(xiàng)所述的化合物特異性結(jié)合。
13.一種抗體或抗體的抗原結(jié)合片段，所述抗體或抗體的抗原結(jié)合片段與權(quán)利要求1至65任一項(xiàng)所述的化合物特異性結(jié)合，所述抗體或抗體的抗原結(jié)合片段由分離自駱駝科動物的基因得到。
14.如權(quán)利要求13所述的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中，所述駱駝科動物選自雙峰駝(Camelus bactriamus)、單峰駝(Camelus dromaderius)、羊駝(Lama pPaccos)、駝羊(Lama ggGlama)或小羊駝(Lama vVicugna)。
15.一種藥物組合物，該藥物組合物包含權(quán)利要求11至14任一項(xiàng)所述的抗體或抗原結(jié)合片段，以及生理學(xué)上可接受的載體。
16.權(quán)利要求15所述的藥物組合物在人體或動物中作為治療劑的應(yīng)用。
17.一種減少禽畜體內(nèi)的彎曲菌屬病原體存在的方法，該方法包括給所述禽畜施用如權(quán)利要求11至15任一項(xiàng)所述的抗體或抗原結(jié)合片段。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其中，所述的施用包括用與所述抗體或抗原結(jié)合片段混合的飼料喂養(yǎng)所述禽畜。
19.如權(quán)利要求17或18所述的方法，其中，所述禽畜是家禽。
20.一種預(yù)防由彎曲菌屬病原體在人體內(nèi)引起彎曲菌屬感染的方法，該方法包括通過如權(quán)利要求17所述的方法從禽畜體內(nèi)清除所述病原體。
21.一種治療由彎曲菌屬病原體在人體或動物體內(nèi)引起的疾病的方法，該方法包括施用如權(quán)利要求11至14任一項(xiàng)所述的抗體或抗原結(jié)合片段。
22.一種防止由彎曲菌屬病原體導(dǎo)致地下水污染的方法，該方法包括通過如權(quán)利要求17所述的方法減少禽畜體內(nèi)的所述病原體的存在。
23.一種用于禽畜的動物飼料或飲用品，該飼料或飲用品含有權(quán)利要求11至14任一項(xiàng)所述的抗體或抗原結(jié)合片段。
24.如權(quán)利要求23所述的飼料或飲用品，該飼料或飲用品包含含有所述抗體或片段的添加劑。
25.如權(quán)利要求23所述的飼料，該飼料包含以下植物，該植物含有經(jīng)過修飾以表達(dá)所述抗體或片段的基因組。
26.一種植物基因組，該植物基因組包含能表達(dá)權(quán)利要求11至14任一項(xiàng)所述的抗體或抗體片段的基因。
27.一種包含權(quán)利要求26所述的基因組的植物細(xì)胞。
28.一種包含權(quán)利要求27所述細(xì)胞的植物。
29.如權(quán)利要求26所述的植物基因組，其中，所述基因是用下述方法得到的用含有權(quán)利要求1至5任一項(xiàng)所述化合物的探針淘選駱駝科動物的基因庫以得到能夠表達(dá)所述抗體片段的駱駝科動物基因，并將所述基因整合入植物的基因組。
30.一種用于檢測動物或人體中彎曲菌存在的診斷試劑盒，該診斷試劑盒包含權(quán)利要求11至14任一項(xiàng)所述的抗體或抗體片段。
31.一種用于檢測樣品中彎曲菌存在的診斷試劑盒，該診斷試劑盒包含權(quán)利要求11至14任一項(xiàng)所述的抗體或抗體片段。
32.如權(quán)利要求31所述的試劑盒，其中，所述樣品選自水、土壤或肥料。
全文摘要
發(fā)現(xiàn)多個菌株和菌種的彎曲菌都具有共同的聚糖部分，這種聚糖部分存在于許多暴露于表面的糖蛋白中。這種聚糖具有下式的結(jié)構(gòu)GalNAc－α1，4－GalNAc－α1，4－[Glc－β1，3]GalNAc－α1，4－GalNAc－α1，4－GalNAc－α1，3－Bac，其中Bac為2，4－二乙酰氨基－2，4，6－三脫氧－D－吡喃型葡萄糖。這種聚糖和其免疫活性片段具有作為疫苗對抗人類和動物中彎曲菌感染的用途。同時，可以提供與這些化合物特異性結(jié)合的抗體。這些抗體和疫苗可以用于預(yù)防或中和禽畜中的彎曲菌感染，由此防止這種病原體進(jìn)入人類的食物鏈。所述聚糖可以與一個或一個以上的氨基酸相連以形成糖肽。同時，提供檢測完整糖蛋白的聚糖結(jié)構(gòu)的方法，該方法包括對所述樣品進(jìn)行高分辨魔角旋轉(zhuǎn)核磁共振(HR－MASNMR)波譜分析。
文檔編號G01N33/569GK1671722SQ03818185
公開日2005年9月21日 申請日期2003年7月30日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月1日
發(fā)明者諾埃爾·M·揚(yáng), 吉恩－羅伯特·布里松, 約翰·弗蘭西斯·克里, 大衛(wèi)·C·沃森, 克里斯蒂那·M·希曼斯基, 哈羅德·C·賈雷爾 申請人:加拿大國家研究院