專利名稱：：使用經(jīng)過加工的臨床樣品通過涂片顯微鏡檢術(shù)、培養(yǎng)和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)診斷結(jié)核的方法...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本申請描述了一種用于細菌性感染(包括結(jié)核)的多用途診斷方法學(xué)，其包括加工臨床樣品和將所加工的材料用于涂片顯微鏡檢術(shù)(smearmicroscopy)、培養(yǎng)和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。該方法學(xué)可以應(yīng)用于所有類型的肺結(jié)核和肺外結(jié)核(extrapulmonarytuberculosis)。本發(fā)明的背景和現(xiàn)有技術(shù)參考在印度和東南亞，結(jié)核比任何其它傳染性疾病都造成更多的人死亡——超過HIV、STD、瘧疾和熱帶病的組合。在印度，每天有超過1千人會死于TB——每年超過450,000人，每分鐘超過1人?？焖僭\斷結(jié)核對于提高治愈率、減少該疾病通過肺部途徑擴散的危險、和對抗目前出現(xiàn)的結(jié)核分枝桿菌(M.tuberculosis)的抗藥性菌株以及該疾病在HIV感染患者中的嚴(yán)重牽連問題，變得日益重要。導(dǎo)致該疾病的生物體是結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)。該生物的特征為生長緩慢和存在獨特的富含脂質(zhì)的細胞壁，該細胞壁使得其可以不受到常規(guī)抗生素和裂解方法的作用的影響。該細胞壁的耐酸性質(zhì)被應(yīng)用于通過涂片顯微鏡檢術(shù)快速檢測臨床樣品中結(jié)核分枝桿菌和其它分枝桿菌的存在。至今，涂片顯微鏡檢術(shù)由于簡單、快速、費用低以及對儀器及技術(shù)的要求最少，是目前全世界所用的所有實驗室診斷結(jié)核的方法中最為流行的方法。然而，該方法缺乏靈敏度——為了通過ZiehlNeelsen染色從濃縮的樣品獲得陽性報告，要求大約10,000個生物/ml的樣品載量(Kent和Kubica，1995)。一種同樣簡單但更靈敏的涂片顯微鏡檢術(shù)對于實驗室診斷將是高度有用的。培養(yǎng)被認(rèn)為是金標(biāo)準(zhǔn)，但是考慮到該病原體緩慢的生長速率，僅僅依賴于培養(yǎng)將總是導(dǎo)致確定診斷結(jié)果的獲得被延遲4-6周。除了肺結(jié)核，肺外結(jié)核由于其涉及廣泛的器官并且在送至診斷實驗室的樣品中少菌型(paucibacillary)細菌載量，也是一項巨大的診斷挑戰(zhàn)。核酸擴增技術(shù)由于提供了靈敏、特異而快速的替代性結(jié)核診斷方法而受到擁護。這些方法在不小的程度上受到其不能夠從所有類型的臨床材料中分離出足量的PCR可擴增的分枝桿菌DNA的限制。就我們所知，目前尚沒有可普遍應(yīng)用于所有類型的臨床材料上的、使用利于環(huán)境的試劑進行的DNA分離方法。這為DNA擴增技術(shù)在臨床材料上的應(yīng)用構(gòu)成了一個十分實際而嚴(yán)重的障礙。與此背景相對，一種通用方法學(xué)已經(jīng)被開發(fā)出來，該方法學(xué)包括獨特的樣品加工技術(shù)，該技術(shù)單獨可以和最常用的實驗室TB診斷方法——涂片顯微鏡檢術(shù)、培養(yǎng)和PCR——相容。在肺結(jié)核和肺外結(jié)核的情況下，該方法學(xué)可以應(yīng)用于除了糞便物之外的所有臨床材料類型。該方法利用分枝桿菌細胞壁的獨特性質(zhì)選擇性地除去外來物質(zhì)、污染性生物及潛在的PCR抑制性物質(zhì)并同時對結(jié)核分枝桿菌的耐酸性、生存力和完整性不造成不利影響。鹽酸胍的離液(chaotropic)性質(zhì)與去污劑和中性pH緩沖液聯(lián)合用于此目的。涂片顯微鏡檢術(shù)和培養(yǎng)是全球最廣泛使用的實驗室結(jié)核診斷技術(shù)。近年來，基于核酸的技術(shù)，尤其是PCR，也被用作輔助檢驗以便在合理的時間期限實現(xiàn)確診。就我們所知，對于涂片顯微鏡檢術(shù)、培養(yǎng)和PCR，已經(jīng)公開的技術(shù)和商業(yè)試劑盒及它們的缺點如下涂片顯微鏡檢術(shù)和培養(yǎng)用于結(jié)核分枝桿菌的涂片顯微鏡檢術(shù)和培養(yǎng)的樣品的制備方法，涉及使用4％NaOH；0.5％NALC和2％NaOH(3％NaOH被推薦用于具有高度潮濕氣候的熱帶國家)；二硫蘇糖醇(DTT)和2％NaOH；13％含有或不含有苯扎氯銨(benzalkoniumchloride)的磷酸三鈉(Zephiran)；5％草酸；1％十六烷基氯化吡啶和2％NaCl。(Koneman等，1997)。家庭用漂白劑(NaOCl)也已經(jīng)用于痰的液化處理和涂片的制備。這需要過夜沉淀和從沉淀物制備涂片。在埃塞俄比亞和印度進行的3項研究中，利用NaOCl方法使耐酸性桿菌陽性的樣品數(shù)量增加了100％以上(Gebre等，1995)。但是一些研究證實，盡管漂白沉淀可以增加診斷率，但是這僅僅只達到微小的程度(VanDeun等，2000)。這些方法的基本目的均是旨在對樣品進行液化和凈化，并已最廣泛地應(yīng)用于痰樣品。NALC和DTT是有效的粘液溶解劑但是價格高。凈化劑如NaOH和磷酸三鈉需要小心地控制暴露時間。Zephiran需要用卵磷脂中和并且與在基于卵的培養(yǎng)基上的接種不相容。(Koneman等，1997)。近來，描述了一種使用C18-羧基丙基甜菜堿(CB-18TM)——一種兼性離子去污劑——加工呼吸道樣品以檢測分枝桿菌的方法。該方法涉及弱堿性消化樣品和用CB-18TM處理并隨后孵育2-24小時、離心和AFB涂片檢查。對于結(jié)核分枝桿菌的培養(yǎng)，指定一個單獨的方案，其中聯(lián)合使用三種分解酶和CB-18TM，該方案增加了費用。最初的研究顯示，與NALC-NaOH方法相比，該方法使總的(aggregate)涂片靈敏度和培養(yǎng)靈敏度分別增加大約58％和43％(Thornton等，1998)。在近來的一份關(guān)于CB-18TM方法與NALC-NaOH法比較的報道中，前一方法顯示出59.6％的涂片靈敏度，該靈敏度稍后在對該方案進行改進時增加至71.4％(Scott等，2002)。應(yīng)當(dāng)注意，通過該方法加工的樣品與在液體培養(yǎng)基中的培養(yǎng)是不相容的。此產(chǎn)品由QuestDiagnosticsIncorporated，Baltimore，USA以CB-18TM涂片試劑盒及CB-18TMTB培養(yǎng)試劑盒和LyticDeconII的形式市場銷售。近來已經(jīng)描述了使用殼多糖消化痰中的粘液的另一方法，該方法涉及在痰中添加殼多糖溶液、通過渦旋或振蕩進行勻漿、以單位重力沉淀30分鐘和從沉淀物制備涂片。這僅適于從痰實施的涂片顯微鏡檢術(shù)。該方法的靈敏度估計為80％，特異性為96.7％(Farnia等，2002)。未評價該方法在培養(yǎng)中的應(yīng)用。另一最近出版的方法描述了使用酚和硫酸銨的組合(PhAS)來液化痰。但這需要過夜沉淀，并且因為該方法殺死分枝桿菌故不適用于培養(yǎng)。該方法的靈敏度和特異性分別為85％和97％(Selvakumar等，2002)。直接的涂片方法(利用ZN和/或金胺染色)的靈敏度在不同的實驗室設(shè)置下在40％至85％范圍變動。濃縮步驟的包括使得該直接涂片方法的靈敏度由54-57％增加至63-80％(Bruchfeld等，2000；Garay等，2000)。此CDC方法顯示出大約66至83％的靈敏度水平(Scott等，2002，F(xiàn)arnia等，2002，我們的研究)。據(jù)報道，離心步驟(4000g，15分鐘)的包括使得可以通過涂片顯微鏡檢術(shù)和培養(yǎng)分別檢測到≥5000和500個生物體/ml(Perera等，1999)。然而，其它的報道提示，痰的液化和濃縮并未提高涂片顯微鏡檢術(shù)的總體診斷靈敏度(Wilkinson等，1997)。已經(jīng)提議，使用熒光顯微鏡檢術(shù)可以極大地提高痰涂片——尤其是在可能被ZN染色涂片遺漏的具有低桿菌密度的樣品中——的診斷價值(Githui等，1993)。然而，熒光顯微鏡檢術(shù)將造成費用的增加。目前可獲得的培養(yǎng)分枝桿菌的自動和半自動系統(tǒng)診斷TB的最靈敏但是耗時的方法是培養(yǎng)病原體。在國際市場上有幾種液體和固體培養(yǎng)基可用于此目的。由于為了獲得結(jié)論性的結(jié)果在諸如Lowenstein-Jensen的培養(yǎng)基或其它固體培養(yǎng)基中的生長需要至少4-6周，故使用放射性材料或氧淬滅和氧化還原劑的液體培養(yǎng)系統(tǒng)因其良好的速度和靈敏度已經(jīng)被推行。這些系統(tǒng)均需要已經(jīng)通過NALC-NaOH處理而凈化的呼吸道樣品?；谶@些原理的、最廣泛使用的結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)試劑盒是1)BACTEC460TB(BectonDickinsonDiagnosticInstruments，Sparks，MD)。其通過放射性測量術(shù)檢測CO2的消耗。2)MB/BacT(OrganonTeknikaCorporation，DurhamNC)。其通過比色法檢測CO2的消耗。3)ESPMyco系統(tǒng)(DifcoLaboratories，Detroit，Michigan)。其檢測氣壓的改變。4)分枝桿菌生長指示管(MycobacterialGrowthIndicatorTube，MGIT)BectonDickinson，Cockeysville，MD)。其通過氧敏感性熒光傳感器檢測氧的消耗。5)Septi-CheckAFB系統(tǒng)(BBL)通過直觀觀察來檢測菌落。所有以上系統(tǒng)均使用液體培養(yǎng)基、(除了Septi-Check，其是具有液體和固體培養(yǎng)基的雙相系統(tǒng))生長補充物、抗生素，并涉及復(fù)雜技術(shù)。除了Septi-CheckAFB系統(tǒng)，其它系統(tǒng)均是自動化的，可以早在5-7天獲得結(jié)果。但是，使用這些自動化系統(tǒng)不可以研究生長的細胞的菌落形態(tài)，而且污染物的缺乏不得不通過實施陽性培養(yǎng)物的AFB染色來加以驗證。這些系統(tǒng)非常昂貴，不合適地方病流行的國家，如印度。此外，放射測量檢測具有生物學(xué)危險性。DNA分離和內(nèi)部使用(in-house)PCR——已經(jīng)描述了多種旨在分離PCR可擴增的結(jié)核分枝桿菌DNA的內(nèi)部使用方法。但是目前還沒有單一一個方法(a)與從臨床樣品進行的涂片顯微鏡檢術(shù)、培養(yǎng)和DNA分離均相容并(b)適于所有的肺樣品和肺外樣品類型。所有這些方法均要求用粘液溶解劑(NALC或DTT)預(yù)先處理痰樣品以及/或者使用NaOH凈化，并且不變地涉及使用有機溶劑和酶。就我們所知，分離DNA的最流行方法如下1.酚氯仿法NALC-NaOH處理的痰樣品進一步用分解酶和有機溶劑處理，之后用十六烷基三甲基溴化銨處理和用異丙醇進行DNA沉淀。(Singh等，2000)。2.去污劑法用溶菌酶消化NALC-NaOH處理的痰沉淀物。通過55℃加熱，利用去污劑和蛋白酶K獲得DNA。(Perera等，1994)。3.Chelex100樹脂和去污劑法利用DTT液化的痰通過添加15％Chelex、0.1％SDS、1％NP40和1％T20并100℃加熱30分鐘進行DNA提取(deLamballerie等，1992)。我們的研究證實，SDS抑制PCR而且TritonX-100比NP40可以提供更高的裂解作用(Chakravorty和Tyagi，2001)。Chelex100樹脂也已經(jīng)用于從肺外樣品分離結(jié)核分枝桿菌DNA(Walsh等，1991)。4.在異硫氰酸胍(GITC)存在下裂解結(jié)核分枝桿菌和在二氧化硅上捕獲DNA用NALC-NaOH處理痰、支氣管洗液、膿和胸腔積液并離心。CSF和尿直接離心。勻漿組織并用蛋白酶K-SDS處理12-16小時。通過加入GITC二氧化硅懸浮液并80℃加熱以誘導(dǎo)裂解，之后混合以結(jié)合DNA、洗滌二氧化硅顆粒并在水中洗脫。該方法是麻煩的，涉及毒性GITC，加工組織時花費更長時間并且要求酶促消化，此外僅開發(fā)用于分離DNA(Noordhoek等，1995)。5.本發(fā)明的發(fā)明人先前已經(jīng)公開了一種從肺和肺外樣品獲得PCR可擴增的、無抑制劑的結(jié)核分枝桿菌DNA的方法。該方法盡管簡單快捷并有效，但是使用毒性試劑GITC、要求NALC處理，且未評價其與涂片顯微鏡檢術(shù)和培養(yǎng)的相容性(Chakravorty和Tyagi，2001)。商業(yè)核酸檢測試劑盒就我們所知，在國際市場上，可以獲得以下利用結(jié)核分枝桿菌DNA或RNA的擴增的診斷試劑盒。這些試劑盒使用不同的擴增技術(shù)(PCR、TMA、SDA和LCR)。它們需要用NALC-NaOH(CDC方法)預(yù)先處理的呼吸道或非呼吸道樣品。1.AMPLICORMicrowellPlate和COBASAMPLICORTM分析儀自動PCR試驗。(RocheMolecularSystems，USA)。AMPLICORMTB試驗是一種基于PCR的系統(tǒng)，其檢測具有AFB(耐酸性桿菌)陽性涂片結(jié)果的未治療患者中的結(jié)核分枝桿菌。快速鑒定1天，定性試驗。COBASAMPLICORTM分析儀是實施聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)試驗過程的擴增和檢測步驟的臺式自動系統(tǒng)。其利用將5種儀器(熱循環(huán)儀、自動移液器、溫育器、洗滌器和讀數(shù)器)合而為一的單一儀器。2.AmplifiedMtDirectTest(AMTDTI)和AMTDTII(Gen-Probe，USA)。AMTDT以等溫擴增16SrRNA基因的582bp片段為基礎(chǔ)用于檢測結(jié)核分枝桿菌。該系統(tǒng)使用TMA方法通過DNA中間體擴增rRNA，之后利用吖啶-酯(acridinium-ester)標(biāo)記的DNA探針通過化學(xué)發(fā)光檢測擴增子。其涉及使用兩種酶(逆轉(zhuǎn)錄酶和RNA聚合酶)和超聲波儀制備樣品。它是被FDA批準(zhǔn)用于AFB涂片陽性樣品的第一個試劑盒。3.LCxMtb試驗(AbbottLaboratories，USA)。該試驗以連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴增分枝桿菌中編碼蛋白質(zhì)抗原b的染色體基因的片段為基礎(chǔ)。樣品制備過程為兩次洗滌和離心除去抑制劑、90℃加熱10分鐘殺死分枝桿菌和超聲裂解細胞。使用兩種酶(聚合酶、連接酶)擴增后，通過Micro-particleEnzymeImmunoassay(MEIA)自動分析儀檢測靶物質(zhì)。4.BDProbeTec(BectonDickinson，USA)。BDProbeTec技術(shù)基本上由以下步驟組成(i)加熱NALC-NaOH處理的樣品，(ii)凈化，(iii)擴增(SDA)，(iv)雜交和(v)檢測。通過鋯珠和二氧化硅加上在Lysolyzer儀(BectonDickinson)中高溫孵育，機械破碎分枝桿菌細胞壁。隨后的破碎利用另一儀器，F(xiàn)astPrep儀(Bio101，Vista，USA)。然后，使用完全自動化的BDProbeTec儀分析樣品，即，擴增和雜交。產(chǎn)物通過與BDProbeTec儀一起提供的分光光度計進行檢測?？傊?，這些商業(yè)技術(shù)十分復(fù)雜、昂貴，包括高的運轉(zhuǎn)費用，一般不適用于發(fā)展中國家。這些國家也恰好是最為需要價廉、快速且有效的診斷試驗的高發(fā)病率國家。兩種最常用的涂片顯微鏡檢術(shù)方法是直接涂片檢查(Akhtar等，2000)和CDC，Atlanta，U.S.A.推薦的濃縮方法(Koneman等，1997)。這些方法的缺點列舉如下目前的涂片顯微鏡檢術(shù)方法的缺點直接涂片檢查的缺陷1.該方法盡管非常快速且相對容易，然而缺乏靈敏度。檢測下限為大約10,000個耐酸性桿菌(AFB)/ml痰(Kent和Kubica，1995)。2.該方法涉及收集痰的含膿部分以便獲得最佳結(jié)果。這就需要正確地訓(xùn)練技術(shù)人員鑒別含膿部分，未成功收集該部分可能導(dǎo)致即使從含有＞10,000個AFB/ml的痰樣品也會獲得假陰性涂片報告。3.直接涂片方法優(yōu)選含膿的“理想”痰樣品。帶有鼻因排出物或唾液的樣品盡管可能含有可檢測水平的AFB，也不被鼓勵使用。4.由于處理的是痰的含膿部分，故存在涂片可能過厚而不適于涂片顯微鏡檢術(shù)的可能性。即使使用適當(dāng)涂布的載玻片，由于痰中存在的粘液、蛋白質(zhì)和組織/細胞碎屑而導(dǎo)致的復(fù)染也常常妨礙對載玻片的正確閱讀。5.該方法主要用于痰樣品。涂片檢查的濃縮方法(NALC-NaOH法)的缺點1.該方法盡管處理整個痰樣品，但是涉及昂貴試劑NALC。2.該試劑需要每次在樣品處理前新鮮制備。3.該方法被開發(fā)出發(fā)僅僅廣泛地用于痰樣品。4.對于少菌型(paucibacillary)樣品，涂布僅僅一或兩環(huán)濃縮樣品并不總是允許在涂片上存在可檢測水平的AFB。目前培養(yǎng)方法的缺點在固體和液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)前，臨床樣品常規(guī)地進行凈化以除去分枝桿菌以外的生物體。由于分枝桿菌生長緩慢而且培養(yǎng)物會被更快速生長的污染性生物淹沒，故這是必需的。最普遍使用的凈化方法使用2-3％NaOH以及粘液溶解劑NALC。1.CDC方法(NALC/NaOH法)利用NaOH作為凈化劑，而NaOH需要完全地被中和。不如此做將使得樣品不適于培養(yǎng)。2.該方法被開發(fā)出來廣泛地用于痰樣品。3.使用2％NaOH的凈化作用不是總是適合具有潮濕氣候的熱帶國家，在這些國家推薦使用3％NaOH，而這會由于毒性作用導(dǎo)致極小化活分枝桿菌回收率(Krasnow和Wayne，1966)。目前所用的用于分枝桿菌PCR的DNA分離方法的缺點1.目前沒有可以從所有類型的肺和肺外樣品分離分枝桿菌DNA的通用方法。2.大多數(shù)DNA分離方法涉及危險的有機試劑或昂貴的酶。3.沒有保證從所有類型的臨床樣品分離到無PCR質(zhì)量抑制劑的分枝桿菌DNA的且有利于環(huán)境的方法。本發(fā)明的目的本發(fā)明的主要目的是開發(fā)一種經(jīng)濟有效地加工可用于簡單、快速、安全、靈敏和準(zhǔn)確地診斷結(jié)核病及一些革蘭氏陽性細菌感染的臨床樣品的方法。本發(fā)明的另一主要目的是開發(fā)涂片、培養(yǎng)或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)(使用PCR可擴增的分枝桿菌DNA和RNA)起始材料形式的經(jīng)加工樣品。本發(fā)明的再一目的是開發(fā)一組可用于篩選結(jié)核病患者的引物。本發(fā)明的再一目的是開發(fā)經(jīng)加工的臨床樣品。本發(fā)明的再一目的是開發(fā)一種單獨包括了樣品加工和最常見的實驗室TB診斷方法(即，涂片顯微鏡檢術(shù)、培養(yǎng)和PCR/RT-PCR)的單一方法學(xué)。本發(fā)明的再一目的是開發(fā)一種對于結(jié)核的肺和肺外情況而言可用于所有類型的臨床材料而不僅僅是用于痰的方法學(xué)。本發(fā)明的再一目的是使得可以從具有極少細菌載量的樣品顯微鏡觀察AFB。本發(fā)明的再一目的是開發(fā)一種非NaOH處理的凈化方法，該方法可以避免樣品中和的繁瑣過程并且降低毒性。再一目的是消除對NALC或其它昂貴粘液溶解劑的使用。本發(fā)明的再一目的是可以廣泛地應(yīng)用于從所有分枝桿菌物種(包括機會病原體)鑒定、分離和擴增DNA。本發(fā)明的再一目的是從各種肺和肺外樣品分離無抑制劑的PCR可擴增DNA。本發(fā)明的再一目的是在從臨床材料分離干凈的PCR可擴增DNA時避免使用有機溶劑和酶。本發(fā)明的再一目的是在無毒且可以以有利于環(huán)境的方式安全使用的方法中使用離液劑。本發(fā)明的再一目的是開發(fā)一種最少依賴于冷凍高速離心和復(fù)雜儀器的簡單方法學(xué)。本發(fā)明的再一目的是開發(fā)一種在操作中涉及最少的樣品在管間的轉(zhuǎn)移從而防止樣品丟失的方法。本發(fā)明的再一目的是開發(fā)一種與從臨床樣品分離分枝桿菌RNA相容的方法。本發(fā)明的再一目的是開發(fā)一種用于診斷結(jié)核病的模塊化技術(shù)(modulartechnology)。本發(fā)明的再一目的是開發(fā)一種用于加工臨床樣品以鑒定疾病狀況的高靈敏方法。發(fā)明概述本發(fā)明涉及一種有效且經(jīng)濟的加工臨床樣品的方法，所述臨床樣品可以用于簡單、快速、安全、靈敏和準(zhǔn)確地診斷細菌感染，該方法使用包含由通用樣品加工(USP)溶液(由濃度3至6M的鹽酸胍(GuHCl)、濃度40-60mM且pH7.3-7.7的Tris-Cl、濃度20-30mM的EDTA、濃度0.3-0.8％的十二烷基肌氨酸鈉、濃度為0.1-0.3M的β-巰基乙醇組成)組成的溶液1、由濃度65-70mM且pH6.7-6.8的磷酸鈉組成的溶液2(可選擇地，可以由無菌水代替)、和由濃度0.03-0.08％的Tween80組成的溶液3、及用于分離DNA的包含濃度8-12％的Chelex100懸浮液的溶液A、由濃度0.02-0.04％的TritonX-100組成的溶液B和包含濃度0.2-0.4％的Tween20的溶液C的組合物(任選地，可以使用單獨溶液3或具有0.03-0.1％TritonX100的溶液3替代溶液A、B和C從含高桿菌載量或低廢料的樣品分離DNA)，所述方法包括步驟向樣品添加1.5至2體積溶液1并勻漿、向勻漿物添加溶液2或無菌水并離心得到沉淀、用溶液1再次洗滌沉淀(任選地，對于含有高廢料(junk)的樣品)、用水洗滌經(jīng)溶液1洗滌后的沉淀、和將水洗后的沉淀重新懸浮在溶液3中獲得形式適于通過涂片顯微鏡檢術(shù)、培養(yǎng)和PCR實施標(biāo)準(zhǔn)診斷程序的經(jīng)加工樣品；本發(fā)明還涉及包含上述溶液和兩組引物——第一組分別是SEQIDNO1和SEQIDNO2的devRf2和devRr2以及第二組分別是SEQIDNO3和SEQIDNO4的devRf3和devRr3——的試劑盒、以及使用所述引物通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)篩選結(jié)核病患者的方法。發(fā)明詳述因此，本發(fā)明涉及一種有效且經(jīng)濟的臨床樣品加工方法，所述臨床樣品可以用于簡單、快速、安全、靈敏和準(zhǔn)確地診斷細菌感染，該方法使用包含由通用樣品加工(USP)溶液(由濃度為3至6M的鹽酸胍(GuHCl)、濃度為40-60mM且pH為7.3-7.7的Tris-Cl、濃度為20-30mM的EDTA、濃度為0.3-0.8％的十二烷基肌氨酸鈉、濃度為0.1-0.3M的β-巰基乙醇組成)組成的溶液1、由濃度為65-70mM且pH為6.7-6.8的磷酸鈉組成的溶液2(可選擇地，可以由無菌水代替)、和由濃度0.03-0.08％的Tween80組成的溶液3、及用于分離DNA的包含濃度8-12％的Chelex100懸浮液的溶液A、由濃度0.02-0.04％的TritonX-100組成的溶液B和包含濃度0.2-0.4％的Tween20的溶液C的組合物(任選地，可以使用單獨溶液3或具有0.03-0.1％TritonX100的溶液3替代溶液A、B和C從含高桿菌載量或低廢料的樣品分離DNA)，所述方法包括步驟向樣品添加1.5至2體積溶液1并勻漿、向勻漿物添加溶液2或無菌水并離心得到沉淀、用溶液1再次洗滌沉淀(任選地，對于含有高廢料的樣品)、用水洗滌經(jīng)溶液1洗滌后的沉淀、和將水洗后的沉淀重新懸浮在溶液3中獲得形式適于通過涂片顯微鏡檢術(shù)、培養(yǎng)和PCR實施標(biāo)準(zhǔn)診斷程序的經(jīng)加工樣品；本發(fā)明還涉及包含上述溶液和兩組引物——第一組分別是SEQIDNO1和SEQIDNO2的devRf2和devRr2以及第二組分別是SEQIDNO3和SEQIDNO4的devRf3和devRr3——的試劑盒、以及使用所述引物通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)篩選結(jié)核病患者的方法。在本發(fā)明的一個實施方案中，其中涉及一種有效且經(jīng)濟的臨床樣品加工方法，所述臨床樣品可以用于簡單、快速、安全、靈敏和準(zhǔn)確地診斷細菌感染，所述方法使用包含由通用樣品加工(USP)溶液(由濃度為3至6M的鹽酸胍(GuHCl)、濃度為40-60mM且pH為7.3-7.7的Tris-Cl、濃度為20-30mM的EDTA、濃度為0.3-0.8％的十二烷基肌氨酸鈉、濃度為0.1-0.3M的β-巰基乙醇組成)組成的溶液1、由濃度為65-70mM且pH為6.7-6.8的磷酸鈉組成的溶液2(可選擇地，可以由無菌水代替)、和由濃度0.03-0.08％的Tween80組成的溶液3、及用于分離DNA的包含濃度8-12％的Chelex100懸浮液的溶液A、由濃度0.02-0.04％的TritonX-100組成的溶液B和包含濃度0.2-0.4％的Tween20的溶液C的組合物(任選地，可以使用單獨溶液3或具有0.03-0.1％TritonX100的溶液3替代溶液A、B和C從含高桿菌載量或低廢料的樣品分離DNA)，所述方法包括步驟·獲得臨床樣品，·將樣品與1.5至2體積溶液1混合，·勻漿混合物同時避免起泡，·向勻漿物添加溶液2或無菌水并隨后離心得到沉淀，·取決于沉淀體積的減少，任選地用溶液1洗滌沉淀，·用水洗滌經(jīng)溶液1洗滌后的沉淀，和·將水洗后的沉淀重新懸浮在溶液3中獲得用于診斷的經(jīng)加工樣品。在本發(fā)明另一實施方案中，其中經(jīng)加工的樣品可以以涂片、培養(yǎng)物或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)起始材料(使用PCR可擴增的分枝桿菌DNA和RNA)的形式使用。在本發(fā)明再一實施方案中，其中所述通用樣品加工(USP)溶液包含濃度3-6M的鹽酸胍(GuHCl)、濃度40-60mM且pH7.3-7.7的Tris-Cl、濃度20-30mM的EDTA、濃度0.3-0.8％的十二烷基肌氨酸鈉、濃度0.1-0.3M的β-巰基乙醇。本發(fā)明再一實施方案中，其中所述經(jīng)加工樣品可以用于分枝桿菌，包括結(jié)核分枝桿菌和革蘭氏陽性生物如葡萄球菌屬種(Staphylococcussp.)的涂片顯微鏡檢術(shù)。本發(fā)明另一實施方案中，其中要求勻漿持續(xù)20-120秒。本發(fā)明另一實施方案中，其中溶液1的鹽酸胍裂解真核和革蘭氏陰性細胞、使蛋白質(zhì)變性、液化樣品和失活內(nèi)源性酶。本發(fā)明另一實施方案中，其中所述加工在總共1-2小時的持續(xù)時間內(nèi)完成。本發(fā)明再一實施方案中，其中所述方法產(chǎn)生無抑制劑的分枝桿菌DNA，該DNA可用于基于PCR診斷分枝桿菌疾病，包括TB和麻風(fēng)病。本發(fā)明另一實施方案中，其中用于僅僅加工培養(yǎng)和涂片樣品的通用樣品加工(USP)溶液包含濃度大約4M的鹽酸胍(GuHCl)、濃度40-60mM且pH7.3-7.7的Tris-Cl、濃度20-30mM的EDTA、濃度0.3-0.8％的十二烷基肌氨酸鈉、濃度大約0.1M的β-巰基乙醇。本發(fā)明另一實施方案中，其中用于加工培養(yǎng)、涂片和PCR樣品的所述通用樣品加工(USP)溶液包含濃度大約5M的鹽酸胍(GuHCl)、濃度40-60mM且pH7.3-7.7的Tris-Cl、濃度20-30mM的EDTA、濃度0.3-0.8％的十二烷基肌氨酸鈉、濃度0.1-0.2M的β-巰基乙醇。本發(fā)明另一實施方案中，其中用于僅加工涂片和PCR樣品的所述通用樣品加工(USP)溶液包含濃度大約6M的鹽酸胍(GuHCl)、濃度40-60mM且pH7.3-7.7的Tris-Cl、濃度20-30mM的EDTA、濃度0.3-0.8％的十二烷基肌氨酸鈉、濃度大約0.2M的β-巰基乙醇。本發(fā)明另一實施方案中，其中USP中的鹽酸胍(GuHCl)、十二烷基肌氨酸鈉和β-巰基乙醇以協(xié)同方式作用以實現(xiàn)對所有類型的臨床樣品的最佳加工。本發(fā)明另一實施方案中，其中β-巰基乙醇和十二烷基肌氨酸鈉的存在適于粘液樣痰樣品的最佳加工。本發(fā)明另一實施方案中，其中GuHCl以及β-巰基乙醇和十二烷基肌氨酸鈉的存在對于粘液膿性的痰樣品的最佳加工是絕對必需的。本發(fā)明另一實施方案中，其中對于含有血液的樣品，GuHCl通過變性血紅蛋白和從樣品中除去該蛋白質(zhì)而作為主要的抑制劑去除組分起作用。本發(fā)明另一實施方案中，其中GuHCl作為臨床樣品的主要凈化劑起作用。本發(fā)明另一實施方案中，其中對于含有高桿菌載量和/或較低量廢料的樣品，PCR可擴增的分枝桿菌DNA可以通過在溶液3和/或0.03-0.1％TritonX100存在下煮沸、借助簡單的裂解作用而獲得，而無需使用溶液A、B和C。本發(fā)明另一實施方案中，其中所述經(jīng)加工的樣品無污染生物、蛋白質(zhì)、酶和干擾性物質(zhì)。本發(fā)明另一實施方案中，其中在涂片顯微鏡檢術(shù)下所述方法可以檢測到大約300-400個桿菌/ml的樣品。靈敏度(檢測限)可以進一步通過將超過所建議的10％的經(jīng)加工樣品用于涂片顯微鏡檢而增加。本發(fā)明另一實施方案中，其中所述方法比常規(guī)直接涂片顯微鏡檢方法具有增強大約30倍的靈敏度。本發(fā)明另一實施方案中，其中在涂片中所述方法顯示出97-99％的靈敏度。本發(fā)明另一實施方案中，其中在涂片中所述方法顯示出83-92％的特異性。本發(fā)明另一實施方案中，其中所述方法顯示出比涂片顯微鏡檢術(shù)的CDC方法增加大約18％的靈敏度。本發(fā)明另一實施方案中，其中所述方法顯示比直接涂片方法增加大約30％的靈敏度。本發(fā)明另一實施方案中，其中在涂片中所述方法顯示出80-96％的陽性預(yù)測值。本發(fā)明另一實施方案中，其中在涂片中所述方法顯示出91-99％的陰性預(yù)測值。本發(fā)明另一實施方案中，其中在涂片中所述方法顯示出大約91％的診斷準(zhǔn)確度。本發(fā)明另一實施方案中，其中所述方法降低復(fù)染背景使得可以更好地觀察載玻片、提高載玻片的分級(gradation)、并減少閱讀載玻片的時間和勞動。本發(fā)明另一實施方案中，其中所述方法比CDC方法更有效地進行樣品的凈化。本發(fā)明另一實施方案中，其中在培養(yǎng)中，與未處理的微生物相比，所述方法導(dǎo)致微生物菌落延遲大約1周出現(xiàn)。本發(fā)明另一實施方案中，其中在培養(yǎng)中所述方法顯示出大約50％的靈敏度。本發(fā)明另一實施方案中，其中所述方法比CDC方法更適于熱帶區(qū)域。本發(fā)明另一實施方案中，其中在培養(yǎng)中所述方法在中性pH下運行。本發(fā)明另一實施方案中，其中在PCR中所述方法顯示出測試的任何臨床樣本類型對PCR試驗均無抑制。本發(fā)明另一實施方案中，其中在PCR中所述方法顯示出96.5-100％的靈敏度。本發(fā)明另一實施方案中，其中在PCR中所述方法顯示出71-100％的特異性。本發(fā)明另一實施方案中，其中在使用所述引物的PCR中所述方法顯示出82-100％的陽性預(yù)測值。本發(fā)明另一實施方案中，其中在使用所述引物的PCR中所述方法顯示出94-100％的陰性預(yù)測值。本發(fā)明另一實施方案中，其中在使用所述引物的PCR中所述方法顯示出大約90-100％的診斷準(zhǔn)確度。本發(fā)明另一實施方案中，其中樣品可以獲自包含各種類型的痰的來源和其它體液，包括FNAC、膿、胸膜液、心包液、關(guān)節(jié)吸出物(jointaspirate)、腹膜液、腦脊髓液、子宮內(nèi)膜吸出物、滑液、胃吸出物、氣管內(nèi)吸出物、尿、經(jīng)氣管吸出物、支氣管肺泡灌洗液、喉拭子和鼻咽拭子；身體組織，包括血液、胸膜組織、骨髓和活檢物；實體器官，包括淋巴結(jié)、骨、皮膚，和牛(bovine)樣品，包括淋巴腺、乳汁和血液。本發(fā)明另一實施方案中，其中可以加工在大約-20℃儲存多達2個月的樣品用于PCR、涂片顯微鏡檢術(shù)和培養(yǎng)。本發(fā)明另一實施方案中，其中在PCR中所述方法可以用于DNA和RNA。本發(fā)明另一實施方案中，其中所述組合物顯示出粘液溶解、凈化、變性蛋白質(zhì)、離液劑作用、液化、軟化/消化組織以及釋放分枝桿菌的作用。本發(fā)明另一實施方案中，其中在涂片中所述方法使得可以將更多的桿菌涂布在載玻片上，由此增加靈敏度和效力。本發(fā)明另一實施方案中，其中在涂片中所述方法一般地將通過直接方法分級為1+或極少的(scanty)載玻片分別轉(zhuǎn)變?yōu)?+/3+或2+/1+。本發(fā)明另一實施方案中，其中所述方法有助于加工缺少膿或含有鼻咽排出物和/或唾液和/或血液的痰樣品。本發(fā)明另一實施方案中，其中所述方法從組織活檢樣品產(chǎn)生適于非常靈敏的AFB涂片顯微鏡檢術(shù)的高質(zhì)量涂片。本發(fā)明另一主要實施方案中，其中涉及一種有效且經(jīng)濟的加工臨床樣品的方法，所述臨床樣品可以用于簡單、快速、安全、靈敏和準(zhǔn)確地診斷分枝桿菌感染(尤其是由結(jié)核分枝桿菌引起的結(jié)核病)，所述方法使用包含由通用樣品加工(USP)溶液(由濃度為3至6M的鹽酸胍(GuHCl)、濃度為40-60mM且pH為7.3-7.7的Tris-Cl、濃度為20-30mM的EDTA、濃度為0.3-0.8％的十二烷基肌氨酸鈉、濃度為0.1-0.3M的β-巰基乙醇組成)組成的溶液1、由濃度為65-70mM且pH為6.7-6.8的磷酸鈉組成的溶液2(可選擇地，可以由無菌水代替)、和由濃度0.03-0.08％的Tween80組成的溶液3、以及用于分離DNA的包含濃度8-12％的Chelex100懸浮液的溶液A、由濃度0.02-0.04％的TritonX-100組成的溶液B和包含濃度0.2-0.4％的Tween20的溶液C(任選地，可以使用單獨溶液3或具有0.03-0.1％TritonX100的溶液3替代溶液A、B和C從含高桿菌載量或低廢料的樣品分離DNA)的組合物，所述方法包括步驟·獲得臨床樣品，·將樣品與1.5至2體積溶液1混合，·勻漿混合物同時避免起泡，·向勻漿物添加溶液2并離心得到沉淀，任選地溶液2可以由無菌水替代，·用溶液1洗滌沉淀，·用水洗滌經(jīng)溶液1洗滌后的沉淀，和·將水洗后的沉淀重新懸浮在溶液3中獲得用于診斷的經(jīng)加工樣品。本發(fā)明另一實施方案中，其中所述經(jīng)加工樣品可以以涂片、培養(yǎng)物或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)起始材料(使用PCR可擴增的分枝桿菌DNA和RNA)的形式使用。本發(fā)明另一實施方案中，其中所述經(jīng)加工樣品可以以涂片、培養(yǎng)物或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)起始材料的形式使用，其中可以通過煮沸的簡單裂解作用獲得PCR可擴增的分枝桿菌DNA。本發(fā)明另一實施方案中，其中所述通用樣品加工(USP)溶液包含濃度為3-6M的鹽酸胍(GuHCl)、濃度為40-60mM且pH為7.3-7.7的Tris-Cl、濃度為20-30mM的EDTA、濃度為0.3-0.8％的十二烷基肌氨酸鈉、濃度為0.1-0.3M的β-巰基乙醇。本發(fā)明另一實施方案中，其中所述方法維持分枝桿菌和某些革蘭氏陽性細菌的生存力。本發(fā)明另一實施方案中，其中要求勻漿持續(xù)20-120秒。本發(fā)明另一實施方案中，其中溶液1的鹽酸胍裂解真核和革蘭氏陰性細胞、使蛋白質(zhì)變性、液化樣品和失活內(nèi)源性酶。本發(fā)明另一實施方案中，其中所述加工在總共1-2小時的持續(xù)時間內(nèi)完成。本發(fā)明再一實施方案中，其中所述方法產(chǎn)生可用于基于PCR的診斷的、無抑制劑的分枝桿菌DNA。本發(fā)明另一實施方案中，其中用于加工培養(yǎng)和涂片樣品的通用樣品加工(USP)溶液包含濃度大約4M的鹽酸胍(GuHCl)、濃度40-60mM且pH7.3-7.7的Tris-Cl、濃度20-30mM的EDTA、濃度0.3-0.8％的十二烷基肌氨酸鈉、濃度大約0.1M的β-巰基乙醇。本發(fā)明另一實施方案中，其中用于加工培養(yǎng)、涂片和PCR樣品的所述通用樣品加工(USP)溶液包含大約5M的鹽酸胍(GuHCl)、濃度40-60mM且pH7.3-7.7的Tris-Cl、濃度20-30mM的EDTA、濃度0.3-0.8％的十二烷基肌氨酸鈉、濃度0.1-0.2M的β-巰基乙醇。本發(fā)明另一實施方案中，其中用于加工涂片和PCR樣品的所述通用樣品加工(USP)溶液包含濃度大約6M的鹽酸胍(GuHCl)、濃度40-60mM且pH7.3-7.7的Tris-Cl、濃度20-30mM的EDTA、濃度0.3-0.8％的十二烷基肌氨酸鈉、濃度大約0.2M的β-巰基乙醇。本發(fā)明另一實施方案中，其中所述組合物包含由通用樣品加工(USP)溶液組成的溶液1、由濃度為65-70mM且pH為6.7-6.8的磷酸鈉組成的溶液2、由濃度0.03-0.08％的Tween80組成的溶液3、以及任選地，包含濃度8-12％的Chelex100懸浮液的溶液A、和/或由濃度0.02-0.04％的TritonX-100組成的溶液B、和/或濃度0.2-0.4％的Tween20。本發(fā)明另一實施方案中，其中溶液A、溶液B和溶液C的應(yīng)用可以限于僅從低桿菌載量的樣品中分離DNA。本發(fā)明另一實施方案中，其中USP中的鹽酸胍(GuHCl)、十二烷基肌氨酸鈉和β-巰基乙醇以協(xié)同方式作用以便實現(xiàn)對所有類型的臨床樣品的最佳加工。本發(fā)明另一實施方案中，其中β-巰基乙醇和十二烷基肌氨酸鈉的存在適于粘液樣痰樣品的最佳加工。本發(fā)明另一實施方案中，其中GuHCl以及β-巰基乙醇和十二烷基肌氨酸鈉的存在對于粘液膿性痰樣品的最佳加工是絕對必需的。本發(fā)明另一實施方案中，其中對于含有血液的樣品，GuHCl通過變性血紅蛋白和從樣品中除去該蛋白質(zhì)而作為主要的抑制劑去除組分起作用。本發(fā)明另一實施方案中，其中GuHCl作為臨床樣品的主要凈化劑起作用。本發(fā)明另一實施方案中，其中對于含有高桿菌載量和/或較低的廢料含量的樣品，PCR可擴增的分枝桿菌DNA可以通過在溶液3存在下煮沸和/或通過添加0.03-0.1％TritonX100，經(jīng)簡單裂解而獲得，而無需使用溶液A、B和C。本發(fā)明另一實施方案中，其中所述經(jīng)加工的樣品無污染生物、蛋白質(zhì)、酶和干擾性物質(zhì)。本發(fā)明另一實施方案中，其中在涂片顯微鏡檢術(shù)下所述方法可以檢測到300-400個桿菌/ml樣品。靈敏度(檢測限)可以進一步通過將超過所建議的10％的經(jīng)加工樣品用于涂片顯微鏡檢而增加。本發(fā)明另一實施方案中，其中所述方法比常規(guī)直接涂片顯微鏡檢方法具有增強大約30倍的靈敏度。本發(fā)明另一實施方案中，其中在涂片中所述方法顯示出97-99％的靈敏度。本發(fā)明另一實施方案中，其中在涂片中所述方法顯示出83-92％的特異性。本發(fā)明另一實施方案中，其中所述方法顯示出比涂片顯微鏡檢術(shù)的CDC方法增加大約18％的靈敏度。本發(fā)明另一實施方案中，其中所述方法顯示出比直接涂片法增加大約30％的靈敏度。本發(fā)明另一實施方案中，其中在涂片中所述方法顯示出80-96％的陽性預(yù)測值。本發(fā)明另一實施方案中，其中在涂片中所述方法顯示出91-99％的陰性預(yù)測值。本發(fā)明另一實施方案中，其中在涂片中所述方法顯示出大約91％的診斷準(zhǔn)確度。本發(fā)明另一實施方案中，其中所述方法降低復(fù)染背景使得可以更好地觀察載玻片、提高載玻片的分級(gradation)、并減少閱讀載玻片的時間和勞動。本發(fā)明另一實施方案中，其中所述方法比CDC方法更有效地進行樣品的凈化。本發(fā)明另一實施方案中，其中在培養(yǎng)中所述方法顯示出微生物的生存力是CDC方法的兩倍。本發(fā)明另一實施方案中，其中在培養(yǎng)中，與未處理的微生物相比，所述方法導(dǎo)致微生物菌落延遲大約1周出現(xiàn)。本發(fā)明另一實施方案中，其中在培養(yǎng)中所述方法顯示出大約50％的靈敏度。本發(fā)明另一實施方案中，其中所述方法比CDC方法更適于熱帶區(qū)域。本發(fā)明另一實施方案中，其中在培養(yǎng)中所述方法在中性pH下運行。本發(fā)明另一實施方案中，其中在PCR中所述方法顯示出測試的任何樣本類型對PCR試驗均無抑制。本發(fā)明另一實施方案中，其中在PCR中所述方法顯示微生物結(jié)核分枝桿菌的devR基因的兩組引物，即，devRf2&devRr2、和devRf3&devRr3。本發(fā)明另一實施方案中，其中引物devRf2和devRr2擴增微生物結(jié)核分枝桿菌devR基因的308bp片段。本發(fā)明另一實施方案中，其中引物devRf3和devRr3擴增微生物結(jié)核分枝桿菌devR基因的164bp片段。本發(fā)明另一實施方案中，其中在使用引物devRf2和devRr2的PCR中所述方法顯示出比devRf和devRr增加2-4倍的靈敏度。本發(fā)明另一實施方案中，其中在使用引物devRf3和devRr3的PCR中所述方法顯示出比devRf和devRr增加至少10倍的靈敏度。本發(fā)明另一實施方案中，其中樣品可以獲自包含各種類型的痰的來源和其它體液，包括FNAC、膿、胸膜液、心包液、關(guān)節(jié)吸出物(jointaspirate)、腹膜液、腦脊髓液、子宮內(nèi)膜吸出物、滑液、胃吸出物、氣管內(nèi)吸出物、尿、經(jīng)氣管吸出物、支氣管肺泡灌洗液、喉拭子和鼻咽拭子；身體組織，包括血液、胸膜組織、骨髓和活檢物；實體器官，包括淋巴結(jié)、骨、皮膚，和牛樣品，包括淋巴腺、乳汁和血液。本發(fā)明另一實施方案中，其中可以加工在大約-20℃儲存多達2個月的樣品用于PCR、涂片顯微鏡檢術(shù)和培養(yǎng)。本發(fā)明另一實施方案中，其中在PCR中所述方法可以用于DNA和RNA。本發(fā)明另一實施方案中，其中所述組合物顯示出粘液溶解、凈化、變性蛋白質(zhì)、離液作用、液化、軟化/消化組織以及釋放分枝桿菌的作用。本發(fā)明另一實施方案中，其中在涂片中所述方法使得可以將更多的桿菌涂在載玻片上，由此增加靈敏度和功效。本發(fā)明另一實施方案中，其中在涂片中所述方法一般地將通過直接方法分級為1+或極少的載玻片分別轉(zhuǎn)變?yōu)?+/3+或2+/1+。本發(fā)明另一實施方案中，其中可以加工缺少膿或含有鼻咽排出物或唾液的樣品。本發(fā)明另一實施方案中，其中所述方法從組織活檢樣品產(chǎn)生適于非常靈敏的AFB涂片顯微鏡檢術(shù)的高質(zhì)量涂片。本發(fā)明另一實施方案中，其中所述方法對結(jié)核分枝桿菌的耐酸性質(zhì)、生存力、和完整性未顯示出不利影響。本發(fā)明另一實施方案中，其中所述方法適于診斷肺結(jié)核和肺外結(jié)核且功效相同。本發(fā)明另一實施方案中，其中所述方法與在固體和液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)來自臨床樣品的分枝桿菌相容。本發(fā)明另一實施方案中，其中對于通過涂片顯微鏡檢術(shù)的直接方法和CDC方法已經(jīng)檢測為陰性的樣品，所述方法可以將其檢測為陽性。本發(fā)明另一實施方案中，其中涉及可用于加工臨床樣品的試劑盒，所述臨床樣品可以用于簡單、快速、安全、靈敏和準(zhǔn)確地診斷微生物疾病狀態(tài)，所述試劑盒包含由通用樣品加工(USP)溶液組成的溶液1、由濃度為65-70mM且pH為6.7-6.8的磷酸鈉組成的溶液2(可選擇地，可以由無菌水代替)、由濃度0.03-0.08％的Tween80組成的溶液3、包含濃度8-12％的Chelex100懸浮液的溶液A、由濃度0.02-0.04％的TritonX-100組成的溶液B和由濃度0.2-0.4％的Tween20組成的溶液C，任選地兩組引物——分別為SEQIDNO1和SEQIDNO2的devRf2和devRr2引物和分別為SEQIDNO3和SEQIDNO4的devRf3和devRr3引物。本發(fā)明另一實施方案中，其中所述試劑盒用于加工可以用于檢測細菌感染的臨床樣品。本發(fā)明另一實施方案中，其中所述試劑盒用于加工可以用于檢測結(jié)核病的臨床樣品。本發(fā)明另一實施方案中，其中所述通用樣品加工(USP)溶液包含濃度為3-6M的鹽酸胍(GuHCl)、濃度為40-60mM且pH為7.3-7.7的Tris-Cl、濃度為20-30mM的EDTA、濃度為0.3-0.8％的十二烷基肌氨酸鈉、濃度為0.1-0.3M的β-巰基乙醇。本發(fā)明另一實施方案中，其中用于加工培養(yǎng)和涂片樣品的通用樣品加工(USP)溶液包含濃度大約4M的鹽酸胍(GuHCl)、濃度40-60mM且pH7.3-7.7的Tris-Cl、濃度20-30mM的EDTA、濃度0.3-0.8％的十二烷基肌氨酸鈉、濃度大約0.1M的β-巰基乙醇。本發(fā)明另一實施方案中，其中用于加工培養(yǎng)、涂片和PCR樣品的所述通用樣品加工(USP)溶液包含濃度大約5M的鹽酸胍(GuHCl)、濃度40-60mM且pH7.3-7.7的Tris-Cl、濃度20-30mM的EDTA、濃度0.3-0.8％的十二烷基肌氨酸鈉、濃度0.1-0.2M的β-巰基乙醇。本發(fā)明另一實施方案中，其中用于加工涂片和PCR樣品的所述通用樣品加工(USP)溶液包含濃度大約6M的鹽酸胍(GuHCl)、濃度40-60mM且pH7.3-7.7的Tris-Cl、濃度20-30mM的EDTA、濃度0.3-0.8％的十二烷基肌氨酸鈉、濃度大約0.2M的β-巰基乙醇。本發(fā)明另一實施方案中，其中所述組合物包含由通用樣品加工(USP)溶液組成的溶液1、由濃度為65-70mM且pH為6.7-6.8的磷酸鈉組成的溶液2(任選地，可以用無菌水代替)、由濃度0.03-0.08％的Tween80組成的溶液3、以及任選地，包含濃度8-12％的Chelex100懸浮液的溶液A、和/或由濃度0.02-0.04％的TritonX-100組成的溶液B、和/或濃度0.2-0.4％的Tween20。本發(fā)明另一實施方案中，其中涉及一組分別具有SEQIDNO1和SEQIDNO2的devRf2和devRr2引物。本發(fā)明另一實施方案中，其中涉及一組分別具有SEQIDNO3和SEQIDNO4的devRf3和devRr3引物。本發(fā)明另一實施方案中，其中涉及使用基因devR的SEQIDNO1和2或SEQIDNO3和4的引物篩選結(jié)核病患者的方法，所述方法包括步驟使用從受試者的經(jīng)加工樣品獲得的結(jié)核分枝桿菌DNA或RNA實施聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，鑒定患有結(jié)核的受試者。本發(fā)明另一實施方案中，其中經(jīng)加工的臨床樣品通過使用本文描述的方法加工臨床樣品而獲得。本發(fā)明另一實施方案中，其中樣品可以獲自包含各種類型的痰的來源和其它體液，包括FNAC、膿、胸膜液、心包液、關(guān)節(jié)吸出物(jointaspirate)、腹膜液、腦脊髓液、子宮內(nèi)膜吸出物、滑液、胃吸出物、氣管內(nèi)吸出物、尿、經(jīng)氣管吸出物、支氣管肺泡灌洗液、喉拭子和鼻咽拭子；身體組織，包括血液、胸膜組織、骨髓和活檢物；實體器官，包括淋巴結(jié)、骨、皮膚，和牛樣品，包括淋巴腺、乳汁和血液。本發(fā)明另一實施方案中，其中所述方法包括新的通用樣品加工(USP)溶液的應(yīng)用。簡單的說，USP方法包括在通過使用USP溶液處理的臨床樣品上實施的勻漿、液化和凈化步驟、離心濃縮分枝桿菌的步驟和洗滌步驟。鹽酸胍與還原劑和緩沖溶液中的試劑一起構(gòu)成USP的活性成分。該離液劑鹽酸胍有效地裂解真核細胞以及除了分枝桿菌外的大多數(shù)細菌，使蛋白質(zhì)(包括粘蛋白)變性和由此造成痰的液化，以及失活內(nèi)源性酶(包括DNase和RNase)。蛋白質(zhì)、碎屑和其它污染物在隨后的快速洗滌步驟中除去。分枝桿菌的獨特細胞壁特性使得其可以選擇性抵抗離液劑的作用，所得細菌適用于涂片顯微鏡檢術(shù)、培養(yǎng)、PCR、RNA分離和利用由此分離的DNA和RNA的操作。整個樣品加工過程可以在至2小時內(nèi)完成。該過程不涉及酚氯仿抽提、蛋白質(zhì)消化和沉淀步驟，使得該過程對于一次加工多個樣品是理想的。該方法可應(yīng)用于所有類型的體液、血液、組織活檢物、來自脊椎骨和其它骨關(guān)節(jié)的活檢物和CSF。也適用于加工牛來源的組織活檢物和乳汁。對于痰以外的體液，離心濃縮后的USP溶液和水洗就足以滿足涂片顯微鏡檢術(shù)、培養(yǎng)、核酸分離和擴增的要求。組織樣品需要在USP溶液中勻漿后才可以以正常方式繼續(xù)加工。經(jīng)加工的樣品直接用于涂片顯微鏡檢術(shù)、固體培養(yǎng)基(例如LowensteinJensen(LJ)斜面培養(yǎng)基或Middlebrook7H10瓊脂培養(yǎng)基)或液體培養(yǎng)基(例如在MGIT系統(tǒng)中使用的Middlebrook7H9培養(yǎng)基)上的培養(yǎng)和提取DNA和RNA用于擴增分枝桿菌的DNA和RNA。該方法學(xué)的持續(xù)時間如下至2小時用于樣品加工；1/2至1小時用于涂片顯微鏡檢術(shù)和培養(yǎng)，4小時用于核酸擴增。本發(fā)明是一種通用樣品加工和診斷方法學(xué)，可以應(yīng)用于各種臨床環(huán)境中針對任何臨床樣品類型實驗室診斷結(jié)核病。其快速、價廉且容易，并與涂片顯微鏡檢術(shù)、培養(yǎng)、DNA-RNA分離和PCR/RT-PCR相容。其達到四重目的(i)為涂片顯微鏡檢術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌提供了一種極為靈敏的方法；(ii)制備用于固體或液體實驗室培養(yǎng)基上培養(yǎng)的樣品；(iii)分離無PCR抑制劑的DNA模板；和(iv)提供基于PCR的靈敏特異診斷試驗。這些方法已經(jīng)在臨床樣品上進行過評價。與直接涂片法的68.6％靈敏度和CDC方法的80％靈敏度相比，USP涂片顯微鏡檢術(shù)顯示出97-99％靈敏度。使用培養(yǎng)作為金標(biāo)準(zhǔn)時，‘短靶’PCR試驗產(chǎn)生98.5％靈敏度而‘長靶’PCR試驗顯示73.2％靈敏度。就對于培養(yǎng)的有用性而言，USP方法與常規(guī)方法無顯著性區(qū)別；對于USP和常規(guī)的培養(yǎng)方法，分別注意到50.1％和53.6％的陽性。因此，明顯地，本文描述的方法可以用于操作含有結(jié)核分枝桿菌和MOTT桿菌的樣品并要求從臨床樣品高靈敏地涂片顯微鏡檢耐酸性桿菌、有效地凈化用于培養(yǎng)的臨床樣品和分離用于PCR擴增的分枝桿菌和結(jié)核分枝桿菌DNA的任何實驗室。故，其具有包括在TB/分枝桿菌診斷試劑盒中的潛力。表的簡述表1與直接和CDC涂片方法相比，USP涂片顯微鏡檢術(shù)對涂片狀態(tài)的改善。表2與直接涂片方法相比，USP涂片顯微鏡檢術(shù)對涂片狀態(tài)的改善。表3USP溶液對結(jié)核分枝桿菌生存力的影響。表4使用不同引物對和結(jié)核分枝桿菌DNA比較devRPCR試驗的靈敏度。附圖簡述圖1顯示USP溶液組成改變對痰樣品加工的影響。圖2顯示USP溶液組成改變對痰樣品的涂片顯微鏡檢的影響。圖3a顯示在使用具有不同組成的USP溶液加工痰樣品后獲得的用于PCR的沉淀。圖3b顯示從利用不同組成的USP溶液加工的痰樣品獲得的結(jié)核分枝桿菌DNA的IS6110PCR擴增圖。圖4顯示USP溶液組成改變對痰中分枝桿菌的培養(yǎng)的影響。圖5a顯示USP溶液對不同物理特征的痰的作用。圖5b顯示USP溶液對代表性的組織活檢樣品的作用。圖6比較從分別利用USP、直接涂片法和CDC法加工的相同痰樣品制備的涂片。圖7顯示涂片顯微鏡檢術(shù)的USP方法的耐酸性桿菌檢測限。圖8顯示涂片顯微鏡檢術(shù)的USP方法將陰性樣品轉(zhuǎn)化為陽性。圖9顯示與涂片顯微鏡檢術(shù)的直接方法和CDC方法相比，涂片顯微鏡檢術(shù)的USP方法增強了涂片狀態(tài)。圖10顯示USP溶液處理對結(jié)核分枝桿菌的生存力的影響。圖11顯示用于擴增devR基因的引物。圖12顯示利用從不同分枝桿菌提取的DNA和devRf3及devRr3引物獲得的PCR擴增產(chǎn)物。圖13顯示利用從不同分枝桿菌提取的DNA和devRf2及devRr2引物獲得的PCR擴增產(chǎn)物。圖14顯示使用靶向devR基因的三對不同引物PCR擴增分枝桿菌DNA的系列稀釋物得到的擴增圖譜。圖15比較使用溶液3、具有0.01％TritonX-100的溶液3和裂解劑(溶液A、B和C)裂解從痰分離的PCR可擴增的結(jié)核分枝桿菌DNA。圖16顯示USP處理的非結(jié)核分枝桿菌的分枝桿菌(MOTT)的涂片顯微鏡檢。圖17顯示USP處理后對MOTT桿菌的培養(yǎng)。圖18顯示從USP處理的MOTT桿菌分離的DNA的擴增。圖19顯示利用從痰分離的結(jié)核分枝桿菌RNA進行的RT-PCR反應(yīng)。圖20顯示USP處理的革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細菌的涂片顯微鏡檢。數(shù)據(jù)集的簡述數(shù)據(jù)集1相對于直接涂片法，評價USP涂片法。數(shù)據(jù)集2相對于涂片顯微鏡檢術(shù)的CDC方法，評價USP方法。數(shù)據(jù)集3使用‘短靶’和‘長靶’devRPCR的PCR靈敏度和特異性以及與基于IS6110的PCR試驗的比較。數(shù)據(jù)集4通過USP法加工的肺外樣品的涂片顯微鏡檢和培養(yǎng)狀態(tài)。數(shù)據(jù)集5devR-短靶PCR對于肺外樣品的靈敏度和特異性值(％)。數(shù)據(jù)集6IS6110PCR對于肺外樣品的靈敏度和特異性值(％)。發(fā)明詳述開發(fā)了一種多用途方法用于通過涂片顯微鏡檢術(shù)、培養(yǎng)和PCR實驗室診斷結(jié)核。該方法十分突出地適于制備用于高靈敏顯微鏡檢術(shù)的涂片。其可以有效地凈化樣品從而使樣品適于培養(yǎng)，并可以產(chǎn)生無抑制劑的高質(zhì)量分枝桿菌DNA用于基于PCR的診斷試驗中。該方法還使得可以從臨床樣品利用普通RNA分離程序分離出高質(zhì)量的分枝桿菌RNA。所述加工痰樣品以用于涂片顯微鏡檢術(shù)、培養(yǎng)和PCR的方法如下試劑(i)溶液1通用樣品加工溶液(USP)4-6M鹽酸胍(GuHCl)、50mMTris-Cl，pH7.5、25mMEDTA、0.5％N-十二烷?；“彼?之后稱作十二烷基肌氨酸鈉)溶液、0.1-0.2Mβ-巰基乙醇。(當(dāng)僅實施培養(yǎng)/培養(yǎng)和涂片時優(yōu)選4MGuHCl和0.1Mβ-巰基乙醇；在實施培養(yǎng)以及涂片顯微鏡檢術(shù)和PCR的情況下優(yōu)選5MGuHCl和0.1-0.2Mβ-巰基乙醇；當(dāng)僅實施涂片顯微鏡檢術(shù)、PCR和RT-PCR時優(yōu)選6MGuHCl和0.2Mβ-巰基乙醇)。(ii)溶液268mM磷酸鈉緩沖液，pH6.8(任選的)。(iii)無菌水(優(yōu)選地雙蒸或三蒸)；(在分離RNA的情況下為DEPC處理的無菌水)。(iv)溶液3重懸浮溶液(無菌水中0.05％Tween80)。對于從低桿菌載量的樣品分離DNA，需要如下另外的試劑(i)溶液A10％樹脂懸浮液，所述樹脂為與苯乙烯二乙烯基苯基質(zhì)偶聯(lián)的成對亞氨基二乙酸根離子的鈉鹽(以下稱作Chelex100)。(ii)溶液B0.03％TritonX-100。(iii)溶液C0.3％Tween-20。注意對于從涂片陽性樣品和無菌流體分離DNA，無需溶液A、B和C；可以通過直接地在溶液3中90-100℃加熱樣品30-40分鐘以分離可擴增的DNA(或者可以在溶液3中補加TritonX-100至終濃度0.01％)(見圖11)。方法學(xué)樣品加工加工痰1)在50ml帶螺帽的小瓶中向痰樣品中加入1.5至2體積的溶液1。2)如果可以，使用5ml容積的一次性塑料Pasteur移液管將痰重懸浮在USP溶液中。3)充分渦旋并避免起泡(盡可能地)，直到痰獲得充分勻漿(這一般在30-40秒內(nèi)完成)。完全勻漿對于獲得最佳結(jié)果時必需的(對于高膿性大體積、粘性很強的、含有血塊的咯血痰，渦旋后室溫孵育10分鐘可能是必需的)。4)室溫放置5-10分鐘，向勻漿物中加入10-15ml溶液2。該步驟幫助形成適當(dāng)?shù)某恋?。輕柔地混合并在實驗室離心機中室溫以4000-5000rpm離心10-15分鐘。5)棄上清液，小心不要除去沉淀。如果沉淀體積沒有發(fā)生可觀的減少(至原痰體積的1/10至1/20)，則使用大約2-5ml溶液1進行再次洗滌。6)用無菌三蒸水洗滌(當(dāng)在水中重懸浮沉淀時，應(yīng)當(dāng)僅僅通過渦旋來實現(xiàn)。如果不按此進行可能得不到最佳的結(jié)果)。目前沉淀已可用于涂片顯微鏡檢術(shù)、培養(yǎng)、DNA/RNA分離和PCR檢驗。加工未凝結(jié)的血液(含有EDTA)1)向血液樣品中加入等體積的溶液1并混合。如果血液部分凝結(jié)，則在37℃與溶液1一起溫育半小時。2)以中速(4000-5000rpm，對于＞1.3ml的樣品體積，使用15ml或50ml管)或高速(12,000-15,000rpm，對于＜1.3ml的樣品體積，使用1.5ml管)沉淀樣品。3)如果必需，用溶液1洗滌沉淀一次或兩次，直到獲得淺黃色沉淀。4)用無菌三蒸水洗滌沉淀。通過渦旋但不抽吸液體，將沉淀重懸浮在水中。(如果不按此進行可能得不到最佳結(jié)果)。5)沉淀現(xiàn)可用于涂片顯微鏡檢術(shù)、培養(yǎng)、DNA/RNA分離和PCR檢驗。加工其它體液(除了痰和儲存的胸膜液樣品外)1)對于體積＞1.3ml的樣品在15ml或50ml帶螺帽的小瓶中以中速(4000-5000rpm)沉淀樣品。2)對于體積＜1.3ml的樣品在1.5ml聚丙烯小瓶中以高速(12,000-15,000rpm)沉淀樣品。3)注意對于非常稠的膿樣品，向樣品加入等體積至體積溶液1并渦旋混合，沉淀前加入一些溶液2。對于牛奶樣品，離心后用無菌棉拭子除去乳脂。4)用1.5至2倍沉淀體積的溶液1洗滌沉淀一次或兩次，之后用無菌三蒸水洗滌。通過渦旋但不抽吸液體，將沉淀重懸浮在水中。(如果不按此進行可能得不到最佳結(jié)果)。沉淀現(xiàn)可用于涂片顯微鏡檢術(shù)、培養(yǎng)、DNA/RNA分離和PCR檢驗。加工胸膜液如果胸膜液在收集后1小時內(nèi)進行加工，則加工可以如“加工其它體液”中所述進行。如果胸腔積液儲存超過1小時，蛋白質(zhì)將以凝結(jié)物形式析出。這樣的樣品應(yīng)當(dāng)按如下方式加工1)單獨地用USP溶液在37℃或室溫處理凝結(jié)的蛋白質(zhì)(通過將上清液傾析至另一管獲得)30分鐘，直到蛋白溶解。2)與上清液混合，并再加入一些溶液1和大約10ml溶液2，在15ml或50ml帶螺帽的小瓶中以中速(4000-5000rpm)離心。3)如果未恰當(dāng)?shù)匦纬沙恋恚偌尤胍恍┤芤?并再次沉淀。4)用溶液1再次洗滌沉淀之后水(10-15ml)洗。5)沉淀現(xiàn)可用于涂片顯微鏡檢術(shù)、培養(yǎng)、DNA/RNA分離和PCR檢驗。注意從加工該樣品的液體部分獲得的沉淀應(yīng)當(dāng)與從凝結(jié)物獲得加工沉淀合并。如果在EDTA(防止凝結(jié)物形成)小瓶中收集胸膜液，可以按照“加工其它體液”中所述進行加工。加工組織活檢物(新鮮的和石蠟包埋的)1)在除去容納活檢物的生理鹽水或液體后，將溶液1加入含有活檢物的小瓶，15-20分鐘后將活檢物轉(zhuǎn)移至無菌培養(yǎng)皿。這幫助軟化組織材料，對于后續(xù)步驟是必需的。2)活檢材料變軟后，用無菌解剖刀盡可能細地切碎活檢材料。為了得到最佳結(jié)果，應(yīng)當(dāng)細細地切碎。(注意使用細針吸活檢時，無需切碎)3)將切碎的活檢材料轉(zhuǎn)移至小型珠-攪拌器小瓶(1.5ml容積)，其中在該小瓶中含有至少一半體積的無菌1mm玻璃珠。該體積不應(yīng)超過1ml。4)在小型珠攪拌器(Mini-BeadbeaterTM，BiospecProducts，USA)中攪拌30-60秒。如果材料未徹底勻漿，再一次重復(fù)珠攪拌30秒。5)2000rpm離心小瓶2分鐘，將勻漿物收集到新的小瓶中，其間避免收集任何玻璃珠。6)25℃下12000-15000rpm離心勻漿物10分鐘，棄上清液。7)再一次用溶液1(最大1ml體積)洗滌沉淀，之后用無菌水洗滌。8)現(xiàn)沉淀可用于涂片顯微鏡檢術(shù)、培養(yǎng)、DNA/RNA分離和PCR檢驗。注意對于石蠟包埋的組織樣品，加工之前必需用二甲苯脫石蠟。涂片顯微鏡檢術(shù)、培養(yǎng)和PCR技術(shù)向無菌水洗滌后獲得沉淀添加500μl溶液3，并徹底重懸浮沉淀?？梢宰⒁獾?，離心后沉淀具有沿著管壁以及在底部沉積的趨勢。小心地將沉淀完全地重懸以得到均質(zhì)溶液。這對于獲得最佳結(jié)果是重要的。將其轉(zhuǎn)移至1.5ml聚丙烯小瓶。該材料目前可用于三項檢查，即，顯微鏡檢術(shù)、培養(yǎng)和PCR。A)涂片檢查(使用10％的重懸浮液)在干凈的載玻片上在盡可能最小區(qū)域中涂布50μl。如果涂片中存在任何顆粒物，在涂片時應(yīng)當(dāng)小心地用接種環(huán)將其均勻地鋪開。涂片面積優(yōu)選應(yīng)當(dāng)不超過1cm×1cm。簡化的USP涂片制備方法將2-3體積USP溶液加入收集在McCartney瓶中的痰(樣品體積小于或等于2ml)內(nèi)。用手混合30-60秒以充分勻化。放置5-10分鐘。對于高粘性的膿性痰樣品，加入至少3體積的溶液1，用手混合并37℃溫育20-30分鐘。向瓶中補充無菌水至不超過2/3水平，并顛倒混合。在室溫臨床離心機中3,000g離心20分鐘。棄上清液并小心不倒出/丟失沉淀。將沉淀重懸在2-5ml溶液1中，如前述進行離心。小心棄去上清液，用大約10ml無菌水洗滌沉淀。小心棄去上清液，用滴管/Pasteur吸管將大約10滴溶液2加至沉淀，并在接種環(huán)的幫助下將沉淀徹底重懸。小心地將離心時沿著瓶壁沉積的沉淀包括在最終得重懸浮液中。將3-4滴重懸浮液倒在干凈載玻片上，使用接種環(huán)通過連續(xù)地轉(zhuǎn)動將之鋪開以產(chǎn)生大約20mm×10mm的涂片?？諝飧稍锿科蠹s30-45分鐘，火焰上固定，使用ZN染色法染色AFB，并使用光學(xué)顯微鏡在油鏡下檢查載玻片。B).培養(yǎng)(使用50％重懸浮液)將200μl接種在LJ培養(yǎng)基上。37℃溫育。C).分離用于PCR的DNA(使用40％重懸浮液)對于DNA分離，在微量離心管中以12,000-13,000rpm沉淀‘溶液3重懸浮液’。向沉淀加入大約5倍體積的溶液A以及各1/10溶液A體積的溶液B和溶液C。充分混合，同時避免起泡。90℃加熱40分鐘。室溫12,000rpm離心5-10分鐘。用上清液實施PCR。小心不要將任何來自溶液A的碎屑和樹脂加入PCR反應(yīng)。注意如果沉淀體積劇烈地減少以至于根本看不見或沉淀體積十分微小或樣品為高桿菌載量的樣品，可以通過直接地或在加入TritonX-100(終濃度0.01％)后于90-100℃加熱‘溶液3重懸浮液’30-40分鐘，進行裂解?？梢灾苯邮褂蒙锨逡簩嵤㏄CR。在這些情況下可以避免添加裂解試劑(即，溶液A、B和C)；但是為了得到最佳結(jié)果，推薦使用裂解試劑(溶液A、B和C)分離PCR可擴增DNA(見以下詳述)。D).RNA分離可以使用任何標(biāo)準(zhǔn)RNA分離程序或試劑盒從獲得的沉淀分離分枝桿菌RNA。PCR技術(shù)該PCR試驗靶向結(jié)核分枝桿菌的devR基因(Rv3133c)，對于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的生物具有特異性[Singh等，1999]。在我們實驗室公布的研究中，devRf和devRr引物對被用于‘長靶’PCR試驗中，從devR基因擴增513bp片段[Singh等，1999；2000]。在題為“評估基于PCR的結(jié)核病檢驗”的DBT資助計劃下的多中心研究中，[持續(xù)時間從1997年2月至2000年2月，財政支援至1999年2月28日]，對編碼的痰樣品使用了相同PCR試驗。涂片顯微鏡檢術(shù)和培養(yǎng)的結(jié)果與PCR結(jié)果相關(guān)。對于陽性培養(yǎng)物的靈敏度為100％(14/14培養(yǎng)物陽性)，對于涂片陽性樣品的靈敏度為94％(17/18涂片陽性樣品)[參見關(guān)于就地開發(fā)的不同PCR結(jié)核診斷試驗的評估結(jié)果分析的DBT報道，DBT，Govt.ofIndia]。據(jù)推論，對于少菌型的涂片陰性樣品，devR基因更小區(qū)域的擴增可能提供相等/更好的靈敏度。在此想法下，設(shè)計了兩對新引物以擴增devR基因中的更短片段。首先在純化的結(jié)核分枝桿菌DNA上評價了該‘短靶’PCR試驗，接著在臨床樣品上驗證了該試驗。‘短靶’引物對是(i)devRf2，5’TGGCAACGGCATTGAACTGT3’和devRr2，5’TAAGCAGGCCCAGTAGCGT3’和(ii)devRf3，5’ATCTGTTGTCCCGCATGCC3’和devRr3，5’GTCCAGCGCCCACATCTTT3’。使用以下PCR參數(shù)‘短靶’試驗94℃起始變性10分鐘；45個循環(huán)，各為94℃變性1分鐘、52℃退火1分鐘和72℃延伸30秒；最后72℃延伸10分鐘?！L靶’試驗除了以65℃90秒實施退火和延伸外，使用與‘短靶’試驗中相同的參數(shù)。IS6110試驗公布的由Eisenach等(1990)提出的引物用于如下PCR反應(yīng)參數(shù)94℃起始變性10分鐘；之后45個循環(huán)，各為94℃1分鐘、60℃1分鐘30秒；之后，72℃最后延伸5分鐘。反應(yīng)成分*在PCR級水中重構(gòu)得到20μM濃度。總反應(yīng)體積是40μl(30μl混合物和10μl模板)。在無DNA罩中將30μl混合物分配到無菌0.2或0.5ml小瓶中。在遠離PCR準(zhǔn)備區(qū)的指定區(qū)域添加10μl模板。簡短離心管子30秒，放入熱循環(huán)儀。完成反應(yīng)(以上給出的參數(shù))后，在1.5-2.3％瓊脂糖凝膠上于0.5×TBE緩沖液中80伏特電泳擴增產(chǎn)物20-30分鐘。通過溴化乙錠染色在UV光下觀察產(chǎn)物(加樣量至少35μl)。8.實施例(A)USP溶液成分的功能為了檢查USP溶液的各成分的功能，選擇性地從USP溶液中去除單個成分，并用所得溶液處理樣品。USP溶液由如下5種成分組成1.鹽酸胍(GuHCl)2.十二烷基肌氨酸鈉3.β-巰基乙醇4.Tris-Cl5.EDTA明顯地，USP的主要功能——粘液溶解、凈化、蛋白質(zhì)變性、離液作用、液化作用、組織軟化/消化作用、釋放分枝桿菌的作用——通過前3個成分，即，GuHCl、十二烷基肌氨酸鈉和β-巰基乙醇，實現(xiàn)。為了確立此點，從USP中選擇性地將這三個成分分別地或聯(lián)合地去除，并保持Tris-Cl和EDTA組成不變。評價經(jīng)過選擇性去除組分后的溶液對于樣品加工、涂片顯微鏡檢術(shù)、PCR和培養(yǎng)的影響(圖1至4)。痰樣品(通過合并3至4個AFB陽性痰獲得，以便得到就污染物而言的大體積非均質(zhì)組合物)通過用3mm玻璃珠渦旋3-5分鐘勻漿。勻漿后痰的各5ml等分試樣被分配用于以不同組成的溶液進行加工。使用USP溶液作為對照。準(zhǔn)備了具有不同組成的以下溶液用于加工樣品1.含有所有成分的USP溶液(稱作USP)；2.無GuHCl的USP溶液(稱作USP-1)；3.無十二烷基肌氨酸鈉的USP溶液(稱作USP-2)；4.無β-巰基乙醇的USP溶液(稱作USP-3)；5.無GuHCl和十二烷基肌氨酸鈉的USP溶液(稱作USP-1，2)；6.無GuHCl和β-巰基乙醇的USP溶液(稱作USP-1，3)；7.無GuHCl、十二烷基肌氨酸鈉和β-巰基乙醇的USP溶液(稱作USP-1，2，3)；8.無十二烷基肌氨酸鈉和β-巰基乙醇的USP溶液(稱作USP-2，3)。所有這些溶液均用于加工所述的痰樣品并進行涂片顯微鏡檢、PCR和培養(yǎng)。針對具有不同物理特征的樣品，重復(fù)實驗兩次。主要觀察結(jié)果1.當(dāng)用缺乏三個主要成分的USP溶液(USP-1，2，3，圖1)加工痰樣品時，沉淀體積沒有減少。當(dāng)將最終加工的沉淀的10％涂在載玻片上時，得到具有大量背景的過厚涂片，十分難于讀取信息。在接種在LJ培養(yǎng)基上兩天內(nèi)出現(xiàn)培養(yǎng)污染，且PCR表現(xiàn)出抑制作用。2.無論組成改變可能是怎樣的，USP溶液總是最佳地從樣品中除去廢物和PCR抑制劑，從痰樣品產(chǎn)生最干凈的沉淀(圖1，圖3)。3.對于含有血液的痰樣品，GuHCl通過使血紅蛋白變性并從樣品中將之除去，作為樣品的主要抑制劑除去成分起作用。對于具有高膿性和血液的樣品，在使用不含GuHCl的USP溶液加工的樣品的DNA制備物中注意到PCR抑制。4.觀察到，對于粘液樣痰樣品，僅含有十二烷基肌氨酸鈉和β-巰基乙醇(即，不含GuHCl(USP-1))的USP溶液以值得稱贊的效率有效地加工樣品，而且就涂片顯微鏡檢和PCR而言比僅含有GuHCl的USP(USP-2，3)好(圖1，2和3)。然而，USP-1不能充分地加工具有高膿性性質(zhì)的痰樣品(就去除廢物和抑制劑的效力而言)。在這些情況中，僅含有GuHCl的USP溶液(USP-2，3)或僅含有GuHCl與十二烷基肌氨酸鈉的USP(USP-3)表現(xiàn)更好。因此，顯然USP中GuHCl和十二烷基肌氨酸鈉的存在更適于膿性樣品，而β-巰基乙醇和十二烷基肌氨酸鈉的存在更適于粘液樣樣品。可是甚至對于粘液樣樣品，GuHCl的存在也是有效地除去PCR抑制所必須的。但是對于粘液膿性樣品，為了最佳的加工，GuHCl與β-巰基乙醇和/或十二烷基肌氨酸鈉一起存在是絕對必須的。5.無論何時從USP溶液中扣除GuHCl，在LJ培養(yǎng)基上接種時所得的培養(yǎng)物都表現(xiàn)出污染(圖4A)。在該溶液中存在GuHCl對于樣品的徹底凈化是必須的。6.去除這些主要成分之任一個都導(dǎo)致在使用最終加工的沉淀的10％制備涂片時涂片中背景增加(圖2)，這干擾了讀取載玻片的容易度，而容易地讀取載玻片是USP方法的一個主要優(yōu)點(見下節(jié))。7.因此，明顯地，USP溶液中的這三個主要成分以協(xié)同方式發(fā)揮作用在加工樣品時產(chǎn)生最佳效果，而且這些成分中任一個成分的缺乏都導(dǎo)致次最佳的結(jié)果。USP溶液以等同效力加工各種物理特征和生物化學(xué)性質(zhì)的樣品的通用性可以歸因于USP溶液中所有成分的協(xié)同作用。Tris-Cl幫助維持USP溶液的中性pH，這樣在培養(yǎng)之前無需對USP溶液處理過的樣品進行中和。EDTA作為陽離子的螯合劑起作用，由此失活DNase。GuHCl是有效的離液劑，由此幫助變性樣品中的所有宿主蛋白質(zhì)，包括粘蛋白和血紅蛋白，借此從臨床樣品中除去潛在的PCR抑制劑和對染的物質(zhì)。GuHCl殺死樣品中存在的革蘭氏陰性細菌，由此凈化該細菌(見以下)。其還變性DNase和RNase，由此保存核酸和使得該方法適于DNA和RNA分離。十二烷基肌氨酸鈉溶解脂質(zhì)、破壞真核細胞和革蘭氏陰性細菌的細胞膜，幫助凈化樣品和從巨嗜細胞釋放分枝桿菌。還原劑β-巰基乙醇作為粘液溶解成分起作用將粘蛋白的S-S鍵還原為-SH基團并釋放陷在粘液中的分枝桿菌。分枝桿菌堅固的細胞壁特征使其完全地不受USP溶液造成的任何不利作用的影響，因此該方法極為突出地適用于加工樣品，作為通過涂片顯微鏡檢術(shù)、培養(yǎng)、PCR和RT-PCR(對于RNA)診斷分枝桿菌的序曲(prelude)。(B)USP的快速液化性質(zhì)圖5a和圖5b顯示用USP處理的代表性痰和組織樣品。在加工結(jié)束時，去除了樣品中的污染生物、蛋白質(zhì)、酶和干擾物質(zhì)，并且樣品體積發(fā)生相當(dāng)大的減少。(C)涂片顯微鏡檢術(shù)通過USP、CDC、直接涂片法制備的代表性載玻片涂片顯示在圖6中。值得注意的，USP載玻片中背景染色物質(zhì)的明顯減少。(i)涂片顯微鏡檢術(shù)的USP法的靈敏度在含有ADC和0.05％Tween80的Middlebrook7H9培養(yǎng)基中培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌H37Rv至對數(shù)期。以一式兩份的設(shè)置，按如下系列稀釋培養(yǎng)物1∶10，1∶100，1∶1000等等至1∶100000。將每個稀釋物的10％接種在LJ斜面(固體培養(yǎng)基)上，在另一設(shè)置中將每個稀釋物的100％攙入(spikeinto)來自患有慢性阻塞性肺病(COPD)但無任何TB病史或癥狀的患者的1ml痰等分試驗中。攙入稀釋物后的樣品通過USP方法加工，將各樣品的10％分別涂在載玻片上，對AFB進行染色，并在油鏡下顯微鏡檢。使用攙有恥垢分枝桿菌(M.smegmatis)——一種非致病性快速生長的分枝桿菌——的COPD痰樣品進行相似實驗。從兩個實驗確立，涂片顯微鏡檢術(shù)的USP方法能夠?qū)⒑忻縨l樣品300-400個AFB的樣品檢測為陽性。對結(jié)果再進行兩次驗證。代表性的實驗顯示在圖7中。這些結(jié)果清楚地說明涂片顯微鏡檢術(shù)的USP方法的優(yōu)異靈敏度。注意到超過常規(guī)直接涂片顯微鏡檢術(shù)方法大約30倍的靈敏度增加。直接方法的檢測靈敏度為大約10,000個桿菌/ml樣品(Kent和Kubica，1995)。(ii)在臨床環(huán)境中評價USP涂片顯微鏡檢術(shù)在一組571份痰上評價USP涂片顯微鏡檢術(shù)的性能，這些痰收集自在NewDelhiTuberculosisCentre，NewDelhi的DOTS中心；SunderlalJainCharitableTrustHospital，Delhi和TuberculosisResearchCentre，Chennai就醫(yī)以診斷肺結(jié)核的患者(n＝571)。針對該研究中選用的患者評價了以下臨床癥狀中的任一種，即，發(fā)燒、咳嗽、吐痰、咳血、疼痛、呼吸困難和其它癥狀，如體重減輕、盜汗和全身無力、胸部X光片、Mantoux狀況和任何結(jié)核病的過往病史。從研究中排除來自在樣品收集時已經(jīng)在ATT上的個體的樣品。在LJ培養(yǎng)基上的培養(yǎng)結(jié)果被用作金標(biāo)準(zhǔn)。編碼所有樣品，并實施盲檢。(iii)相對應(yīng)直接涂片和NALC-NaOH濃縮法——兩者均為最普遍使用的涂片顯微鏡檢術(shù)方法，評價USP方法的性能。通過直接方法和USP方法加工所有571份樣品用于顯微鏡檢術(shù)(數(shù)據(jù)集1)。其中325份樣品(數(shù)據(jù)集2)還使用NALC-NaOH濃縮法(在CDC，Atlanta研發(fā)的，稱作CDC方法)加工。在被認(rèn)為大約相同的痰樣品等分式樣上實施USP和CDC方法。直接涂片獨立地制備并在兩個不同地點由不同的所訓(xùn)人員讀取信息。通過USP和CDC方法制備的涂片在一個實驗室由至少兩名所訓(xùn)人員讀取信息。USP涂片法相對于直接涂片法和CDC方法存在的改進有a).在USP涂片中陰性樣品轉(zhuǎn)陽在該組571個痰樣品上，直接涂片法和USP涂片法的靈敏度分別為68.6％和98.2％，特異性分別為92.6％和91.4％(數(shù)據(jù)集1)。通過直接方法診斷為陽性的所有樣品通過USP和CDC涂片顯微鏡檢術(shù)方法也檢查為陽性。在325個直接涂片陰性樣品中，USP方法檢測到另外97個樣品為涂片陽性，這些樣品通過培養(yǎng)也檢測為陽性，由此記錄29.6％的靈敏度增加。代表性實例顯示在圖8中。這97份USP涂片陽性樣品中，14份分級為極少的，29份分級為1+，23份分級為2+，31份分級為3+。同時在這571份樣品中的325份上，還將USP涂片方法與涂片顯微鏡檢術(shù)的CDC方法作了比較(數(shù)據(jù)集2)。通過CDC方法檢測為涂片陰性的29份樣品被涂片顯微鏡檢術(shù)的USP方法檢測為陽性，所有這些樣品也均是培養(yǎng)陽性的。因此，USP方法也比流行使用的涂片顯微鏡檢術(shù)濃縮方法(CDC方法)在檢測靈敏度上更好(對于USP和CDC涂片顯微鏡檢術(shù)，分別為97.1％和80％)。數(shù)據(jù)集1相對于直接涂片法評價USP涂片法金標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)(在LJ培養(yǎng)基上)，樣品強度，n＝571在95％置信區(qū)間測量相關(guān)性USP涂片顯微鏡檢術(shù)(ZN)靈敏度98.2％(95.9％-99.3％)特異性91.4％(86.9％-94.4％)PPV93.9％(90.7％-96.1％)NPV97.4％(94.1％-98.9％)診斷準(zhǔn)確度90.5％直接涂片顯微鏡檢術(shù)(ZN)靈敏度68.6％(63.2％-73.5％)特異性92.6％(88.4％-95.4％)PPV92.6％(88.4％-95.4％)NPV68.3％(62.9％-73.3％)診斷準(zhǔn)確度78.3％數(shù)據(jù)集2相對應(yīng)涂片顯微鏡檢術(shù)的CDC法評價USP法(ZN)金標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)(在LJ培養(yǎng)基上)樣品強度，n＝325。在95％置信區(qū)間測量相關(guān)性。USP涂片顯微鏡檢術(shù)(ZN)靈敏度97.1％(92.9％-98.9％)特異性83.3％(76.2％-88.6％)PPV86.4％(80.5％-90.8％)NPV96.3％(91.1％-98.6％)診斷準(zhǔn)確度90.5％CDC涂片顯微鏡檢術(shù)(ZN)靈敏度80.0％(73.0％-85.6％)特異性89.67％(83.5％-93.8％)PPV89.47％(83.2％-93.7％)NPV80.35％(73.5％-85.8％)診斷準(zhǔn)確度84.6％b).涂片狀況的提升USP方法增強了載玻片的分級，使得更容易在更短的時間讀取載玻片的信息。通過涂片顯微鏡檢術(shù)的直接方法分級為極少、1+或2+的載玻片一般通過USP方法轉(zhuǎn)化為1+、2+或3+。在將該組571個樣品通過涂片顯微鏡檢術(shù)的USP法得到的結(jié)果與通過直接方法得到的結(jié)果比較時，觀察到該趨勢(表1)。當(dāng)USP溶液方法與CDC方法比較時，也觀察到涂片狀況的提升(表2)。代表性載玻片顯示在圖9中。因此，就每個視野觀察到的桿菌數(shù)而言，USP方法也比CDC方法表現(xiàn)好。這利于快速且有效的讀取載玻片信息，最終導(dǎo)致技術(shù)人員的時間和勞動力的節(jié)約。表1相對于直接涂片方法，USP涂片顯微鏡檢術(shù)對涂片狀況的提升(總樣品強度＝571；通過直接方法得到陽性的樣品，n＝243)(括號中的值指示樣品強度)表2相對于CDC涂片法，USP涂片顯微鏡檢術(shù)對涂片狀況的提升(總樣品強度＝326；通過CDC方法為陽性的樣品，n＝152)(括號中的值指示樣品強度)因此，涂片的USP溶液方法顯示比測試的另兩種方法好得多的97％-98％的非常高靈敏度，特異性范圍為83％-91％。USP涂片顯微鏡檢術(shù)在培養(yǎng)陽性樣品中顯示97-98％的陽性，而CDC方法顯示80％陽性，直接涂片法顯示68.6％陽性，由此記錄分別比直接和CDC涂片顯微鏡檢術(shù)方法在靈敏度上增加大約30％和18％。該靈敏度增加是顯著的，因為所有三種方法的靈敏度值在95％置信區(qū)間完全不重疊。沒有一個通過直接涂片方法或CDC方法檢測到的樣品被USP涂片法遺漏。USP涂片顯微鏡檢術(shù)方法與直接涂片方法相比，特異性為91.3％，而與CDC方法相比為83.3％。兩個值在95％置信區(qū)間重疊。(數(shù)據(jù)集1和2)。(D)培養(yǎng)(i)USP溶液對攙入痰中的結(jié)核分枝桿菌的致死性將對數(shù)期結(jié)核分枝桿菌系列稀釋高達10000倍，且一式兩份。一組稀釋物的10％被接種在LJ斜面上，將副本組的每一個稀釋物的100％分別攙入來自COPD患者的1ml痰等分試樣中。攙入稀釋物的樣品利用USP方法加工，加工后的物質(zhì)的10％接種在LJ斜面上。8周后就未處理細胞獲得的活細胞計數(shù)為720/ml，就攙入稀釋物的經(jīng)USP溶液處理的細胞獲得的活細胞計數(shù)為400/ml(在10000倍稀釋下)(表3；圖10)。大約55％分枝桿菌在USP處理下存活。CDC方法作為目前最流行使用的臨床樣品凈化方法使用NaOH，利用該方法，已經(jīng)報道了從28％至70％的生存力喪失(Krasnow和Wayne，1966)。表3.USP對攙入COPD痰中的結(jié)核分枝桿菌的生存力的影響然而，發(fā)現(xiàn)含有4MGuHCl(代替5MGuHCl)的USP溶液對分枝桿菌較不苛刻。當(dāng)用含有4MGuHCl的USP而非用具有6MGuHCl的USP處理結(jié)核分枝桿菌時獲得更多的存活細菌菌落；4周后，對于用含有4MGuHCl的USP處理的細胞為142個細胞/ml，而對于用6MGuHCl處理的細胞為72個細胞/ml(100倍稀釋)。相同稀釋度的未處理細胞相應(yīng)于277個細胞/ml。但是其凈化臨床樣品中的效力相同。因此，當(dāng)首要的是培養(yǎng)來自臨床樣品的結(jié)核分枝桿菌時，含有4MGuHCl的USP將增加培養(yǎng)陽性的幾率。(ii)USP對結(jié)核分枝桿菌生長速率的影響熟知用凈化劑例如NaOH處理將減緩來自臨床材料的結(jié)核分枝桿菌的生長速率。使用USP溶液處理的細菌也進行了相似觀察。在固體培養(yǎng)基(Middlebrook7H10或LJ)上，與未處理的細胞相比，USP處理后的結(jié)核分枝桿菌菌落在延遲至少1至周后出現(xiàn)。在固體培養(yǎng)基上與USP處理的細菌相比NALC-NaOH處理的結(jié)核分枝桿菌(CDC方法)生長也稍更快(至少早4-5天得到可見的菌落)，但是當(dāng)細菌在液體系統(tǒng)BCBACTECTMMGITTM960系統(tǒng)(BectonDickinson，USA)中培養(yǎng)時兩份處理之間未觀察到明顯差異[見下文]。從以上實驗估計37℃以USP溶液(含5MGuHCl)處理20分鐘后使得56-62％的結(jié)核分枝桿菌細胞無法存活。因此，USP溶液并不完全致死結(jié)核分枝桿菌。(iii)在液體培養(yǎng)中用USP溶液和NALC-NaOH處理后結(jié)核分枝桿菌的生長速率相等(分枝桿菌生長指示管)熟知用凈化劑處理會不利地影響分枝桿菌的生存力并減緩其生長速率。比較NALC-NaOH處理(CDC方法)與USP溶液處理對結(jié)核分枝桿菌生長速率的影響。將Middlebrook7H9液體培養(yǎng)基(具有ADC補充物和0.05％Tween80)中生長的對數(shù)期結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)物分成3組。一組用USP溶液處理，另一組用NALC-NaOH處理之后用磷酸緩沖液中和(CDC方案)。將三組(即，USP溶液處理的、NALC-NaOH處理的和未處理的)均接種至具有PANTA試劑和OADC補充物(BectonDickinson，USA)的MGIT管，并使用BDBACTECTMMGITTM960系統(tǒng)監(jiān)測陽性信號。未處理的細胞在兩天內(nèi)給出生長的陽性信號，而USP溶液處理的細胞和NALC-NaOH處理的細胞在5天內(nèi)給出生長的陽性信號。重復(fù)該實驗，得到相同結(jié)果。這提示，USP和CDC方法以相同程度減慢液體培養(yǎng)基(MGIT)中結(jié)核分枝桿菌的生長。(iv)在臨床環(huán)境中評價USP培養(yǎng)在一組571個樣品上比較培養(yǎng)的USP方法與其它常規(guī)培養(yǎng)方法(CDC方法、改良的Pettrof方法和Nassua方法)。值得注意的發(fā)現(xiàn)有(a)USP和常規(guī)方法均表現(xiàn)出相當(dāng)?shù)年栃园俜謹(jǐn)?shù)。常規(guī)方法的陽性率(53.6％)未顯著地高于USP方法的陽性率(50.1％)，它們在95％置信區(qū)間重疊。(b)USP方法被證明對于凈化非常有效，而且與常規(guī)方法(n＝21)相比表現(xiàn)出較少的污染培養(yǎng)物數(shù)目(n＝5)，由此證明其更適于熱帶國家。(c)由于USP溶液是中性pH溶液，因此在培養(yǎng)前無需中和使用USP溶液凈化的樣品。因此就靈敏度、對存活力的影響和對生長速率的影響而言，培養(yǎng)的USP方法與目前接受的培養(yǎng)來自臨床樣品的結(jié)核分枝桿菌的方法相當(dāng)。(E)PCR在＞700份肺和肺外來源的樣品上實施PCR檢查。樣品或是新鮮的或是在-20℃冷凍多達2個月。通過USP方法分離用于此目的的分枝桿菌DNA。沒有一個樣品在PCR試驗中顯示抑制作用，說明從臨床樣品通過USP法分離的DNA不含抑制劑。該PCR試驗靶向結(jié)核分枝桿菌的devR基因(Rv3133c)，并且對結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的生物具有特異性[Singh等，1999]。在公布的研究中，PCR引物對devRf和devRr從該靶基因擴增513bp片段[Singh等，1999；2000]。據(jù)推論，擴增該同一基因的更小區(qū)域可能為少菌型的和涂片陰性樣品提供等同的/更好的靈敏度。在該思想下，使用作圖定位在devR基因中的兩組新引物擴增devR基因的更短片段。所用的新引物對是分別(i)從devR基因擴增308bp片段的devRf2和devRr2(圖11)和(ii)擴增164bp的devRf和devRr3(圖11)。將這些結(jié)果與最初的513bpdevR試驗和在全球大量實驗室中使用的IS6110為基礎(chǔ)的試驗比較。(i)試驗特異性試驗的特異性通過向PCR反應(yīng)中添加來自不同分枝桿菌物種的DNA進行評價。devRf2和devRr2引物顯示出優(yōu)異的特異性，僅僅在使用來自屬于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的生物的DNA時獲得了預(yù)期大小的條帶(308bp)而在使用來自其它分枝桿菌物種的DNA時則未獲得該條帶(圖13)。然而，使用devRf3和devRr3引物，除了從來自非洲分枝桿菌(M.africanum)、牛分枝桿菌(M.bovis)和結(jié)核分枝桿菌的DNA還從來自堪薩斯分枝桿菌(M.kansasii)和蟾分枝桿菌(M.xenopi)物種的DNA獲得了擴增(164bp產(chǎn)物)。而且，使用來自屬于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的田鼠分枝桿菌(M.microti)的DNA未獲得擴增(圖12)。(ii)使用純化的DNA的試驗靈敏度在PCR試驗中使用純結(jié)核分枝桿菌DNA的系列稀釋物評價通過溴化乙錠檢測擴增產(chǎn)物的檢測限(表4，圖14)。與產(chǎn)生513bp擴增產(chǎn)物的PCR試驗相比，引物對devRf2-devRr2和devRf3-devRr3顯示出明顯增加的靈敏度。與devRf和devRr引物(產(chǎn)物大小，513bp)相比，devRf2和devRr2引物[產(chǎn)物大小308bp]顯示出高2至4倍的靈敏度，devRf3和devRr3引物(產(chǎn)物大小，164bp)顯示出高至少10倍的靈敏度[表4]。表4在系列稀釋的結(jié)核分枝桿菌基因組DNA上比較使用不同引物對的devRPCR試驗的靈敏度(iii)在臨床環(huán)境中評價‘短靶’和‘長靶’PCR試驗針對收集自懷疑患有結(jié)核病的患者(n＝571)的571份樣品，將PCR試驗的結(jié)果與培養(yǎng)和涂片顯微鏡檢術(shù)的結(jié)果進行比較，其中所述患者來自NewDelhiTuberculosisCenter的DOTS中心，SunderlalJainHospital，DelhiandTuberculosisresearchcenter，Chennai。所用試驗如下1.使用引物對devRf2&devRr2(產(chǎn)物大小，308bp)和devRf3&devRr3(產(chǎn)物大小，164bp)的組合的‘短靶’devRPCR試驗(在571份痰樣品上進行)。2.使用先前公布的并得到驗證的引物對devRf和devRr(產(chǎn)物大小，513bp)[Singh等，1998，2000]的‘長靶’devRPCR試驗(在該571份樣品中的506份上進行)。3.使用公開的引物[Eisenach等，1990]在571份樣品上實施的IS6110PCR試驗。由于該試驗是全世界最廣泛使用的PCR試驗，故用作對照?！贪小囼灥撵`敏度為98.5％。這充分好于靈敏度為73.2％的‘長靶’試驗。例如，在分析的571份痰樣品中，322份痰樣品通過USP涂片方法為陽性，并且也是培養(yǎng)陽性的。這些培養(yǎng)陽性和USP涂片陽性樣品中，長靶試驗未能檢出65份樣品，而這些樣品被短靶試驗檢出，從而證實后一試驗為更靈敏。因此，在使用培養(yǎng)陽性作為金標(biāo)準(zhǔn)時引入‘短靶’引物使devR試驗的靈敏度增加了25.3％(數(shù)據(jù)集3)，并且當(dāng)使用結(jié)核分枝桿菌基因組DNA的系列稀釋物進行比較時該靈敏度增加了2-10倍(表4)。短靶試驗的總體診斷準(zhǔn)確性比長靶試驗的高大約7％(數(shù)據(jù)集3)。然而，‘短靶’試驗增加的靈敏度伴隨著與‘長靶’試驗91.9％的特異性相比77％的較低特異性(數(shù)據(jù)集3)。‘短靶’試驗特異性的明顯降低可能是試驗靈敏度增加的一個反映，而不可能是由于假陽性/較低的特異性導(dǎo)致的。這得到如下證據(jù)的支持(i)328份培養(yǎng)陽性樣品中，‘短靶’PCR檢測到323份樣品。通過IS6110PCR試驗，也有相同數(shù)目的樣品為陽性。然而，在包括571份樣品的該研究中，6份樣品通過IS6110試驗檢測為陰性，而對于devR‘短靶’試驗為陽性，這可能是由于IS6110基因的缺乏所致。IS6110PCR還檢測到另外2份培養(yǎng)陽性樣品(數(shù)據(jù)集3)。用于擴增123bp產(chǎn)物的基于IS6110的PCR試驗對于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的生物具有特異性，并且由于所述基因組中存在IS6110的多個拷貝(與每個基因組僅存在一個拷貝的devR不同)而顯示出高靈敏度。但是，devR短靶試驗顯示出與IS6110試驗相當(dāng)?shù)撵`敏度(數(shù)據(jù)集3)。devR的值也在于與IS6110相比其普遍地存在于所有的結(jié)核分枝桿菌分離物中，而據(jù)報道IS6110在印度菌株中有時完全不存在或者存在1個拷貝或幾乎沒有拷貝(Narayanan等，2001)。這通過在使用肺外樣品的研究(見下文詳述)中針對胸膜組織和淋巴結(jié)樣品IS6110試驗具有的較低靈敏度得以反映(數(shù)據(jù)集5&6)。(ii)非結(jié)核對照在一組來自69名患有經(jīng)臨床證實非結(jié)核病的其它疾病的患者的78份痰上進行涂片顯微鏡檢、培養(yǎng)和PCR。所有樣品通過涂片顯微鏡檢、PCR和培養(yǎng)均為陰性，從而證明了這些試驗系統(tǒng)的特異性。數(shù)據(jù)集3使用‘長靶’和‘短靶’devRPCR的PCR的靈敏度和特異性使用培養(yǎng)陽性作為金標(biāo)準(zhǔn)；樣品強度，對于devR-長PCR為n＝506，對于devR-短PCR為n＝571。在95％置信區(qū)間測量相關(guān)性。devR-長靈敏度73.2％(67.4％-78.2％)特異性91.9％(87.4％-94.9％)PPV91.3％(86.5％-94.5％)NPV77.1％(69.1％-79.5％)診斷準(zhǔn)確度81.8％devR-短靈敏度98.5％(96.3％-99.4％)特異性77％(71.0％-82.0％)PPV85.2％(81.8％-88.5％)NPV97.4％(93.7％-99.0％)診斷準(zhǔn)確度89.32％IS6110靈敏度99.1％(97.1％-99.8％)特異性71.2％(65％-76.7％)PPV82.28％(78.1％-85.8％)NPV98.3％(94.7％-99.6％)診斷準(zhǔn)確度87.22％肺外樣品在盲檢試驗中使用從來自SafdarjungHospital，NewDelhi，印度的患者收集的編碼的胸膜液、胸膜組織和淋巴結(jié)活檢樣品，評價USP方法在診斷結(jié)核性胸腔積液和淋巴結(jié)病方面的性能。樣品由來自88名患者的100份樣品組成，其中包括來自TB患者的77份樣品和來自患有諸如惡性腫瘤、阿米巴病、CHF、結(jié)節(jié)病和反應(yīng)性性淋巴結(jié)病(非特異性炎癥)的疾病的對照個體的23份樣品。入選標(biāo)準(zhǔn)基于以下任一個或多個參數(shù)a)組織病理/細胞病理與TB一致；(b)AFB陽性涂片；(c)結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性；(d)對ATT具有臨床反應(yīng)。使用USP方法加工樣品，并實施涂片顯微鏡檢、培養(yǎng)和PCR。在此研究中，比較基于devR和IS6110的PCR。devRPCR使用引物對devRf3/devRr3進行。從這些樣品分離的結(jié)核分枝桿菌DNA具有良好質(zhì)量并且沒有明顯的PCR抑制作用。涂片顯微鏡檢術(shù)的USP方法檢測到8份樣品(6份胸膜液以及淋巴結(jié)和胸膜組織活檢物各一份)(數(shù)據(jù)集4)為陽性，而涂片顯微鏡檢術(shù)的常規(guī)方法檢測到3份樣品為陽性。在該組肺外樣品中USP涂片顯微鏡檢術(shù)的靈敏度為10.4％，而常規(guī)方法的靈敏度僅為3.9％。因此，與常規(guī)診斷方法相比，USP方法使得從組織活檢樣品和其它肺外樣品進行的結(jié)論性AFB涂片顯微鏡檢術(shù)得到改進。通過培養(yǎng)的USP方法，5份樣品為陽性(靈敏度6.5％)(數(shù)據(jù)集4)。devRPCR顯示出比IS6110對胸膜組織和淋巴結(jié)(分別為75％和50％)樣品具有更好的靈敏度(分別為100％和75％)，原因可能是在這些菌株中不存在任何IS6110拷貝(數(shù)據(jù)集5&6)。因此，樣品加工的USP方法和devRPCR作為一個有用的模式起到確定性地診斷結(jié)核性胸腔積液和淋巴結(jié)病的作用。數(shù)據(jù)集4USP方法加工的肺外樣品的涂片顯微鏡檢和培養(yǎng)狀況數(shù)據(jù)集5devR-短靶PCR對于肺外樣品的靈敏度和特異性值(％)數(shù)據(jù)集6IS6110PCR對于肺外樣品的靈敏度和特異性值(％)使用SAS8.0軟件(SASInstituteInc.Cary，NC，USA)進行統(tǒng)計學(xué)分析。計算了變量的描述性統(tǒng)計(descriptivestatistics)、頻率分布和百分?jǐn)?shù)。為了評價這些試驗相對于金標(biāo)準(zhǔn)的診斷準(zhǔn)確度和可靠性，計算了靈敏度、特異性、陽性和陰性預(yù)測值以及它們的95％置信區(qū)間。(F)在分離DNA用于PCR之前裂解加工的樣品中存在的分枝桿菌的簡化方案在USP加工后，如果沉淀體積劇烈減少以致于幾乎看不見或十分微小，或者如果樣品為高桿菌載量樣品，則可以通過直接在溶液3中或在加入TritonX-100(終濃度0.01％)后90-100℃加熱重懸浮液30-40分鐘，實現(xiàn)裂解。利用USP方法加工了三份AFB陽性痰樣品。加工后的沉淀重懸浮在重懸浮溶液(溶液3)中，對于每個樣品均分成三個相同的等分試樣。一份等分試樣進行沉淀，并向沉淀物中加入裂解試劑(即，溶液A、B和C)，向第二等分試樣加入TritonX-100至終濃度0.01％，另一等分試驗保持原樣。所有三個等分試樣在90℃煮沸40分鐘，使用上清液實施PCR。當(dāng)通過瓊脂糖凝膠電泳分析時，三份樣品每一個的所有三個裂解物都產(chǎn)生了具有幾乎相同強度的擴增子(圖15)。這些結(jié)果說明，對于加工后獲得的非常干凈的沉淀或者對于具有高桿菌載量的樣品，可以不用添加裂解試劑(即，溶液A、B和C)；但是對于最佳結(jié)果，推薦使用裂解試劑(溶液A、B和C)分離PCR可擴增的DNA。(G)USP方方法可應(yīng)用于診斷由結(jié)核病類型以外的分枝桿菌造成的分枝桿菌病(MOTT)，因為USP方法對于這些分枝桿菌不具有任何有害作用室溫下USP處理MOTT桿菌10-15分鐘，之后用無菌三蒸水洗滌。然后針對每種物種進行涂片顯微鏡檢、LJ斜面上的培養(yǎng)和PCR，以檢查USP溶液的有害作用(如果有的話)。所用MOTT物種是鳥分枝桿菌(M.avium)、偶發(fā)分枝桿菌(M.fortuitum)、戈特氏分枝桿菌(M.gordonae)、胞內(nèi)分枝桿菌(M.intracellulare)、堪薩斯分枝桿菌(M.kansasi)、瘰疬分枝桿菌(M.scrofulacem)、恥垢分枝桿菌(M.smegmatis)、草分枝桿菌(M.phlei)和牝牛分枝桿菌(M.vaccae)。屬于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的生物，如非洲結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌、牛分枝桿菌(BCG)、田鼠分枝桿菌也包括在此研究中。所有生物保持了它們的AFB狀況(圖16)和生存力。然而，恥垢分枝桿菌盡管維持了其完整性和AFB性質(zhì)但是喪失了生存力。圖17顯示兩種經(jīng)USP處理的快速生長者。從所有的USP處理的分枝桿菌均分離了良好質(zhì)量的PCR可擴增DNA(圖18)。(H)USP方法加工的樣品與從結(jié)核分枝桿菌分離RNA的程序相容USP方法也與從痰樣品分離高質(zhì)量的結(jié)核分枝桿菌RNA相容。為此目的，使用具有如下組成的USP溶液6M鹽酸胍、50mMTris-Cl，pH7.5、25mMEDTA、0.5％十二烷基肌氨酸鈉和0.2Mβ-巰基乙醇。所用痰樣品通過涂片顯微鏡檢術(shù)的直接方法分為3+級。向該樣品(5-7ml)加入1.5倍體積的USP溶液，勻漿該混合物。向其中加入10ml無菌DEPC水并混合。然后室溫5,000rpm離心10分鐘。再次用2-3mlUSP溶液洗滌沉淀，之后用無菌DEPC水洗滌。此最終的加工沉淀可以用作通過適當(dāng)方法分離RNA的起始材料。例如，使用QiagenRneasyMini試劑盒按照廠商方案分離RNA。分離的結(jié)核分枝桿菌RNA使用Stratrascript逆轉(zhuǎn)錄酶(RT)(Stratagene，USA)進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，得到cDNA。使用結(jié)核分枝桿菌rRNA-(23SrRNA)和mRNA(Rv3134c基因)特異性引物擴增cDNA，以檢測結(jié)核分枝桿菌RNA的存在。RT陰性對照——其中，分離的RNA進行不含逆轉(zhuǎn)錄酶的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)——也進行PCR運行以監(jiān)測制備物中存在的任何污染性基因組DNA。獲得了相應(yīng)于核糖體和信使cDNA的擴增(圖19)，證明兩種結(jié)核分枝桿菌RNA均從痰樣品獲得分離。(I)USP溶液對革蘭氏染色細菌的生存力和染色性質(zhì)的影響評價了USP溶液對痰樣品中最通常存在的三種微生物區(qū)系，即，大腸桿菌(Escherichiacoli)、假單胞菌屬種(Pseudomanassp.)和葡萄球菌屬種(Staphylococcussp.)的生存力和染色性質(zhì)的影響。細菌用溶液1于室溫處理10-15分鐘，之后離心并用無菌水洗滌沉淀(如所述的)。然后，將沉淀重懸浮在溶液3中，取10％涂在載玻片上(一式兩份)，取40％接種在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中并37℃孵育以監(jiān)測任何生長。這之后革蘭氏染色載玻片。也對未處理的細菌進行了革蘭氏染色。觀察到假單胞菌屬種和大腸桿菌均被USP溶液的處理所裂解，這由通過革蘭氏染色觀察到的全部形態(tài)喪失(圖20)和甚至在1周以后在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中的無任何生長所證實。然而，葡萄球菌屬種在USP處理后保持了其形態(tài)和生存力(通過營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上的生長檢查)。然而，當(dāng)利用USP方法加工含有結(jié)核分枝桿菌和葡萄球菌屬種的痰樣品并在LJ培養(yǎng)基上培養(yǎng)時，葡萄球菌屬種不在LJ培養(yǎng)基上生長(未顯示)，這可能是由于培養(yǎng)基的選擇性所致。因此，USP溶液裂解并殺死革蘭氏陰性細菌，但是對革蘭氏陽性細菌如葡萄球菌屬種不具有任何有害作用，因此，也可以用于診斷葡萄球菌疾病。8.本發(fā)明的主要優(yōu)點(i)開發(fā)了一個涉及最優(yōu)化的樣品加工的方法學(xué)，該方法學(xué)使用離液劑的新用途以實現(xiàn)對結(jié)核病的快速、靈敏和準(zhǔn)確診斷。分枝桿菌細胞壁的獨特性質(zhì)使得分枝桿菌選擇性地抵抗鹽酸胍的作用。(ii)除了結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌，含有其它分枝桿菌的樣品在用于診斷試驗之前也可以有效地利用USP方法進行加工。(iii)所要求保護的技術(shù)是模塊化的(modular)；它十分突出地適于高靈敏的涂片顯微鏡檢術(shù)、培養(yǎng)和用于基于核酸的診斷試驗的良好質(zhì)量的無抑制劑的分枝桿菌DNA和RNA的分離。而且，描述了可以靈敏且特異地診斷結(jié)核病的靈敏PCR試驗。(iv)由于相對簡單且用戶容易使用，該方法學(xué)可以由具有最少科學(xué)背景和訓(xùn)練的技術(shù)人員來實施。USP涂片顯微鏡檢術(shù)的優(yōu)點1.此USP方法相較于現(xiàn)有涂片顯微鏡檢術(shù)方法存在的主要優(yōu)點是其非常高的靈敏度。已經(jīng)證實，該方法可以重現(xiàn)性地檢測含有可達300-400個桿菌/ml痰的樣品。這比涂片檢查的直接方法靈敏大約30倍。此靈敏度(檢測限)可以進一步通過將超過所建議的10％的加工樣品用于涂片顯微鏡檢而增加。2.由于此方法處理整個痰樣品，故缺少膿或含有鼻煙排出物或唾液的樣品也可以容易地利用該方法加工。3.由于痰中的組織和細胞碎屑及蛋白質(zhì)性廢物可以被有效地除去，故可以在極小的區(qū)域(1cm×1cm)中制備涂片。可以使用多達10％的樣品，而不會出現(xiàn)得到過厚涂片或獲得干擾載玻片的顯微鏡檢的高背景的機會(見圖2)。4.在不實施培養(yǎng)和PCR檢查的情況下，可以在多個載玻片上檢查＞10％的樣品。預(yù)期該方法可以進一步提供通過USP方法實施的涂片顯微鏡檢術(shù)的靈敏度。5.在從組織活檢樣品制備涂片時，此方法尤其有利。它可以繞過從實體活檢物樣品制備用于AFB涂片顯微鏡檢術(shù)的涂片時常規(guī)的組織病理學(xué)步驟。此方法從組織活檢樣品產(chǎn)生適于AFB染色的高質(zhì)量涂片，而這通過涂片的直接或濃縮(CDC)方法均是不可能的。6.此方法也與結(jié)核分枝桿菌之外的分枝桿菌相容。USP培養(yǎng)的優(yōu)點1.該方法不涉及使用昂貴試劑，例如NALC。2.USP溶液是具有中性pH的緩沖的溶液。因此在培養(yǎng)前無需對樣品進行中和。3.該方法具有通用性質(zhì)，可以用于從痰以及各種各樣的肺和肺外樣品培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌。4.USP溶液是非常有效的凈化劑，并適于在具有潮濕氣候的熱帶國家使用。5.該方法還與結(jié)核分枝桿菌之外的分枝桿菌和革蘭氏陽性生物如葡萄球菌屬種的培養(yǎng)相容。USP核酸分離方法的優(yōu)點1.由于該方法是一種多用途方法，故無需一個單獨的方法用于從加工用于涂片顯微鏡檢和培養(yǎng)的樣品分離DNA/RNA。2.該方法可以從各種各樣的肺和肺外來源樣品分離無抑制劑的PCR可擴增DNA，實際上可以將該方法稱為一種通用加工方法。它有效地從臨床樣品(例如，血液、咳血痰(hemoptyicsputum)樣品)除去已知是有力的PCR抑制劑(Mahony等，1998；Al-Soud和RadstromP2001；Kang等，2002)的血紅蛋白。3.該方法不涉及使用危險有機溶劑如酚或氯仿或昂貴的酶如溶菌酶等。4.由于該方法含有離液劑GuHCl——一種有效的RNase變性劑，故該方法與從臨床樣品分離高質(zhì)量的分枝桿菌RNA相容。基于devR的PCR的優(yōu)點1.和基于插入序列IS6110的流行試驗大不相同，devR基因在結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的所有物種和分離菌(包括，結(jié)核分枝桿菌和牛分枝桿菌)中保守。IS6110序列據(jù)報道在印度和全球的一定比例的臨床分離物中缺失。[Dale等，1997，Barlow等，2001，Narayanan等，2001]。模塊化的技術(shù)的優(yōu)點該技術(shù)適于任何類型的體液和組織活檢物(除了未檢查的糞便物)。本發(fā)明技術(shù)可以用于各種臨床環(huán)境和實驗室。(1)它可以在具有最少設(shè)備(僅渦旋振蕩器、光學(xué)顯微鏡和可以達到4000rpm速度的室溫離心機)的實驗室中用于涂片顯微鏡檢。(2)它可以在具有培養(yǎng)分枝桿菌的額外設(shè)施的實驗室中用于涂片顯微鏡檢和培養(yǎng)。(3)最后，可以在完善的實驗室中應(yīng)用PCR和RT-PCR檢查。因此，該技術(shù)可以按如下進行市場銷售以配合個體需要試劑盒1通用樣品加工(USP)試劑盒[含有4-6MGuHCl和0.1-0.2β-巰基乙醇；細節(jié)見“詳述”]。試劑盒2USP、涂片和培養(yǎng)試劑盒。試劑盒3USP、涂片、培養(yǎng)和DNA分離試劑盒。試劑盒4完全試劑盒(USP、涂片、培養(yǎng)、DNA分離和PCR)試劑盒5作為從臨床樣品分離分枝桿菌RNA的試劑盒的一部分。9.本發(fā)明的多個有意義的方面1.本發(fā)明方法單獨可以服務(wù)于通過分子和微生物學(xué)方法診斷TB的所有三個重要方面，即，涂片顯微鏡檢術(shù)、培養(yǎng)和PCR/RT-PCR。實際上，該方法可以聲稱為一種通用加工方法。2.該方法學(xué)是通用的，可以應(yīng)用于所有類型的人類臨床材料，包括呼吸道樣品(自發(fā)咳出的痰、生理鹽水噴霧誘導(dǎo)的痰、經(jīng)氣管的吸出物、支氣管肺泡灌洗物、喉拭子、鼻煙拭子)、體液(胸膜液、心包液、關(guān)節(jié)吸出物、胃吸出物、腹膜液、腦脊髓液、尿、膿、子宮內(nèi)膜吸出物、滑液)、身體組織(血液、骨髓活檢物)和實體器官(淋巴結(jié)、骨、皮膚)和牛樣品(淋巴腺、奶和血液)。3.該方法快速；其需要最多2小時來完成樣品加工。4.該方法也適于從冰凍的痰樣品(-20℃儲存多達2個月)和冰凍的肺外樣品進行的涂片顯微鏡檢術(shù)、培養(yǎng)和PCR。5.該方法在經(jīng)某些修改后適用于分離宿主(人類)DNA。與USP溶液有關(guān)的其它方面1.安全(i)USP溶液含有鹽酸胍(GuHCl)而非異硫氰酸胍(GuSCN)作為主要成分。由于GuSCN與酸接觸時產(chǎn)生潛在的有害氣體HCN，因此在處置掉含有該化學(xué)品的溶液時需要極為小心。因此，其不適于非專門化的常規(guī)微生物學(xué)實驗室。但是，在該試劑中使用GuHCl使得可以安全地操作和處置該試劑。(ii)USP溶液不使用任何危險有機溶劑。2.穩(wěn)定性和操作無需特殊操作。3.節(jié)省成本USP方法與IRS方法不同，其不涉及使用昂貴試劑NALC。此外，GuHCl也比GuSCN(抑制劑除去溶液的一部分)便宜。4.USP溶液是中性pH溶液USP溶液是緩沖的中性pH溶液。因此，在從凈化后的樣品培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌和其它分枝桿菌之前無需額外的涉及中和作用的步驟。USP溶液也與RNA分離方案相容。5.粘液溶解、凈化、蛋白質(zhì)變性、離液作用、液化、組織軟化/消化、釋放分枝桿菌的作用。6.USP的三種主要成分(包括離液劑GuHCl、去污劑十二烷基肌氨酸鈉和還原劑β-巰基乙醇)協(xié)同作用。與涂片顯微鏡檢術(shù)相關(guān)的方面1.本發(fā)明方法十分適于制備用于高靈敏度顯微鏡檢術(shù)的涂片。該方法已經(jīng)證實可以重現(xiàn)性地檢測含有可達300-400個桿菌/ml痰的樣品。這比涂片檢查的直接方法靈敏大約30倍。該靈敏度(檢測限)還可以進一步通過將超過所建議的10％的經(jīng)加工樣品用于涂片顯微鏡檢而增加。2.由于該方法處理整個痰樣品，因此，缺乏膿或含有鼻咽排出物或唾液的痰也可以容易地使用該方法加工。3.由于該方法有效地除去痰中的組織和細胞碎屑及蛋白質(zhì)性廢料(復(fù)染物質(zhì)(counterstainingmaterial))，故可以取樣品的至少10％在極小區(qū)域(1cm×1cm)制備涂片，而不會有得到過厚涂片或獲得干擾載玻片顯微鏡檢的高背景的機會(見圖9B)。這使得可以將更多桿菌涂在載玻片上，由此相當(dāng)程度地增加該顯微鏡檢方法的靈敏度，并最小化在檢查每個載玻片時花費的時間。因此，此USP方法一般將按照直接方法分級為1+或極少的載玻片分別轉(zhuǎn)變?yōu)?+/3+或2+/1+。根據(jù)相同的原則，利用直接方法被讀為陰性的載玻片可以通過此USP方法變?yōu)殛栃浴Ｔ诖吮仨毺峒暗氖?，對于涂片的各方法，針對陰性樣品所掃描的視野?shù)是300-500個，并且為了確信樣品的狀況，該視野數(shù)不限于100個視野。就我們所知，此方法是迄今所報道的最靈敏的方法，具有每ml樣品300-400個桿菌的檢測限。(圖3)。4.該靈敏度(檢測限)可以進一步地通過將超過所建議的10％的經(jīng)加工的樣品用于涂片顯微鏡檢術(shù)而增加。5.在不實施培養(yǎng)和PCR檢查的情況下，可以在多個載玻片上檢查＞10％的樣品。預(yù)期該方法可以進一步提高通過USP方法實施的涂片顯微鏡檢術(shù)的靈敏度。6.此方法也與結(jié)核分枝桿菌之外的分枝桿菌相容。7.此涂片顯微鏡檢術(shù)方法可應(yīng)用于所有的分枝桿菌，包括緩慢生長的物種如屬于結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群的生物、鳥分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、副結(jié)核分枝桿菌(M.paratuberculosis)、蟾分枝桿菌等，快速生長的物種如恥垢分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌、草分枝桿菌、牝牛分枝桿菌、戈特氏分枝桿菌等，和不可培養(yǎng)的物種如麻風(fēng)分枝桿菌(M.leprae)。8.USP涂片顯微鏡檢方法與革蘭氏陽性生物例如葡萄球菌屬種相容，并預(yù)期可以應(yīng)用于其它耐酸性桿菌(例如，Cryptosporidiumsp.，諾卡氏菌屬種(Nocardiasp.)，Isosporabelli和Rhodococcusequi.)9.高度靈敏該方法有效地從樣品中去除背景復(fù)染物，使得可以在載玻片上涂至少10％的樣品，否則這將是不可能的。由于復(fù)染廢料的如此有效的去除，涂多達10％的樣品也不會產(chǎn)生厚涂片并且該涂片可以非常容易地?zé)峁潭ê腿旧?圖9b)。10.可以直接地加工組織活檢樣品用于涂片顯微鏡檢，而避開固定、石蠟包埋和切片的常規(guī)組織學(xué)程序。與培養(yǎng)有關(guān)的方面1.USP溶液起到非常有效的凈化劑的作用，并適于在具有潮濕氣候的熱帶國家使用。2.該方法不涉及使用昂貴試劑，如NALC。3.USP溶液是具有中性pH的緩沖的溶液，且不涉及使用NaOH。因此，在培養(yǎng)之前，無需中和樣品。樣品中和在涉及用NaOH凈化的方法(例如CDC方法)中是首先的要求。不適當(dāng)?shù)闹泻统３２焕赜绊懪囵B(yǎng)結(jié)果。4.該方法是通用的，可以用于培養(yǎng)來自痰以及各種各樣肺和肺外樣品的結(jié)核分枝桿菌。5.該方法也與MOTT桿菌的培養(yǎng)相容。與DNA分離和基于devR的PCR有關(guān)的方面1.由于此方法是一個多用途方法，故無需單獨的方法用于從加工用于涂片顯微鏡檢術(shù)和培養(yǎng)的樣品分離DNA。2.此方法有效地除去PCR抑制劑?？梢詮乃蓄愋偷姆魏头瓮鈽悠房芍噩F(xiàn)地分離無抑制劑的PCR可擴增DNA。3.此方法不涉及使用危險有機溶劑，如酚或氯仿或昂貴的酶如溶菌酶等。4.此DNA分離方法將與PCR之外的其它核酸擴增方法，例如連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、鏈置換試驗等相容。5.描述了一個能夠靈敏、特異地診斷結(jié)核的特異性靈敏PCR試驗。6.與分離DNA的IRS方法[Chakravorty和Tyagi2001；抑制劑去除溶液(IRS)包括在題為“用于從臨床樣品分離PCR可擴增的結(jié)核分枝桿菌DNA的快速、有效單管提取方法”的專利申請中，其中所述申請在NewDelhi專利局提出，申請?zhí)?97/DEL/2000。]相比，USP方法被很大簡化并且涉及更少的技術(shù)。首先，可以在最大速度可達4000rpm的臺式離心機上室溫進行離心，由此避開對高速冷凍離心機的需要。其二，消除了NALC作為粘液溶解劑的使用，由此節(jié)約成本。其三，USP方法對環(huán)境有利，因為其不涉及使用異硫氰酸胍。其四，USP方法不需要使用溶菌酶。7.該DNA分離方法也與用于檢測其它分枝桿菌的核酸擴增方法相容。8.由于此USP加工方法不涉及用堿進行處理，因此，其也與從臨床樣品分離RNA的程序以及RNA擴增程序如轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增相容。與RNA分離和擴增技術(shù)相關(guān)的方面1.經(jīng)USP處理的分枝桿菌適用于標(biāo)準(zhǔn)RNA-分離方案。2.由此分離的RNA適于使用酶如逆轉(zhuǎn)錄酶、TaqDNA聚合酶等通過擴增技術(shù)實施的進一步分析。3.mRNA和rRNA均可以成功地從經(jīng)USP處理的結(jié)核分枝桿菌分離。參考文獻1.AkhtarM，BretzelG，BoulahbalF，DawsonD，F(xiàn)attoriniL，F(xiàn)eldmannK，F(xiàn)riedenT，HavelkováM.NdeKantorI，KimSJ，KüchlerR，LamotheF，LaszloA，CasabonaNM，McDougallAC，MirnerH，OreficiG，ParamasivanCN，PattynSR，RenieroA，RiederHL，Ridderhof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結(jié)核病的臨床樣品的、經(jīng)濟有效的方法，該方法使用包含由通用樣品加工(USP)溶液(由濃度3至6M的鹽酸胍(GuHCl)、濃度40-60mM且pH7.3-7.7的Tris-Cl、濃度20-30mM的EDTA、濃度0.3-0.8％的十二烷基肌氨酸鈉、濃度0.1-0.3M的β-巰基乙醇組成)組成的溶液1、由濃度65-70mM且pH6.7-6.8的磷酸鈉組成的溶液2(可選擇地，可以由無菌水代替)、和由濃度0.03-0.08％的Tween80組成的溶液3、以及用于分離DNA的包含濃度8-12％的Chelex100懸浮液的溶液A、由濃度0.02-0.04％的TritonX-100組成的溶液B和包含濃度0.2-0.4％的Tween20的溶液C(任選地，可以使用單獨溶液3或具有0.03-0.1％TritonX100的溶液3替代溶液A、B和C從含高桿菌載量或低廢料的樣品分離DNA)的組合物，所述方法包括步驟a.獲得臨床樣品，b.將樣品與1.5至2體積溶液1混合，c.勻漿混合物同時避免起泡，d.向勻漿物添加溶液2以得到沉淀，任選地溶液2可以由無菌水替代，e.用溶液1洗滌沉淀，f.用水洗滌經(jīng)溶液1洗滌后的沉淀，和g.將水洗后的沉淀重新懸浮在溶液3中獲得用于診斷的經(jīng)加工樣品。49.權(quán)利要求47的方法，其中所述經(jīng)加工樣品可以以涂片、培養(yǎng)物或使用PCR可擴增的分枝桿菌DNA和RNA的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)起始材料的形式使用。50.權(quán)利要求47的方法，其中所述經(jīng)加工樣品可以以涂片、培養(yǎng)物或聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)起始材料的形式使用，其中可以通過煮沸的簡單裂解作用獲得PCR可擴增的分枝桿菌DNA。51.權(quán)利要求47的方法，其中所述通用樣品加工(USP)溶液包含濃度3-6M的鹽酸胍(GuHCl)、濃度40-60mM且pH7.3-7.7的Tris-Cl、濃度20-30mM的EDTA、濃度0.3-0.8％的十二烷基肌氨酸鈉、濃度0.1-0.3M的β-巰基乙醇。52.權(quán)利要求47的方法，其中所述方法維持活樣品的生存力。53.權(quán)利要求47的方法，其中勻漿持續(xù)時間20-120秒。54.權(quán)利要求47的方法，其中溶液1的鹽酸胍裂解真核和革蘭氏陰性細胞、使蛋白質(zhì)變性、液化樣品和滅活內(nèi)源性酶。55.權(quán)利要求47的方法，其中所述加工在總共1-2小時的持續(xù)時間內(nèi)完成。56.權(quán)利要求47的方法，其中所述方法產(chǎn)生無抑制劑的、用于基于PCR的診斷的分枝桿菌DNA。57.權(quán)利要求48的方法，其中用于加工培養(yǎng)和涂片樣品的通用樣品加工(USP)溶液包含濃度大約4M的鹽酸胍(GuHCl)、濃度40-60mM且pH7.3-7.7的Tris-Cl、濃度20-30mM的EDTA、濃度0.3-0.8％的十二烷基肌氨酸鈉、濃度大約0.1M的β-巰基乙醇。58.權(quán)利要求48的方法，其中用于加工培養(yǎng)、涂片和PCR樣品的所述通用樣品加工(USP)溶液包含大約5M的鹽酸胍(GuHCl)、濃度40-60mM且pH7.3-7.7的Tris-Cl、濃度20-30mM的EDTA、濃度0.3-0.8％的十二烷基肌氨酸鈉、濃度0.1-0.2M的β-巰基乙醇。59.權(quán)利要求48的方法，其中用于加工涂片和PCR樣品的所述通用樣品加工(USP)溶液包含濃度大約6M的鹽酸胍(GuHCl)、濃度40-60mM且pH7.3-7.7的Tris-Cl、濃度20-30mM的EDTA、濃度0.3-0.8％的十二烷基肌氨酸鈉、濃度大約0.2M的β-巰基乙醇。60.權(quán)利要求48的方法，其中所述組合物包含由通用樣品加工(USP)溶液組成的溶液1、由濃度為65-70mM且pH為6.7-6.8的磷酸鈉組成的溶液2、由濃度0.03-0.08％的Tween80組成的溶液3、以及任選地，包含濃度8-12％的Chelex100懸浮液的溶液A、和/或由濃度0.02-0.04％的TritonX-100組成的溶液B、和/或濃度0.2-0.4％的Tween20。61.權(quán)利要求48的方法，其中溶液A、溶液B和溶液C的應(yīng)用可以限于僅從低桿菌載量的樣品中分離DNA。62.權(quán)利要求48的方法，其中USP中的鹽酸胍(GuHCl)、十二烷基肌氨酸鈉和β-巰基乙醇以協(xié)同方式作用以實現(xiàn)對所有類型的臨床樣品的最佳加工。63.權(quán)利要求48的方法，其中β-巰基乙醇和十二烷基肌氨酸鈉的存在適于粘液樣痰樣品的最佳加工。64.權(quán)利要求48的方法，其中GuHCl以及β-巰基乙醇和十二烷基肌氨酸鈉的一起存在對于粘液膿性痰樣品的最佳加工是絕對必需的。65.權(quán)利要求48的方法，其中對于含有血液的樣品，GuHCl通過變性血紅蛋白和從標(biāo)本中除去該蛋白質(zhì)而作為主要的抑制劑去除組分起作用。66.權(quán)利要求48的方法，其中GuHCl作為臨床標(biāo)本的主要凈化劑起作用。67.權(quán)利要求48的方法，其中對于含有高桿菌載量和/或較低的廢料含量的樣品，PCR可擴增的分枝桿菌DNA可以通過在0.04％-0.06％Tween80存在下煮沸或通過添加0.03-0.1％TritonX100，經(jīng)簡單裂解而獲得，而無需使用溶液A、B和C。68.權(quán)利要求47的方法，其中所述經(jīng)加工的樣品無污染性生物、蛋白質(zhì)、酶和干擾性物質(zhì)。69.權(quán)利要求48的方法，其中在涂片顯微鏡檢術(shù)下所述方法可以檢測到300-400個桿菌/ml的樣品。70.權(quán)利要求48的方法，其中通過使用10％以上的經(jīng)加工樣品用于涂片制備，涂片顯微鏡檢術(shù)可以檢測到少于300-400個桿菌/ml的樣品。71.權(quán)利要求48的方法，其中所述方法比常規(guī)直接涂片顯微鏡檢方法具有增強大約30倍的靈敏度。72.權(quán)利要求48的方法，其中在涂片中所述方法顯示出97-99％的靈敏度。73.權(quán)利要求48的方法，其中在涂片中所述方法顯示出83-92％的特異性。74.權(quán)利要求48的方法，其中所述方法顯示出比涂片顯微鏡檢術(shù)的CDC方法增加大約18％的靈敏度。75.權(quán)利要求48的方法，其中所述方法顯示出比直接涂片法增加大約30％的靈敏度。76.權(quán)利要求48的方法，其中在涂片中所述方法顯示出80-96％的陽性預(yù)測值。77.權(quán)利要求48的方法，其中在涂片中所述方法顯示出91-99％的陰性預(yù)測值。78.權(quán)利要求48的方法，其中在涂片中所述方法顯示出大約91％的診斷準(zhǔn)確度。79.權(quán)利要求48的方法，其中所述方法降低復(fù)染背景使得可以更好地觀察載玻片、提高載玻片的分級、并減少閱讀載玻片的時間和勞動。80.權(quán)利要求48的方法，其中所述方法比CDC方法更有效地進行樣品的凈化。81.權(quán)利要求48的方法，其中在培養(yǎng)中，與CDC方法相比，所述方法顯示出兩倍的微生物生存力。82.權(quán)利要求48的方法，其中在培養(yǎng)中，與未處理的微生物相比，所述方法導(dǎo)致微生物菌落延遲大約1周出現(xiàn)。83.權(quán)利要求48的方法，其中在培養(yǎng)中所述方法顯示出大約50％的靈敏度。84.權(quán)利要求48的方法，其中所述方法比CDC方法更適于熱帶地區(qū)。85.權(quán)利要求48的方法，其中在培養(yǎng)中所述方法在中性pH下運行。86.權(quán)利要求48的方法，其中在PCR中所述方法顯示出對PCR試驗無抑制。87.權(quán)利要求48的方法，其中在PCR中所述方法顯示微生物結(jié)核分枝桿菌的devR基因的兩組引物，即，devRf2&devRr2和devRf3&devRr3。88.權(quán)利要求79的方法，其中引物devRf2和devRr2擴增微生物結(jié)核分枝桿菌devR基因的308bp片段。89.權(quán)利要求79的方法，其中引物devRf3和devRr3擴增微生物結(jié)核分枝桿菌devR基因的164bp片段。90.權(quán)利要求79的方法，其中在使用引物devRf2和devRr2的PCR中所述方法顯示出比devRf和devRr增加2-4倍的靈敏度。91.權(quán)利要求79的方法，其中在使用引物devRf3和devRr3的PCR中所述方法顯示出比引物devRf和devRr增加至少10倍的靈敏度。92.權(quán)利要求48的方法，其中樣品可以獲自包含各種類型的痰的來源和其它體液，包括FNAC、膿、胸膜液、心包液、關(guān)節(jié)吸出物、腹膜液、腦脊髓液、子宮內(nèi)膜吸出物、滑液、胃吸出物、氣管內(nèi)吸出物、尿、經(jīng)氣管吸出物、支氣管肺泡灌洗液、喉拭子和鼻咽拭子；身體組織，包括血液、胸膜組織、骨髓和活檢物；實體器官，包括淋巴結(jié)、骨、皮膚；和牛樣品，包括淋巴腺、乳汁和血液。93.權(quán)利要求48的方法，其中可以加工在大約-20℃儲存多達2個月的樣品用于PCR、涂片顯微鏡檢術(shù)和培養(yǎng)。94.權(quán)利要求48的方法，其中在PCR中所述方法可以用于DNA和RNA。95.權(quán)利要求48的方法，其中所述組合物顯示出粘液溶解、凈化、變性蛋白質(zhì)、離液作用、液化、軟化/消化組織以及釋放分枝桿菌的作用。96.權(quán)利要求48的方法，其中在涂片中所述方法使得可以將更多的桿菌涂在載玻片上，由此增加靈敏度和效率。97.權(quán)利要求48的方法，其中在涂片中所述方法一般將通過直接方法分級為1+或極少的載玻片分別轉(zhuǎn)變?yōu)?+/3+或2+/1+。98.權(quán)利要求48的方法，其中可以加工缺少膿或含有鼻咽排出物或唾液的樣品。99.權(quán)利要求48的方法，其中所述方法從組織活檢樣品產(chǎn)生適于非常靈敏的AFB涂片顯微鏡檢術(shù)的高質(zhì)量涂片。100.權(quán)利要求48的方法，其中所述方法對結(jié)核分枝桿菌的耐酸性質(zhì)、生存力和完整性顯示出無不利影響。101.權(quán)利要求47的方法，其中所述方法適于診斷肺結(jié)核和肺外結(jié)核且功效相同。102.權(quán)利要求47的方法，其中所述方法與在固體和液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)來自臨床標(biāo)本的分枝桿菌相容。103.權(quán)利要求48的方法，其中對于通過涂片顯微鏡檢術(shù)的直接方法和CDC方法已經(jīng)檢測為陰性的樣品，所述方法可以將其檢測為陽性。104.一種用于加工臨床樣品的試劑盒，所述臨床樣品用于簡單、快速、安全、靈敏和準(zhǔn)確地診斷微生物疾病狀況，所述試劑盒包含由通用樣品加工(USP)溶液(由濃度3-6M的鹽酸胍(GuHCl)、濃度40-60mM且pH7.3-7.7的Tris-Cl、濃度20-30mM的EDTA、濃度0.3-0.8％的十二烷基肌氨酸鈉、濃度0.1-0.3M的β-巰基乙醇組成)組成的溶液1、由濃度65-70mM且pH6.7-6.8的磷酸鈉組成的溶液2(可選擇地，可以由無菌水代替)、由濃度0.03-0.08％的Tween80組成的溶液3、包含濃度8-12％的Chelex100懸浮液的溶液A、由濃度0.02-0.04％的TritonX-100組成的溶液B和由濃度0.2-0.4％的Tween20組成的溶液C，任選地兩組引物，分別為SEQIDNO1和SEQIDNO2的devRf2和devRr2引物和分別為SEQIDNO3和SEQIDNO4的devRf3和devRr3引物。105.權(quán)利要求104的試劑盒，其中所述試劑盒在加工用于檢測細菌感染的臨床樣品中有用。106.權(quán)利要求104的試劑盒，其中所述試劑盒在加工用于檢測結(jié)核病的臨床樣品中有用。107.權(quán)利要求104的試劑盒，其中所述通用樣品加工(USP)溶液包含濃度3-6M的鹽酸胍(GuHCl)、濃度40-60mM且pH7.3-7.7的Tris-Cl、濃度20-30mM的EDTA、濃度0.3-0.8％的十二烷基肌氨酸鈉、濃度0.1-0.3M的β-巰基乙醇。108.權(quán)利要求104的試劑盒，其中用于加工培養(yǎng)和涂片樣品的通用樣品加工(USP)溶液包含濃度大約4M的鹽酸胍(GuHCl)、濃度40-60mM且pH7.3-7.7的Tris-Cl、濃度20-30mM的EDTA、濃度0.3-0.8％的十二烷基肌氨酸鈉、濃度大約0.1M的β-巰基乙醇。109.權(quán)利要求104的試劑盒，其中用于加工培養(yǎng)、涂片和PCR樣品的所述通用樣品加工(USP)溶液包含濃度大約5M的鹽酸胍(GuHCl)、濃度40-60mM且pH7.3-7.7的Tris-Cl、濃度20-30mM的EDTA、濃度0.3-0.8％的十二烷基肌氨酸鈉、濃度0.1-0.2M的β-巰基乙醇。110.權(quán)利要求104的試劑盒，其中用于加工涂片和PCR樣品的所述通用樣品加工(USP)溶液包含濃度大約6M的鹽酸胍(GuHCl)、濃度40-60mM且pH7.3-7.7的Tris-Cl、濃度20-30mM的EDTA、濃度0.3-0.8％的十二烷基肌氨酸鈉、濃度大約0.2M的β-巰基乙醇。111.權(quán)利要求104的試劑盒，其中所述組合物包含由通用樣品加工(USP)溶液組成的溶液1、由濃度為65-70mM且pH為6.7-6.8的磷酸鈉組成的溶液2、由濃度0.03-0.08％的Tween80組成的溶液3、以及任選地，包含濃度8-12％的Chelex100懸浮液的溶液A、和由濃度0.02-0.04％的TritonX-100組成的溶液B、和由濃度0.2-0.4％的Tween20組成的溶液C。112.一組分別為SEQIDNO1和SEQIDNO2的devRf2和devRr2引物。113.一組分別為SEQIDNO3和SEQIDNO4的devRf3和devRr3引物。114.使用基因devR的SEQIDNO1和2或SEQIDNO3和4的引物篩選結(jié)核病患者的方法，所述方法包括步驟使用受試者的經(jīng)加工樣品的DNA或RNA實施聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，鑒定患有結(jié)核病的受試者。115.通過使用權(quán)利要求1的方法加工臨床標(biāo)本而獲得的經(jīng)加工臨床樣品。116.權(quán)利要求112的經(jīng)加工樣品，其中所述臨床標(biāo)本包括所有類型的痰和其它體液，包括FNAC、膿、胸膜液、心包液、關(guān)節(jié)吸出物、腹膜液、腦脊髓液、子宮內(nèi)膜吸出物、滑液、胃吸出物、氣管內(nèi)吸出物、尿、經(jīng)氣管吸出物、支氣管肺泡灌洗液、喉拭子和鼻咽拭子；身體組織，包括血液、胸膜組織、骨髓和活檢物；實體器官，包括淋巴結(jié)、骨、皮膚；和牛樣品，包括淋巴腺、奶和血液。全文摘要本發(fā)明涉及加工臨床樣品以便通過涂片顯微鏡檢術(shù)、培養(yǎng)或PCR診斷細菌性感染的方法和用于實施該方法的試劑盒。本發(fā)明還涉及兩組對結(jié)核分枝桿菌的DevR基因具有特異性的引物以及使用所述引物通過PCR篩選結(jié)核病患者的方法。文檔編號G01N33/483GK1856570SQ03827070公開日2006年11月1日申請日期2003年7月29日優(yōu)先權(quán)日2003年7月29日發(fā)明者J·S·蒂亞吉,S·查克拉瓦蒂申請人:全印度醫(yī)學(xué)科學(xué)院