專利名稱：一種基于微流控芯片的細(xì)胞定性分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞定性分析技術(shù)，特別提供了一種基于微流控芯片以電泳淌度為參數(shù)的細(xì)胞定性分析方法。
背景技術(shù)：
細(xì)胞分類是了解復(fù)雜細(xì)胞群的手段之一。與細(xì)胞分選和分離不同的是它可以不經(jīng)過分離過程而實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞群的初步認(rèn)識(shí)。現(xiàn)有商品化儀器均需對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分選或分離而完成細(xì)胞分類，尚沒有不需細(xì)胞分離的分類儀出現(xiàn)。
細(xì)胞電泳淌度是表征細(xì)胞表面電荷的參數(shù)之一[林克椿主編《生物物理學(xué)》北京人民教育出版社，1981；267-282]，其常用測(cè)量手段包括細(xì)胞電泳[Hashimoto，N.，F(xiàn)ujita，s.，Yokoyama，T.，Ozawa，Y.，Kingstsu，I.，Kurosaka，D.，Sabolovic，D.，Schuett，W.，Electrophoresis 1998，19，1227-1230.][劉健，李安立中國生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)報(bào)1990，9(3)，161-191]，毛細(xì)管電泳(CE)[Daniel W.Armstrong；MarcoGirod，Lingfeng He，Michael A.Rodriguez，Wei Wei，Jinjian Zheng and Edward S.Yeung.Anal Chem，2002，745523]，激光電泳[毛慧生、胡蘭靛、馬強(qiáng)、李安之中國生物醫(yī)學(xué)工程學(xué)報(bào) 1994，13(2)，171-174]等。比較而言，細(xì)胞電泳儀設(shè)備相對(duì)簡單，但由于要求精確聚焦于靜止層，容易產(chǎn)生較大測(cè)量誤差[嚴(yán)宗毅，山慧賢。中國血液流變學(xué)雜志 2001，11(1)，1-4]。CE測(cè)量細(xì)胞電泳淌度難以作到單個(gè)細(xì)胞的測(cè)量。進(jìn)樣長度，細(xì)胞之間的作用及細(xì)胞與管壁的作用對(duì)測(cè)量精度影響較大。激光電泳儀雖然測(cè)量準(zhǔn)確，但其設(shè)備昂貴。九十年代發(fā)展起來的微流控芯片技術(shù)具有分析速度快、試劑消耗量小、易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化和集成化等優(yōu)點(diǎn)，在包括細(xì)胞分析在內(nèi)的生命科學(xué)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。微通道具有各處均為檢測(cè)窗，深寬僅為幾十微米的特點(diǎn)，可以方便的與顯微鏡耦連，實(shí)現(xiàn)微通道內(nèi)的顯微電泳，且不存在靜止層，降低測(cè)量誤差。但在微流控芯片平臺(tái)上研究細(xì)胞電泳淌度的報(bào)道很少，最早由Ichiki[Takanori Ichiki.，TatekazuUjiie.，Satomi Shinbashi.，Tomoko Okuda.，Electrophoresis 2002，23，2029-2034]等人開展，他們考察了羊紅細(xì)胞在石英芯片上的電泳淌度以及抗體對(duì)羊紅細(xì)胞電泳淌度的影響。與CE和激光電泳相比芯片上細(xì)胞電泳淌度測(cè)量方法具有設(shè)備簡單，操作靈活的特點(diǎn)。無論上述哪一種測(cè)量電泳淌度的方法均沒有提及其在細(xì)胞分類中的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種基于微流控芯片以電泳淌度為參數(shù)的細(xì)胞定性分類分析方法，該方法干擾小，無須對(duì)細(xì)胞群分離或分選，儀器簡單，操作靈活。
本發(fā)明提供了一種基于微流控芯片的細(xì)胞定性分析方法，其特征在于以單通道的微流控芯片為平臺(tái)，通道兩端分別為緩沖池和廢液池，在通道的任一位置處耦合顯微鏡；過程是將細(xì)胞液加入緩沖池中，緩沖液加入到廢液池中，調(diào)節(jié)緩沖池液面高度，使視野范圍內(nèi)細(xì)胞處于靜止；在緩沖池和廢液池上施加電壓，通過安裝在顯微鏡上的電子耦合器(CCD)記錄下每一個(gè)細(xì)胞定向移動(dòng)的速度，并據(jù)此計(jì)算出每一個(gè)細(xì)胞的電泳淌度(淌度系指單位場強(qiáng)下的遷移速度)；以電泳淌度為橫坐標(biāo)，細(xì)胞的數(shù)量為縱坐標(biāo)畫出待測(cè)細(xì)胞的分布譜線；將待測(cè)細(xì)胞的分布譜線與標(biāo)準(zhǔn)譜線的譜峰比較，獲得細(xì)胞的分類定性結(jié)果。
本發(fā)明提供的基于微流控芯片的細(xì)胞定性分析方法中，所用細(xì)胞濃度應(yīng)在103個(gè)/mL-108個(gè)/mL之間。細(xì)胞濃度低于這個(gè)范圍時(shí)，耗時(shí)長。高于這個(gè)范圍時(shí)，由于細(xì)胞相互接觸及其與通道接觸的機(jī)會(huì)大，統(tǒng)計(jì)誤差增大。
本發(fā)明提供的基于微流控芯片的細(xì)胞定性分析方法中，所施加電場范圍取決于所用芯片的伏安特性曲線，電場強(qiáng)度以不超過伏安曲線偏離直線時(shí)的電場強(qiáng)度為宜。
本發(fā)明提供的基于微流控芯片的細(xì)胞定性分析方法中，所述芯片材料可以是聚合物，玻璃，陶瓷或它們的復(fù)合體。
本發(fā)明提供的基于微流控芯片的細(xì)胞定性分析方法中，所述通道寬度在20微米到2000微米之間，深30微米到200微米之間。
本發(fā)明提供的基于微流控芯片的細(xì)胞定性分析方法中，所述細(xì)胞可以是未經(jīng)任何處理的細(xì)胞，也可以是標(biāo)有各種抗體或其他分子的細(xì)胞。
此外，對(duì)于非細(xì)胞的帶電顆粒(直徑從幾微米至幾十微米)本發(fā)明同樣適用。
本發(fā)明方法較傳統(tǒng)的顯微細(xì)胞電泳儀受到更小的方法干擾，更能真實(shí)的反映細(xì)胞或微顆粒自身的性質(zhì)。本發(fā)明方法無須對(duì)細(xì)胞群分離或分選。所用儀器簡單，操作靈活。


圖1為細(xì)胞在通道中的遷移照片；
圖2為細(xì)胞遷移速度與電場強(qiáng)度的直線關(guān)系，該直線的斜率即為細(xì)胞的表觀電泳淌度；圖3為電泳淌度分類三組紅細(xì)胞直方圖；圖4為形態(tài)學(xué)觀察法正常-實(shí)驗(yàn)組紅細(xì)胞照片；圖5為形態(tài)學(xué)觀察法功夫菊酯-實(shí)驗(yàn)組紅細(xì)胞照片；圖6為形態(tài)學(xué)觀察法功夫菊酯-對(duì)照組紅細(xì)胞照片。
具體實(shí)施例方式取13uL樣品加入到緩沖液池中，由于液面的高度差，液體連續(xù)充滿各通道，然后在廢液池中加入13uL的緩沖液，小心調(diào)整各儲(chǔ)液池的液面高度，使顆?；蚣?xì)胞在通道中保持靜止，消除靜壓差的影響。隨后在緩沖池中接正電壓，廢液池接地，顆粒或細(xì)胞由正極向負(fù)極遷移。顯微鏡成像，CCD記錄。CCD記錄結(jié)果為25幀/秒，選定單個(gè)顆粒記錄其起始時(shí)刻，保存該時(shí)刻圖片見圖1，記錄其起始位置。以幀前進(jìn)方式找到同一顆粒終止時(shí)刻和終止位置，從而計(jì)算該顆粒速度。每一電場下記錄顆粒數(shù)目大于30。
圖3是實(shí)驗(yàn)中測(cè)得的所有細(xì)胞的單位場強(qiáng)速度分布及其正態(tài)分布擬合。三個(gè)擬合峰與三組實(shí)驗(yàn)細(xì)胞相對(duì)應(yīng)。第一組和第三組擬合峰實(shí)現(xiàn)“基線分離”，第二組“峰”與其他兩組“峰”“分離度”較差。這三組細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果見圖4～6。圖4，5顯示細(xì)胞大小一致，血紅蛋白分布均勻，二者形態(tài)區(qū)分并不十分顯著。圖6則可看出細(xì)胞有溶解趨勢(shì)。形態(tài)學(xué)觀察與電泳分類均表明第一組和第二組細(xì)胞分類顯著性不強(qiáng)，兩者可以相互補(bǔ)充，相互驗(yàn)證。同時(shí)說明，以電泳淌度分類細(xì)胞的結(jié)果與形態(tài)觀察細(xì)胞分類結(jié)果至少相近，見表1。
表1為三組鯉魚紅細(xì)胞電泳淌度。

權(quán)利要求
1.一種基于微流控芯片的細(xì)胞定性分析方法，其特征在于以單通道的微流控芯片為平臺(tái)，通道兩端分別為樣品池和緩沖池，在通道的任一位置處耦合顯微鏡；過程是將細(xì)胞液加入緩沖池中，緩沖液加入到廢液池中，調(diào)節(jié)緩沖池液面高度，使視野范圍內(nèi)細(xì)胞處于靜止；在緩沖池和廢液池上施加電壓，通過安裝在顯微鏡上的電子耦合器(CCD)記錄下每一個(gè)細(xì)胞定向移動(dòng)的速度，并據(jù)此計(jì)算出每一個(gè)細(xì)胞的電泳淌度；以電泳淌度為橫坐標(biāo)，細(xì)胞的數(shù)量為縱坐標(biāo)畫出待測(cè)細(xì)胞的分布譜線；將待測(cè)細(xì)胞的分布譜線與標(biāo)準(zhǔn)譜線的譜峰比較，獲得細(xì)胞的分類定性結(jié)果。
2.按照權(quán)利要求1所述基于微流控芯片的細(xì)胞定性分析方法，其特征在于所用細(xì)胞濃度應(yīng)在103個(gè)/mL-108個(gè)/mL之間。
3.按照權(quán)利要求1所述基于微流控芯片的細(xì)胞定性分析方法，其特征在于所施加電場強(qiáng)度不超過所用芯片的伏安曲線偏離直線時(shí)的電場強(qiáng)度。
4.按照權(quán)利要求1所述基于微流控芯片的細(xì)胞定性分析方法，其特征在于所述芯片材料是聚合物，玻璃，陶瓷或它們的復(fù)合體。
5.按照權(quán)利要求1所述基于微流控芯片的細(xì)胞定性分析方法，其特征在于所述通道寬度在20微米到2000微米之間，深30微米到200微米之間。
6.按照權(quán)利要求1所述基于微流控芯片的細(xì)胞定性分析方法，其特征在于所述細(xì)胞是未經(jīng)任何處理的細(xì)胞，或者標(biāo)有各種抗體或其他分子的細(xì)胞。
全文摘要
一種基于微流控芯片的細(xì)胞定性分析方法，其特征在于以單通道的微流控芯片為平臺(tái)，通道兩端分別為樣品池和緩沖池，在通道的任一位置處耦合顯微鏡；過程是將細(xì)胞液加入緩沖池中，緩沖液加入到廢液池中，調(diào)節(jié)緩沖池液面高度，使視野范圍內(nèi)細(xì)胞處于靜止；在緩沖池和廢液池上施加電壓，通過安裝在顯微鏡上的電子耦合器(CCD)記錄下每一個(gè)細(xì)胞定向移動(dòng)的速度，并據(jù)此計(jì)算出每一個(gè)細(xì)胞的電泳淌度；以電泳淌度為橫坐標(biāo)，細(xì)胞的數(shù)量為縱坐標(biāo)畫出待測(cè)細(xì)胞的分布譜線；將待測(cè)細(xì)胞的分布譜線與標(biāo)準(zhǔn)譜線的譜峰比較，獲得細(xì)胞的分類定性結(jié)果。本發(fā)明方法干擾小，無須對(duì)細(xì)胞群分離或分選，儀器簡單，操作靈活。
文檔編號(hào)G01N33/50GK1616958SQ20031010507
公開日2005年5月18日 申請(qǐng)日期2003年11月11日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月11日
發(fā)明者蓋宏偉, 於林芬, 馬銀法, 林炳承 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所