專利名稱：一種生物層析凝膠及其生產(chǎn)工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生化技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種生物層析凝膠及其生產(chǎn)工藝。
背景技術(shù)：
生物層析凝膠是生物物質(zhì)純化分離所必需的試劑，它起到離子交換作用，已經(jīng)在生化領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。隨著生物制藥工業(yè)的蓬勃發(fā)展，生物層析凝膠的需求量越來越大，對(duì)規(guī)格型號(hào)的要求也越來越多。特別對(duì)于基因工程所制備的蛋白類藥物，其表達(dá)產(chǎn)物中混有較多的雜蛋白，而層析法是惟一可純化基因工程藥物的方法，因此更是離不開生物層析凝膠。
目前生物層析用的凝膠常用葡聚糖、瓊脂糖、DEAE纖維素作為載體，如Pharmacia公司產(chǎn)品Sepharose CL-4B，Sepharose CL-6B等。但以瓊脂糖作為載體存在著許多缺點(diǎn)，如價(jià)格昂貴，合成再生較復(fù)雜，需要用劇毒的CNBr活化等。這種狀況嚴(yán)重影響了生化分離技術(shù)的提高，直接制約了生物制藥產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程。因此，尋找、研究和開發(fā)一種新型凝膠是十分必要且具有巨大社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種新型的生物層析凝膠，以替代現(xiàn)有的生物層析凝膠，使它不僅具有現(xiàn)有生物層析凝膠的優(yōu)點(diǎn)，而且還具有其它一些特有的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)其產(chǎn)品原料來源廣泛、產(chǎn)品成本低。
本發(fā)明的另一目的是提供該新型生物層析凝膠的生產(chǎn)工藝。
本發(fā)明的目的是通過下列技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的本生物層析凝膠主要是由分子量在10萬至12萬之間的聚氨糖所組成。
本發(fā)明采用聚氨糖作為生物層析凝膠的主要原料，是考慮到聚氨糖在某些方面具有和瓊脂糖類似的優(yōu)點(diǎn)，如具有良好的生物相容性、表面基團(tuán)豐富、pH值使用范圍寬等。同時(shí)，作為層析凝膠載體，它還沒有瓊脂糖的某些缺點(diǎn)。
上述的生物層析凝膠的生產(chǎn)工藝如下1、將一定量的殼聚糖溶于酸性介質(zhì)中，并進(jìn)行降解，降解的時(shí)間不小于3小時(shí)；2、降解所得的聚氨糖滴于氫氧化鈉溶液中，然后水洗至中性；3、水洗后的聚氨糖移到容器中，攪拌，同時(shí)滴加交聯(lián)劑，充分交聯(lián)；4、交聯(lián)反應(yīng)后，用還原劑還原；5、還原后水洗至中性，用60至200目的分樣篩分樣，得到生物層析凝膠。
通常，所得的生物層析凝膠保存于20％的乙醇中。
本生物層析凝膠是以殼聚糖為主要原料制備而成的多聚氨基葡萄糖凝膠，簡稱為聚氨糖凝膠。殼聚糖(chitosan)又名殼多糖、脫乙酰甲殼素、幾丁聚糖、聚葡萄糖胺，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥保健、水處理、日化等行業(yè)。
本生產(chǎn)工藝是利用聚氨糖2位上游離的-NH2與戊二醛上的-CHO在弱酸介質(zhì)中發(fā)生希夫式反應(yīng)，然后用硼氫化鈉還原，使之變成弱堿陰離子交換劑的。
在本生產(chǎn)工藝中，高分子量的聚氨糖的分子鏈?zhǔn)禽^長的，戊二醛不易和其發(fā)生交聯(lián)，因此為提高合成生物層析凝膠的穩(wěn)定性，必須對(duì)聚氨糖進(jìn)行適度降解，再對(duì)其進(jìn)行交聯(lián)。較合適的降解時(shí)間為3至6小時(shí)。
在上述的生產(chǎn)工藝中，所述的交聯(lián)劑可以是甲醛、戊二醛、乙二醛、乙二醇雙環(huán)氧丙基醚中的一種。
在上述的生產(chǎn)工藝中，利用戊二醛對(duì)殼聚糖進(jìn)行交聯(lián)后，戊二醛中的兩個(gè)醛基只有一個(gè)參加了反應(yīng)，還有一個(gè)醛基沒有參加反應(yīng)。
在上述的生產(chǎn)工藝中，還原劑最好是采用硼氫化鈉。加入還原劑的作用在于1、制備的生物層析凝膠顏色由黃色變?yōu)槿榘咨?、由于其結(jié)構(gòu)中含有醛基結(jié)構(gòu)，在紫外有吸收峰，因此加入還原劑可以防止對(duì)蛋白質(zhì)的檢測產(chǎn)生影響。
在上述的生產(chǎn)工藝中，交聯(lián)的時(shí)間是一個(gè)比較重要的因素。交聯(lián)時(shí)間不足，影響凝膠的酸性pH穩(wěn)定性和機(jī)械強(qiáng)度，浪費(fèi)原料；交聯(lián)時(shí)間過長，易發(fā)生一些負(fù)反應(yīng)，影響凝膠的吸附容量。通常，較合適的交聯(lián)時(shí)間是在4～10小時(shí)之間。
在室溫下，最佳的交聯(lián)時(shí)間是在6～8小時(shí)之間。
在上述的生產(chǎn)工藝中，所述的交聯(lián)反應(yīng)應(yīng)在攪拌的條件下進(jìn)行。
在上述的生產(chǎn)工藝中，所述的反應(yīng)介質(zhì)可以是水、乙醇、乙醚或者石油醚中的一種。反應(yīng)介質(zhì)對(duì)產(chǎn)物的吸附性能影響不明顯，石油醚、乙醚和水不互溶，但在石油醚和乙醚中不易分散水洗后的聚氨糖，交聯(lián)后洗滌也較麻煩，故最好是選擇水為反應(yīng)介質(zhì)。
在上述的生產(chǎn)工藝中，所述的氫氧化鈉溶液的濃度范圍為0.3％～3％。其中最佳的濃度范圍為1％～2％。選擇合適的濃度，將有利于聚氨糖的析出，且使其析出量較多。
親和層析是蛋白質(zhì)和酶純化效率最高的分離技術(shù)。常用的層析介質(zhì)如珠狀葡聚糖凝膠和瓊脂糖凝膠一般容易壓縮，不易用于高壓液相色譜；而用改性的硅膠具有剛性，但硅膠顆粒改性比較困難，而且生物親和性較差。比較起來，本發(fā)明所采用的聚氨糖既有剛性，又有親水性和抗菌性，完全可用于蛋白質(zhì)、酶的吸附分離。
聚氨糖對(duì)血漿低密度脂蛋白及極低密度脂蛋白有很好的吸附性，可應(yīng)用于高脂血癥患者的血液灌流。聚氨糖對(duì)膽固醇甘油三脂均有明顯的吸附作用，而且隨著脫乙酰度的提高而吸附率增大。
由丁二醇二縮水甘油醚交聯(lián)的珠狀高脫乙酰度聚氨糖或戊二醛交聯(lián)的珠狀高脫乙酰度聚氨糖吸附那些會(huì)引起自體免疫擾亂、變態(tài)反應(yīng)和腫瘤等相關(guān)的免疫球蛋白，已用于臨床，由苯丙氨酸和色氨酸固定化修飾的珠狀聚氨糖選擇地吸附免疫蛋白，這種修飾的聚氨糖比不修飾的聚氨糖對(duì)α-球蛋白的親和性更高，而且對(duì)纖維蛋白的吸附量降低，還能降低血小板粘附性，對(duì)血液灌流是優(yōu)良的吸附劑。
交聯(lián)羧甲基聚氨糖具有兩性離子交換能力，對(duì)含糖類的白蛋白或γ-球蛋白水溶液，不吸附糖類，卻能吸附蛋白。以磷酸鹽緩沖溶液為溶劑時(shí)，分別能吸附9.4mg/g白蛋白或58.4mg/gγ-球蛋白。改變?nèi)軇┑碾x子強(qiáng)度，還可以從γ-球蛋白中分離白蛋白，或從牛血清蛋白中分離出白蛋白。
在分離純化酶方面，聚氨糖分離純化溶菌酶、淀粉葡萄糖苷酶、纖維素酶等多種酶具有很好的效果。這些酶的作用底物在結(jié)構(gòu)上與聚氨糖相似，在吸附過程中聚氨糖能牢固地吸附這些酶，有的還形成固定組成的絡(luò)合物。
聚氨糖吸附淀粉糖苷酶的量比其他凝膠吸附劑的吸附量大得多，且pH值在4.0～4.5時(shí)有最大吸附量。珠狀聚氨糖也強(qiáng)烈地吸附α-淀粉酶和乳糖酶，最佳pH值在6.0附近，吸附α-淀粉酶的最大吸附量達(dá)286mg/ml凝膠，用低離子強(qiáng)度的緩沖液就可洗脫。
用珠狀的羧甲基聚氨糖直接對(duì)雞卵蛋白進(jìn)行親和層析，然后以0.1mol/L乙酸洗脫，可獲得高純度的溶菌酶。
聚氨糖經(jīng)戊二醛交聯(lián)后，對(duì)蛋白質(zhì)的吸附量都有下降，但對(duì)β-糖苷酶、α-淀粉酶堿性淀粉酶酸性淀粉酶和大豆胰淀粉酶抑制劑的吸附量反而增大，在2.4mol/L(NH4)2SO4溶液中，堿性磷酸酶的吸附率達(dá)99％，經(jīng)50％乙二醇洗脫時(shí)，酶可定量回收，酶的純度提高4.5倍，比活率達(dá)4.70un/mg。用聚氨糖純化過的纖維素酶水解纖維素時(shí)，可使溶液中的纖維二糖含量由42％提高到95％。
本發(fā)明可將我國盛產(chǎn)的殼聚糖加工為高附加值的生物層析凝膠產(chǎn)品，其產(chǎn)品成本較低、應(yīng)用面很廣，具有較高的實(shí)用價(jià)值。
具體實(shí)施例方式
取2％(w/v)的殼聚糖先降解4小時(shí)，滴于濃度為2％的氫氧化鈉溶液中析出，水洗至中性；然后移至三口瓶中，滴加0.6％的戊二醛溶液，同時(shí)攪拌交聯(lián)6個(gè)小時(shí)；加入硼氫化鈉使游離的醛基充分封閉，用分樣篩水洗，得到60目～200目純白色的生物層析凝膠。
在本實(shí)施例中，所述的交聯(lián)劑采用戊二醛。戊二醛的濃度通常在0.5％～2.5％之間。在一定離子強(qiáng)度的磷酸緩沖液中，隨著戊二醛濃度的提高，凝膠的交聯(lián)度上升，其吸附能力將逐步下降。這是由于戊二醛用量過大時(shí)占用殼聚糖分子上過多氨基、使得參與吸附作用的氨基減少所造成的。而我們希望合成的層析凝膠具有較大的離子交換功能，交聯(lián)僅是增加生物層析凝膠的機(jī)械強(qiáng)度及穩(wěn)定性，因此交聯(lián)劑用量應(yīng)在保證凝膠穩(wěn)定性的前提下盡可能的少。經(jīng)實(shí)驗(yàn)表明，戊二醛最佳的濃度為0.6％。
本實(shí)施例所合成的生物層析凝膠外觀為純白色纖維狀。
本生物層析凝膠對(duì)一般有機(jī)溶劑都很穩(wěn)定，尤其在pH值為1.5的酸性條件下，凝膠不發(fā)生溶解，達(dá)到良好的穩(wěn)定性，這一點(diǎn)明顯優(yōu)于DEAE纖維素。具體的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果見表1所示。
表1 聚氨糖生物層析凝膠穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

注“-”表示不溶，在室溫下試驗(yàn)。
本實(shí)施例所得的生物層析凝膠裝柱，上樣，洗脫，分別接收洗脫組分，測定各組分的酶(中性蛋白酶)和蛋白含量(牛血清蛋白)，并與DEAE纖維素層析作比較，結(jié)果見表2、表3、表4和表5。
表2 聚氨糖層析凝膠對(duì)中性蛋白酶的分離

注以水為平衡液，三羥甲基氨基甲烷—鹽酸(pH＝9)的緩沖液洗脫。
表3 DEAE纖維素層析分離中性蛋白酶的結(jié)果

注以水為平衡液，三羥甲基氨基甲烷—鹽酸(pH＝9)的緩沖液洗脫表4 聚氨糖凝膠對(duì)牛血清蛋白層析分離

注以水為平衡液，三羥甲基氨基甲烷—鹽酸(pH＝9)的緩沖液洗脫表5 DEAE纖維素對(duì)牛血清蛋白層析分離結(jié)果

由表2和表3可知，合成的聚氨糖層析凝膠對(duì)中性蛋白酶進(jìn)行純化，可以得到較好的純化效果，酶活回收率達(dá)90.66％，酶活主要存在峰1、峰3，酶活損失較少，另外峰2、峰4也有少量的酶活。由表4和表5可知，在同一條件下，聚氨糖層析凝膠和DEAE纖維素對(duì)牛血清蛋白的吸附性能實(shí)驗(yàn)表明，聚氨糖層析凝膠性能稍優(yōu)。通過兩組實(shí)驗(yàn)的對(duì)比，可以得出以下結(jié)論1、合成的聚氨糖層析凝膠和DEAE纖維素對(duì)中性蛋白酶、牛血清蛋白的吸附狀況相似，對(duì)牛血清蛋白的回收率甚至比DEAE纖維素高，分離效果稍優(yōu)；2、合成的聚氨糖層析凝膠對(duì)酶的生物親和性良好，優(yōu)于DEAE纖維素，一次層析活性保持率大于90％。
因此，聚氨糖在某些方面具有和瓊脂糖類似的優(yōu)點(diǎn)，如具有良好的生物相容性、表面基團(tuán)豐富、pH值適用范圍寬等，作為層析凝膠材料是完全可行的。
權(quán)利要求
1.一種生物層析凝膠，其特征在于該生物層析凝膠主要是由分子量在10萬至12萬之間的聚氨糖所組成。
2.一種如權(quán)利要求1所述的生物層析凝膠的生產(chǎn)工藝，其特征在于該生產(chǎn)工藝如下(1)、將一定量的殼聚糖溶于酸性介質(zhì)中，并進(jìn)行降解，降解的時(shí)間不小于3小時(shí)；(2)、降解所得的聚氨糖滴于氫氧化鈉溶液中，然后水洗至中性；(3)、水洗后的聚氨糖移到容器中，攪拌，同時(shí)滴加交聯(lián)劑，充分交聯(lián)；(4)、交聯(lián)反應(yīng)后，用還原劑還原；(5)、還原后水洗至中性，用60目至200目的分樣篩分樣，得到生物層析凝膠。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的生物層析凝膠的生產(chǎn)工藝，其特征在于所述的降解時(shí)間為3至6小時(shí)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的生物層析凝膠的生產(chǎn)工藝，其特征在于所述的交聯(lián)劑是甲醛、戊二醛、乙二醛、乙二醇雙環(huán)氧丙基醚中的一種。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的生物層析凝膠的生產(chǎn)工藝，其特征在于所述的還原劑是硼氫化鈉。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的生物層析凝膠的生產(chǎn)工藝，其特征在于較合適的交聯(lián)時(shí)間是在4～10小時(shí)之間。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的生物層析凝膠的生產(chǎn)工藝，其特征在于最佳的交聯(lián)時(shí)間是在6～8小時(shí)之間。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的生物層析凝膠的生產(chǎn)工藝，其特征在于所述的反應(yīng)介質(zhì)是水、乙醇、乙醚或者石油醚中的一種。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的生物層析凝膠的生產(chǎn)工藝，其特征在于所述的氫氧化鈉溶液的濃度范圍為0.3％～3％。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的生物層析凝膠的生產(chǎn)工藝，其特征在于所述的氫氧化鈉溶液的最佳濃度范圍為1％～2％。
全文摘要
本發(fā)明提供的一種生物層析凝膠及其生產(chǎn)工藝屬于生化技術(shù)領(lǐng)域。它解決了現(xiàn)有的生物層析用凝膠所存在的價(jià)格昂貴、合成再生較復(fù)雜等缺點(diǎn)。本生物層析凝膠主要是由分子量在10萬至12萬之間的聚氨糖所組成，其生產(chǎn)工藝是將一定量的殼聚糖溶于酸性介質(zhì)中，并進(jìn)行降解，降解的時(shí)間不小于3小時(shí)；降解所得的聚氨糖滴于氫氧化鈉溶液中，然后水洗至中性；水洗后的聚氨糖移到容器中，攪拌，同時(shí)滴加交聯(lián)劑，充分交聯(lián)；交聯(lián)反應(yīng)后，用還原劑還原；還原后水洗至中性，用60至200目的分樣篩分樣，得到生物層析凝膠。本發(fā)明采用聚氨糖作為生物層析凝膠的主要原料，具有良好的生物相容性、表面基團(tuán)豐富、pH值使用范圍寬等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N30/00GK1540340SQ20031010821
公開日2004年10月27日 申請(qǐng)日期2003年10月25日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月25日
發(fā)明者錢俊青, 徐君義, 林榮業(yè) 申請(qǐng)人:玉環(huán)縣海洋生物化學(xué)有限公司