專(zhuān)利名稱(chēng)：以視黃醇x受體為靶點(diǎn)的藥物篩選系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及藥物篩選領(lǐng)域。更具體地，本發(fā)明提供了一種以視黃醇X受體(RXR)和孤兒受體(TR3)作為藥物靶點(diǎn)的新的篩選藥物分子的方法。本發(fā)明還提供了用這種方法篩選的藥物組合物用于治療癌癥、心腦血管病、糖尿病等多種疾病的方法。
背景技術(shù)：
具有視黃醇樣活性的化合物的應(yīng)用技術(shù)是眾所周知的，在世界許多國(guó)家的專(zhuān)利和科學(xué)刊物上都有所記載。視黃醇樣活性化合物已廣泛應(yīng)用于治療人類(lèi)以及動(dòng)物的多種疾病，包括用于預(yù)防和治療癌癥和癌前期病變，如乳腺癌、皮膚癌、前列腺癌、宮頸癌、子宮癌、結(jié)腸癌、膀胱癌、食道癌、胃癌、肺癌、喉癌、口腔癌、血液和淋巴系統(tǒng)腫瘤，用于治療組織非典型增生、發(fā)育障礙、粘膜白斑病、粘膜乳頭瘤以及卡波西肉瘤。視黃醇樣活性化合物還參與對(duì)代謝紊亂的調(diào)節(jié)，被應(yīng)用于對(duì)II型糖尿病、高脂質(zhì)血癥和動(dòng)脈硬化癥的治療。
視黃醇樣活性化合物的作用通過(guò)兩類(lèi)核受體介導(dǎo)，這兩個(gè)受體家族分別命名為視黃酸受體(RAR)和視黃醇X受體(RXR)，每種受體又各有α、β和γ三種亞型。RAR和RXR兩類(lèi)蛋白結(jié)合DNA的C區(qū)高度保守，主要區(qū)別在于配體結(jié)合E區(qū)的氨基酸序列差異，同源性低于27％；各種亞型之間區(qū)別主要在于A/B區(qū)的氨基酸序列差異。
RXR除可形成同源二聚體(Homodimer)外，還可和I型核受體成員形成異源二聚體，包括維生素D受體(VDR)、過(guò)氧物酶體增殖激活受體(PPAR)、甲狀腺激素受體(TR)以及多種孤兒受體，如肝X受體(LXR)、胚胎X受體(PXR)、持續(xù)激活受體(CAR)和孤兒受體TR3/Nur77/NGFI-B(Kastner，P.，Cell，1995，83，859-869；Mangelsdorf，D.J.，etal.，Cell，1995，83，841-850)和RAR、甲狀腺素受體(TR)、維生素D3受體(VD3R)等核受體形成異源二聚體(Heterodimer)，以二聚體的形式與靶基因結(jié)合，激活或抑制特定基因的轉(zhuǎn)錄活性，形成能夠廣泛調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄活性的轉(zhuǎn)錄因子庫(kù)。
RXR和RAR的DBD區(qū)高度同源說(shuō)明它們能調(diào)控一些相同的基因轉(zhuǎn)錄，但它們的特異性配體產(chǎn)生的不同生物活性可能與RXR-RXR、RAR-RXR調(diào)節(jié)不同基因表達(dá)有關(guān)，尤其RXR可與其它調(diào)節(jié)生長(zhǎng)發(fā)育的核受體蛋白形成異源二聚體，廣泛調(diào)控核基因的表達(dá)活性，因而RXR的激活可能作為體內(nèi)調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育的一個(gè)非常重要的環(huán)節(jié)。
RXR調(diào)控它的異源結(jié)合鏈的轉(zhuǎn)錄活性的作用機(jī)制已被廣泛研究(Kastner，P.，Cell，1995，83，859-869；Mangelsdorf，D.J.，etal.，Cell，1995，83，841-850；Zhang，X.K.，et al.，Nature，1992b，358，587-591)。近年來(lái)對(duì)RXR研究的重要進(jìn)展是發(fā)現(xiàn)了RXR在與其他核受體結(jié)合形成異源二聚體后可從細(xì)胞核中遷出，定位到細(xì)胞質(zhì)的線粒體上，引起細(xì)胞色素C釋放，參與對(duì)細(xì)胞凋亡的調(diào)控，這一發(fā)現(xiàn)具有重要的意義，可能具有可應(yīng)用于治療多種與凋亡相關(guān)的疾病。
孤兒受體TR3(也稱(chēng)nur77和NGFI)是另一類(lèi)核受體，TR3和它的近親家族成員NOT-1(也稱(chēng)Nurr1和RNR-1)和NOR-1(也稱(chēng)MINOR和TEC)在核家族內(nèi)組成一個(gè)引人注目的亞家族(Chang，C.，et al.J Steroid Biochem，1989，34，391-395；Zhang，X.K.，et al.，Nature，1992b，358，587-591；Hedvat，C.V.，et al.，Mol Endocrinol，1995，9，1692-1700；Kastner，P.，Cell，1995，83，859-869；Mangelsdorf，D.J.，et al.，Cell，1995，83，841-850)。TR3是一種瞬時(shí)早期反應(yīng)基因，它的表達(dá)可被許多細(xì)胞外刺激因素如生長(zhǎng)因子和佛波酯等迅速誘導(dǎo)，并作用于特異的DNA反應(yīng)元件(NBRE或NurRE)調(diào)控靶基因的表達(dá)，參與調(diào)控細(xì)胞增殖和分化(Wilson，T.E.，et al.，Science，1991，252，1296-1300；Phillips，A.，et al.，Mol Cell Biol，1997，17，5946-5951)。近年來(lái)另一個(gè)重要發(fā)現(xiàn)是TR3還可從細(xì)胞核遷出，調(diào)節(jié)多種重要不同的生物學(xué)功能，例如，用NGF處理PC嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞，TR3可從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中，有利于NGF誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞分化。在其他細(xì)胞中，TR3從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)定位于線粒體，可誘導(dǎo)細(xì)胞色素C釋放，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡(Li，H.，et al.Science，2000，289，1159-1164)，提示TR3又可能是一種潛在的凋亡前分子(Maruyama，K.，et al.，Cancer Lett，1995，96，117-122)。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，TR3可與RXR形成異源二聚體(Forman，B.M.，et al.Cell，1995，81，541-550；Perlmann and Jasson，Gene Dev，1995，9，769-782)，并可與孤兒受體COUP-TF(Wu et al.，Embo J，1997b，16，1656-1669)相互作用。由于COUP-TF與RARβ啟動(dòng)子結(jié)合，可使RARβ高效表達(dá)(Lin et al.，Mol Cell Biol，2000，20，957-970)，所以，通過(guò)與RXR和COUP-TF相互作用，TR3可調(diào)節(jié)RARβ表達(dá)并改變細(xì)胞對(duì)視黃醇的反應(yīng)(Wu et al.，Embo J.，1997b，16，1656-1669)。
RXR和TR3從細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中參與調(diào)控細(xì)胞凋亡有著重要的生物學(xué)意義，這一新的作用途徑的發(fā)現(xiàn)，使RXR和TR3有可能作為重要的藥物靶點(diǎn)，其分子模型可用于篩選治療凋亡相關(guān)疾病如腫瘤等新的藥物，因而建立RXR和TR3新作用途徑的分子模型具有重要的價(jià)值。因此，本領(lǐng)域需要尋找新的RXR途徑，以便發(fā)現(xiàn)和開(kāi)發(fā)作用于RXR介導(dǎo)的途徑的治療劑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種以視黃醇X受體(RXR)和孤兒受體(TR3)作為藥物靶點(diǎn)的篩選藥物分子的方法。
本發(fā)明的另一目的是提供含有篩選出的化合物的藥物組合物，這些化合物組合可應(yīng)用于治療與細(xì)胞凋亡有關(guān)的疾病。
在本發(fā)明的第一方面，提供了一種篩選化合物的方法，所述化合物調(diào)控視黃醇X受體(RXR)和孤兒受體TR3從細(xì)胞核遷移到以下部位細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜、線粒體、高爾基體和/或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，它包括步驟(a)提供一種細(xì)胞，該細(xì)胞在細(xì)胞核中含有RXR和TR3；(b)在存在或不存在測(cè)試化合物情況下培育所述細(xì)胞；和(c)選擇出調(diào)節(jié)RXR和TR3從所述細(xì)胞的細(xì)胞核向以下部位遷移的化合物細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜、線粒體、高爾基體和/或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。
在另一優(yōu)選例中，所述化合物增加RXR到所述細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)的遷移。
在另一優(yōu)選例中，所述化合物減弱RXR到所述細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)的遷移。
在另一優(yōu)選例中，所述化合物選自下列物質(zhì)肽、聚合肽、擬肽、非肽化合物、碳水化合物、脂、合成化合物、天然產(chǎn)物、抗體或抗體片段、有機(jī)小分子、無(wú)機(jī)小分子和核酸序列。
在本發(fā)明的第二方面，提供了一種藥物組合物，它含有用本發(fā)明上述方法篩選出的化合物和藥學(xué)上可接受的載體，而且所述藥物組合物通過(guò)調(diào)控RXR從細(xì)胞核向線粒體的亞細(xì)胞遷移而影響凋亡。
在本發(fā)明的第三方面，提供了一種篩選化合物的方法，所述化合物調(diào)控RXR/TR3 II型異源二聚體的形成，從而影響細(xì)胞調(diào)亡，該方法包括步驟(a)提供一種細(xì)胞，所述細(xì)胞含有與線粒體相關(guān)的Bcl-2家族蛋白，所述細(xì)胞還含有能形成I型和II型RXR/TR3異源二聚體；
(b)在存在或不存在測(cè)試化合物情況下培育所述細(xì)胞；和(c)選出選擇性誘導(dǎo)II型異源二聚體形成的化合物。
在另一優(yōu)選例中，該方法還包含選擇調(diào)控II型異源二聚體從細(xì)胞核向線粒體的遷移的化合物。
在另一優(yōu)選例中，該方法還包含選擇調(diào)控II型異源二聚體與Bcl-2家族蛋白結(jié)合的化合物。
在另一優(yōu)選例中，異源二聚體的形成用選自下組的方法鑒別(a)根據(jù)所述異源二聚體的構(gòu)型差別加以鑒別；(b)根據(jù)所述異源二聚體的亞細(xì)胞定位而被辨認(rèn)；或(c)對(duì)II型異源二聚體特異性的報(bào)告基因辨認(rèn)。
在本發(fā)明第四方面，提供了一種藥物組合物，它含有用本發(fā)明上述方法篩選出的化合物和藥學(xué)上可接受的載體，而且所述藥物組合物通過(guò)調(diào)控II型RXR/TR3異源二聚體從細(xì)胞核向線粒體的亞細(xì)胞遷移而影響凋亡。
本發(fā)明的其它方面由于本文的技術(shù)的公開(kāi)，對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的。


下列附圖用于說(shuō)明本發(fā)明的具體實(shí)施方案，而不用于限定由權(quán)利要求書(shū)所界定的本發(fā)明范圍。
圖1顯示共聚焦顯微鏡的分析結(jié)果，表明RXR在藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡時(shí)，定位于線粒體。
圖2是一系列免疫染色細(xì)胞的共聚焦顯微鏡圖像，表明不存在15d-PGJ2時(shí)，RXRα轉(zhuǎn)染進(jìn)入H460肺癌細(xì)胞或SY5Y神經(jīng)真核瘤細(xì)胞。然而當(dāng)細(xì)胞用15d-PGJ2處理后，大量RXRα出現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)中。Flag-RXRα的表達(dá)載體被轉(zhuǎn)染進(jìn)所述細(xì)胞系后，用15d-PGJ2(5μM)處理細(xì)胞3小時(shí)，然后用Flag的抗體免疫染色來(lái)檢測(cè)RXRα，用共聚焦顯微鏡觀察Flag-RXRα。
圖3是劑量反應(yīng)分析結(jié)果，用競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合分析表明15d-PGJ2加入后與RXRα高效結(jié)合。15d-PGJ2替代了與RXR配體結(jié)合區(qū)結(jié)合的[3H]9-cis-RA，Ki為1.8μM。細(xì)菌純化RXRα配體結(jié)合區(qū)蛋白在有或沒(méi)有所述濃度的15d-PGJ2存在時(shí)，與10nM[3H]9-cis-RA一同培育。通過(guò)Sephadex G-25脫鹽柱洗脫，結(jié)合物與放射性分離后，洗脫掉的放射活性用液體scientillation計(jì)數(shù)測(cè)量。
圖4是一系列免疫染色細(xì)胞的共聚焦顯微鏡圖像，表明非類(lèi)固醇類(lèi)消炎藥物消炎痛(indomethacin)和二氯芬酸(diclofenac)能誘導(dǎo)RXRα從細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)遷移。將GFP-RXRα和Mito-RFP轉(zhuǎn)染進(jìn)入cos7細(xì)胞，用或不用10-4M消炎痛和二氯芬酸處理細(xì)胞4小時(shí)，用共聚焦顯微鏡觀察GFP-RXRα和Mito-RFP的分布。
圖5顯示共聚焦顯微鏡的分析結(jié)果，表明RXR和TR3在藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡時(shí)，共同定位于線粒體。
圖6是一系列免疫染色的PC12細(xì)胞的共聚焦顯微鏡圖像，表明15d-PGJ2與RXRα結(jié)合誘導(dǎo)RXRα同源二聚體/單鏈或TR3/RXRα異源二聚體從細(xì)胞核遷移到細(xì)胞質(zhì)。Flag-RXRα和GFP-TR3的表達(dá)載體共同或單獨(dú)轉(zhuǎn)染進(jìn)PC12細(xì)胞，用15d-PGJ2(5μM)處理細(xì)胞3小時(shí)，用Flag的抗體免疫染色來(lái)檢測(cè)RXRα，用共聚焦顯微鏡觀察Flag-RXRα和GFP-TR3，二者的影像重疊。
圖7顯示共聚焦顯微鏡的分析結(jié)果，表明RXR和TR3在藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡時(shí)，共同定位于線粒體是相互依賴(lài)的。
圖8是GST pull-down分析的免疫印跡圖，表明TR3和RXR形成一個(gè)異源二聚體而相互作用。
圖9是免疫印跡圖，Calu-6肺癌和ZR75-1乳腺癌細(xì)胞用或不用trans-RA(10-6M)或15d-PGJ2(5μM)或它們相結(jié)合處理24小時(shí)，用Western檢測(cè)RXRβ的表達(dá)。
圖10是免疫印跡圖，表明RXRα/TR3異源二聚體在體外與15d-PGJ2一起培育完全取消了RXRα/TR3異源二聚體與βRARE的結(jié)合。體外翻譯的RXRα和TR3與15d-PGJ2(10-6M)在有或沒(méi)有抗TR3或抗RXRα抗體的存在下共同培育15分鐘，再與32P-同位素標(biāo)記的βRARE一起培育，用EMSA分析反應(yīng)。
具體實(shí)施例方式
申請(qǐng)人用多種凋亡刺激因素(如佛波酯(12-O-十四烷酰佛波醇-13-乙酯，TPA)、消炎痛或diclofenac；臨床上已知的抗癌藥如5-Fu以及未知化合物SR11247)處理不同的細(xì)胞系(LNCap前列腺癌細(xì)胞、Cos7細(xì)胞、H460肺癌細(xì)胞、SY5Y瘤細(xì)胞、PC-12細(xì)胞、SMMC7721肝癌細(xì)胞)，發(fā)現(xiàn)這些藥物可與RXR結(jié)合并誘導(dǎo)RXR從細(xì)胞核遷移到細(xì)胞質(zhì)，這些藥物通過(guò)依賴(lài)于RXR的遷移作用誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡(圖1)。
申請(qǐng)人還發(fā)現(xiàn)環(huán)戊烷前列腺素的代謝產(chǎn)物15-脫氧-12，14-前列腺素J2(15d-PGJ2)新的作用機(jī)制。15d-PGJ2在調(diào)控炎癥過(guò)程中具有重要作用，包括抑制NF-KB的激活。另外15d-PGJ2對(duì)許多腫瘤細(xì)胞系都有抗增殖的作用和凋亡誘導(dǎo)的作用，但其作用機(jī)理并不清楚。近來(lái)有報(bào)道微摩爾濃度的15d-PGJ2結(jié)合并激活PPARγ，提示15d-PGJ2可能通過(guò)PPARγ起作用。然而各種研究表明15d-PGJ2可能還以不依賴(lài)于PPARγ的機(jī)理發(fā)揮作用。申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)15d-PGJ2通過(guò)RXR新的作用途徑調(diào)控多種癌細(xì)胞的凋亡(圖2、3)。
申請(qǐng)人進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)RXR從細(xì)胞核遷移出來(lái)后能與許多細(xì)胞質(zhì)蛋白相互作用，RXR與細(xì)胞質(zhì)靶點(diǎn)的相互作用能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其作用不依賴(lài)于RXR的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用(圖4)。
申請(qǐng)人還發(fā)現(xiàn)某種異源二聚體的形成能誘導(dǎo)RXR從細(xì)胞核遷移到細(xì)胞質(zhì)，如在凋亡刺激因素的作用下，形成的RXR/TR3異源二聚體可從細(xì)胞核遷移到細(xì)胞質(zhì)。申請(qǐng)人還發(fā)現(xiàn)，TR3從細(xì)胞核中遷移出來(lái)是與RXRα的遷移密切相關(guān)的。例如用TPA處理共轉(zhuǎn)染了Flag RXRα和GFP TR3細(xì)胞，RXRα和TR3均出現(xiàn)于細(xì)胞質(zhì)中呈點(diǎn)狀分布，且與線粒體結(jié)合蛋白相互重疊，而對(duì)照組二者均位于細(xì)胞核。申請(qǐng)人進(jìn)一步用siRNA技術(shù)分別抑制RXRα或TR3在LNCap細(xì)胞中的表達(dá)，再用TPA處理細(xì)胞，無(wú)論是RXRα或是TR3均不能從細(xì)胞核中遷移出來(lái)，提示在藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡時(shí)，RXRα和TR3從細(xì)胞核遷移到細(xì)胞質(zhì)是相互依賴(lài)的(圖5～8)。由于TR3/NGFI-B的晶體結(jié)構(gòu)表明TR3/NGFI-B不含配體結(jié)合口袋，因此，體外TR3/RXR異源雙鏈的DNA的調(diào)節(jié)作用不可能由于與TR3的結(jié)合。申請(qǐng)人進(jìn)一步調(diào)查了15d-PGJ2與RXRα直接結(jié)合的可能性，用[3H9]-cis-RA和RXRα配體結(jié)合區(qū)的競(jìng)爭(zhēng)分析結(jié)果表明，15d-PGJ2代替[3H9]-cis-RA結(jié)合到RXR的配體結(jié)合區(qū)，Ki為1.8μm，表明15d-PGJ2可直接與RXRα結(jié)合。
申請(qǐng)人還發(fā)現(xiàn)，RXR/TR3異源二聚體在藥物誘導(dǎo)下從細(xì)胞核遷移到細(xì)胞形成的結(jié)構(gòu)型式與其核內(nèi)作用于DNA調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄的RXR/TR3異源二聚體不同。
申請(qǐng)人進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，凋亡因素刺激后形成的RXR/TR3異源二聚體通過(guò)依賴(lài)CRM1的輸出方式從細(xì)胞核遷移到細(xì)胞質(zhì)，這種輸出是一種位于RXR的C-末端的螺旋7的核輸出序列(NES)引發(fā)的，這種輸出序列僅當(dāng)RXR/TR3異源二聚體是凋亡誘導(dǎo)構(gòu)型時(shí)才能引起CRM1依賴(lài)的細(xì)胞核輸出。
申請(qǐng)人進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，RXRα的細(xì)胞核輸出序列(NES)位于其C末端的LBD螺旋7。RXRα的晶體結(jié)構(gòu)揭示，RXRα形成同源二聚體或與RAR和PPAR異源二聚體或形成三鏈結(jié)構(gòu)時(shí)，螺旋7發(fā)生了顯著不同的構(gòu)型變化(Bourguet，W.，et al.MolCell，20005，289-298；Gampe，R，T.，et al.Mol Cell，2000a5，545-555；Gampe，R.T.，et al.Genes Dev，2000a14，2229-2241)。RXRα的螺旋7的單體結(jié)構(gòu)包含一個(gè)α螺旋結(jié)構(gòu)(Bourguet，W.，et al.Nature，1995375，377-382)，由于螺旋7中間的谷氨酸的存在，當(dāng)RXRα形成同源二聚體或與RAR或PPAR形成異源二聚體或三者形成三鏈結(jié)構(gòu)時(shí)，α螺旋變成π螺旋(Bourguet，W.，et al.MolCell，20005，289-298；Gampe R.T.，et al.Mol Cell，2000a5，545-555；Gampe，R.T.，et al.Genes Dev，2000a14，2229-2241)，申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)RXRα與TR3形成異源二聚體時(shí)，同樣可發(fā)生α螺旋(I型，定位于細(xì)胞核)向π螺旋(II型，可引起異源二聚體向細(xì)胞質(zhì)遷移)轉(zhuǎn)換，并進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)異源二聚體的亞細(xì)胞定位與其功能密切相關(guān)。
申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)在RXRα/TR3異源二聚體中僅RXRαNES被RXR配體結(jié)合所調(diào)節(jié)，如某些RXR的配體(rexinoids)，例如9cis-RA，有效抑制RXRα/TR3異源二聚體作用于線粒體，從而抑制凋亡，而其它一些RXR配體如15d-PGJ2則促進(jìn)凋亡的發(fā)生。
申請(qǐng)人還發(fā)現(xiàn)15d-PGJ2能有效抑制多種癌細(xì)胞的視黃酸受體β(RXRβ)的表達(dá)，但15d-PGJ2的這一作用與PPARγ的活性無(wú)關(guān)。通過(guò)凝膠移位分析，申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)15d-PGJ2影響了TR3/RXRα異源雙鏈與βRARE的結(jié)合(圖9、10)，提示15d-PGJ2是作用于TR3/RXRα異源雙鏈并抑制了該異源雙鏈的活性。
本發(fā)明基于申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新的RXR作用途徑，該途徑涉及RXRα從細(xì)胞核到細(xì)胞質(zhì)的遷移，結(jié)合對(duì)這種新的RXR途徑分子基礎(chǔ)的理解，用適當(dāng)?shù)暮Y選方法，可以發(fā)現(xiàn)選擇性調(diào)控受RXR途徑調(diào)節(jié)的一個(gè)或更多功能的化合物。
申請(qǐng)人基于一些新的化合物能調(diào)控一種獨(dú)特的RXR/TR3異源二聚體的形成，并使這種異源二聚體從細(xì)胞核遷移到線粒體，作用于線粒體，引起凋亡，進(jìn)一步發(fā)明了新的篩選方法來(lái)找出這種新的化合物，因此預(yù)測(cè)這些調(diào)控化合物可激活、增強(qiáng)、抑制、減少或其它方式調(diào)節(jié)一種獨(dú)特的RXR/TR3異源二聚體從細(xì)胞核遷移到線粒體的化合物的方法。
申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)RXR能被誘導(dǎo)從細(xì)胞核遷移到細(xì)胞質(zhì)中，并與細(xì)胞質(zhì)靶點(diǎn)相互作用，這可用于發(fā)展篩選能調(diào)控這種遷移的化合物的篩選方法。申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)RXR的一個(gè)新穎的非基因引向功能能通過(guò)作用于線粒體調(diào)控凋亡，這可用于發(fā)展調(diào)控凋亡的化合物的篩選方法。相似的，申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)RXR配體能通過(guò)作用于RXRα/TR3異源二聚體的形成和細(xì)胞核輸出調(diào)控凋亡，這可用于篩選調(diào)控凋亡的化合物。這些被發(fā)現(xiàn)用于調(diào)控凋亡的測(cè)試化合物都可作為藥物組和成分，用于治療、預(yù)防和其它用于調(diào)控病理狀態(tài)如凋亡的方法。
具體的講，此發(fā)明包括找出能誘導(dǎo)RXR從細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)遷移并使RXR與細(xì)胞質(zhì)靶標(biāo)相互作用的藥物。
此發(fā)明包括找出能激活、增強(qiáng)、減弱、抑制、逆轉(zhuǎn)、破壞或其它方式調(diào)控一種獨(dú)特的異源二聚體的形成的化合物的方法。
此發(fā)明包括找出能激活，增強(qiáng)、減弱、抑制、逆轉(zhuǎn)、破壞或其它方式調(diào)控一種獨(dú)特的異源二聚體從細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)遷移的化合物的方法。
本發(fā)明利用它的篩選化合物的方法及使用這種調(diào)控化合物的方法，提供了用于治療凋亡相關(guān)異常/疾病狀態(tài)的調(diào)控化合物和含有這種化合物的藥物組合物，因此RXR可能代表一種用于發(fā)展癌癥治療藥物的理想的分子靶標(biāo)。RXR/TR3凋亡途徑異源二聚體代表另一種用于發(fā)展治療癌癥和疾病藥物的理想靶標(biāo)。
申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)RXR能被許多藥物誘導(dǎo)從細(xì)胞核遷移出來(lái)，并且這種遷移是以細(xì)胞質(zhì)為靶標(biāo)的如線粒體。一旦RXR位于細(xì)胞核外，就與許多能誘導(dǎo)各種細(xì)胞途徑如凋亡的細(xì)胞質(zhì)靶標(biāo)相互作用。RXR的這些細(xì)胞質(zhì)作用與通過(guò)它的DNA結(jié)合作用調(diào)控基因表達(dá)的傳統(tǒng)作用是不同的。
申請(qǐng)人進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)在藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡時(shí)，RXR受體與TR3受體在細(xì)胞核中形成一種獨(dú)特的異源二聚體。此異源二聚體從細(xì)胞核中輸出，作用于線粒體，即引發(fā)凋亡。此發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致發(fā)明的篩選方法，由此考慮到用于調(diào)節(jié)所述的發(fā)現(xiàn)進(jìn)而處理和阻止相關(guān)情況的化合物的發(fā)現(xiàn)，識(shí)別和其制劑形式。
申請(qǐng)人發(fā)現(xiàn)RXR與TR3結(jié)合調(diào)節(jié)細(xì)胞生物學(xué)功能至少有兩種異源二聚體形式，即I型和II型RXR/TR3異源二聚體，前者于細(xì)胞核中特異的DNA反應(yīng)元件，調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄，主要參與細(xì)胞的增殖，后者則可在某種化合物的誘導(dǎo)下從細(xì)胞核遷出定位于線粒體細(xì)胞器，所作用的細(xì)胞較好是取哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，更好的是癌細(xì)胞系，最好是LNCaP細(xì)胞系。
申請(qǐng)人還發(fā)現(xiàn)用文獻(xiàn)中的技術(shù)調(diào)控RXR的亞細(xì)胞定位，遷移都是一定的。而那些文獻(xiàn)中的常規(guī)技術(shù)將會(huì)用許多這些和其它已知技術(shù)來(lái)獲得此發(fā)明的精髓，申請(qǐng)人更好的用免疫染色，免疫印跡分析，可探測(cè)標(biāo)記，和/或與目的蛋白質(zhì)和肽實(shí)用連接的天然熒光蛋白和顯微可見(jiàn)技術(shù)。
定義此文所用的單數(shù)形式“一個(gè)”，“和”，“這個(gè)”除清楚指明的都包括復(fù)數(shù)相應(yīng)事物。例如“一個(gè)化合物”指一個(gè)或多個(gè)這種化合物，而“這個(gè)酶”包括一個(gè)特別的酶也包括在文獻(xiàn)中為人所熟知的其它家族成員和相等物。
一般來(lái)講，隨后所用的專(zhuān)門(mén)術(shù)語(yǔ)和以下所描述的細(xì)胞培養(yǎng)、分子遺傳學(xué)、核酸化學(xué)、雜交的實(shí)驗(yàn)步驟都是那些熟悉的在文獻(xiàn)中常用的。重組核酸方法、多核苷酸合成、細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)基因融合(例如電穿孔、顯微注射、脂轉(zhuǎn)染法)都使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)。一般酶反應(yīng)、寡聚核苷酸合成和純化步驟都是按照產(chǎn)品說(shuō)明進(jìn)行的。技術(shù)和步驟一般都根據(jù)文獻(xiàn)中常規(guī)方法和文獻(xiàn)中提供的各種常規(guī)參考書(shū)，即Maniatis et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual(1989)，2nd Ed.，ColdSpring Harbor，N.Y.；and Berger and Kimmel，Methords in Enzymology，Volume152，Guide to Molecular Cloning Techniques(1987)，Academic Press，Inc.，SanDiego，Calif.，此專(zhuān)利參考了這些資料。寡聚核苷酸可以根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)用應(yīng)用生物系統(tǒng)寡聚核苷酸合成器合成。這些步驟都是文獻(xiàn)中常用的，讀者很方便得到。所有這些文獻(xiàn)在此引用作為參考。
所有這里所提到的“反義”指單鏈、雙鏈、三鏈寡聚核苷酸及與RNA轉(zhuǎn)錄物或DNA結(jié)合的肽核苷酸(PNAS)。來(lái)源于基因的轉(zhuǎn)錄起始部位如起始位點(diǎn)的-10到+10的區(qū)段的寡聚核苷酸，是一個(gè)特別的例子。形成反義的三鏈能與雙鏈DNA相結(jié)合而抑制基因轉(zhuǎn)錄。反義分子一般100％與意義鏈互補(bǔ)，但也可能部分互補(bǔ)(少于100％互補(bǔ)，例如95％，90％，80％，70％甚至更少)。反義分子可由基因轉(zhuǎn)錄方法或化學(xué)合成獲得(例如固相亞磷酰胺合成)。反義寡聚核苷酸可能包括L-或D-形式，當(dāng)給病人用藥時(shí)為抵抗降解也可適當(dāng)加以修飾。特例包括5′和3′連鎖，它們能抵抗存在于動(dòng)物體內(nèi)各組織或體液的核酸內(nèi)切酶和核酸外切酶的作用。為減少基因的表達(dá)，反義核苷酸不要求表達(dá)控制元件在體內(nèi)發(fā)揮作用。這種反義分子能被細(xì)胞吸收或通過(guò)被動(dòng)擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞，也可用載體導(dǎo)入細(xì)胞，如病毒載體。然而，反義分子可能被核苷酸編碼以至于被翻譯，甚至編碼這個(gè)反義分子的核苷酸可能有效與表達(dá)控制元件相連接，使這個(gè)翻譯分子在細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外表達(dá)量得到維持或提高。
術(shù)語(yǔ)“探測(cè)標(biāo)記”指在篩選分析中能被選擇探測(cè)到的任何一部分。如無(wú)限制，則包括同位素標(biāo)記(例如3H，14C，35S，125I，131I)、親和標(biāo)記(例如生物素/抗生物素蛋白，鏈酶抗生物素、抗體結(jié)合部位、金屬結(jié)和部位、表位標(biāo)記、FLASH結(jié)合部位——參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利6,451,569；6,054,271；6,008,378和5,932,474——谷胱甘肽或麥芽糖結(jié)合部位)、熒光和冷光部分(例如熒光及其衍生物，GFP，羅丹明及其衍生物，鑭等)和酶部分(例如辣根過(guò)氧化物酶、β-半乳糖苷酶、β-內(nèi)酰胺酶、熒光素酶、堿性磷酸酶)。這種探測(cè)標(biāo)記能在原位進(jìn)行。例如使用一個(gè)非標(biāo)記主要抗體，而它又能被一個(gè)帶有探測(cè)標(biāo)記的次抗體所檢測(cè)。
術(shù)語(yǔ)“DNA結(jié)合部位”或“DBD”指能與一個(gè)特殊DNA序列相結(jié)合的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域，包括至少一個(gè)鋅指序列。
這里所提到的術(shù)語(yǔ)“分裂”包含造成RXR-TR3異源二聚體實(shí)際上完全分離(例如超過(guò)90％分離)的測(cè)試化合物。術(shù)語(yǔ)“充分分裂”包含造成至少50％結(jié)合協(xié)同因子與受體分離的測(cè)試化合物。
這里所提到的術(shù)語(yǔ)“功能上的表達(dá)”指一個(gè)編碼序列，它能被轉(zhuǎn)錄、翻譯、翻譯后修飾(如果有意義)，并置于細(xì)胞中，發(fā)揮其功能。關(guān)于一個(gè)報(bào)告盒子，功能表達(dá)一般指這個(gè)所編碼的細(xì)胞表面受體蛋白充足量的生產(chǎn)，以提供一個(gè)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的可探測(cè)信號(hào)來(lái)報(bào)告一個(gè)報(bào)告寡聚核苷酸的轉(zhuǎn)錄結(jié)果。
這里所提到的術(shù)語(yǔ)“LBD”或“配體結(jié)合區(qū)”指一個(gè)核受體的蛋白結(jié)構(gòu)域，正如這里所提到的類(lèi)固醇超家族受體或其它適宜的核受體，它們與一個(gè)生理配體相結(jié)合，構(gòu)型發(fā)生變化，與一個(gè)結(jié)合蛋白的分子間相互作用發(fā)生或不發(fā)生改變，基于所連接的功能區(qū)于是提供了一個(gè)可探測(cè)的活性。
這里所提到的術(shù)語(yǔ)“調(diào)控子”指廣范圍的測(cè)試化合物，不僅包括天然的，還包括合成和半合成有機(jī)分子、蛋白質(zhì)、寡核苷酸反義分子和RNAi，即間接或直接影響RXR從細(xì)胞核遷移到細(xì)胞質(zhì)的物質(zhì)。
而且調(diào)控子的前體(如能轉(zhuǎn)化成調(diào)控子的化合物)也被認(rèn)為是調(diào)控子。與此類(lèi)似，轉(zhuǎn)化前體為調(diào)控子的化合物也被認(rèn)為是調(diào)控子。
“天然熒光蛋白”指能形成高度熒光的，內(nèi)源的發(fā)色團(tuán)的蛋白，而這些蛋白的形成是通過(guò)蛋白質(zhì)的內(nèi)源核苷酸的環(huán)化和氧化或由于作為熒光協(xié)同因子酶的加入。一般這種發(fā)色團(tuán)光譜來(lái)自于弱熒光氨基酸例如色氨酸和酪氨酸。內(nèi)源熒光蛋白已從大量海洋物種中分離并克隆出來(lái)，包括海洋三色紫羅蘭Renilla reniformis，R.kollikeri和R.mullerei，sea pens Ptilosarcus，Stylatula和Acanthoptilum，還有太平洋西北水母Aequorea Victoria；Szent-Gyorgyi等(SPIE conference 1999；D.C.Prasher et al.，Gene，1992，111229-233)，紅熒光蛋白和黃熒光蛋白也從珊瑚中得到了。已得到來(lái)源于Aequorea victoria的GFP許多突變體，與天然的GFP相比，它們具有獨(dú)特的光譜性質(zhì)，熒光增強(qiáng)，表達(dá)提高，在哺乳動(dòng)物中可折疊(GreenFluorescent Proteins，Chapter 2，pages 19-47，edited Sullivan and Kay，AcademicPress，U.S.patent Nos5,625,048 to Tsien et al.，essued April 29，1997；5,777,079 to Tsien et al.，issued July 7，1998；and U.S.Patent No.5,804,387 toCormack et al.，issued September 8，1998)。在許多情況下這些功能性熒光蛋白比野生型蛋白有著卓越的光譜特點(diǎn)，此發(fā)明用它作為報(bào)告基因。若無(wú)限制，所提及的天然熒光蛋白包括GFP、EGFP、YFP、RFP和DS red。
這里所提到的術(shù)語(yǔ)“實(shí)用連接”指寡聚核苷酸元件功能關(guān)系上的連接。當(dāng)一個(gè)核苷酸與其它核苷酸序列發(fā)生功能性關(guān)系時(shí)即為實(shí)用連接。例如，如果一個(gè)啟動(dòng)子或增強(qiáng)子影響了編碼序列的轉(zhuǎn)錄，它就與此編碼序列發(fā)生了實(shí)用連接。實(shí)用連接意味著被連接的DNA序列一般是連續(xù)的，必須結(jié)合兩個(gè)蛋白編碼區(qū)，還需是在閱讀框內(nèi)。然而，增強(qiáng)子發(fā)揮作用時(shí)一般與啟動(dòng)子間隔幾個(gè)Kb，內(nèi)含子序列長(zhǎng)度也是不同的，因此一些寡聚核苷酸序列可能是實(shí)用連接但不是連續(xù)的。與一個(gè)寡聚核苷酸序列即一個(gè)內(nèi)源基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控序列實(shí)用連接的一個(gè)結(jié)構(gòu)基因(如HSVtk基因)的表達(dá)實(shí)際上與天然發(fā)生的基因具有相同時(shí)間和相同的凋亡特異性模式。
這里所提及的術(shù)語(yǔ)“非類(lèi)固醇抗炎藥”指那些通過(guò)抑制前列腺素的產(chǎn)生而抑制發(fā)炎的化合物。這些化合物具有抗炎、鎮(zhèn)痛、解熱的作用。以那些只有抗炎作用的類(lèi)固醇化合物(例如hydrocortisone或prednisone)作為參照。非類(lèi)固醇抗炎藥是COX2抑制劑例如消炎痛，二氯芬酸，celecoxib naproxen，布洛芬和rofecxib。
這里所提及的術(shù)語(yǔ)“核苷酸”和“核苷序列”包括反義核苷序列，RNA分子或aptamer序列。例如一個(gè)核苷酸序列如aptamer能與RXR或者RXR/TR3或RXR/Agent復(fù)合物的一個(gè)或更多組分結(jié)合，來(lái)調(diào)節(jié)此復(fù)合物的水平和穩(wěn)定性。Aptamer是具有能與小分子靶標(biāo)結(jié)合的三維構(gòu)像的核苷酸序列，包括金屬離子、有機(jī)染料、藥物、氨基酸、協(xié)同因子、氨基糖苷、抗生素、核苷堿基類(lèi)似物、核苷酸和聚合肽(Jayasena，S.D.，Clinical Chemistry，1999，459，1628-1650)。為了增加這些核苷酸序列在細(xì)胞中穩(wěn)定性，可以用文獻(xiàn)中所談及的幾種方法對(duì)其加以修飾。
這里所提及的術(shù)語(yǔ)“孤兒受體”是核受體超家族成員，其天然配體(激素)還未找到。
這里所提及的術(shù)語(yǔ)“擬肽”指非肽化合物，與相應(yīng)多肽是拓?fù)漕?lèi)似物。例如這種擬肽仍然保留多肽中具有重要功能的氨基酸的部分或全部功能團(tuán)。例如這種擬肽也能部分或全部由非肽主鏈組成，在文獻(xiàn)中也如此設(shè)計(jì)其它擬肽如葡萄糖支架、吡咯烷酮支架、類(lèi)固醇支架、苯丙二嗪支架等等。擬肽能提供各種多肽沒(méi)有的優(yōu)點(diǎn)，由于給藥時(shí)能穩(wěn)定通過(guò)消化道，因此可口服給藥。另外擬肽能設(shè)計(jì)為更好的通過(guò)血腦屏障。
這里所提及的術(shù)語(yǔ)“RNAi”指用RNA干擾的方法干擾雙鏈RNA的小分子。RNA干擾是通過(guò)轉(zhuǎn)錄后RNA降解使得特異性序列基因沉默的過(guò)程，這是由于雙鏈RNA(dsRNA)同源物引起了沉默基因序列的產(chǎn)生。雙鏈RNA的一個(gè)特殊的例子包含對(duì)應(yīng)于與19個(gè)RNA核苷酸雜交的靶基因的有大約21個(gè)連續(xù)的核苷酸的有意義鏈和反意義鏈，在每條鏈3′末端懸掛兩個(gè)核苷酸(Elbashir et al.，Nature，2001，411494-498；Zamore，Nat.Struct.Biol.，2001，8746-750)。大約25-30個(gè)核苷酸的dsRNAs已被用于RNAi(Karabinos et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2001，987863-7868)。dsRNA能在體外合成并通過(guò)文獻(xiàn)中所述方法導(dǎo)如細(xì)胞。用這種方法靶多肽的翻譯減少。
報(bào)告基因包括任何直接或間接產(chǎn)生特異性報(bào)告基因產(chǎn)品，可探測(cè)標(biāo)記，酶的一部分或細(xì)胞基因型如能監(jiān)測(cè)基因轉(zhuǎn)錄的藥物賴(lài)受性的基因。所提及的報(bào)告基因包括有酶活性的蛋白，提供基因表達(dá)的酶的擴(kuò)增，如β-內(nèi)酰胺酶、蟲(chóng)熒光素酶、β-半乳糖苷酶、催化抗體和堿性磷酸酶。其它的報(bào)告基因包括蛋白質(zhì)如天然熒光蛋白或同源物，細(xì)胞表面蛋白或者內(nèi)源性基因的天然或修飾形式，對(duì)于分析這些蛋白的特殊方法已經(jīng)存在或有待將來(lái)發(fā)展。
這里所提到的“選擇性誘導(dǎo)”指一個(gè)細(xì)胞群從非凋亡狀態(tài)到凋亡狀態(tài)的轉(zhuǎn)換。較好的轉(zhuǎn)換是可檢測(cè)到凋亡的增加，更好的是凋亡10％的增加，最好的是凋亡是50％的增加。
這里所提到的“處理”或“處置”包括與凋亡作用相關(guān)的疾病狀態(tài)的處理，具體如下a)阻斷與凋亡作用相關(guān)的疾病狀態(tài)的發(fā)生；b)抑制與凋亡作用相關(guān)的疾病狀態(tài)如阻止它的發(fā)展；或c)減少與凋亡作用相關(guān)的疾病狀態(tài)如使?fàn)顟B(tài)好轉(zhuǎn)。
這里所提及的術(shù)語(yǔ)“轉(zhuǎn)錄激活區(qū)”指能增強(qiáng)結(jié)構(gòu)序列內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)或蛋白域。增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄的能力可能影響基因可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄或基因的基礎(chǔ)水平轉(zhuǎn)錄或兩者。例如一個(gè)報(bào)告多肽可能包含驅(qū)使編碼一個(gè)報(bào)告基因的序列的轉(zhuǎn)錄的最小的啟動(dòng)子。這種報(bào)告多肽可以轉(zhuǎn)入核受體敏感細(xì)胞系，用于建立改進(jìn)的宿主細(xì)胞。在凋亡激動(dòng)劑的存在下使培養(yǎng)細(xì)胞的報(bào)告基因表達(dá)沉默的克隆序列也包括在內(nèi)(例如減少基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄和保證可探測(cè)的誘導(dǎo)性)。許多其它轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件的特異性例子如特異性最小啟動(dòng)子和報(bào)告元件在文獻(xiàn)中都有所報(bào)道，基于從事者所需應(yīng)用可選擇用于發(fā)明方法和寡聚核苷酸結(jié)構(gòu)。在選擇用于此發(fā)明的適宜轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件和其它結(jié)構(gòu)和功能序列時(shí)，參考了文獻(xiàn)資源和公布的專(zhuān)利文件，Genbank和其它序列信息數(shù)據(jù)資源。如果需要，可以根據(jù)可得到的序列信息(如美國(guó)Genebank序列，反應(yīng)元件，最小啟動(dòng)子等)，通過(guò)寡核苷酸合成(和連接)構(gòu)建一個(gè)轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。
術(shù)語(yǔ)“I型和/或II型”指RXRTR3異源二聚體構(gòu)型的變化。I型異源二聚體的構(gòu)型使其定位于細(xì)胞核，能與DNA反應(yīng)元件結(jié)合，II型異源二聚體的構(gòu)型使其能從細(xì)胞核遷移到細(xì)胞質(zhì)，與線粒體相結(jié)合，觸發(fā)凋亡。
這里所提到的術(shù)語(yǔ)“系統(tǒng)”指完整的有機(jī)體和以細(xì)胞為基礎(chǔ)的系統(tǒng)，包含用于分析反應(yīng)于這里提到的測(cè)試化合物的RXR-TR3異源二聚體II型細(xì)胞途徑的各種成分。
至于多肽，術(shù)語(yǔ)“實(shí)際相等”意味著兩個(gè)肽最適比對(duì)時(shí)，例如用省略缺口參數(shù)通過(guò)程序GAP或BESTFIT進(jìn)行最佳比對(duì)時(shí)，有至少90％序列相等，更好的至少有95％序列相等。更好的，不相同的殘基位置與保守的氨基酸取代不同。保守的氨基酸取代是指有著相似側(cè)鏈的殘基相互替換。例如，一群有著脂肪族側(cè)鏈的氨基酸是氨基乙酸、丙氨酸、纈草氨酸、亮氨酸和異亮氨酸；一群有著脂肪族-羥基側(cè)鏈的氨基酸是絲氨酸和羥丁氨酸；一群含氨基側(cè)鏈的氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；一群有著芳香族側(cè)鏈的氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；一群有著堿性側(cè)鏈的氨基酸是賴(lài)氨酸，精氨酸和組氨酸；和一群有著含硫側(cè)鏈的氨基酸是胱氨酸和甲硫胺酸。更好的保守氨基酸替代群是纈草氨酸-亮氨酸-異亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、賴(lài)氨酸-精氨酸、丙氨酸-亮氨酸、谷氨酸-天冬胺酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。
由于技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)不能完全列舉出來(lái)，任何未限定的術(shù)語(yǔ)其意義可理解為此發(fā)明引用文獻(xiàn)中的意義。關(guān)于“限制酶”或“高保真酶”可能包括這種酶和任何其它適合所述標(biāo)準(zhǔn)的酶，或者關(guān)于方法則包括參考文獻(xiàn)中已知的獲得cDNA序列的一種或更多方法或在這個(gè)說(shuō)明中將要讀到的方法。
本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)在于(a)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了RXR和TR3的細(xì)胞亞定位決定其不同的生物學(xué)功能，這一新的發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致了新的藥物篩選系統(tǒng)的方面；
(b)本發(fā)明的第二方面是成功地設(shè)計(jì)并將綠色熒光蛋白GFP連接到適宜地靶基因，不影響靶基因的功能，同時(shí)綠色熒光可方便于觀察靶基因的細(xì)胞亞定位；(c)本發(fā)明的第三方面是將紅色熒光蛋白R(shí)FP連接到線粒體特異性蛋白上(RFP-mito)，利用共聚焦顯微鏡可方便地觀察到感興趣基因從細(xì)胞核遷移出來(lái)定位于線粒體上；(d)利用本發(fā)明的篩選方法，可以高效快速地篩選獲得以RXR和/或TR3為靶點(diǎn)的化合物，利用熒光定位可清楚地發(fā)現(xiàn)這些化合物調(diào)控RXR和/或TR3的異源雙鏈從細(xì)胞核遷移到細(xì)胞質(zhì)中，從而調(diào)控細(xì)胞凋亡；(e)本篩選方法已成功應(yīng)用于多種細(xì)胞系，并篩選到可引起細(xì)胞凋亡的已知和未知的化合物。
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1在第一種篩選方法中，用各種測(cè)試化合物來(lái)處理細(xì)胞，并分析其RXRα的細(xì)胞核輸出。
LNCaP(ATCC，Cat.No.CRL-1740)或其它類(lèi)似細(xì)胞，如H460肺癌細(xì)胞、SY5Y神經(jīng)瘤細(xì)胞和COS-7細(xì)胞首先在96孔、384孔、1536孔或其它容易買(mǎi)到的組織培養(yǎng)板中過(guò)夜培養(yǎng)。
篩選可采用以下兩種方法。第一種方法是檢測(cè)化合物對(duì)適宜細(xì)胞中表達(dá)的內(nèi)源性RXRα遷移的影響。第二種方法涉及標(biāo)記或未標(biāo)記GFP、FLAG或myc的RXRαcDNAs的轉(zhuǎn)染。可以用RXRα的抗體檢測(cè)內(nèi)源性受體，而轉(zhuǎn)染的受體可以用RXRα的抗體或標(biāo)記的抗體檢測(cè)。用標(biāo)準(zhǔn)程序?qū)⑹荏w質(zhì)粒如GFP-RXRα融合表達(dá)質(zhì)粒(或其它標(biāo)記融合)轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞。根據(jù)Li，H.et al.(Science，2000298，1159-64)制備GFP融合表達(dá)質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染16小時(shí)后，用以下任一方法處理細(xì)胞(1)僅0.5％胎牛血清(FBS)；(2)在0.5％FBS中加入一種凋亡刺激(如對(duì)LNCaP細(xì)胞用TPA)；(3)在0.5％FBS中加入測(cè)試化合物。反應(yīng)板總體積96孔板100μl，24孔板1ml，每種化合物加入量是1-5μl，TPA為100ng/ml，其余預(yù)測(cè)化合物工作濃度范圍在10-5～10-7Mol/L。細(xì)胞經(jīng)處理3小時(shí)后，用磷酸緩沖鹽(PBS)洗滌，用4％多聚甲醛溶液固定，然后用適宜的抗體將細(xì)胞免疫染色，用MRC-1024MP激光掃描聚焦顯微鏡觀察內(nèi)源性RXRα的亞細(xì)胞定位(BioRad)。比較處理過(guò)的細(xì)胞受體分布圖像和對(duì)照細(xì)胞的亞細(xì)胞定位。用相關(guān)蛋白和組織的免疫染色檢測(cè)是否RXRα遷移到細(xì)胞質(zhì)和線粒體。DAPI染色用于檢測(cè)細(xì)胞核，而線粒體用Hsp60免疫染色檢測(cè)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)用染色的鈣網(wǎng)蛋白檢測(cè)。
實(shí)施例2在第二種篩選方法中，用各種測(cè)試化合物來(lái)處理細(xì)胞，并分析RXRα/TR3異源二聚體對(duì)線粒體的作用。
首先將LNCaP(ATCC，Cat.No.CRL-1740)或其它類(lèi)似細(xì)胞，如H460肺癌細(xì)胞、SY5Y神經(jīng)瘤細(xì)胞和COS-7細(xì)胞在96孔、384孔、1536孔或其它容易買(mǎi)到的組織培養(yǎng)板中過(guò)夜培養(yǎng)。
篩選可采用以下兩種方法。第一種方法是檢測(cè)化合物對(duì)適宜細(xì)胞中表達(dá)的內(nèi)源性RXRα/TR3異源二聚體遷移的影響。第二種方法涉及標(biāo)記或未標(biāo)記GFP，F(xiàn)LAG或myc的RXRα和TR3 cDNAs的轉(zhuǎn)染。可以用RXRα和TR3的抗體檢測(cè)內(nèi)源性受體，而轉(zhuǎn)染的受體可以用RXRα和TR3的抗體或標(biāo)記的抗體檢測(cè)。用標(biāo)準(zhǔn)程序?qū)⑹荏w質(zhì)粒如Flag-RXRα融合表達(dá)質(zhì)粒(或適宜的標(biāo)記受體融合)和GFP-TR3融合表達(dá)質(zhì)粒(或適宜的標(biāo)記融和質(zhì)粒)轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞。根據(jù)Li，H.et al.(Science，2000298，1159-64)制備GFP融合表達(dá)質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染16小時(shí)后，用以下任一方法處理細(xì)胞(1)僅0.5％胎牛血清(FBS)；(2)在0.5％FBS中加入一種凋亡刺激(如對(duì)LNCaP細(xì)胞用TPA)；(3)在0.5％FBS中加入測(cè)試化合物[反應(yīng)板總體積是對(duì)于96孔板是100μl，對(duì)于24孔板是1ml。每種化合物體積是1-5μ1，TPA為100ng/ml，其余測(cè)試化合物工作濃度范圍在10-5～10-7Mol/L。培育對(duì)照組細(xì)胞和加了測(cè)試化合物的細(xì)胞3小時(shí)，然后用磷酸緩沖鹽(PBS)洗滌，并固定在4％的多聚甲醛溶液T×PBS中。然后用適宜的抗體將細(xì)胞免疫染色來(lái)檢測(cè)RXRα和TR3，用MRC-1024MP激光掃描聚焦顯微鏡觀察內(nèi)源性或轉(zhuǎn)染的RXRα和TR3的亞細(xì)胞定位(BioRad)。比較處理過(guò)的細(xì)胞受體分布圖像和對(duì)照細(xì)胞的亞細(xì)胞定位。用相關(guān)蛋白和組織的免疫染色檢測(cè)是否RXRα和TR3遷移到細(xì)胞質(zhì)和線粒體。用DAPI染色檢測(cè)細(xì)胞核，而線粒體用Hsp60免疫染色檢測(cè)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)用染色的鈣網(wǎng)蛋白檢測(cè)。
實(shí)施例3在另一篩選方法中，在存在或不存在RXRα抑制劑的情況下，用各種測(cè)試化合物處理細(xì)胞，然后分析其對(duì)細(xì)胞增長(zhǎng)和凋亡的影響。這些抑制劑包括但不僅限于siRNA，其作用是抑制RXRα，或者可以用反義TR3。在這個(gè)例子中，用RXRαsiRNA。
用含0.5％FBS培養(yǎng)液在組織培養(yǎng)板上培養(yǎng)細(xì)胞，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染GFP-RXRα，構(gòu)建如實(shí)施例1中所述。然后用以下之一處理細(xì)胞(1)僅0.5％胎牛血清(FBS)；(2)TPA；(3)0.5％FBS中的TPA和RXRαsiRNA；(4)測(cè)試化合物或；(5)測(cè)試化合物和RXRαsiRNA。用MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2-yl)-2，5-二苯-四氮唑溴化物)和DAPI(4，6-二酰胺-2-苯吲哚)分析檢測(cè)細(xì)胞增長(zhǎng)和凋亡。
與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染了RXRαsiRNA的細(xì)胞喪失生長(zhǎng)抑制作用，表明化合物的生長(zhǎng)抑制作用需要RXRα。
實(shí)施例4在進(jìn)一步篩選方法中，LMB被用于抑制CRM1依賴(lài)性的RXRα和RXRα/TR3異源二聚體的細(xì)胞核輸出。因此在存在和不存在LMB的情況下，用各種測(cè)試化合物處理細(xì)胞，檢測(cè)RXRα或RXRα/TR3異源二聚體的亞細(xì)胞定位和化合物的生長(zhǎng)抑制和凋亡作用。
在組織培養(yǎng)板上培養(yǎng)細(xì)胞，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染或不轉(zhuǎn)染RXRα和TR3表達(dá)載體，構(gòu)建如實(shí)施例1中所述。然后用以下之一處理細(xì)胞(1)僅0.5％胎牛血清(FBS)；(2)在0.5％FBS中加入一種凋亡刺激(如對(duì)LNCaP細(xì)胞用TPA)；(3)在0.5％FBS中加入一種凋亡刺激(如對(duì)LNCaP細(xì)胞用TPA)和LMB；(4)0.5％FBS中的測(cè)試化合物或(5)0.5％FBS中的測(cè)試化合物和LMB。
按照實(shí)施例1將培養(yǎng)板細(xì)胞染色并觀察，正如實(shí)施例1所述檢測(cè)各個(gè)蛋白的亞細(xì)胞定方式。用實(shí)施例3的方法檢測(cè)生長(zhǎng)抑制和凋亡。
不用LMB的情況下，細(xì)胞質(zhì)定位方式表明測(cè)試藥物是否引起RXRα或RXRα/TR3異源二聚體的細(xì)胞核輸出。如果含LMB的培養(yǎng)板顯示RXRα或RXRα/TR3異源二聚體的細(xì)胞核定位，表明細(xì)胞核輸出CRM1依賴(lài)性的。如果含LMB的培養(yǎng)板顯示缺乏生長(zhǎng)抑制和凋亡，則表明測(cè)試化合物通過(guò)RXRα或RXRα/TR3異源二聚體的細(xì)胞質(zhì)定位抑制細(xì)胞生長(zhǎng)并誘導(dǎo)凋亡。
實(shí)施例5在另一篩選方法中，用各種測(cè)試化合物處理體外或在細(xì)菌中合成的RXRα或TR3蛋白，用凝膠移位分析RXRα/TR3異源二聚體的形成。這種分析將會(huì)檢測(cè)哪種測(cè)試化合物能調(diào)節(jié)RXRα/TR3異源二聚體的形成。在存在或不存在測(cè)試化合物情況下培育RXRα和TR3蛋白。隨后將混合物與23P標(biāo)記的β視黃酸反應(yīng)序列(βRARE)一同培育，用凝膠移位分析RXRα/TR3異源二聚體的結(jié)合。9-cis-RA能增強(qiáng)RXRα/TR3異源二聚體與DNA的結(jié)合，可用作陽(yáng)性對(duì)照，而15d-PGJ2能阻止異源二聚體的結(jié)合，可用作陰性對(duì)照。
某化合物增強(qiáng)異源二聚體的結(jié)合將表明此化合物有保留RXRα/TR3異源二聚體在細(xì)胞核中的作用，可能通過(guò)RXRα/TR3異源二聚體的LBD二聚體表面的誘導(dǎo)造成異源二聚體的轉(zhuǎn)錄活性。相似的某化合物抑制異源二聚體的結(jié)合可能表明此化合物可能通過(guò)RXRα/TR3異源二聚體的LBD二聚體表面的誘導(dǎo)造成異源二聚體的細(xì)胞核輸出。
實(shí)施例6在另一篩選方法中，用各種測(cè)試化合物處理細(xì)胞并分析對(duì)線粒體的作用。在這個(gè)例子中，在存在和不存在RXR-NES抗體的情況下，用各種化合物處理細(xì)胞。這種分析可檢測(cè)那些引起凋亡的化合物是否是通過(guò)RXRα/TR3異源二聚體途徑其作用的。
首先將LNCaP或其它類(lèi)似細(xì)胞，如H460肺癌細(xì)胞，SY5Y神經(jīng)瘤細(xì)胞和COS-7細(xì)胞用96孔、384孔、1536孔或其它容易買(mǎi)到的組織培養(yǎng)板上過(guò)夜培養(yǎng)。然后用以下反應(yīng)混合物之一處理細(xì)胞(1)0.5％FBS中的測(cè)試化合物；(2)測(cè)試化合物和RXR-NES抗體。另外對(duì)照板含僅僅FBS，F(xiàn)BS和一種已知凋亡誘導(dǎo)藥物如TPA，F(xiàn)BS和RXR-NES抗體，或FBS，RXR-NES抗體和TPA。然后培育混合物，用PBS洗滌，并固定在多聚甲醛溶液中，如實(shí)施例1所述。
先用Hsp60抗體IgG，再用Cy3結(jié)合IgG抗體對(duì)線粒體結(jié)合的蛋白Hsp60進(jìn)行染色(Pharmingen，Cat.No.)。用相似的兩步抗體技術(shù)對(duì)RXR或RXR/TR3染色。收集熒光圖像，用MRC-1024MP激光掃描共聚焦顯微鏡分析，圖像重疊。
比較異源二聚體和Hsp60的亞細(xì)胞定位。在僅含測(cè)試化合物的培養(yǎng)板中，RXRα或RXRα/TR3與Gsp60的重合表明測(cè)試化合物激活或增強(qiáng)RXRα對(duì)凋亡的調(diào)控。在含測(cè)試化合物和RXR-NES抗體的培養(yǎng)板中，RXRα或RXRα/TR3在細(xì)胞核中的定位，表明測(cè)試化合物的凋亡刺激作用通過(guò)阻止NES調(diào)節(jié)的異源二聚體的遷移而被抑制。
實(shí)施例7在另一篩選實(shí)驗(yàn)中，用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)對(duì)誘導(dǎo)RXRα或RXRα/TR3異源二聚體從細(xì)胞核向細(xì)胞質(zhì)膜和各種細(xì)胞內(nèi)器官如線粒體，高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)遷移的化合物進(jìn)行高通量篩選。為研究是否受體遷移到細(xì)胞質(zhì)膜，將一種細(xì)胞質(zhì)膜靶序列如含K-ras的C末端的CAAX盒子與藍(lán)色熒光蛋白(BFP)或適宜熒光蛋白融合。為研究線粒體靶點(diǎn)，將一種線粒體靶序列如果蠅外部線粒體膜蛋白Mas70p的跨膜區(qū)與BFP或適合的熒光蛋白融合。為研究線粒體靶點(diǎn)，將一種ER特異性靶序列如細(xì)胞色素b5的ER特異性同工型中的ER靶序列，與BFP或適宜的熒光蛋白結(jié)合。為研究高爾基體靶點(diǎn)，將一種取自ST3Gal轉(zhuǎn)移酶I的高爾基特異性靶序列與BFP或適宜的熒光蛋白融合。融合質(zhì)粒和GFP-RXRα或GFP-TR3將被穩(wěn)定轉(zhuǎn)染進(jìn)COS-7細(xì)胞或其它適宜細(xì)胞。穩(wěn)定表達(dá)GFP-RXRα或GFP-TR3和一個(gè)BFP融合的克隆，將利用前面描述的FRET技術(shù)，用于高通量篩選誘導(dǎo)RXRα或TR3向細(xì)胞質(zhì)膜或其它細(xì)胞內(nèi)器官遷移的化合物。
藥物組合物這里提供此發(fā)明中化合物和藥物組合物的使用方法。此方法包括用一種依賴(lài)于特異細(xì)胞類(lèi)型的方式改變前面所提到的細(xì)胞核受體活性的化合物和藥物組合物在體內(nèi)和體外的使用方法。
所講方法具體就包括凋亡調(diào)控化合物的發(fā)現(xiàn)和使用。
一旦某化合物被本發(fā)明的篩選方法鑒別為調(diào)控物，那么該化合物就可制成藥學(xué)上可接受的形式，如用Remington′s Pharmaceutical Science，18thed.，MackPublishing Co.，Easton，PA(1990)所述的方法，從而產(chǎn)生可用于治療疾病和病理狀態(tài)的藥物組合物。
用這里所講述的方法找出的藥物給病人用藥，可以單獨(dú)用藥，也可制成混合物，加入適宜的載體或賦形劑，給病人具有有效劑量的藥物。有效劑量指引起病人癥狀改良或生命延長(zhǎng)的藥物劑量。
藥物也可制成藥學(xué)可接受的鹽。藥學(xué)上可接受的鹽包括如那些含氫氯化物、硫酸鹽、磷酸鹽、醋酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽、酒石酸鹽、甲醇磺酸鹽、乙烷磺酸鹽、苯磺酸鹽、p-甲苯磺酸鹽、環(huán)己基磺酸鹽和奎寧酸的鹽。這種鹽可能是用酸如氫氯酸、硫酸、磷酸、醋酸、檸檬酸、乳酸、酒石酸、甲醇磺酸、乙烷磺酸、苯磺酸、p-甲苯磺酸、環(huán)己基磺酸和奎寧酸制成。
用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)制備藥學(xué)可接受的鹽。例如，藥物的自由堿基形式首先溶于含適當(dāng)酸的適宜溶劑如水或水-甲醇溶液中。然后蒸發(fā)溶液以分離鹽。在另一個(gè)例子中，在有機(jī)溶液中用反應(yīng)自由堿基和酸的方法制備鹽。
載體或賦形劑有利于藥物給藥，例如，增加藥物的溶解度。載體和賦形劑的例子包括碳酸鈣、磷酸鈣，各種糖和各種形式的淀粉、纖維素、動(dòng)物膠、植物油、聚乙烯和生理適宜溶液。
可用標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)方法如用細(xì)胞培養(yǎng)或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物檢測(cè)這些藥物的毒性和治療效果，如檢測(cè)LD50(50％死亡劑量)和ED50(50％有效劑量)。毒性和有效劑量的比例是治療指數(shù)，可用LD50/ED50表示。具有較高的治療指數(shù)的藥物比較好。從這些細(xì)胞培養(yǎng)分析和動(dòng)物研究中所得出的數(shù)據(jù)可推出用于人的劑量范圍。這些藥物的劑量最好存在于包括小的ED50或沒(méi)有毒性的范圍內(nèi)。劑量可以根據(jù)所提供的劑量和所用的給藥途徑有所變化。
對(duì)于所有用這里所講述的方法找出的藥物，有效劑量的估計(jì)可能一開(kāi)始都來(lái)自于細(xì)胞培養(yǎng)分析。例如，劑量能在動(dòng)物模型中形成，以獲得包括IC50的循環(huán)血漿濃度，正如細(xì)胞培養(yǎng)中檢測(cè)的一樣(如檢測(cè)藥物獲得蛋白質(zhì)復(fù)合物最大破壞的一半的劑量，或復(fù)合物細(xì)胞內(nèi)水平和/或活性最大抑制的一半的劑量)。這種信息可用于更準(zhǔn)確的檢測(cè)人類(lèi)有效劑量。可檢測(cè)血漿水平，如用HPLC。
醫(yī)生可根據(jù)病人情況選擇適當(dāng)?shù)乃幬锝M合物、給藥途徑和劑量(See e.g.Finglet al.，in The Pharmacologocal Basis of Therapeutics，Ch.1p.1(1975))。醫(yī)生應(yīng)根據(jù)毒性、器官功能障礙等決定什麼時(shí)候結(jié)束、中斷或調(diào)整劑量。相反的，如果臨床劑量不夠時(shí)(避開(kāi)毒性)，醫(yī)生也應(yīng)該知道調(diào)節(jié)劑量到較高水平。給藥劑量范圍應(yīng)隨處理的疾病嚴(yán)重程度和給藥途徑有所變化。而且，劑量和可能的給藥頻率也要根據(jù)年齡、體重、具體病人的反應(yīng)情況有所調(diào)整。與上述討論類(lèi)似的程序也可用于獸醫(yī)。
根據(jù)處理的特殊情況，這些藥可系統(tǒng)給藥或局部給藥，給藥方法可參考Remington′s Pharmaceutical Sciences，18thed.，Mack Publishing Co.，Easton，PA(1990)。適宜途徑包括口腔、直腸、經(jīng)皮、陰道、經(jīng)黏膜或腸內(nèi)給藥；腸外途徑包括肌內(nèi)、皮下、髓內(nèi)注射和鞘內(nèi)、直接心室內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)或眼內(nèi)注射。
用于注射的藥物可制成水溶液，最好用生理適宜緩沖液如Hanks溶液、Ringer溶液或生理鹽水。對(duì)經(jīng)粘膜途徑給藥，制劑應(yīng)采用適宜載體滲透的穿透方式，這些穿透一般可見(jiàn)于文獻(xiàn)。
注意要使用制藥可接受的載體，以制成含適于系統(tǒng)給藥劑量的藥物。選擇適宜的載體和生產(chǎn)方案。這些藥物，特別是那些以溶液形式存在的藥物，可腸外給藥，如通過(guò)靜脈注射。用文獻(xiàn)中常見(jiàn)的制藥可接受載體，這些藥物能容易制成適于口服給藥的劑量。這些載體能使此發(fā)明的藥物制成片劑、膠囊、丸劑、液體、凝膠、糖漿、漿液、懸液等病人能口服吸收的制劑。
細(xì)胞內(nèi)給藥的藥物可參考文獻(xiàn)中常用的技術(shù)。例如，這些藥物可包裹進(jìn)脂質(zhì)體，然后，按以上所述給藥。脂質(zhì)體是球形脂雙層膜，內(nèi)部為親水性。有脂質(zhì)體形成時(shí)水溶液中的所有分子都包裹進(jìn)親水內(nèi)部，脂包裹物與外部微環(huán)境隔絕，由于脂質(zhì)體與細(xì)胞膜融合，因此，脂質(zhì)體包裹物能有效進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。另外，由于它們的疏水性，小的有機(jī)分子可以直接注入細(xì)胞內(nèi)。
適合用于此發(fā)明的藥物組成，包括能獲得預(yù)期目的的有效劑量的活性成份的組成。有效劑量的確定可參考文獻(xiàn)，特別可參考此文所述。除了活性成分，這些藥物組成還可含有適合的藥物可接受載體，其中包含幫助活性藥物制備成藥學(xué)可用的成藥的過(guò)程的賦形劑和輔助劑。用于口服的成藥可制成片劑、糖衣藥丸、膠囊或溶液。此發(fā)明所述的藥物組成可通過(guò)已知方式生成，如通過(guò)常規(guī)混合、溶解、成粒，制成糖衣藥丸、懸浮、乳化，制成膠丸，或凍干過(guò)程。
用于腸外給藥的系統(tǒng)包括以水溶液形式存在的活性藥物的水溶液，另外，活性藥物的懸浮液可制成適宜的油注射懸浮液，適合的親脂性溶劑或賦形劑包括脂肪油如芝麻油，或合成脂肪酸酯，如乙基油酸酯或三酸甘油酯或脂質(zhì)體。水注射懸浮液可能包含能增加懸浮液粘度的物質(zhì)，如羧基纖維素鈉，山梨醇或葡聚糖，也可包含適宜的穩(wěn)定劑和藥物，增加藥物溶解度以制成高濃度的溶液。
通過(guò)結(jié)合活性藥物與固體賦形劑能制成用于口服的成藥，此混合物可碾磨成可接受的程度，也可制成微粒的混合物。如果需要，在加入適宜輔助劑后，可制成片劑和糖衣制劑。特別的是，適宜的賦形劑是某些裝填物如糖，包括乳糖、蔗糖、甘露糖或甘梨醇；纖維素成藥如玉米淀粉、小麥淀粉、米淀粉、土豆淀粉、動(dòng)物膠、制阿拉伯橡膠的樹(shù)膠、甲基纖維素、羥基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和/或聚合乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要，可加入崩解劑如交聯(lián)聚合乙烯吡咯烷酮，瓊脂或藻酸或鹽如藻酸鹽。
糖衣藥丸可包裹適宜的外殼，因此可用濃縮糖溶液，含阿拉伯樹(shù)膠，滑石，聚合乙烯吡咯烷酮，聚乙烯已二醇，和/或二氧化鈦，漆溶液和適宜的有機(jī)溶劑或溶劑混合物。染料或涂料可被加入片劑或糖衣中用于識(shí)別或標(biāo)示活性化合物劑量的不同組合。
能用于口服的成藥包括動(dòng)物膠制成的配合插入膠囊，動(dòng)物膠制成的軟的密封膠囊和可塑膠如甘油或山梨醇。配合插入膠囊含活性成分，并與填充物如乳糖，黏合劑如淀粉，和/或潤(rùn)滑劑如滑石或硬脂酸鎂和穩(wěn)定劑等混合。在軟膠囊中，活性藥物可溶解或懸浮在適宜液體中，如脂肪油，液體石蠟或液體聚合乙烯乙二醇。另外可加入穩(wěn)定劑。
可用一些遞送的方法，包括a.封裝在脂質(zhì)體中；b.用逆轉(zhuǎn)錄載體轉(zhuǎn)導(dǎo)；c.利用在許多細(xì)胞核蛋白上找到的細(xì)胞核靶點(diǎn)定位到細(xì)胞核；d.體內(nèi)用被轉(zhuǎn)染細(xì)胞的再移植或給藥進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染；e.DNA運(yùn)輸系統(tǒng)在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種篩選化合物的方法，所述化合物調(diào)控視黃醇X受體RXR和孤兒受體TR3從細(xì)胞核遷移到以下部位細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜、線粒體、高爾基體和/或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，其特征在于，包括步驟(a)提供一種細(xì)胞，該細(xì)胞在細(xì)胞核中含有RXR和TR3；(b)在存在或不存在測(cè)試化合物情況下培育所述細(xì)胞；和(c)選擇出調(diào)節(jié)RXR和TR3從所述細(xì)胞的細(xì)胞核向以下部位遷移的化合物細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜、線粒體、高爾基體和/或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述化合物增加RXR到所述細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)的遷移。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述化合物減弱RXR到所述細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)的遷移。
4.權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述化合物選自下列物質(zhì)肽、聚合肽、擬肽、非肽化合物、碳水化合物、脂、合成化合物、天然產(chǎn)物、抗體或抗體片段、有機(jī)小分子、無(wú)機(jī)小分子和核酸序列。
5.一種藥物組合物，其特征在于，它含有用權(quán)利要求1所述方法篩選出的化合物和藥學(xué)上可接受的載體，而且所述藥物組合物通過(guò)調(diào)控RXR從細(xì)胞核向線粒體的亞細(xì)胞遷移而影響凋亡。
6.一種篩選化合物的方法，所述化合物調(diào)控RXR/TR3 II型異源二聚體的形成，從而影響細(xì)胞調(diào)亡，該方法包括步驟(a)提供一種細(xì)胞，所述細(xì)胞含有與線粒體相關(guān)的Bcl-2家族蛋白，所述細(xì)胞還含有能形成I型和II型RXR/TR3異源二聚體；(b)在存在或不存在測(cè)試化合物情況下培育所述細(xì)胞；和(c)選出選擇性誘導(dǎo)II型異源二聚體形成的化合物。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，還包含選擇調(diào)控II型異源二聚體從細(xì)胞核向線粒體的遷移的化合物。
8.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，還包含選擇調(diào)控II型異源二聚體與Bcl-2家族蛋白結(jié)合的化合物。
9.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，異源二聚體的形成用選自下組的方法鑒別(a)根據(jù)所述異源二聚體的構(gòu)型差別加以鑒別；(b)根據(jù)所述異源二聚體的亞細(xì)胞定位而被辨認(rèn)；或(c)對(duì)II型異源二聚體特異性的報(bào)告基因辨認(rèn)。
10.一種藥物組合物，其特征在于，它含有用權(quán)利要求6所述方法篩選出的化合物和藥學(xué)上可接受的載體，而且所述藥物組合物通過(guò)調(diào)控II型RXR/TR3異源二聚體從細(xì)胞核向線粒體的亞細(xì)胞遷移而影響凋亡。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種以視黃醇X受體(RXR)和孤兒受體(TR3)作為藥物靶點(diǎn)的篩選藥物分子的方法。本發(fā)明還公開(kāi)了用這種方法篩選的藥物組合物用于治療癌癥、心腦血管病、糖尿病等多種疾病的方法。
文檔編號(hào)G01N33/574GK1611939SQ20031010829
公開(kāi)日2005年5月4日 申請(qǐng)日期2003年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月31日
發(fā)明者張曉坤, 曾錦章, 楊汀 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院, 永春縣永春老醋有限責(zé)任公司