專利名稱：作為體外檢測(cè)試劑的真核通用表達(dá)載體系統(tǒng)及其構(gòu)建方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種體外檢測(cè)試劑，具體地說(shuō)涉及一種通過(guò)在畢赤酵母中利用穿梭質(zhì)粒pPIC9構(gòu)建的一種通用的表達(dá)載體系統(tǒng)及構(gòu)建方法。
背景技術(shù)：
嗜甲醇畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是最常用的真核表達(dá)系統(tǒng)之一。與原核表達(dá)系統(tǒng)相比，它所產(chǎn)生的蛋白絕大部分都能折疊成正確的構(gòu)象，保留了其原來(lái)的活性；并能將蛋白分泌至細(xì)胞外以利于其后期的分離純化。而與哺乳動(dòng)物細(xì)胞相比，它作為一種低等的真核生物，培養(yǎng)周期短、成本低、易于操作，并能產(chǎn)生更多數(shù)量的分泌型功能蛋白。此外，畢赤酵母本身分泌的蛋白量很少，因此分泌的蛋白大部分都是外源蛋白，有利于后期處理。
根據(jù)Invitrogen公司的說(shuō)明手冊(cè)A annual of Methods for Expression ofRecombinant Proteins in Pichia pastoris的報(bào)道，穿梭質(zhì)粒pPIC9是畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中經(jīng)典的分泌型表達(dá)載體。它含有AOX1啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止子片斷，AOX1作為一種強(qiáng)啟動(dòng)子，可以使所克隆的蛋白得到高表達(dá)。此外還含有組氨酸脫氫酶基因(HIS4)選擇標(biāo)記及3’AOX1區(qū)。它還含有當(dāng)前分泌性能優(yōu)越的釀酒酵母信號(hào)肽片段，以達(dá)到使蛋白成功分泌到胞外的目的。
根據(jù)文獻(xiàn)“Complete amino acid sequence of a mouse immuno buil alphaclain(MOPC 511)(Proc Natl Acad Sci USA 1980 Aug；77(9)4909-13.)”報(bào)道的小鼠抗體Fc段包括其IgG1重鏈恒定區(qū)的鉸鏈區(qū)、CH2和CH3三部分。它能介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒作用(ADCC)。構(gòu)建含有Fc片段的融合蛋白已有許多報(bào)導(dǎo)，它具有多方面的應(yīng)用，包括介導(dǎo)ADCC作用，激活補(bǔ)體反應(yīng)，延長(zhǎng)其在體內(nèi)的半衰期，以及增強(qiáng)對(duì)于腫瘤細(xì)胞的功效。
上述的表達(dá)載體系統(tǒng)通用性較差，使用不便，不易于檢測(cè)，檢測(cè)不夠快速、價(jià)格較高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明需要解決的技術(shù)問(wèn)題是公開(kāi)一種作為體外檢測(cè)試劑的真核通用表達(dá)載體系統(tǒng)及其構(gòu)建方法，以克服現(xiàn)有技術(shù)存在的上述缺陷，滿足醫(yī)療領(lǐng)域需要。
所述的載體含有一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位，該單位由以下一系列組成(1)一個(gè)在畢赤酵母中可以啟動(dòng)基因表達(dá)的遺傳因子；(2)信號(hào)肽；(3)合適的多克隆位點(diǎn)；(4)小鼠IgG1 Fc段的脫氧核糖核酸片段；(5)六個(gè)組氨酸組成的短肽；(6)轉(zhuǎn)錄及翻譯的起始及終止序列。
上述的表達(dá)載體系統(tǒng)的構(gòu)建方法包括如下步驟本發(fā)明從畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9出發(fā)，克隆入小鼠抗體Fc片段、并引入Sfi I、Not I酶切位點(diǎn)以及HIS(6)-tag，分別作為引入目的基因和融合蛋白純化之用，從而構(gòu)建了一種用以體外檢測(cè)的新型載體系統(tǒng)。
首先用Klenow酶將pPIC9載體多克隆位點(diǎn)中Not I位點(diǎn)補(bǔ)平，得pPIC9-Not I minus，以便后期基因片段的插入。
從小鼠脾臟中用Trizol試劑抽提總RNA，經(jīng)變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性。用提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以此為模板，由引物MO-1(5’-GTGCCCAGGGATTGTGGT-3’)和MO-2(5’-TTATTTACCAGGAGAGTGGG AGAGG-3’)經(jīng)PCR擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物即為小鼠IgG1 Fc段，將此Fc段裝入pMD18-T載體。
再以此為模板，用帶有酶切位點(diǎn)的引物MO-3和MO-4擴(kuò)增出Fc段以引入Sfi I、Not I和HIS-tag至其兩端。
MO-3和MO-4分別為(5’-GGGATTCAAGGGCCAGCCGGCCAGCGGCCGCGTGCCCAGGGATTGT
EcoR I Sfi I Not IG-3’)(5’AAAACATGCCTAGGAAGCTTGTGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTTACCAGGAGAGTGG-3’)Avr II Hind III (His)6sequences經(jīng)EcoR I和Not I雙酶切，將此PCR擴(kuò)增產(chǎn)物裝入pPIC9-Not I minus中。得到pPIC9-Fc。
至此完成了此載體系統(tǒng)的構(gòu)建。PCR鑒定電泳結(jié)果，表明，F(xiàn)c段確已裝入，測(cè)序結(jié)果如下1gaattcaagg cccagccggc cgcggccggc cgcgtgccca gggattgtgg ttgtaagcct61 tgcatatgta cagtcccaga agtatcatct gtcttcatct tccccccaaa gcccaaggat121 gtgctcacca ttactctgac tcctaaggtc acgtgtgttg tggtagacat cagcaaggat181 gatcccgagg tccagttcag ctggtttgta gatgatgtgg aggtgcacac agctcagacg241 caaccccggg aggagcagtt caacagcact ttccgctcag tcagtgaact tcccatcatg301 caccaggact ggctcaatgg caaggagttc aaatgcaggg tcaacagtgc agctttccct361 gcccccatcg agaaaaccat ctccaaaacc aaaggcagac cgaaggctcc acaggtgtac421 accattccac ctcccaagga gcagatggcc aaggataaag tcagtctgac ctgcatgata481 acagacttct tccctgaaga cattactgtg gagtggcagt ggaatgggca gccagcggag541 aactacaaga acactcagcc catcatggac acagatggct cttacttcgt ctacagcaag601 ctcaatgtgc agaagagcaa ctgggaggca ggaaatactt tcacctgctc tgtgttacat661 gagggcctgc acaaccacca tactgagaag agcctctccc actctcctgg taaacaccac721 caccaccacc acttaagctt cctagggcgg ccggccgcga attaa本發(fā)明的載體系統(tǒng)可生產(chǎn)融合蛋白以作為體外檢測(cè)試劑。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于此表達(dá)載體系統(tǒng)具有顯著的通用性由于在pPIC9-Fc中人為引入了SfiI、Not I酶切位點(diǎn)，與pHEN 1和pCANTAB 5E這兩種噬菌粒中的多克隆位點(diǎn)一致，因此使得那些從噬菌體展示系統(tǒng)中所篩出的目的基因片段能直接克隆入pPIC9-Fc中而不需中間的克隆步驟，非常方便。另外也可根據(jù)需要裝入任何在其5’和3’端含有Sfi I、Not I酶切位點(diǎn)的基因片段。更加推廣了此載體系統(tǒng)的應(yīng)用。
易于檢測(cè)目的基因片段與小鼠抗體Fc片段是以融合蛋白的形式表達(dá)，因此只要用普通的抗鼠抗體便可檢測(cè)到。使得其應(yīng)用更加方便、快速、低廉。
所表達(dá)的融合蛋白易于、分離純化由于在多克隆位點(diǎn)的3’端引入了His-Tag，可以使用鎳性的親和層析柱分離純化。而對(duì)于帶有His-Tag的蛋白的純化已經(jīng)是一項(xiàng)較為成熟的技術(shù)，因此也使得本系統(tǒng)更加方便使用。


圖1為質(zhì)粒簡(jiǎn)圖；圖2為多克隆位點(diǎn)詳圖；圖3是PCR鑒定凝膠電泳圖；圖4是ScFv-Fc融合蛋白小量表達(dá)SDS-PAGE分析圖；圖5是ScFv-Fc融合蛋白大量表達(dá)和純化的SDS-PAGE分析圖；圖6是Western Blotting鑒定ScFv-Fc融合蛋白活性分析圖。
具體實(shí)施例方式
圖1為質(zhì)粒簡(jiǎn)圖，圖中，S為α因子分泌信號(hào)肽；Fc為小鼠IgG1 Fc重鏈恒區(qū)中的鉸鏈區(qū)、CH2、CH3；HIS-tag為六個(gè)組氨酸組成的短肽；5’及3’AOX1為醇氧化酶1啟動(dòng)子；HIS4為編碼組氨酸脫氫酶的基因；Co1E1為原核復(fù)制起始點(diǎn)；Amp為氨芐抗性基因。
圖2為多克隆位點(diǎn)詳圖。S、Fc和HIS-tag見(jiàn)圖1的說(shuō)明，Xho I、SnaBI、Sfi I、EcoR I、Not I、HindIII、AvrII皆為限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)。
由圖1和圖2可見(jiàn)，所述的載體含有一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位，該單位由以下一系列組成(1)一個(gè)在畢赤酵母中可以啟動(dòng)基因表達(dá)的遺傳因子；(2)信號(hào)肽；(3)合適的多克隆位點(diǎn)；(4)小鼠IgG1 Fc段的脫氧核糖核酸片段；(5)六個(gè)組氨酸組成的短肽；(6)轉(zhuǎn)錄及翻譯的起始及終止序列。
所述的遺傳因子是啟動(dòng)子，所述的啟動(dòng)子選自醇氧化酶1基因，所述的信號(hào)肽選自釀酒酵母α因子。
實(shí)施例1裝入一個(gè)抗GST的單鏈抗體ScFv
抗GST(谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶)的ScFv的克隆將從噬菌體抗體庫(kù)中篩出的一個(gè)抗GST的ScFv片段，經(jīng)PCR擴(kuò)增和Sfi I、Not I雙酶切，克隆至Sfi I、Not I消化的pPIC9-Fc質(zhì)粒之中，得表達(dá)載體pPIC9-ScFv-Fc。
ScFv-Fc融合蛋白的小量表達(dá)。
按Invitrogen操作手冊(cè)制備畢赤酵母KM71菌株的感受態(tài)細(xì)胞，將pPIC9-ScFv-Fc用Sal I酶切線性化后電轉(zhuǎn)入以上感受態(tài)細(xì)胞中(1500伏、25uF、400歐)，立刻加入1ml預(yù)冷的1M山梨醇，轉(zhuǎn)移至管中離心，涂布在MD平板上，30℃培養(yǎng)。
從MD板上挑取7個(gè)克隆培養(yǎng)在10ml BMGY培養(yǎng)基中(1％酵母粉，2％蛋白胨，100mM磷酸鉀緩沖液，pH6.0，1.34％YNB，4×10-5％生物素，1％甘油)，30℃，250rpm下培養(yǎng)至O.D.600＝2.0-6.0。細(xì)胞離心后重懸在2ml BMMY培養(yǎng)基中(1％酵母粉，2％蛋白胨，100mM磷酸鉀緩沖液，pH6.0，1.34％YNB，4×10-5％生物素，0.5％甲醇)以誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。30℃、250rpm條件下培養(yǎng)6天，每24小時(shí)添加甲醇至終濃度為0.5％。6天后離心收集上清，取少量進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，結(jié)果如圖3所示。
ScFv-Fc融合蛋白的大量表達(dá)挑選表達(dá)量最高的克隆進(jìn)行大量表達(dá)，即在5升發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵。具體操作按Invitrogen的發(fā)酵手冊(cè)(Pichia Fermentation Process Guidelines，Invitrogen)進(jìn)行。100小時(shí)后離心收集上清，-80℃保存。取少量進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，結(jié)果如圖4所示。其中l(wèi)ane1 Marker，lane2未插入Fc段的pPIC9轉(zhuǎn)化株，lane3-lane8 MD板上挑取的七個(gè)克隆。
ScFv-Fc 融合蛋白的純化取1生發(fā)酵得上清液，加入PMSF至終濃度為1mM，以防止蛋白降解。并加入1/10總體積的1.0Mtris，8.0將培養(yǎng)基的pH值調(diào)至8.0。然后加入硫酸銨至飽和度為60％以沉淀蛋白質(zhì)，冰浴下攪拌2小時(shí)。沉淀離心后重懸在40ml 20mM Tris-HCl，pH7.9中，透析過(guò)夜。加入imidazole和NaCl至終濃度分別為0.5M和5mM。然后將樣品上至鎳性親和層析柱，經(jīng)洗滌液(20mM Tris/HCl，pH7.9，60mM imidazole，0.5M NaCl)充分洗凈雜質(zhì)后，用洗脫液(20mM Tris/HCl，pH7.9，0.5M imidazole，0.5M NaCl)將目的蛋白洗下。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果如圖5所示。其中l(wèi)ane1大量表達(dá)后的上清液，lane2純化后的ScFv-Fc融合蛋白，lane3 Marker。
5、Western Blotting檢測(cè)ScFv-Fc融合蛋白活性為檢測(cè)此ScFv-Fc蛋白的活性，獲得GST和一批含GST的融合蛋白，包括hCG(絨毛促腎上腺激素)，F(xiàn)GF(堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子)，來(lái)自多藥抗性P糖蛋白的蛋白片段，B37，C21，C23，D1，D2。
將以上GST和GST融合蛋白進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，其中包括未經(jīng)誘導(dǎo)的BL21細(xì)胞裂解液作為陰性對(duì)照。分離出的目的蛋白由semi-dry transfer apparatus(Bio-Rad Laboratories)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將膜用封閉緩沖液(PBST中含有5％脫脂奶粉)封閉1小時(shí)。進(jìn)行三次洗滌，每次用PBST洗10分鐘，之后室溫下與ScFv-Fc融合蛋白溫育1小時(shí)。同樣三次洗滌后，在由辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG1 1∶1000稀釋液中溫育1小時(shí)。再經(jīng)三次洗滌后，膜用ECL Western Blotting檢測(cè)試劑(AmershamPharmacia Biotech.)處理后送去暗室曝光。Western Blotting結(jié)果如圖6所示。其中l(wèi)ane1未誘導(dǎo)的BL21細(xì)胞裂解液lane2 FGF lane3 D1 lane4 D2lane5 hCG lane6 B37 lane7 C21 lane8 C23 lane9 GST lane2-9所示蛋白的預(yù)期分子量分別為42kDa，54kDa，50kDa，43kDa，30kDa，29kDa，30kDaand 26kDa。
結(jié)果表明實(shí)施例1中將抗GST單鏈抗體克隆入所構(gòu)建的載體系統(tǒng)中后，獲得了高表達(dá)，不僅引入了Fc段檢測(cè)此融合蛋白的功效，還保留了單鏈抗體部分抗GST的活性。因此，此ScFv-Fc融合蛋白可以開(kāi)發(fā)成檢測(cè)GST及其融合蛋白的體外檢測(cè)試劑。也驗(yàn)證了所構(gòu)建的表達(dá)載體系統(tǒng)的意義。
權(quán)利要求
1.一種作為體外檢測(cè)試劑的真核通用表達(dá)載體系統(tǒng)，其特征在于，所述的載體含有一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位，該單位由以下一系列組成(1)一個(gè)在畢赤酵母中可以啟動(dòng)基因表達(dá)的遺傳因子；(2)信號(hào)肽；(3)合適的多克隆位點(diǎn)；(4)小鼠IgG1 Fc段的脫氧核糖核酸片段；(5)六個(gè)組氨酸組成的短肽；(6)轉(zhuǎn)錄及翻譯的起始及終止序列。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的真核通用表達(dá)載體系統(tǒng)，其特征在于，所述的遺傳因子是啟動(dòng)子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的真核通用表達(dá)載體系統(tǒng)，其特征在于，所述的啟動(dòng)子選自醇氧化酶1基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的真核通用表達(dá)載體系統(tǒng)，其特征在于，所述的信號(hào)肽選自釀酒酵母α因子。
5.根據(jù)權(quán)利要求1～4任一項(xiàng)所述的真核通用表達(dá)載體系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其特征在于，包括如下步驟從畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9出發(fā)，克隆入小鼠抗體Fc片段、并引入合適的酶切位點(diǎn)以及HIS(6)-tag，分別作為引入目的基因和融合蛋白純化之用，從而構(gòu)建了一種用以體外檢測(cè)的新型載體系統(tǒng)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的真核通用表達(dá)載體系統(tǒng)的構(gòu)建方法，其特征在于，所說(shuō)的酶切位點(diǎn)為SfiI和NotI。
7.一種根據(jù)權(quán)利要求1～4任一項(xiàng)所述的真核通用表達(dá)載體系統(tǒng)的應(yīng)用，其特征在于，用于生產(chǎn)融合蛋白以作為體外檢測(cè)試劑。
全文摘要
一種作為體外檢測(cè)試劑的真核通用表達(dá)載體系統(tǒng)，含有一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位，該單位包括(1)一個(gè)在畢赤酵母中可以啟動(dòng)基因表達(dá)的遺傳因子；(2)信號(hào)肽；(3)合適的多克隆位點(diǎn)；(4)小鼠IgG1 Fc段的脫氧核糖核酸片段；(5)六個(gè)組氨酸組成的短肽；(6)轉(zhuǎn)錄及翻譯的起始及終止序列。構(gòu)建方法包括如下步驟從畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9出發(fā)，克隆入小鼠抗體Fc片段、并引入合適的酶切位點(diǎn)以及HIS(6)－tag，分別作為引入目的基因和融合蛋白純化之用。該真核通用表達(dá)載體系統(tǒng)可用于生產(chǎn)融合蛋白以作為體外檢測(cè)試劑。此表達(dá)載體系統(tǒng)具有顯著的通用性易于檢測(cè)，所表達(dá)的融合蛋白易于、分離純化，使用方便。
文檔編號(hào)G01N33/68GK1544639SQ20031010881
公開(kāi)日2004年11月10日 申請(qǐng)日期2003年11月24日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月24日
發(fā)明者魏東芝, 劉江瀾, 錢峰, 楊忠 申請(qǐng)人:華東理工大學(xué)