專利名稱：一種制備抗體芯片的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及蛋白質(zhì)芯片，尤其是用于免疫學(xué)分析的抗體芯片制備方法。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)芯片(Protein Microarray)也叫蛋白質(zhì)微陳列，其原理是對(duì)固相載體進(jìn)行特殊的化學(xué)處理，再將已知的蛋白分子固定其上，(如抗體、抗原、酶、細(xì)胞因子等)，利用蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)，酶與底物，蛋白質(zhì)與其他小分子之間的相互作用，檢測(cè)分析蛋白質(zhì)，從而獲得重要的生命信息。蛋白質(zhì)檢測(cè)微陣列能夠在同一生物學(xué)樣本中同時(shí)檢測(cè)多種蛋白質(zhì)的水平，因此可作為一種分析工具。
目前，制備蛋白質(zhì)芯片的載體有三種類型，分別為玻片(glass slide)；多孔凝膠墊(porous gel pad slides)；微孔(Microwells)。在載玻片表面構(gòu)建蛋白質(zhì)微陣列的優(yōu)勢(shì)在于此方法可以制備標(biāo)準(zhǔn)的微陣列，并用基因芯片掃描儀來掃描，獲取結(jié)果。根據(jù)蛋白質(zhì)的特性，用蛋白質(zhì)的氨基端NH2固定在經(jīng)醛基處理的玻片上，這樣就可以在玻片上進(jìn)行抗原抗體反應(yīng)。為蛋白芯片能象DNA芯片簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確、快速平行，高通量的操作提供前提條件。
抗體芯片(Antibody Microarray)是蛋白質(zhì)芯片的一種主要類型，最新發(fā)展的抗體芯片技術(shù)的原理類似于常規(guī)的酶聯(lián)免疫反應(yīng)，即將特異性抗體或抗原固定在載體上，待測(cè)樣本按一定的比例稀釋后與載體上的抗體或抗原進(jìn)行反應(yīng)，再加入熒光標(biāo)記的抗體或抗原，通過激光共聚焦掃描儀或CCD相機(jī)讀取熒光強(qiáng)度，由計(jì)算機(jī)軟件對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行分析，得到準(zhǔn)確的定性結(jié)果或定量數(shù)據(jù)。因?yàn)樵谝粡埖鞍踪|(zhì)芯片上可分布上千甚至數(shù)萬的抗體或抗原，陣列并能標(biāo)記多種熒光素，通過熒光強(qiáng)度分析蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用的關(guān)系，由此達(dá)到測(cè)定各種蛋白質(zhì)功能的目的。使得這些免疫學(xué)指標(biāo)能同時(shí)被快速檢測(cè)。
(一)抗體蛋白在玻片上的固定要點(diǎn)由于生物芯片采用發(fā)光檢測(cè)方法，玻璃芯片具有良好的透射及反射光學(xué)性能，所以在制作生物芯片時(shí)，玻璃片是最常用的載體材料，其表面活性基團(tuán)主要為羥基，要固定生物分子，玻片表面必須經(jīng)過氨基化，醛基化處理，即活化表面的活性基團(tuán)。氨基硅烷活化玻片載體化學(xué)式見圖1，氨基化玻片固定蛋白質(zhì)的化學(xué)式見圖2。
同型雙功能交聯(lián)劑戊二醛的兩個(gè)醛基可以分別與兩個(gè)相同或不同分子的伯氨基形成Schiff堿，將兩分子以五碳鏈的橋連接起來。戊二醛連接反應(yīng)是最溫和的交聯(lián)反應(yīng)之一，可在4-10℃溫度范圍pH6.0-8.0的緩沖水溶液中進(jìn)行，但是緩沖組份中不得含有氨基化合物。
(二)抗體溶液中所添加的防腐劑疊氮鈉對(duì)抗體分子在玻片上固定的干擾作用。
無論是純化的抗體，還是標(biāo)記抗體，在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)的保存條件和方法對(duì)維持其效價(jià)十分重要。保存方法不當(dāng)，可使抗體腐敗變質(zhì)、雜菌污染或混入其他雜質(zhì)而失去應(yīng)用價(jià)值。由于抗體本身是大分子蛋白，因此，在抗體的保存和運(yùn)輸過程中，一定要注意避免蛋白質(zhì)的變性問題，即雜菌污染，腐敗變質(zhì)，過度的高溫，或極端pH值的出現(xiàn)。所以，抗體溶液中常加入防腐劑保存。
常用于抗體保存的防腐劑有疊氮鈉(0.1％-0.01％濃度)、硫柳汞(0.01％濃度)?？贵w及標(biāo)記抗體加入防腐劑后可放入4℃普通冰箱保存，保存期約1年。NaN3是最常用于抗體保存的防腐劑，但NaN3除了對(duì)熒光素(異硫氰酸熒光素)有淬滅作用外，更關(guān)鍵的是在蛋白質(zhì)芯片制作中，NaN3還對(duì)點(diǎn)樣于玻片表面上的抗體分子的中的伯氨基與玻片表面的醛基Schiff鍵的形成有干擾作用。對(duì)于第一點(diǎn)，已有文獻(xiàn)闡明，但對(duì)于第二點(diǎn)，未見文獻(xiàn)報(bào)道，也常為實(shí)驗(yàn)人員忽略。
在蛋白質(zhì)芯片的制作中熒光抗體是必用試劑，無論實(shí)驗(yàn)人員向生物技術(shù)公司購買現(xiàn)成的，或自行制備，但為了保存抗體的長(zhǎng)時(shí)間的生物活性，疊氮鈉(0.1％-0.01％濃度)必須添加于抗體溶液中，由于疊氮鈉使用濃度甚低(0.1％-0.01％濃度)，實(shí)驗(yàn)人員常常沒意設(shè)到或忽略了疊氮鈉對(duì)玻片表面上的抗體分子的中的伯氨基與玻片表面的醛基Schiff鍵形成的干擾作用，其后果是用激光共聚焦掃描的各點(diǎn)上的熒光強(qiáng)度會(huì)相對(duì)減弱，從而減低了檢測(cè)靈敏度。所以，在蛋白質(zhì)芯片制作中，用于熒光抗體保存的防腐劑疊氮鈉必須去除。
(三)抗體固定模式對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響抗體芯片的制作采用標(biāo)準(zhǔn)玻片為支撐物。該標(biāo)準(zhǔn)玻片長(zhǎng)76.2mm，寬25.4mm，在玻片的一段可以留有標(biāo)簽的位置。芯片探針區(qū)域一般在玻片的中央，其大小視探針數(shù)量和探針之間的間距而定。若采取中密度點(diǎn)樣技術(shù)，其點(diǎn)樣區(qū)域可在0.5至1cm2之間。但不同的點(diǎn)樣固定的格式對(duì)檢測(cè)結(jié)果的判斷有明顯的影響，為了便于對(duì)掃描圖象的分析，在各抗體之間加點(diǎn)熒光標(biāo)志，這樣可以根據(jù)熒光標(biāo)記很快找到檢測(cè)信號(hào)的位置和抗原類型。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，若把FITC標(biāo)記的IgG作為熒光標(biāo)志，按常規(guī)點(diǎn)樣在最后一例，而把陰性對(duì)照點(diǎn)樣在最后第二例，陽性對(duì)照點(diǎn)樣在最后第三例，用激光共聚焦掃描，陰性對(duì)照的點(diǎn)樣熒光強(qiáng)度會(huì)受最后一例熒光標(biāo)志的影響，用相應(yīng)的芯片分析軟件分析，熒光強(qiáng)度數(shù)值會(huì)少量上升，從而提高本低，減低檢測(cè)靈敏度，嚴(yán)重的會(huì)造成檢測(cè)結(jié)果的誤判。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種抗體芯片制作方法，以有效去除防腐劑的干擾作用，提高檢測(cè)結(jié)果的靈敏度，特異性。
本發(fā)明的制備抗體芯片的方法，包括以下操作步驟(1)熒光抗體蛋白的純化、鑒定純化將熒光抗體蛋白裝入透析袋中，并移入0.01MpH7.2的磷酸鹽緩沖液中透析，直到透析液在OD495nm中的吸光值接近零為止；鑒定用紫外分光光度計(jì)測(cè)定熒光標(biāo)記抗體的OD495nm，若其吸光值接近零，表明疊氮鈉透析完全；(2)載玻片的預(yù)處理將玻片分別用強(qiáng)堿和濃硫酸浸洗；雙蒸水沖洗，晾干；將清洗后的玻片浸入2％的氨基硅烷的95％乙醇溶液中，冰醋酸調(diào)節(jié)pH至4.5，室溫作用30min，用95％乙醇沖洗，晾干；再將氨基化玻片浸入2.5％戊二醛的0.1mol/L，pH7.2的PBS溶液中，室溫作用2h，PBS沖洗，晾干；(3)點(diǎn)樣抗體芯片的制作采用標(biāo)準(zhǔn)玻片為載體，把待點(diǎn)樣的蛋白溶于40％的甘油，60％的PBS，PBS的pH值為7.5，終濃度為100μg/ml，然后用Cartisian機(jī)器人點(diǎn)樣，將倍比稀釋的抗體在醛基化玻片上逐行點(diǎn)樣，斑點(diǎn)間距0.25mm，每點(diǎn)10nl，其中，第一列為FITC標(biāo)記的IgG對(duì)照點(diǎn)樣，最后第二列為陽性標(biāo)本對(duì)照點(diǎn)樣，每個(gè)探針點(diǎn)樣重復(fù)數(shù)次，最后一列為陰性對(duì)照點(diǎn)樣(見圖3模式)，放置4℃冰箱內(nèi)3h，晾干后再用10％的小牛血清，溶于0.01mol/L，pH 7.2的PBS，室溫封閉1.5h，用0.01mol/L，pH7.2，0.05％Tween20的PBST沖洗數(shù)次，10秒/次，晾干，備用；(4)目的蛋白的檢測(cè)陽性標(biāo)本用5％的小牛血清，溶于0.01mol/L，pH7.2的PBS，稀釋液稀釋10倍，加入玻片中，37℃孵育1h，用0.01mol/L，pH7.2，0.9％NaCl的PBS沖洗數(shù)次，晾干，在玻片上加稀釋的熒光抗體，37℃孵育1h，再用0.01mol/L，pH8.2，0.9％NaCl 0.05％Tween20的PBST沖洗數(shù)次，晾干；(5)激光共聚焦掃描上述玻片用Scan Array Lite型激光共聚焦掃描成像，圖像用專業(yè)分析軟件定量分析即可。
通常，can Array Lite型激光共聚焦掃描激光強(qiáng)度設(shè)定為60％-95％，光電倍增管強(qiáng)度設(shè)定為70-80％，掃描分辨率為5-10μm，激發(fā)及檢測(cè)波長(zhǎng)分別為500nm，520nm。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其有益效果有本發(fā)明在制備抗體芯片的方法中，由于增加標(biāo)記抗體的透析這一步，因此能有效地去除熒光抗體溶液中所添加的防腐劑疊氮鈉，消除疊氮鈉對(duì)點(diǎn)樣于玻片表面上的抗體分子中的伯氨基與玻片表面的醛基Schiff鍵的形成的干擾作用，提高了抗體芯片檢測(cè)靈敏度。
設(shè)計(jì)出一種抗體固定點(diǎn)樣模式，對(duì)熒光標(biāo)記、陽、陰性對(duì)照各列的序列進(jìn)行了優(yōu)化。第一列為FITC標(biāo)記的IgG對(duì)照點(diǎn)樣，每個(gè)探針重復(fù)點(diǎn)樣數(shù)次，這樣根據(jù)熒光標(biāo)記可以很快找到檢測(cè)信號(hào)的位置和抗原類型，減少點(diǎn)樣的誤差；同時(shí)這種模式的固定有利于對(duì)掃描圖象的分析。對(duì)熒光標(biāo)記、陽、陰性對(duì)照點(diǎn)樣中，第一列為FITC標(biāo)記的IgG對(duì)照點(diǎn)樣，最后第二列為陽性標(biāo)本對(duì)照點(diǎn)樣，最后一列為陰性對(duì)照點(diǎn)樣，這樣在用激光共聚焦掃描時(shí)，陰性對(duì)照點(diǎn)樣熒光的分析，熒光強(qiáng)度不會(huì)受最后一列熒光標(biāo)記的影響，提高了實(shí)驗(yàn)的真實(shí)性，增加抗體芯片檢測(cè)的靈敏度，特異性。


圖1是氨基硅烷活化玻片載體化學(xué)反應(yīng)式；圖2是氨基化玻片固定蛋白質(zhì)的化學(xué)反應(yīng)式；圖3是抗體芯片的探針固定格式圖；圖4是用抗體芯片檢測(cè)血清中HBsAg的激光共聚焦掃描(掃描儀的激光強(qiáng)度設(shè)定為65％，第一列熒光抗體(FITC-IgG)，最后第二列陽性對(duì)照，最后一列陰性對(duì)照)；圖5是用抗體芯片檢測(cè)血清中HBsAg的激光共聚焦掃描(掃描儀的激光強(qiáng)度設(shè)定為90％，第一列熒光抗體(FITC-IgG)，最后第二列陽性對(duì)照，最后一列陰性對(duì)照)。
具體實(shí)施實(shí)例以制備檢測(cè)血清中乙肝表面抗原抗體芯片為例，制備方法包括以下步驟(1)熒光抗體蛋白的純化、鑒定純化將熒光抗體蛋白裝入透析袋移入0.01MpH7.2的磷酸鹽緩沖液中透析，每天換液3次，直到透析液在OD495nm中的吸光值接近零為止。一般，經(jīng)過透袋內(nèi)滲透標(biāo)記的熒光抗體比較均勻，過量結(jié)合的抗體較少，可以不通過離子交換層析法進(jìn)一步純化。
鑒定用紫外分光光度計(jì)測(cè)定熒光標(biāo)記抗體的OD495nm其吸光值為0.01。表明疊氮鈉透析完全。
(2)載玻片的預(yù)處理將玻片分別用強(qiáng)堿和濃硫酸浸洗；雙蒸水沖洗，晾干。然后將上述清洗后的玻片浸入2％的氨基硅烷的95％乙醇溶液中，冰醋酸調(diào)節(jié)pH至4.5，室溫作用30min，用95％乙醇沖洗，晾干。再將氨基化玻片浸入2.5％戊二醛的0.1mol/L，PBS(pH7.2)溶液中，室溫作用2h，PBS沖洗，晾干。
(3)點(diǎn)樣把待點(diǎn)樣的抗HBsAgS1單抗溶于40％的甘油，60％的PBS，PBS的pH值為7.5，終濃度為100μg/ml，用Cartisian機(jī)器人將倍比稀釋的抗HBsAgS1單抗在處理好的載玻片上高速點(diǎn)樣，每點(diǎn)10nl，最后一例為1mg/ml BSA對(duì)照點(diǎn)樣，放置4℃冰箱內(nèi)3h，晾干后再用10％的小牛血清PBS(0.01mo/L磷酸鹽，pH7.2，0.9％NaCl)室溫封閉1.5h.用PBST(0.01mol/L磷酸鹽，pH7.2，0.9％NaCl 0.05％Tween20)沖洗8次，10秒/次，晾干，備用。
(4)目的蛋白的檢測(cè)HBsAg陽性血清標(biāo)本用5％的小牛血清PBS(0.01mol/L磷酸鹽，pH7.2，0.9％NaCl)稀釋液稀釋，加入載玻片中，37℃孵育1h，用PBS(0.01mol/L磷酸鹽，pH7.2，0.9％NaCl)沖洗10次，晾干.在載玻片上加1∶50稀釋的熒光抗體(FITC-monoclonal anti-HBsAg S2antibody)，37℃孵育1h，用PBST(0.01mol/L磷酸鹽，pH8.2，0.9％NaCl 0.05％Tween20)沖洗10次，晾干。
(5)激光共聚焦掃描用Scan Array Lite型激光共聚焦掃描成像，掃描儀的激光強(qiáng)度分別設(shè)定為65％，90％，光電倍增管強(qiáng)度設(shè)定為80％。掃描分辨率為10μm，激發(fā)及檢測(cè)波長(zhǎng)分別為500nm，520nm。
圖4所顯示的是所制得的檢測(cè)血清中乙肝表面抗原抗體芯片的陽性血清標(biāo)本的激光共聚焦掃描圖，第一例為熒光抗體(FITC-IgG)對(duì)照，第二例樣品中陽性血清HBsAg的濃度為10ng/ml，第三例樣品中陽性血清HBsAg的濃度為5ng/ml最后第二例為陽性對(duì)照HBsAg的濃度為1ng/ml點(diǎn)樣，最后一例為HBsAg陰性血清標(biāo)本對(duì)照。圖5所顯示的是用抗體芯片檢測(cè)血清中HBsAg的激光共聚焦掃描圖。第一例為熒光抗體(FITC-IgG)對(duì)照，第二例樣品中陽性血清HBsAg的濃度為10ng/ml，第三例樣品中陽性血清HBsAg的濃度為5ng/ml最后第二例為陽性對(duì)照HBsAg的濃度為1ng/ml點(diǎn)樣，最后一例為HBsAg陰性血清標(biāo)本對(duì)照。
從圖4、圖5可見，熒光強(qiáng)度與血清HBsAg濃度成逐例遞減關(guān)系。圖4-5顯示第一行為FITC標(biāo)記的IgG對(duì)照點(diǎn)樣，最后第二例為陽性標(biāo)本對(duì)照點(diǎn)樣，每個(gè)探針點(diǎn)樣重復(fù)5次，最后一例為陰性對(duì)照點(diǎn)樣，這種抗體固定點(diǎn)樣模式，陰性對(duì)照的點(diǎn)樣熒光強(qiáng)度不會(huì)受最后熒光標(biāo)志的影響，從而提高了本低的真實(shí)性，提高了抗體芯片檢測(cè)特異性，同時(shí)可以根據(jù)熒光標(biāo)記很快找到檢測(cè)信號(hào)的位置和抗原類型。在芯片中加入陽性對(duì)照，若在檢測(cè)時(shí)該信號(hào)呈陰性，提示檢測(cè)操作有問題或抗體蛋白發(fā)生變性。在芯片中加入陰性對(duì)照，在檢測(cè)時(shí)該信號(hào)的熒光強(qiáng)度代表實(shí)驗(yàn)中本底值的大小。
權(quán)利要求
1.一種制備抗體芯片的方法，其特征在于包括以下操作步驟(1)熒光抗體蛋白的純化、鑒定純化將熒光抗體蛋白裝入透析袋中，并移入0.01MpH7.2的磷酸鹽緩沖液中透析，直到透析液在OD495nm中的吸光值接近零為止；鑒定用紫外分光光度計(jì)測(cè)定熒光標(biāo)記抗體的OD495nm，若其吸光值接近零，表明疊氮鈉透析完全；(2)載玻片的預(yù)處理將玻片分別用強(qiáng)堿和濃硫酸浸洗；雙蒸水沖洗，晾干；將清洗后的玻片浸入2％的氨基硅烷的95％乙醇溶液中，冰醋酸調(diào)節(jié)pH至4.5，室溫作用30min，用95％乙醇沖洗，晾干；再將氨基化玻片浸入2.5％戊二醛的0.1mol/L，pH7.2的PBS溶液中，室溫作用2h，PBS沖洗，晾干；(3)點(diǎn)樣抗體芯片的制作采用標(biāo)準(zhǔn)玻片為載體，把待點(diǎn)樣的蛋白溶于40％的甘油，60％的PBS，PBS的pH值為7.5，終濃度為100μg/ml，然后用Cartisian機(jī)器人點(diǎn)樣，將倍比稀釋的抗體在醛基化玻片上逐行點(diǎn)樣， 斑點(diǎn)間距0.25mm，每點(diǎn)10nl，其中，第一列為FITC標(biāo)記的IgG對(duì)照點(diǎn)樣，最后第二列為陽性標(biāo)本對(duì)照點(diǎn)樣，每個(gè)探針點(diǎn)樣重復(fù)數(shù)次，最后一列為陰性對(duì)照點(diǎn)樣，放置4℃冰箱內(nèi)3h，晾干后再用10％的小牛血清，溶于0.01mo/L，pH7.2的PBS，室溫封閉1.5h，用0.01mol/L，pH7.2，0.05％Tween20的PBST沖洗數(shù)次，10秒/次，晾干，備用；(4)目的蛋白的檢測(cè)陽性標(biāo)本用5％的小牛血清，溶于0.01mo/L，pH7.2的PBS，稀釋液稀釋10倍，加入玻片中，37℃孵育1h，用0.01mol/L，pH7.2，0.9％NaCl的PBS沖洗數(shù)次，晾干，在玻片上加稀釋的熒光抗體，37℃孵育1h，再用0.01mol/L，pH8.2，0.9％NaCl 0.05％Tween20的PBST沖洗數(shù)次，晾干；(5)激光共聚焦掃描上述玻片用Scan Array Lite型激光共聚焦掃描成像，圖像用專業(yè)分析軟件定量分析即可。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備抗體芯片的方法，其特征在于所說的ScanArray Lite型激光共聚焦掃描激光強(qiáng)度設(shè)定為60％-95％，光電倍增管強(qiáng)度設(shè)定為70-80％，掃描分辨率為5-10μm，激發(fā)及檢測(cè)波長(zhǎng)分別為500nm，520nm。
全文摘要
本發(fā)明的制備抗體芯片的方法，針對(duì)在抗體芯片制作中疊氮鈉對(duì)醛基化玻片表面上的抗體分子中的伯氨基與玻片表面醛基Schiff鍵形成有干擾作用，而增加標(biāo)記抗體透析，有效去除熒光抗體溶液中所添加的防腐劑疊氮鈉，提高抗體芯片檢測(cè)靈敏度。并設(shè)計(jì)出一種抗體點(diǎn)樣模式，對(duì)熒光標(biāo)記、陽、陰性對(duì)照的序列進(jìn)行了優(yōu)化。第一列為FITC標(biāo)記的IgG對(duì)照點(diǎn)樣。這種點(diǎn)樣模式有利于對(duì)掃描圖象的分析，根據(jù)熒光標(biāo)記可以很快找到檢測(cè)信號(hào)的位置和抗原類型。最后第二列為陽性標(biāo)本對(duì)照點(diǎn)樣，最后一列為陰性對(duì)照點(diǎn)樣，這樣在用激光共聚焦掃描時(shí)，陰性對(duì)照的點(diǎn)樣熒光強(qiáng)度不會(huì)受到熒光標(biāo)志的影響，從而提高抗體芯片檢測(cè)的特異性。
文檔編號(hào)G01N33/533GK1544943SQ200310108819
公開日2004年11月10日 申請(qǐng)日期2003年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月21日
發(fā)明者趙國(guó)瑞, 葉邦策, 王蘭州, 方志剛, 樸美花 申請(qǐng)人:中國(guó)計(jì)量學(xué)院