專利名稱：克倫特羅快速半定量檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測克倫特羅(clenbuterol，CLB)方法。
背景技術(shù)：
克倫特羅又稱鹽酸克倫特羅，或克喘素，俗稱“瘦肉精”，本用于治療哮喘等疾病，在發(fā)現(xiàn)它能顯著提高動物的產(chǎn)量和瘦肉率之后，曾一度作為飼料添加劑廣泛用于畜牧業(yè)。但是，它毒性大，易在動物組織中殘留，人們常因食入其動物食品而引起中毒。我國雖繼歐美之后，1997年禁止它在飼料中使用，但由于受經(jīng)濟利益驅(qū)使，違法濫用現(xiàn)象仍然存在。據(jù)農(nóng)業(yè)部在網(wǎng)上公布的資料，一些不法商販把克倫特羅制成小包裝零售或與飼料搭配銷售，違法銷售轉(zhuǎn)入地下，更趨隱蔽。因此，在抓緊源頭控制的時，必須加強其安全檢測。
對克倫特羅殘留的檢測目前主要采用高效液相色譜法(HPLC)、氣質(zhì)聯(lián)用法(GC-MS)和酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)。GC-MS法和HPLC法靈敏、準確，檢測下限可達0.25ng/mL，但由于這兩種方法需要貴重儀器、樣品前處理繁瑣、分析速度慢，需要幾小時至幾十小時、檢測樣品量少，難以對批量樣品進行檢測，需受過專門訓練的人員才能操作、檢測費用高，幾百上千元/樣，所以應(yīng)用面窄，僅以一些重要的衛(wèi)生防疫和質(zhì)量檢驗監(jiān)督部門采用為主，通常對初步檢測為陽性的樣品確認時采用。ELISA法是目前研究較多的克倫特羅檢測方法，具有靈敏度高，檢測量大，樣品前處理簡單，比儀器分析時間短、成本低，檢測下限可達0.09ng/mL以下。歐美多家公司已有ELISA試劑盒投放市場，如英國Randox公司的試劑盒銷往全球。但該方法仍需酶標儀等部分設(shè)備，分析時間1-3小時，難以在現(xiàn)場采用。
為克服其缺點，使對克倫特羅的檢測更方便、時間更短、成本更低，一些單位開展了膠體金檢測試紙研究，并有“鹽酸克倫特羅快速檢測試紙條”、“一種免疫層析一步法檢測腎上腺素激動劑類藥物的方法及試紙的制備”的報道，這兩則報道所描述的技術(shù)只能定性檢測，不能半定量檢測，且組合線只有2條，而本申請所描述的試紙，為半定量試紙，加有延長部分或增厚部分，組合線數(shù)2-4條。另外也有“半定量快速檢測鹽酸克倫特羅的膠體金試紙條及生產(chǎn)和使用方法”的報道，其與本申請不同之處在于第一、其無參考線；第二、在使用方法上，其樣品中鹽酸克倫特羅含量越高，檢測線顯色條數(shù)多，而本申請的所描述的試紙，樣品中克倫特羅含量越高，檢測線顏色越淺，檢測線顯色條數(shù)越少。以上幾則其他研究者的報道，在膠體金標記部分和檢測反應(yīng)部分之間都無任何其他材料，而本申請所描述的試紙在膠體金標記部分和檢測反應(yīng)部分之間加有延長部分，或在膠體金標記部分之下或之上加有增厚部分。因此，本申請克服了上述幾則報道的缺點，研制出了克倫特羅半定量檢測試紙。

發(fā)明內(nèi)容
本設(shè)計的目的研制出簡便、靈敏、價格低廉的克倫特羅快速半定量檢測方法。
現(xiàn)結(jié)合附圖對發(fā)明進行說明附

圖1為本發(fā)明的結(jié)構(gòu)示意圖。圖中1為樣液吸收部分、2為膠體金標記部分、3為檢測反應(yīng)部分、4為檢測線、5為參考線、6為吸水部分。它們按照下列次序粘貼在背襯上樣液吸收部分、膠體金標記部分、檢測反應(yīng)部分、吸水部分。膠體金標記部分為玻璃纖維或醋酸纖維或尼龍膜，其上標記的物質(zhì)為第二種屬動物蛋白與克倫特羅抗體的混合物，或第二種屬動物蛋白與克倫特羅檢測用抗原的混合物?；旌衔锏幕旌戏椒ǖ诙N屬動物蛋白與克倫特羅抗體或抗原的混合比例以標準的克倫特羅樣品為標準，當陰性樣品檢測時，參考線和檢測線剛好出現(xiàn)肉眼可見的紅色為準。檢測反應(yīng)部分上面包被有克倫特羅檢測用抗原1～3條作為檢測線，或包被有克倫特羅抗體1～3條作為檢測線，同時還包被有抗第二種屬動物蛋白的IgG 1～3條作為參考線。檢測線和參考線組合時不能同時多于1條，組合線條數(shù)為2～4條，組合方式為1條檢測線和1條參考線、1條檢測線和2條參考線、1條檢測線和3條參考線、2條檢測線和1條參考線、3條檢測線和1條參考線五種形式。根據(jù)半定量檢測的準確度要求，組合線數(shù)越多，半定量越準確。
當膠體金標記部分標記對象為第二種屬動物蛋白和克倫特羅抗體混合物時，為了提高檢測試紙的靈敏度，在膠體金標記部分和檢測反應(yīng)部分之間用玻璃纖維紙或濾紙或吸水紙加有延長部分或在膠體金標記部分之上或之下加有增厚部分。
其中檢測用抗原是指克倫特羅與蛋白質(zhì)類物質(zhì)或多糖類物質(zhì)形成的偶合物，所說蛋白質(zhì)為牛血清白蛋白、匙孔血、藍蛋白、卵清白蛋白。多糖為葡聚糖、殼聚糖、纖維素。在用膠體金標記抗原時此混合物作為標記的對象，或在用膠體金標記抗體時此混合物作為檢測線上的包被物質(zhì)；第二種屬動物蛋白指非抗體來源屬動物的蛋白。
本發(fā)明所描述的試紙的各部分處理與功能如下背襯為一面涂有不干膠的不吸水的韌性材料，起固定支持試紙其他組成部分的作用。
樣液吸收部分制備將濾紙或玻璃纖維紙浸入pH7.0～8.4的PBS中2min，取出，80℃烘干或其他方式干燥，即作為樣液吸收部分，檢測時起吸收樣品溶液的作用，便于樣品溶液向上移動。
膠體金標記部分的制備該部分起固定膠體金標記的抗原或抗體的作用。制備步驟包括膠體金溶膠的制備、膠體金標記克倫特羅抗體或克倫特羅抗原、膠體金標記部分處理。
(1)膠體金溶膠的制備將氯金酸(HAuCL4)用超純水配置成1％的母液，取1mL的母液，用超純水定容到100mL，配成0.01％的溶液，加熱至沸騰，加入1～5mL的1％檸檬酸三鈉水溶液，繼續(xù)加熱到出現(xiàn)透明的橙紅色為止，即為膠體金溶膠。
(2)膠體金標記克倫特羅抗體將克倫特羅單克隆抗體或多克隆抗體和第二種屬動物蛋白分別用PBS(0.01mol/L，pH7.0～7.5)溶解稀釋至2～4mg/mL，每100mL膠體金溶膠加入1～3mL 2～4mg/mL的克倫特羅抗體和1～1.5mL 2～4mg/mL第二種屬動物蛋白，震蕩2min，用0.2mol/L的K2CO3調(diào)節(jié)pH至8.4，振蕩5min，加入11％PEG-10000 2mL，振蕩5min，8000～15000r/min離心15min，除去上清，用PBS(0.01mol/L，pH7.0～7.5)復溶，以6000～13000r/min離心15min，除去上清，將沉淀用PBS(0.01mol/L，pH7.0～7.5)稀釋500～2000倍，產(chǎn)物作為金標克倫特羅抗體(GAb)。
(3)膠體金標記克倫特羅抗原將克倫特羅檢測用抗原和第二種屬動物蛋白分別用PBS(0.01mol/L，pH7.0～8.4)溶解稀釋至2～4mg/mL，每100mL膠體金溶膠加入1～3mL 2～4mg/mL的檢測用抗原和1～1.5mL 2～4mg/mL第二種屬動物蛋白，震蕩2min，用0.2mol/L的K2CO3調(diào)節(jié)pH至8.4，振蕩5min，加入11％PEG-100002mL，振蕩5min，8000~15000r/min離心15min，除去上清，用PBS(0.01mol/L，pH7.0～7.5)復溶，以6000～13000r/min離心15min，除去上清，將沉淀用PBS(0.01mol/L，pH7.0～7.5)稀釋500～2000倍，產(chǎn)物作為金標記的克倫特羅抗原(GAg)。
(4)膠體金標記部分處理將GAb或GAg倒入一槽中，將玻璃纖維紙或濾紙浸入1min，取出，室溫干燥后，即作為膠體金標記部分。
檢測反應(yīng)部分制備用0.8％的戊二醛溶液或0.2％的碳二亞胺溶液浸泡硝酸纖維膜或醋酸纖維膜或尼龍膜30min，取出，37℃烘干，上邊包被1～3條不同濃度的克倫特羅檢測用抗原線或克倫特羅抗體線作為檢測線，同時包被1～3條不同濃度的抗第二種屬動物蛋白的IgG線作為參考線。當膠體金標記部分標記對象為第二種屬動物蛋白和克倫特羅抗體混合物時，檢測線則包被克倫特羅檢測用抗原；當膠體金標記部分標記對象為第二種屬動物蛋白和克倫特羅檢測用抗原混合物時，檢測線則包被克倫特羅抗體；檢測線和參考線不能同時多于1條，組合線數(shù)2～4條。此即為檢測反應(yīng)部分，該部分主要作用是將反應(yīng)結(jié)果以肉眼可見的顏色表征出來。
吸水部分制備將玻璃纖維紙或濾紙或吸水紙室溫干燥后，即作為吸水部分。該部分主要作用在于將移動上來的多余的樣品溶液吸收。
延長部分或增厚部分的制備將玻璃纖維紙或濾紙或吸水紙室溫干燥后，加在膠體金標記部分和檢測反應(yīng)部分之間，即為延長部分；覆蓋在膠體金部分之上或粘貼在膠體金部分之下背襯之上，即為增厚部分。
試紙組裝在背襯上依次粘貼樣液吸收部分、膠體金標記部分、延長部分、檢測反應(yīng)部分和吸水部分，即成克倫特羅半定量檢測試紙。當膠體金標記部分標記對象為克倫特羅抗體和第二種屬動物蛋白時，背襯上增加粘貼延長部分或增厚部分。
檢測原理檢測原理因膠體金標記的對象不同，而稍有差異。
當膠體金標記部分的標記物為第二種屬動物蛋白和克倫特羅抗體混合物時，如果樣品中含有克倫特羅，樣品溶液被試紙的樣液吸收部分吸收并通過毛細作用上移到達膠體金標記部分，樣品溶液中的克倫特羅與膠體金標記的克倫特羅抗體反應(yīng)形成結(jié)合物，結(jié)合物繼續(xù)上移到檢測線，因膠體金標記的克倫特羅抗體只有一個結(jié)合位點，樣品溶液中的克倫特羅與之結(jié)合后，檢測線上的檢測用抗原就不能再與膠體金標記的克倫特羅抗體結(jié)合，于是檢測線無色；當樣品中沒有克倫特羅時，膠體金標記的克倫特羅抗體到達檢測線時被檢測用抗原捕獲，則形成肉眼可見紅色，此即為陰性。無論樣品中是否含有克倫特羅，膠體金標記的第二種屬動物蛋白上移到達參考線時都可被參考線上包被的抗第二種屬動物蛋白的IgG捕獲形成肉眼可見的紅色，此即為參考線。
當膠體金標記部分的標記物為第二種屬動物蛋白和克倫特羅檢測用抗原混合物時，如果樣品中含有克倫特羅，樣品溶液被試紙的樣液吸收部分吸收并通過毛細作用上移，樣品中的游離克倫特羅分子量小移動速度快，先到達檢測線，先與檢測線上包被的克倫特羅抗體結(jié)合，因檢測線上包被的克倫特羅抗體只有一個結(jié)合位點，而且樣品中游離的克倫特羅結(jié)合能力比偶合態(tài)的克倫特羅檢測用抗原強，于是膠體金標記的檢測用抗原不能再被檢測線上的克倫特羅抗體捕獲，于是檢測線無色，此即為陽性；如果樣品中無克倫特羅，則膠體金標記的克倫特羅檢測用抗原到達檢測線后就被檢測線上包被的克倫特羅抗體捕獲，形成肉眼可見的紅色，此即為陰性。無論樣品中是否含有克倫特羅，膠體金標記的第二種屬動物蛋白上移到達參考線時都可被參考線上包被的抗第二種屬動物蛋白的IgG捕獲形成肉眼可見的紅色，此即為參考線。
以上兩種方式的試紙，可以通過調(diào)節(jié)檢測線和參考線包被物濃度，調(diào)節(jié)顯色深淺，通過設(shè)置多條組合線，并將組合線顏色或顯色條數(shù)與標準物質(zhì)濃度對應(yīng)起來，即可達到半定量檢測目的。
使用方法(1)1條檢測線+1條參考線形式的試紙檢測線包被有濃度為0.1-30μg/mL的克倫特羅單克隆抗體或克倫特羅檢測用抗原1條，寬1mm；參考線包被有濃度為0.01-30μg/mL的抗第二種屬動物蛋白的IgG 1條，寬1mm；兩條線之間間隔2-6mm。當檢測線顏色與參考線顏色相同時，則樣品為陰性；當檢測線與參考線顏色相同時，則樣品為陽性，濃度大于Ang/mL，A為設(shè)定的檢測限，可以是大于或等于0.1ng/mL的某一濃度。參考線始終顯色，若參考線不顯色，表明試紙失效。
(2)2條檢測線+1條參考線形式的試紙2條檢測線包被有0.01-30μg/mL克倫特羅單克隆抗體或克倫特羅檢測用抗原，第2條檢測線上包被物的濃度小于第1條檢測線參考線包被物濃度；參考線包被有濃度為0.01-30μg/mL的抗第二種屬動物蛋白的IgG，寬1mm；各條線之間間隔2-6mm。當兩條檢測線都呈現(xiàn)顏色時，則樣品為陰性；當檢測線第1條檢測線呈色，第2條檢測線不呈色時，則樣品中克倫特羅濃度大于Ang/mL，小于Bng/mL；當兩條檢測線都不呈色時，樣品中克倫特羅濃度大于Bng/mL。A、B為設(shè)定的檢測限，可以是大于或等于0.1ng/mL的某一濃度。參考線始終顯色，若參考線不顯色，表明試紙失效。
(3)3條檢測線+1條參考線形式的試紙3條檢測線包被有0.01-30μg/mL克倫特羅單克隆抗體或克倫特羅檢測用抗原，三條檢測線上包被物的濃度依次遞減；參考線包被有濃度為0.01-30μg/mL的抗第二種屬動物蛋白的IgG；各條線之間間隔2-6mm。當3條檢測線都呈現(xiàn)顏色時，則樣品為陰性；當檢測線第1，2條檢測線呈色，第3條檢測線不呈色時，則樣品中克倫特羅濃度大于Ang/mL，小于Bng/mL，當?shù)?條檢測線呈色，第2，3條檢測線都不呈色時，樣品中克倫特羅濃度大于Bng/mL，小于Cng/mL；當3條檢測線都不呈色時，樣瓶中克倫特羅含量大于Cng/mL；A、B、C為設(shè)定的檢測限，可以是大于或等于0.1ng/mL的某一濃度，B大于A，C大于B。參考線始終顯色，若參考線不顯色，表明試紙失效。
(4)1條檢測線+3條參考線檢測線上包被有0.01-30μg/mL克倫特羅單克隆抗體或克倫特羅檢測用抗原，檢測線之后包被有3條參考線，參考線包被有濃度為0.01-30μg/mL的抗第二種屬動物蛋白的IgG，調(diào)節(jié)參考線包被物濃度和膠體金標記的第2種屬動物蛋白的標記濃度，使3條參考線的顏色分別與標準樣品中克倫特羅含量為C、B、Ang/mL時檢測線的顏色相同，依此確定參考線包被物濃度；各條線之間間隔2-6mm；當檢測線顏色深于第3條參考線顏色時，表明樣品為陰性；當檢測線顏色深于第3條參考線顏色淺于第2條檢測時，表明樣品中克倫特羅濃度大于Ang/mL，小于Bng/mL；當檢測線顏色深于第2條參考線顏色淺于第1條參考線時，表明樣品中克倫特羅濃度大于Bng/mL，小于Cng/mL；當檢測線不呈色時，表明樣品中克倫特羅濃度大于Cng/mL。
(5)1條檢測線+2條參考線檢測線上包被有0.01-30μg/mL克倫特羅單克隆抗體或克倫特羅檢測用抗原，檢測線之后包被有2條參考線，參考線包被有濃度為0.01-30μg/mL的抗第二種屬動物蛋白的IgG，調(diào)節(jié)參考線包被物濃度和膠體標記的第2種屬動物蛋白的標記濃度，使2條參考線的顏色分別與標準樣品中克倫特羅含量為B、Ang/mL時檢測線的顏色相同，依此確定參考線包被物濃度；各條線之間間隔2-6mm；當檢測線顏色深于第2條參考線顏色時，表明樣品為陰性；當檢測線顏色深于第2條參考線顏色淺于第1條檢測時，表明樣品中克倫特羅濃度大于Ang/mL，小于Bng/mL；當檢測線顏色深于第1條參考線顏色淺于第1條參考線時，表明樣品中克倫特羅濃度大于Bng/mL。
本發(fā)明優(yōu)點①特異性強。由于采用了高質(zhì)量的克倫特羅單克隆抗體，該試紙檢測特異性極強，與腎上腺素、去甲腎上腺素等結(jié)構(gòu)相似物質(zhì)和土霉素、金霉素、泰樂菌素、有機鉻、磺胺二甲基嘧啶、鹽酸溴己新、氯霉素、乙氧酰胺苯甲酯、萊克多巴胺、北里霉素、氟苯化考、甲砜霉素等常用獸藥及飼料添加劑無交叉反應(yīng)，可避免假陽性。
②靈敏度高。本試紙檢測下限可達到0.09ng/mL，也可根據(jù)檢測要求在制備試紙時提高檢測下限到0.09ng/mL以上某濃度，避免了假陽性和假陰性，使結(jié)果保證可靠。
③準確性好，能夠半定量。用本試紙檢測結(jié)果與德國r-Biopharm公司ELISA試劑盒以及儀器分析的檢測結(jié)果相關(guān)性完全符合要求。根據(jù)檢測線顏色與參考線顏色對比或根據(jù)檢測線呈色條數(shù)達到半定量檢測目的。
④操作特別方便，無須任何儀器設(shè)備，適用面寬。本試紙不需任何專業(yè)培訓，不需任何儀器設(shè)備，普通人員即可操作，只要將試紙插入檢測液中，用肉眼判讀。各種樣品均可方便地進行測定。因此，本試紙適用面寬，衛(wèi)生檢驗監(jiān)督部門、動物養(yǎng)殖單位、屠宰場以及消費者個人均可使用。
⑤檢測速度快，顏色穩(wěn)定時間長。試紙插入樣液中，若為陰性，30s開始顯色，2min以后便可觀察結(jié)果，比目前普遍使用的克倫特羅ELISA試劑盒檢測速度快40～160倍以上，并且其顏色可永久保存。
⑥檢測溫度適宜范圍寬。在4～40℃均可使用，結(jié)果正常，不需在低溫下進行，不需采取保溫措施，室內(nèi)野外均可使用。
⑦試紙保質(zhì)期長。據(jù)加速老化試驗結(jié)果，試紙保質(zhì)期可達2年。
⑧成本低廉本試紙法檢測成本大大低于克倫特羅ELISA試劑盒檢測法，隨著規(guī)模化生產(chǎn)后，其成本還會大幅度降低。
具體實施例實施例11條檢測線+2條參考線試紙檢測豬尿中的克倫特羅1、克倫特羅偶合抗原合成克倫特羅偶合抗原分為免疫用抗原和檢測用抗原，前者用于免疫動物，后者用于抗體制備中抗體的檢測篩選和試紙制備中的膠體金標記或檢測線包被。
免疫用抗原制備精確稱取克倫特羅22mg，溶解于2mL，pH1.5～2.0的鹽酸溶液中。加入pH2.0的亞硝酸鈉溶液2mL，反應(yīng)20min。同時稱取100mg牛血清蛋白溶解于5mL pH7.4，0.1mol/L的磷酸緩沖溶液中，將反應(yīng)好的克倫特羅重氮鹽加入其中，用1mol/L的氫氧化鈉調(diào)pH值至7.5，4℃下反應(yīng)12小時后。將此反應(yīng)液用pH7.4，0.01mol/L的PBS溶液透析，分裝為免設(shè)用抗原。
檢測用抗原制備采用卵清白蛋白替換牛血清白蛋白，其余步驟同免疫用抗原制備，所得產(chǎn)物即作為檢測用抗原。
2、克倫特羅單克隆抗體制備取健康5周齡雌性二級Balb/c小鼠6只進行免疫。第一次基礎(chǔ)免疫將0.1mL克倫特羅免疫用抗原與等量完全弗氏佐劑用攪拌器充分混勻乳化，進行腹腔注射，注射量0.2mL/只。四周后開始進行加強免疫，佐劑換為不完全弗氏佐劑，每隔兩周加強免疫一次，末次免疫3d后取脾臟融合。
先將HAT培養(yǎng)液、IMDM不完全培養(yǎng)液、IMDM完全培養(yǎng)液和50％PEG-6000溶液于37℃水浴中預(yù)溫，同時將另一盛水的燒杯放入37℃水浴中預(yù)溫。將上述制備好的脾細胞和骨髓瘤細胞和脾細胞按1∶5的比例混合，在50mL塑料離心管內(nèi)用不完全培養(yǎng)液洗1次，1 200r/min離心8min，棄上清，用滴管吸凈殘留液體。置37℃水浴中，將吸管插入管底，在90s內(nèi)邊攪拌邊加入預(yù)熱的1mL、50％PEG-6000。靜置90s后，于37℃水浴中60s內(nèi)加入10mL預(yù)熱的完全培養(yǎng)液。輕輕懸浮一次，以1000r/min離心6min，棄去上清，先用6mL左右完全培養(yǎng)液輕輕懸浮。根據(jù)所用96孔培養(yǎng)板的數(shù)量，補加HAT培養(yǎng)液到76.8mL，輕輕混勻，將混勻懸液接種于有飼養(yǎng)細胞的96孔板中，每孔0.1mL，一次接種8塊板。將培養(yǎng)板置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。融合后7d，用HT培養(yǎng)液半量換液1次，在13d后根據(jù)增殖情況改用20％NBS的完全培養(yǎng)液。約7d后出現(xiàn)雜交瘤細胞集落，細胞大、圓且透亮。待集落長至孔底1/3時，在培養(yǎng)板的蓋板上畫上克隆生長的標記，此時即可取上清檢測相應(yīng)的特異性抗體。細胞完全克隆化后，將細胞注入小鼠腹腔，間隔一段時間等腹水足夠多時，取腹水，將腹水用蛋白A免疫親和層析純化后，即得到克倫特羅單克隆抗體。
3、樣液吸收部分處理將濾紙或玻璃纖維紙等浸入0.1mol/L pH7.4的PBS中2min，取出，80℃烘干或其他方式干燥，即成樣液吸收部分。
4、膠體金標記部分的制備和處理膠體金標記部分的制備和處理包括膠體金溶膠制備、膠體金標克倫特羅抗體、膠體金標記部分處理。
膠體金溶膠制備將氯金酸(HAuCL4)用超純水配置成1％的母液，取1mL的母液，用超純水定容到100mL，配成0.01％的溶液，加熱至沸騰，加入一定量的1％檸檬酸三鈉水溶液，繼續(xù)加熱到出現(xiàn)透明的橙紅色為止，即為膠體金溶膠。
膠體金標記克倫特羅單克隆抗體制備將克倫特羅單克隆抗體和豬血清白蛋白分別用PBS(0.01mol/L，pH7.0～7.5)溶解稀釋至3mg/mL，每100mL膠體金溶膠加入1mL 4mg/mL的克倫特羅單克隆抗體和1mL 2mg/mL豬血清白蛋白，震蕩2min，用0.2mol/L的K2CO3調(diào)節(jié)pH至8.4，振蕩5min，加入11％PEG-10000 2mL，振蕩5min，15000r/min離心15min，除去上清，用PBS(0.01mol/L，pH7.4)復溶，以6000～13000r/min離心15min，除去上清，將沉淀用PBS(0.01mol/L，pH7.5)稀釋1000倍，產(chǎn)物作為金標克倫特羅單克隆抗體。
膠體金標記部分處理將金標克倫特羅單克隆抗體倒入一槽中，將玻璃纖維紙或濾紙浸入1min，取出，室溫干燥或真空冷凍干燥，即成為膠體金標記部分。
5、檢測反應(yīng)部分處理用0.8％的戊二醛溶液或0.2％的碳二亞胺溶液浸泡硝酸纖維膜30min，取出，37℃烘干，上邊用噴涂機噴涂包被1條克倫特羅檢測用抗原線作為檢測線，濃度為3μg/mL；包被2條羊抗豬血清白蛋白的IgG線作為參考線，靠近下端的濃度為2μg/mL，另一條為1μg/mL。此即為檢測反應(yīng)部分。
6、延長部分的處理將玻璃纖維紙室溫干燥后，即作為延長部分。
7、吸水部分處理將吸水紙室溫干燥后，即作為吸水部分。
8、試紙組裝在背襯上依次粘貼樣液吸收部分、膠體金標記部分、延長部分、檢測反應(yīng)部分和吸水部分，即成克倫特羅半定量檢測試紙。
9、檢測尿樣直接作為檢測液使用。將試紙條直接插入檢測液，2min后，觀察顏色。若2條檢測線都呈現(xiàn)顏色，表明樣品為陰性；若第1條檢測線呈色，第2條不呈色，則表明樣品中克倫特羅含量為1ng/mL；若第1條檢測線與第2條檢測線都不呈色，則表明樣品中克倫特羅含量為5ng/mL。無論樣品中克倫特羅含量如何，參考線應(yīng)該顯色，若參考線不顯色，表明試紙失效。
其他形式的試紙制備以及其他種類的樣品檢測與實施例1類似。
權(quán)利要求
1.克倫特羅快速半定量檢測方法，在試紙的背襯上，粘有樣液吸收部分、膠體金標記部分、檢測反應(yīng)部分及吸水部分，其特征在于膠體金標記部分標記的物質(zhì)為第二種屬動物蛋白與克倫特羅抗體的混合物，或第二種屬動物蛋白與克倫特羅檢測用抗原的混合物，檢測反應(yīng)部分上面包被有克倫特羅檢測用抗原1-3條作為檢測線、或包被有克倫特羅抗體1-3條作為檢測線，同時包被有抗第二種屬動物蛋白的IgG 1-3條作為參考線，檢測線和參考線不能同時多于1條，組合線數(shù)為2-4條。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所說的檢測方法，其特征在于克倫特羅檢測用抗原為克倫特羅與蛋白質(zhì)類物質(zhì)或多糖類物質(zhì)形成的偶合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征在于第二種屬動物蛋白為指非抗體來源屬動物的蛋白。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所說的檢測方法，其特征在于所說的蛋白質(zhì)物質(zhì)為牛血清白蛋白、匙孔血藍蛋白、卵清白蛋白。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所說的檢測方法，其特征在于所說的多糖類物質(zhì)為葡聚糖、殼聚糖、纖維素。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所說的檢測方法，其特征為檢測線和參考線的組合方式為1條檢測線和1條參考線、1條檢測線和2條參考線、1條檢測線和3條參考線、2條檢測線和1條參考線、3條檢測線和1條參考線5種形式。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測方法，其特征是當膠體金標記部分標記對象為克倫特羅抗體和第二種屬動物蛋白時，膠體金標記部分和檢測反應(yīng)部分之間加有延長部分，或在膠體金標記部分之下或之上加有增厚部分。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種檢測克倫特羅半定量快速檢測方法。本方法在試紙的背襯上依次粘貼有樣液吸收部分、膠體金標記部分、檢測反應(yīng)部分及吸水部分。檢測反應(yīng)部分上包被有克倫特羅抗體1－3條或檢測用抗原1－3條作為檢測線，同時包被有抗第二種屬動物蛋白的IgG1－3條作為參考線，組合時檢測線和參考線不能同時多于1條，組合線條數(shù)為2－4條。該快速檢測試紙條特異性強、靈敏度達到0.09ng/mL、4－40℃都可使用，2min以后便可觀察結(jié)果，適合于衛(wèi)生、質(zhì)監(jiān)、海關(guān)、肉品加工廠、家畜養(yǎng)殖場等單位或個人對飼料、肉類、尿液、乳品等樣品中的克倫特羅進行快速檢測。
文檔編號G01N33/558GK1547024SQ20031011242
公開日2004年11月17日 申請日期2003年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月3日
發(fā)明者孫遠明, 雷紅濤, 潘科, 黃麗, 黃曉鈺, 諶國蓮, 吳青 申請人:華南農(nóng)業(yè)大學