專利名稱：一種新型人腦紅蛋白檢測及診斷試劑盒，其制備方法及用途的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種免疫檢測及診斷試劑，具體涉及一種新型人腦紅蛋白酶聯免疫檢測及診斷試劑盒，還涉及其制備方法及用途。
背景技術：
腦紅蛋白(Neuroglobin，NGB)是體內除了血紅蛋白和肌紅蛋白之外的第三類重要的攜氧蛋白，在神經系統(tǒng)中特異表達，廣泛分布于腦組織內。和肌紅蛋白一樣，腦紅蛋白能可逆地結合氧，且與氧有很高的親和力。肌紅蛋白在正常人血清內含量極微，當心肌和骨骼肌損傷時，肌紅蛋白可從受損細胞釋放，快速入血，導致血清肌紅蛋白升高。肌紅蛋白已成為臨床上一些重要疾病如心肌梗塞、腎功能衰竭等敏感而又特異的生化診斷指標。腦紅蛋白和肌紅蛋白在功能和性質上具有嚴格的相似性腦紅蛋白有151個氨基酸，分子量為17千道爾頓，而肌紅蛋白則有154個氨基酸，分子量也為17千道爾頓。鑒于腦紅蛋白與肌紅蛋白在功能上具有嚴格的相似性，即肌紅蛋白負責心肌和骨骼肌的氧供應，腦紅蛋白則負責腦的氧供應，兩者均能從損傷細胞中釋放入血，因此，腦紅蛋白在老年性癡呆、腦梗塞、創(chuàng)傷性腦損傷等涉及到神經元損傷和變性死亡等疾病的早期診斷中具有潛在的診斷價值，同時對上述疾病治療過程中的病程跟蹤也具有重要的參考價值。

發(fā)明內容
本發(fā)明提供了一種新型人腦紅蛋白酶聯免疫測定試劑盒。該試劑盒是由96孔酶標板一塊，腦紅蛋白標準品1瓶、腦紅蛋白單克隆抗體1瓶，腦紅蛋白多克隆抗體1瓶、辣根過氧化物酶(HRP)-羊抗兔免疫球蛋白(IgG)1瓶、鄰苯二胺(OPD)2瓶、20倍的濃縮洗滌液1瓶終止液(2M的硫酸溶液(H2SO4))1瓶組成。其中HRP-羊抗兔IgG為中山公司產品。本發(fā)明還公開了試劑盒的制備方法、使用方法及其用途。
用途 本試劑盒具有較高的靈敏度，可用于檢測樣品中腦紅蛋白的含量，并可為老年性癡呆、腦梗塞、創(chuàng)傷性腦損傷等涉及到神經元損傷和變性死亡等疾病中的早期診斷及治療過程中的病程跟蹤提供有效的檢測手段。
制備方法 本試劑盒的使用需要以下自備試劑1)包被稀釋液(0.05mol/L碳酸鹽緩沖液，pH9.6)Na2CO31.5g+NaHCO32.9g溶于雙蒸水，加雙蒸水補充體積至1000ml。
2)磷酸鹽緩沖液(PBS，0.02M，pH7.4)NaCl 16.0g+NaH2PO4·2H2O 0.593g+Na2HPO4·12H2O 5.8g，加雙蒸水至2000ml。
3)樣本稀釋液PBS 100ml+0.1g BSA+50μl Tween 20。
4)封閉液(5％脫脂乳-PBS溶液)50g脫脂乳+PBS至1000ml。
5)底物緩沖液A液(0.1mol/L檸檬酸溶液)檸檬酸19.2g，加雙蒸水至1000ml；B液(0.2mol/L Na2HPO4)Na2HPO4·12H2O 71.7g，加雙蒸水至1000ml；臨用前取A液24.3ml、B液25.7ml混合。
6)30％H2O2500ml。
本試劑盒具體的制備方法1)抗原的制備將構建有腦紅蛋白基因編碼區(qū)的原核表達載體pGEX-4T-2轉化大腸桿菌BL21，通過異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-1-thio-D-galactopyranoside，IPTG)誘導表達，獲得可溶性表達產物，用谷胱甘肽S-轉移酶(GST)親和層析柱純化后作為抗原(圖1，圖2)。
2)抗體的制備將1)中制備的抗原免疫Balb/c小鼠，通過傳統(tǒng)的細胞融合方法制備抗NGB單克隆抗體，同時免疫家兔制備抗NGB多克隆抗體(圖3，圖4)。
3)抗體的純化將2)中所得的抗體經離心、沉淀、脫鹽、得粗提抗體，然后經Protein G柱親和純化，即得純化抗體。
4)試劑盒的制備將試劑盒8種成份，按試劑盒需要量分裝在小瓶或尖底離心管中。
5)鑒定試劑盒的特異性、靈敏度、精密度、穩(wěn)定性合格(圖7)。
使用方法 本試劑盒的使用方法如下1)抗體的包被將包被液稀釋的抗腦紅蛋白的單克隆抗體(10μg/ml)加入96孔酶標板中，每孔100μl，4℃過夜，洗滌液洗滌1次，每次3分鐘。加入封閉液200μl/孔，40℃封閉50～60分鐘(或4℃過夜)。封閉結束后用洗滌液洗板3次，每次3分鐘。
2)加入樣品將含有通過0.1％ BSA和0.05％吐溫(Tween)20樣品稀釋液適當稀釋的待測樣品和標準NGB蛋白(5.76ng/ml、28.8ng/ml、144ng/ml、720ng/ml、3.6μg/ml、18μg/ml)分別加入酶標反應板(100μl/孔)，置于40℃溫箱孵育1小時。棄去孔中液體，洗滌液洗板3次，每次3分鐘。
3)加入兔抗腦紅蛋白多克隆抗體取含有0.1％ BSA和0.05％吐溫20樣品稀釋液最適稀釋的兔抗腦紅蛋白多克隆抗體(1∶500)，加入酶標板中(100μl/孔)，置于40℃溫箱孵育30分鐘。棄去孔中液體，洗滌液洗板3次，每次3分鐘。
4)加入HRP-羊抗兔IgG取最適稀釋HRP-羊抗兔IgG(1∶5000)，加入酶標板中100μl/孔，置于40℃溫箱孵育40分鐘。棄去孔中液體，洗滌液洗板3次，每次3分鐘。
5)顯色取底物液A液24.3ml和B液25.7ml混合，加入鄰苯二胺至濃度4～10mg/ml，最后加入30％H2O2溶液25～50μl。取新鮮配制的底物緩沖液100μl/孔加入反應板。室溫避光反應5～10分鐘。
6)終止反應當陽性對照出現明顯顏色變化或陰性對照略有顯色時，每孔加入終止液50μl終止反應。
7)結果計算在492nm處測定光吸收值(A)。以標準蛋白濃度作為橫坐標，測得的標準蛋白孔A492nm值為縱坐標，繪制標準曲線。通過標準曲線查得待測樣品的腦紅蛋白含量，再乘以稀釋倍數，即得待測樣品中的實際含量。


圖1融合蛋白GST-NGB的表達結果。泳道1轉染空載體pGEX-4T-2后大腸桿菌E.coli(DE3)中表達的總蛋白；泳道2用GST親和柱純化轉染空載體pGEX-4T-2后大腸桿菌E.coli(DE3)中表達的蛋白，獲得GST蛋白樣品。泳道3轉染表達載體pGEX-4T-2/NGB后大腸桿菌E.coli(DE3)中表達的總蛋白；泳道4用GST親和柱純化獲得的GST-NGB融合蛋白；泳道5蛋白質中分子量標記。
圖2GST-NGB經過凝血酶酶切后，得到的NGB蛋白。泳道1蛋白質中分子量標記；泳道2GST-NGB經過凝血酶酶切后，得到的NGB樣品。
圖3小鼠抗NGB單克隆抗體的質量鑒定。應用Western blotting技術對獲得的單抗進行檢測，證明單克隆抗體具有很高的特異性，各株抗體均能與NGB和GST-NGB結合，而與GST及菌體蛋白無反應，而且特異性地檢測到NGB的真核表達產物(GFP-NGB)。
圖4本試劑盒中所制備的小鼠抗NGB單克隆抗體的亞型鑒定。經鑒定，確認四株抗NGB單克隆抗體3G8，3H2，2E7，1E12的重鏈均為IgG1，輕鏈為κ鏈。
圖5兔抗NGB多克隆抗體的質量鑒定兔抗NGB多克隆抗體能夠檢測到真核細胞中表達的NGB蛋白。方法分別用表達載體pcDNA3.1/V5/6×His/NGB、pcDNA3.1/V5/6×His/LacZ和空載體轉染COS-7細胞后，收集轉染48h后的細胞總蛋白，Western blotting檢測。泳道1兔抗NGB多克隆抗體可檢測到約20kDa的條帶；泳道2陰性對照，空載體轉染COS7細胞用兔抗NGB多克隆抗體未能檢測到任何條帶；泳道3用抗6×His單克隆抗體可檢測到NGB-6×His融合表達蛋白；泳道4陽性對照用抗6×His單克隆抗體可檢測到LacZ-6×His融合表達蛋白。
圖6兔抗NGB多克隆抗體的質量鑒定。用本試劑盒中所制備的兔抗NGB多克隆抗體檢測NGB在成年大鼠腦中的組織分布，可見NGB免疫反應陽性細胞廣泛分布于海馬的各區(qū)(CA1、CA2、CA3、CA4)錐體細胞層和小腦蒲肯野細胞及其細胞突起中。
圖7本試劑盒的標準曲線?？蓹z測NGB濃度的濃度范圍在5.76ng/ml～18μg/ml。
權利要求
1.一種新型人腦紅蛋白檢測及診斷試劑盒，其特征在于該試劑盒主要由96孔酶標板1塊，腦紅蛋白標準品1瓶、腦紅蛋白單克隆抗體1瓶，腦紅蛋白多克隆抗體1瓶、陰性對照1瓶、辣根過氧化物酶標記的羊抗兔免疫球蛋白G1瓶、鄰苯二胺2瓶、20倍濃縮洗滌液1瓶和終止液(2M硫酸溶液(H2SO4))1瓶組成。
2.權利要求1所述的試劑盒的制備方法，其特征在于包括如下步驟1)抗原的制備將構建有腦紅蛋白基因編碼區(qū)的原核表達載體轉化大腸桿菌，獲得可溶性表達產物，親和層析柱純化后作為抗原。2)抗體的制備將1)中制備的抗原免疫Balb/c小鼠，通過傳統(tǒng)的細胞融合方法制備抗腦紅蛋白單克隆抗體，同時免疫家兔制備抗腦紅蛋白多克隆抗體。3)抗體的純化將2)中所得的單克隆抗體經離心、沉淀、脫鹽、得粗提抗體，然后經親和純化，即得純化抗體。4)試劑盒的組裝將組成試劑盒的8種成份，按試劑盒需要量分裝在小瓶或尖底離心管中。5)鑒定試劑盒的特異性、靈敏度、精密度、穩(wěn)定性。
3.權利要求1所述的一種新型人腦紅蛋白檢測及診斷試劑盒，其特征在于所能夠檢測的腦紅蛋白的濃度范圍為5.76ng/ml～18μg/ml。
4.權利要求1所述的一種新型人腦紅蛋白檢測及診斷試劑盒，其特征在于其中所述的陰性對照液為正常人血清，濃洗滌液為磷酸-Tween-20。
5.權利要求1所述的一種新型人腦紅蛋白檢測及診斷試劑盒，在檢測腦紅蛋白中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新型人腦紅蛋白檢測及診斷試劑盒，其制備方法及用途。該試劑盒主要由固相載體以及腦紅蛋白的單克隆抗體、多克隆抗體和腦紅蛋白標準品等組成；該試劑盒的制備方法包括抗原和抗體的制備、抗體的純化、試劑盒的包裝等步驟。本試劑盒具有較高的靈敏度，可用于檢測樣品中腦紅蛋白的含量，并可為老年性癡呆、腦梗塞、創(chuàng)傷性腦損傷等涉及到神經元損傷和變性死亡等疾病中的早期診斷及治療過程中的病程跟蹤提供有效的檢測手段。
文檔編號G01N33/72GK1641351SQ20031011350
公開日2005年7月20日 申請日期2004年1月16日 優(yōu)先權日2004年1月16日
發(fā)明者張成崗, 陳婷方, 王春麗, 高艷, 孫建偉, 韓洪彥, 徐文琳, 王航雁 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所