專利名稱：一種檢測環(huán)境雌激素效應(yīng)的試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測環(huán)境雌激素效應(yīng)的試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù)：
隨著工農(nóng)業(yè)的飛速發(fā)展，大量無機物、有機物不斷被生產(chǎn)出來，環(huán)境作為人類和各種生物生存的基礎(chǔ)，隨時承載外界排放的廢棄物質(zhì)。20世紀(jì)60年代，人類就開始意識到這些有毒有害化學(xué)物質(zhì)對人類和生物所產(chǎn)生的各種不利影響，尤其是對水生生態(tài)環(huán)境的影響，因為大部分化學(xué)物質(zhì)的最終歸宿是水環(huán)境，途徑是直接排放或是通過水氣相互交換過程進(jìn)入水環(huán)境?；瘜W(xué)污染物不僅僅破壞自然資源的利用價值，例如DDTs會通過食物鏈危害各種水鳥和魚類的生存及繁衍，尤其是對那些高營養(yǎng)級種類，甚至通過大氣循環(huán)使得極地地區(qū)生物(如北極熊)同樣遭受到威脅，這最終會導(dǎo)致生態(tài)系統(tǒng)的崩潰，危害人類本身。
在這些化學(xué)物質(zhì)當(dāng)中，那些能夠以不同途徑干擾生物體正常內(nèi)分泌的物質(zhì)被稱為內(nèi)分泌干擾物(EDCs)，如引起雌激素效應(yīng)、抗雌激素效應(yīng)、雄激素效應(yīng)、抗雄激素效應(yīng)等的化學(xué)物質(zhì)。這些物質(zhì)的環(huán)境水平很低，對生態(tài)的危害作用只有通過長期暴露才能夠被觀察到，因此對人類的危害很難在短期內(nèi)加以判定。而一旦危害作用變得明顯，那么后果也就難以控制。這就要求建立一種早期的警報系統(tǒng)(生物標(biāo)志物)來作為環(huán)境污染導(dǎo)致的生態(tài)系統(tǒng)即將遭受破壞的信號。當(dāng)環(huán)境發(fā)生變化時，尤其是受到外源污染時，高水平的生化變化會先于早期的生物學(xué)變化，生物標(biāo)志物就可以從分子、細(xì)胞和組織水平上及時、準(zhǔn)確地反映整個生物體的生理參數(shù)、生化組成、細(xì)胞遺傳物質(zhì)的變化。因為不同組織之間的生物標(biāo)志物可以作為有毒物質(zhì)進(jìn)入有機體的預(yù)警信號，當(dāng)這種微觀變化累積到一定程度時即會引發(fā)機體的變異，從而使得建立一種早期的生物標(biāo)志物來及時反映生物體可能即將發(fā)生的生物學(xué)變化成為了可能。毒性試驗對于環(huán)境生物監(jiān)測(BM)來說，有著自身的局限性，這是因為它們不能合理解釋化學(xué)物質(zhì)在環(huán)境中的分配行為、代謝行為、吸附行為、積累行為以及本身和代謝后的毒理效應(yīng)。生物標(biāo)志物反應(yīng)與生物機體特征(如存活、繁殖)之間建立的一種特殊的聯(lián)系，將為生物標(biāo)志物在環(huán)境評價方面的應(yīng)用提供一個具有深遠(yuǎn)意義的基礎(chǔ)。
對于如何選擇監(jiān)測生物，既要根據(jù)分析目的選擇那些分布廣泛的物種，同時還要有一些其它方面的考慮。在水環(huán)境中，魚作為能量的傳遞者將能量從低營養(yǎng)級生物轉(zhuǎn)移到高營養(yǎng)級生物，同時可以被廣泛的捕獲。魚類對正確理解環(huán)境中有毒物質(zhì)在生物體內(nèi)的吸收、代謝行為以及引起的生理生化反應(yīng)有著重要意義，因此，魚類被選為環(huán)境監(jiān)測生物。大多數(shù)生物標(biāo)志物看起來可以直接應(yīng)用到某一種特定的魚體檢測，但考慮到不同魚類之間不同的生理學(xué)特征和環(huán)境污染引起不同的生物標(biāo)志物反應(yīng)，因此需要選擇多種類進(jìn)行檢測以相互補充，從而為正確評價生態(tài)環(huán)境提供可靠性數(shù)據(jù)。
從理論上來說，正常情況下一種污染物應(yīng)激就會引發(fā)一級生物學(xué)反應(yīng)，也就可以作為一種生物標(biāo)志物。而當(dāng)污染物水平超出一定界限(污染物劑量和暴露時間)時，污染物-劑量反應(yīng)就會脫離正常范圍，使得生物體在更高水平上顯示出多重作用效應(yīng)。這就需要對生物所受污染建立早期的預(yù)警系統(tǒng)。而生物標(biāo)志物可以看作是生物體受到一定毒理物質(zhì)暴露后產(chǎn)生的早期生理生化反應(yīng)，這從理論上可以作為生物反應(yīng)的指示器，為外部物質(zhì)暴露和體內(nèi)反應(yīng)之間搭建了橋梁。一般來說，細(xì)胞水平上的生物標(biāo)志物相對于生物學(xué)組織具有更普遍意義，因為對于生物體而言，各種生化反應(yīng)非常相似。因此好的生物標(biāo)志物應(yīng)該能夠靈敏、快速的反映生物體所發(fā)生的微妙變化。在健康風(fēng)險評價中，當(dāng)生物體受到環(huán)境外源污染物作用后，生物標(biāo)志物就可以用于闡明它們之間的因果關(guān)系、劑量-效應(yīng)關(guān)系等。一般認(rèn)為，生物標(biāo)志物是反映生物體受到外源污染與所發(fā)生的生理效應(yīng)中間的補償反應(yīng)。當(dāng)這些補償反應(yīng)開始發(fā)生后，有機體存活的可能性就開始下降。因為當(dāng)生物體遇到生存環(huán)境變動時，開始啟動的補償性反應(yīng)就已經(jīng)開始威脅生物體自身的安全了。利用生物標(biāo)志物進(jìn)行環(huán)境監(jiān)測最大的優(yōu)點就是它們可以為污染物所可能引起的后繼生物學(xué)變化提供有用信息，而不僅僅是量化環(huán)境污染物水平。
正常情況下，繁殖季節(jié)之前卵生雌性生物體內(nèi)雌激素水平升高，刺激肝細(xì)胞分泌卵黃蛋白原(Vitellogenin，VTG)，VTG通過血液循環(huán)進(jìn)入卵巢，在經(jīng)過濾泡細(xì)胞的吸收、轉(zhuǎn)運，最后由卵母細(xì)胞本身微絨毛的微胞飲作用攝入卵質(zhì)內(nèi)，分解形成卵黃磷蛋白和卵黃高磷蛋白，以作為胚胎發(fā)育的前期內(nèi)源營養(yǎng)和能量的來源。這個過程主要發(fā)生在卵母細(xì)胞發(fā)育的后期階段，同性腺大生長期時卵母細(xì)胞的體積急劇增大、卵黃的積累是一致的。其中雌激素起著一個重要的調(diào)節(jié)作用，即在性腺的發(fā)生、發(fā)育、配子的形成、成熟過程中起到激發(fā)、反饋調(diào)節(jié)內(nèi)分泌的作用。這一過程雄性生物體內(nèi)不會發(fā)生，但雄性生物肝細(xì)胞核內(nèi)仍然存在雌激素受體和VTG表達(dá)基因。當(dāng)環(huán)境中存在雌激素和類雌激素物質(zhì)時，就會以同樣的途徑刺激雄性生物肝細(xì)胞分泌VTG，由于缺少正常的代謝、分解途徑，異常產(chǎn)生的VTG就會在生物體內(nèi)(尤其是雄性生物)累積，阻礙正常的代謝。同時，雌/類雌激素物質(zhì)還會對生物體的正常內(nèi)分泌系統(tǒng)產(chǎn)生干擾作用，引發(fā)一系列的生理病變，并威脅到生物種群的繁衍和生態(tài)環(huán)境的健康、持續(xù)發(fā)展。而每種魚VTG分子量、結(jié)構(gòu)性征是不同的(已經(jīng)通過SDS-PAGE和Western blotting方法證實)，這說明了魚體所產(chǎn)生的VTG具有種(或?qū)?的特異性。這樣就需要針對不同種的魚類制備不同的特異性抗體，以用來準(zhǔn)確反映環(huán)境雌激素存在水平。鯽是一種分布廣、易捕獲、普遍性的魚類。
免疫系統(tǒng)作為針對侵入物質(zhì)的主要防御機構(gòu)，所有外源物質(zhì)(稱為抗原)均能夠刺激機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對性的應(yīng)答反應(yīng)，產(chǎn)生特異性的抗體?？乖涂贵w的特異性結(jié)合促使機體產(chǎn)生一系列反應(yīng)，最終使得抗原物質(zhì)被機體代謝出體外，機體恢復(fù)正常。許多分子都能引起免疫應(yīng)答，而每種抗原分子各有其獨特的形狀，從而導(dǎo)致抗原抗體特異性反應(yīng)。較小的抗原可能只有一個抗原決定部位，而較大、較復(fù)雜的分子可能有的抗體-抗原相互作用的基礎(chǔ)是兩個互補形狀的分子正好能配成一對。ELISA方法就是根據(jù)這種抗原--抗體間的特異性結(jié)合，將酶標(biāo)記在抗體/抗原分子上，形成酶標(biāo)抗體/酶標(biāo)抗原，即為酶結(jié)合物。該酶結(jié)合物在酶的催化作用下發(fā)生水解、氧化反應(yīng)，生成有色產(chǎn)物，因為酶結(jié)合物的活性與產(chǎn)物呈現(xiàn)的色澤濃度成正比，并反映被測抗原的量，因此根據(jù)顏色的有無和深淺，來定位或定量抗原。而根據(jù)所產(chǎn)生抗原水平，就可以判斷水域環(huán)境中環(huán)境激素的存在水平及其可能帶來的生態(tài)影響。
發(fā)明創(chuàng)造內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種較靈敏地檢測環(huán)境雌激素效應(yīng)的試劑盒。
本發(fā)明所提供的檢測環(huán)境雌激素效應(yīng)的試劑盒，它包括包被在酶標(biāo)板上的鯽卵黃蛋白原多克隆抗體，鯽卵黃蛋白原單克隆抗體和酶標(biāo)記的二抗。
為了更方便現(xiàn)場操作，所述試劑盒還包括標(biāo)準(zhǔn)濃度的鯽卵黃蛋白原、氧化劑、顯色劑和質(zhì)控血清。
所述鯽卵黃蛋白原多克隆抗體優(yōu)選的為鯽卵黃蛋白原兔多克隆抗體；所述鯽卵黃蛋白原單克隆抗體優(yōu)選的為鯽卵黃蛋白原鼠源單克隆抗體；所述酶標(biāo)記的二抗優(yōu)選的為辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗。
所述鯽卵黃蛋白原多克隆抗體、鯽卵黃蛋白原單克隆抗體及二抗均可按常規(guī)方法制備。
所述酶標(biāo)板可以是96孔單條酶標(biāo)板，也可以是雙條可拆酶標(biāo)板。
本發(fā)明的第二個目的是提供一種制備上述檢測環(huán)境雌激素效應(yīng)的試劑盒的方法。
本發(fā)明所提供的制備上述檢測環(huán)境雌激素效應(yīng)的試劑盒的方法，包括以下步驟1)制備鯽卵黃蛋白原多克隆抗體，并包被于酶標(biāo)板上，用BSA封閉；2)制備鯽卵黃蛋白原單克隆抗體，并與等量甘油混合；3)制備用酶標(biāo)記的二抗；4)將步驟1)中得到的鯽卵黃蛋白原多克隆抗體、步驟2)中得到的鯽卵黃蛋白原單克隆抗體及將步驟3)中得到的用酶標(biāo)記的二抗共同包裝，得到檢測環(huán)境雌激素效應(yīng)的試劑盒。
所述鯽卵黃蛋白原多克隆抗體、鯽卵黃蛋白原單克隆抗體和酶標(biāo)記的二抗均可按常規(guī)方法制備。所述鯽卵黃蛋白原多克隆抗體優(yōu)選的為鯽卵黃蛋白原兔多克隆抗體；所述鯽卵黃蛋白原單克隆抗體優(yōu)選的為鯽卵黃蛋白原鼠源單克隆抗體；所述酶標(biāo)記的二抗優(yōu)選的為辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗。
本發(fā)明巧妙地利用鯽卵黃蛋白原并結(jié)合免疫學(xué)ELISA反應(yīng)機理，提供了一種簡便、高效、靈敏地檢測環(huán)境中雌激素效應(yīng)的試劑盒。相對于其它的生物種而言，鯽在我國分布十分廣泛，并且適應(yīng)能力極強，幾乎在各個水域均有分布，因此為環(huán)境雌激素的調(diào)查取材提供了極大的方便，也為判斷不同水環(huán)境受環(huán)境雌激素污染及其對生物造成的影響提供了不可缺少的生物材料。本發(fā)明的檢測環(huán)境中雌激素效應(yīng)的試劑盒操作簡便、快速，沒有特殊的儀器要求，樣品需要量少，從而大大降低了分析成本并提高了分析效率。本發(fā)明的試劑盒為檢測我國水環(huán)境中可能存在的環(huán)境雌激素污染行為提供了重要的分析手段，也為分析水環(huán)境中生物體健康所受到的影響以及環(huán)境雌激素對生態(tài)可能造成的影響提供了一種新的工具。本發(fā)明具有廣泛的應(yīng)用前景，尤其是對于那些不具備大型分析儀器的實驗室和科研機構(gòu)具有廣泛的應(yīng)用前景。
下面結(jié)合附圖及具體實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。


圖1為本發(fā)明的試劑盒檢測效能曲線具體實施方式
實施例1、鯽卵黃蛋白原單克隆抗體的制備將鯽卵黃蛋白原經(jīng)乳化(弗氏完全佐劑和不完全佐劑)后注射到BalB/C小鼠肢周、背部多點，劑量為50μg/0.5ml/只，每10天一次，共免疫四次(最后一次為脾免25μg/0.5ml/只)；同時培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞Sp2/0至細(xì)胞呈圓滿、透亮、個體均勻后，取免疫小鼠脾，與骨髓瘤細(xì)胞Sp2/0融合，37℃、HAT培養(yǎng)基、CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每2天換半液，2周后間接ELISA篩選陽性雜交瘤細(xì)胞并換HT培養(yǎng)液。將篩選所得陽性細(xì)胞克隆化培養(yǎng)(間接ELISA檢測)，擴大化培養(yǎng)后凍存部分細(xì)胞，部分注入小鼠體內(nèi)，以誘生含有抗體的腹水。10天后連續(xù)取腹水，離心4500rpm/min，30min，腹水上清保存于-80℃超低溫冰箱中。提純腹水采用辛酸-飽和硫酸銨方法，提純抗體經(jīng)PBS、4℃條件下透析24小時以上，中間換液3-4次。用BaCl2檢測無沉淀產(chǎn)生。然后將抗體與等量甘油混勻，分裝，保存在-20℃冰箱中。ELISA法測定抗原抗體的親合常數(shù)Kaff為7.0×108l/mol。
實施例2、鯽卵黃蛋白原ELISA試劑盒的制備首先將按常規(guī)方法制備的鯽卵黃蛋白原兔多克隆抗體包被于單條可拆酶標(biāo)板(聚苯乙烯板)上，BSA封閉，37℃、2h后，洗滌，置于4℃條件下密封保存、備用。同時配制實驗室誘導(dǎo)、提純制備的鯽卵黃蛋白原標(biāo)準(zhǔn)濃度。將上述抗原、鯽卵黃蛋白原兔多克隆抗體，鯽卵黃蛋白原鼠源單克隆抗體、HRP標(biāo)記羊抗鼠二抗、顯色底物(TMB)、終止液、洗滌液(PBS+0.05％體積的Tween20)、鯽陰性血清包裝得到試劑盒，試劑盒中每種試劑分別為鯽卵黃蛋白原多克隆抗體包被的酶標(biāo)板；鯽卵黃蛋白原鼠源單克隆抗體100μl(稀釋1000倍使用)；鯽卵黃蛋白原標(biāo)準(zhǔn)濃度100μl(1mg/ml)；HRP標(biāo)記二抗(稀釋2500倍使用)；顯色液PB、底物(TMB)、過氧化氫(使用時1000∶10∶1.5倍使用)；終止液(2mol/L H2SO4)為5ml；PBS(配成2L使用)；TWEEN20∶1.0ml；鯽陰性血清為100μl(稀釋500倍使用)。
實施例3、鯽卵黃蛋白原ELISA試劑盒對環(huán)境雌激素效應(yīng)污染水平的檢測用實施例2得到的試劑盒對E2誘導(dǎo)鯉、鱘和從環(huán)境中捕獲的狼魚、梭魚、鱸、銅魚進(jìn)行交叉測定，分析樣品中可能具有的卵黃蛋白原。具體過程如下選擇E2誘導(dǎo)鯉、鯽、鱘和從環(huán)境中捕獲的狼魚、梭魚、鱸、銅魚，抽血分離得血清，低溫保存，同時將組織材料固定保存?zhèn)溆谏治?。測定樣品時，將標(biāo)準(zhǔn)濃度的鯽卵黃蛋白原稀釋成0.5、0.8、1.0、1.2、1.4μg/ml和適當(dāng)稀釋的樣品同時加入酶標(biāo)板中(100μl/孔)，37℃孵育1h后洗滌，加入鯽卵黃蛋白原鼠源單克隆抗體(稀釋成1000倍，100μl/孔)，37℃孵育1h，后洗滌，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(2-3％脫脂奶粉稀釋2500倍，100μl/孔)，37℃孵育1h，洗滌，加入底物液(100μl/孔)暗處反應(yīng)10-15min，加入2M H2SO4終止液(50μl/孔)，酶標(biāo)儀(450nm)比色測定吸光度值(OD450nm)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線定量樣品中卵黃蛋白原含量OD(樣)＝OD(樣)-2OD(陰性)。結(jié)果顯示鯉的交叉明顯(66.9％)，而鱘和狼魚、梭魚、鱸、銅魚則沒有明顯的交叉(使用HPLC檢測具有一定水平的VTG)。這說明本試劑盒具有非常強的特異性。
通過本試劑盒，可以快速、靈敏的檢測鯽血清(或血漿)中可能含有的卵黃蛋白原，只需要3-4小時就可以得出結(jié)果，靈敏度可達(dá)50ng/孔。其檢測效能如圖1所示，結(jié)果表明該方法的線性范圍在500-1400ng/ml，回收率在95.95-108.5％。測定時所需要的樣品量(血清或者血漿)非常少，大約100μl左右即可。圖1中VTG即為雙夾心法測定鯽卵黃蛋白原標(biāo)準(zhǔn)曲線Y＝0.7175X-0.2971(R2＝0.98)，所配制標(biāo)準(zhǔn)濃度抗原(0.5、0.8、1.0、1.2、1.4μg/ml)。
權(quán)利要求
1.一種檢測環(huán)境雌激素效應(yīng)的試劑盒，它包括包被在酶標(biāo)板上的鯽卵黃蛋白原多克隆抗體，鯽卵黃蛋白原單克隆抗體和酶標(biāo)記的二抗。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述酶標(biāo)記為辣根過氧化物酶標(biāo)記。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包標(biāo)準(zhǔn)濃度的鯽卵黃蛋白原。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于所述試劑盒還包括氧化劑、顯色劑和質(zhì)控血清。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于所述鯽卵黃蛋白原多克隆抗體為鯽卵黃蛋白原兔多克隆抗體。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于所述鯽卵黃蛋白原單克隆抗體為鯽卵黃蛋白原鼠源單克隆抗體，所述酶標(biāo)記的二抗為羊抗鼠二抗。
7.一種制備檢測環(huán)境雌激素效應(yīng)的試劑盒的方法，包括以下步驟1)制備鯽卵黃蛋白原多克隆抗體，并包被于酶標(biāo)板上，用BSA封閉；2)制備鯽卵黃蛋白原單克隆抗體，并與等量甘油混合；3)制備用酶標(biāo)記的二抗；4)將步驟1)中得到的鯽卵黃蛋白原多克隆抗體、步驟2)中得到的鯽卵黃蛋白原單克隆抗體及將步驟3)中得到的用酶標(biāo)記的二抗共同包裝，得到檢測環(huán)境雌激素效應(yīng)的試劑盒。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于還將標(biāo)準(zhǔn)濃度鯽卵黃蛋白原包裝進(jìn)所述檢測環(huán)境雌激素效應(yīng)的試劑盒。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于還將氧化劑、顯色劑和質(zhì)控血清包裝進(jìn)所述檢測環(huán)境雌激素效應(yīng)的試劑盒。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述鯽卵黃蛋白原多克隆抗體為鯽卵黃蛋白原兔多克隆抗體；所述鯽卵黃蛋白原單克隆抗體為鯽卵黃蛋白原鼠源單克隆抗體，所述酶標(biāo)記的二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測環(huán)境雌激素效應(yīng)的試劑盒及其制備方法，本發(fā)明所提供的檢測環(huán)境雌激素效應(yīng)的試劑盒，它包括包被在酶標(biāo)板上的鯽卵黃蛋白原多克隆抗體，酶標(biāo)記鯽卵黃蛋白原單克隆抗體。該試劑盒的制備方法，包括以下步驟1)制備鯽卵黃蛋白原多克隆抗體，并包被于酶標(biāo)板上，用BSA封閉；2)制備鯽卵黃蛋白原單克隆抗體，并用酶標(biāo)記，將標(biāo)記的抗體與等量甘油混合；3)將步驟1)中得到的鯽卵黃蛋白原多克隆抗體與步驟2)中得到的酶標(biāo)記鯽卵黃蛋白原單克隆抗體共同包裝，得到檢測環(huán)境雌激素效應(yīng)的試劑盒。本發(fā)明的試劑盒為檢測水環(huán)境中可能存在的環(huán)境雌激素污染行為提供了重要的分析手段和工具。
文檔編號G01N33/74GK1624483SQ20031011578
公開日2005年6月8日 申請日期2003年12月2日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月2日
發(fā)明者胡建英, 鄧寶山, 郭振泉, 安立會, 朱修義 申請人:北京大學(xué)