專利名稱：用于細(xì)胞胞外動作電位測量的單細(xì)胞傳感器及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于細(xì)胞胞外動作電位測量的單細(xì)胞傳感器及其制備方法。
背景技術(shù)：
1992年美國分子器件公司首次提出將活細(xì)胞與EIS(電解質(zhì)/絕緣層/硅)結(jié)構(gòu)的光尋址電位傳感器相結(jié)合，構(gòu)成敏感測試儀器，檢測胞外微環(huán)境酸堿度的變化，在此基礎(chǔ)上，又有研究人員改進(jìn)傳感器結(jié)構(gòu)和數(shù)據(jù)處理方法，使該類傳感器可以同時檢測幾種離子的變化。但是，這些細(xì)胞傳感器檢測的都是細(xì)胞群的代謝產(chǎn)物，所以很難確定藥物對單個細(xì)胞的作用機(jī)理，同時，也難以將測量精確定位到離子通道，無法確定藥物對細(xì)胞的作用靶點(diǎn)，對于實(shí)現(xiàn)藥物篩選的定量化是個不可回避的難點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種用于細(xì)胞動作電位檢測及藥物分析測量的單細(xì)胞傳感器及其制備方法，能夠?qū)蝹€細(xì)胞外動作電位進(jìn)行定性和定量檢測。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下1、本發(fā)明的系統(tǒng)結(jié)構(gòu)在鋁板上固定敷銅板，敷銅板上粘附具有SiO2層的打磨的Si片，聚二甲基硅氧烷作的微型測量腔固定在SiO2層上，微型測量腔上覆蓋一層生物兼容性膠，與下表面鍍金膜參考電極的光學(xué)玻璃粘接，玻璃上兩個開口處分別接通藥物和培養(yǎng)液的進(jìn)液乳膠管和出液乳膠管，敷銅板上引出工作電極，對電極與金膜參考電極相連。
所說的微型測量腔為1～2個。
2、本發(fā)明的制備方法(1)光尋址電位傳感器的制備選用<100>n型單晶硅片作為光尋址電位傳感器的襯底，硅片經(jīng)拋光清洗后，放入1000℃高溫爐中進(jìn)行熱氧化20分鐘，使硅片正面生長一層厚度約為30nm的SiO2薄膜，從背面將硅片的厚度打磨至100μm，然后用導(dǎo)電膠將硅片粘在敷銅板上，160℃高溫固化2小時，通過歐姆接觸從敷銅板上引出工作電極；(2)硅器件表面處理兩種細(xì)胞固定的方案涂敷法即在芯片表面做增強(qiáng)貼附性的涂層；通過改變芯片表面的粗糙度，做誘導(dǎo)細(xì)胞生長的圖形；涂敷法過程如下將100μg/ml多聚鳥氨酸的磷酸鹽緩沖液和8μg/ml層粘素的磷酸鹽緩沖液按1∶1混合，用0.22μm的微孔濾膜濾菌，將器件浸入該混合溶液中，37℃，5％CO2環(huán)境下，浸泡24小時，再用雙蒸水沖洗兩次，冷凍備用；改變芯片表面的粗糙度的過程如下用光刻技術(shù)在光尋址電位傳感器表面做2×2mm2的微腔圖形，改變硅片的表面粗糙度，然后再進(jìn)行涂層的處理；(3)參考電極制備熱丙酮清洗增透光學(xué)玻璃，80℃烘干，在玻璃表面，用坐標(biāo)紙做掩模，采用磁控濺射技術(shù)在玻璃表面按掩模形狀鍍金，用導(dǎo)電膠將導(dǎo)線與金膜參考電極粘接，參考電極再與對電極連接；(4)安置微型測量腔用聚二甲基硅氧烷制備0.2×5×5cm3的薄膜結(jié)構(gòu)，用模具在上刻出兩個測量腔，腔的尺寸為0.2×1.4×0.5cm3，用生物兼容性膠將此結(jié)構(gòu)粘著于光尋址電位傳感器表面，在此腔中培養(yǎng)細(xì)胞，測量時，上面粘光學(xué)玻璃為上蓋，形成密封的微型測量腔。
本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)是該單細(xì)胞傳感器提高了精度和穩(wěn)定度，細(xì)胞貼附生長狀況良好，將測量定位于單個細(xì)胞，可以準(zhǔn)確測量藥物刺激下，單細(xì)胞的胞外動作電位變化。本發(fā)明改善了光源設(shè)計(jì)，提高了精度和穩(wěn)定度，可以將測量定位于單個細(xì)胞甚至單個離子通道，從而將精確測量藥物對單個細(xì)胞的作用及作用靶點(diǎn)。這種單細(xì)胞傳感器，可以實(shí)現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞外動作電位的快速、實(shí)時監(jiān)測，定性分析不同濃度不同藥物對細(xì)胞的興奮和抑制作用，主要應(yīng)用于藥物篩選、分析和評價。


下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
圖1是單細(xì)胞傳感器沿圖2的I-I方向剖面結(jié)構(gòu)圖；圖2是單細(xì)胞傳感器俯視圖；
圖3是采用涂敷法提高器件的靈敏度；圖4是硅器件表面處理后細(xì)胞生長狀況；圖5是改變硅器件表面粗糙度的顯微圖形；圖6是單細(xì)胞傳感器檢測實(shí)例系統(tǒng)示意圖；圖7是n型硅襯底LAPS的特性曲線示意圖；圖8是無藥物刺激時，單細(xì)胞傳感器的基線；圖9是低濃度乙酰膽堿刺激時單細(xì)胞傳感器的響應(yīng)；圖10是中濃度乙酰膽堿刺激時單細(xì)胞傳感器的響應(yīng)；圖11是高濃度乙酰膽堿刺激時單細(xì)胞傳感器的響應(yīng)。
圖中，1.鋁板，2.敷銅板，3.光可尋址電位傳感器，3.1.打磨薄后的Si片，3.2.SiO2層，4.光學(xué)玻璃，5.金膜參考電極，6.紅光激光器，7.聚二甲基硅氧烷微型腔，8.生物兼容性膠，9.多聚鳥胺酸與層粘素層，10.工作電極，11.對電極，12.進(jìn)液乳膠管，13.出液乳膠管。
具體實(shí)施例方式
1、傳感器的檢測結(jié)構(gòu)如圖1、圖2所示，本發(fā)明在鋁板1上固定敷銅板2，敷銅板2上粘附具有SiO2層3.2的打磨薄的Si片3.1，聚二甲基硅氧烷作的微型測量腔7固定在SiO2層3.2上，聚二甲基硅氧烷微型測量腔7上覆蓋一層生物兼容性膠8，與下表面鍍金膜參考電極5的光學(xué)玻璃4粘接，微型測量腔7內(nèi)涂敷一層多聚鳥胺酸與層粘素層9，玻璃上兩個開口處分別接通藥物和培養(yǎng)液的進(jìn)液乳膠管12和出液乳膠管13，敷銅板上引出工作電極10，對電極11與金膜參考電極5相連。測量時，微型測量腔上面粘光學(xué)玻璃為上蓋，形成密封測量腔。紅光激光器6選擇照射某一細(xì)胞正上方，進(jìn)液乳膠管與蠕動泵連接，通過泵的通斷控制藥物刺激，工作電極、參考電極、對電極與恒電位/電流儀相連，恒電位/電流儀通過鎖相放大器與數(shù)字補(bǔ)償電路相連，接入計(jì)算機(jī)，與計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)雙向通訊，控制溫度并實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)采集處理，計(jì)算機(jī)與數(shù)字/模擬轉(zhuǎn)換器相連，控制蠕動泵通斷，檢測系統(tǒng)框圖如圖6所示。
2、傳感器的制備(1)光尋址電位傳感器的制備選用<100>n型單晶硅片作為LAPS的襯底。硅片經(jīng)拋光清洗后，放入1000℃高溫爐中進(jìn)行熱氧化20分鐘，使硅片正面生長一層厚度約為30nm的SiO2薄膜，利用打磨技術(shù)從背面將硅片的厚度打磨至100μm，然后用導(dǎo)電膠將硅片粘在敷銅板上，160℃高溫固化2小時，通過歐姆從敷銅板上接觸引出工作電極。
(2)硅器件表面處理本發(fā)明設(shè)計(jì)了兩種細(xì)胞固定的方案一，涂敷法，即在芯片表面做增強(qiáng)貼附性的涂層；二，通過改變芯片表面的粗糙度，做誘導(dǎo)細(xì)胞生長的圖形。
涂敷法過程如下將100μg/ml多聚鳥氨酸的磷酸鹽緩沖液和8μg/ml層粘素的磷酸鹽緩沖液按1∶1混合，用0.22μm的微孔濾膜濾菌，將器件浸入該混合溶液(PLOL)中，37℃，5％CO2環(huán)境下，浸泡24小時，再用雙蒸水沖洗兩次，冷凍備用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明做了表面處理后的單細(xì)胞傳感器，斜率明顯增大，因此器件敏感性提高，從而提高了測量的靈敏度，如圖3所示，而且，細(xì)胞形態(tài)正常，突觸明顯，生長情況良好，如圖4所示。
改變芯片表面的粗糙度的過程如下用光刻技術(shù)在LAPS表面做2×2mm2的微腔圖形，改變硅片的表面粗糙度，然后再進(jìn)行涂層的處理，如圖5所示。
(3)參考電極制備熱丙酮清洗增透光學(xué)玻璃，80℃烘干。在玻璃表面，用坐標(biāo)紙做掩模，采用磁控濺射技術(shù)在玻璃表面按掩模形狀鍍金，用導(dǎo)電膠將導(dǎo)線與金膜粘接，引出參考電極。
(4)微型測量腔設(shè)計(jì)用聚二甲基硅氧烷制備一0.2×5×5cm3的薄膜結(jié)構(gòu)，用模具在上刻出與參考金電極類似的兩個測量腔，腔的尺寸為0.2×1.4×0.5cm3。用生物兼容性膠將此結(jié)構(gòu)粘著于LAPS傳感器表面，在此腔中培養(yǎng)細(xì)胞，測量時，上面粘光學(xué)玻璃為上蓋，形成密封測量腔。
傳感器的原理由于要測量的是細(xì)胞外液體環(huán)境的生理參數(shù)，所以采用的是具有EIS結(jié)構(gòu)的LAPS系統(tǒng)。它的基本原理是半導(dǎo)體的內(nèi)光電效應(yīng)，即當(dāng)半導(dǎo)體受到一定波長的光照射時，半導(dǎo)體吸收光子，發(fā)生禁帶到導(dǎo)帶的躍遷，即產(chǎn)生電子空穴對。在一般情況下，電子空穴對很快復(fù)合，在外電路中是測不到電流的。如果，給LAPS外加反向偏置電壓時(n型硅加負(fù)壓，P型硅加正壓)，半導(dǎo)體中產(chǎn)生耗盡層，這時靠近耗盡層的電子空穴對就被耗盡層拉開。當(dāng)固定光強(qiáng)時，就會產(chǎn)生光電壓，LAPS采用強(qiáng)度調(diào)制的光照射在器件的正面或背面，就可以在外電路中測量到電流。電流的大小，與光強(qiáng)、耗盡層的厚度(即外偏壓)等有關(guān)。
如圖7所示是n型硅襯底光尋址電位傳感器的特性曲線示意圖，該曲線可以分為截止區(qū)、過渡區(qū)(工作區(qū))和飽和區(qū)，這是由硅的特性決定的。特性曲線沿偏壓軸的平移就是膜響應(yīng)值，特性曲線決定了偏壓的選擇點(diǎn)、LAPS靈敏度、膜響應(yīng)與測量值的對應(yīng)關(guān)系等。
單細(xì)胞傳感器檢測細(xì)胞動作電位實(shí)施例選擇了1∶10000、1∶100000、1∶1000000(g/ml)三種濃度的乙酰膽堿(Ach)作為神經(jīng)元的刺激藥物，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，乙酰膽堿對于大腦皮層的神經(jīng)元是興奮作用。
如圖8所示，為未加任何藥物刺激時，細(xì)胞傳感器測得的信號，是信號分析的基線，圖中可以看出，有很小不規(guī)則的擾動，主要是由于測量系統(tǒng)同軸纜線未能起到很好的屏蔽作用以及環(huán)境的微小震動所引起的。如圖9所示，是在1∶1000000低濃度Ach作用下，細(xì)胞傳感器的響應(yīng)，圖中曲線與基線相似，幾乎沒有變化，說明在該濃度下，Ach還未能引起細(xì)胞產(chǎn)生動作電位。如圖10所示，是在1∶100000中濃度Ach作用下，細(xì)胞傳感器的響應(yīng)，由此圖可以看出，胞外的電位頻度和幅度都發(fā)生變化，檢測到有一頻率約為1Hz幅度約為1.8mV的電信號，初步判定為細(xì)胞的動作電位。如圖11所示，是在1∶10000高濃度Ach作用下，細(xì)胞傳感器的響應(yīng)，該信號頻度和幅度都有很大的變化。
該結(jié)果說明，當(dāng)Ach溶液在一定濃度范圍內(nèi)變化，會引起細(xì)胞的胞外電位的改變，單細(xì)胞傳感器可以檢測到電信號頻度和幅度變化，而且，隨Ach濃度增加，電位的幅度增大。
權(quán)利要求
1.一種用于細(xì)胞胞外動作電位測量的單細(xì)胞傳感器，其特征在于在鋁板(1)上固定敷銅板(2)，敷銅板(2)上粘附具有SiO2層(3.2)的打磨的Si片(3.1)，聚二甲基硅氧烷作的微型測量腔(7)固定在SiO2層(3.2)上，微型測量腔(7)上覆蓋一層生物兼容性膠(8)，與下表面鍍金膜參考電極(5)的光學(xué)玻璃(4)粘接，玻璃上兩個開口處分別接通藥物和培養(yǎng)液的進(jìn)液乳膠管(12)和出液乳膠管(13)，敷銅板上引出工作電極(10)，對電極(11)與金膜參考電極(5)相連。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于細(xì)胞胞外動作電位測量的單細(xì)胞傳感器，其特征在于所說的微型測量腔(7)為1～2個。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于細(xì)胞胞外動作電位測量的單細(xì)胞傳感器的制備方法，其特征在于(1)光尋址電位傳感器的制備選用<100>n型單晶硅片作為光尋址電位傳感器的襯底，硅片經(jīng)拋光清洗后，放入1000℃高溫爐中進(jìn)行熱氧化20分鐘，使硅片正面生長一層厚度約為30nm的SiO2薄膜，從背面將硅片的厚度打磨至100μm，然后用導(dǎo)電膠將硅片粘在敷銅板上，160℃高溫固化2小時，通過歐姆接觸從敷銅板上引出工作電極；(2)硅器件表面處理兩種細(xì)胞固定的方案涂敷法即在芯片表面做增強(qiáng)貼附性的涂層；通過改變芯片表面的粗糙度，做誘導(dǎo)細(xì)胞生長的圖形；涂敷法過程如下將100μg/ml多聚鳥氨酸的磷酸鹽緩沖液和8μg/ml層粘素的磷酸鹽緩沖液按1∶1混合，用0.22μm的微孔濾膜濾菌，將器件浸入該混合溶液中，37℃，5％CO2環(huán)境下，浸泡24小時，再用雙蒸水沖洗兩次，冷凍備用；改變芯片表面的粗糙度的過程如下用光刻技術(shù)在光尋址電位傳感器表面做2×2mm2的微腔圖形，改變硅片的表面粗糙度，然后再進(jìn)行涂層的處理；(3)參考電極制備熱丙酮清洗增透光學(xué)玻璃，80℃烘干，在玻璃表面，用坐標(biāo)紙做掩模，采用磁控濺射技術(shù)在玻璃表面按掩模形狀鍍金，用導(dǎo)電膠將導(dǎo)線與金膜參考電極粘接，參考電極再與對電極連接；(4)安置微型測量腔用聚二甲基硅氧烷制備0.2×5×5cm3的薄膜結(jié)構(gòu)，用模具在上刻出兩個測量腔，腔的尺寸為0.2×1.4×0.5cm3，用生物兼容性膠將此結(jié)構(gòu)粘著于光尋址電位傳感器表面，在此腔中培養(yǎng)細(xì)胞，測量時，上面粘光學(xué)玻璃為上蓋，形成密封的微型測量腔。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于細(xì)胞胞外動作電位測量的單細(xì)胞傳感器及其制備方法。在早期多光源細(xì)胞微生理計(jì)的基礎(chǔ)上，利用光尋址電位傳感器(LAPS)技術(shù)，克服傳感器幾何特性對細(xì)胞培養(yǎng)的限制，采用光源移動尋址，對隨機(jī)培養(yǎng)的單個細(xì)胞跟蹤定位測量。本發(fā)明配套改進(jìn)的光源系統(tǒng)，提高了精度和穩(wěn)定度，可以將測量定位于單個細(xì)胞甚至單個離子通道，從而將精確測量藥物對單個細(xì)胞的作用及作用靶點(diǎn)。這種單細(xì)胞傳感器，可以實(shí)現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞外動作電位的快速、實(shí)時監(jiān)測，定性分析不同濃度不同藥物對細(xì)胞的興奮和抑制作用，主要應(yīng)用于藥物篩選、分析和評價。
文檔編號G01N27/403GK1554942SQ200310122949
公開日2004年12月15日 申請日期2003年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月25日
發(fā)明者王平, 許改霞, 秦利鋒, 徐瑩, 王 平 申請人:浙江大學(xué)