專利名稱：通過篩選人或動物組織、血液或體液中的海帕西啶來診斷疾病的方法,以及該方法的治療 ...的制作方法
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背景技術(shù)：
鐵是所有活生物生長和發(fā)育所必需的必需痕量元素；它是DNA合成和多種代謝過程所不可缺少的。不過，鐵代謝紊亂與多種重要的哺乳動物疾病相關(guān)，包括，但不局限于缺鐵性貧血，含鐵血黃素沉著癥或鐵過量疾病血色素沉著病(Pietrangelo，A.(2002)Am J Physiol.Gastrointest.Liver Physiol.282，G403-414；Andrews，N.C.(2000)Annu.Rev.Genomics Hum.Genet.1，75-98；Philpott，C.C.(2002)Hepatology 35，993-1001；Anderson和Powe11(2002)Int J Hematol 76，203-203；Beutler等，(2001)Drug-Metab.Dispos.29，495-499)。在生理學(xué)條件下，人的鐵含量是通過控制吸收調(diào)節(jié)的。在哺乳動物中，鐵的吸收主要是在十二指腸和上部空腸中進行的，并且是鐵儲存受到生理學(xué)控制的唯一的機制(Philpott，C.C.(2002)Hepatology 35，993-1001)。在吸收之后，鐵與循環(huán)的運鐵蛋白結(jié)合，并且送遞到整個身體的組織中。在肝臟中，作為鐵儲存的主要位點，與運鐵蛋白結(jié)合的鐵通過經(jīng)典的運鐵蛋白受體(TfR1)(Collawn等(1990)Cell 63，1061-1072)，并且據(jù)推測在更大量上通過最近鑒定的同源運鐵蛋白受體2(TfR2)(Kawabata等(1999)J Biol Chem274，20826-20832)，通過受體介導(dǎo)的胞吞作用攝取到細胞中。該蛋白的細胞外結(jié)構(gòu)域與TfR1的相應(yīng)部分的同一性為45％(同前)。TfR2還可以結(jié)合雙鐵運鐵蛋白，并且促進對鐵的吸收。業(yè)已發(fā)現(xiàn)TfR2中的突變與某些形式的血色素沉著病相關(guān)，證實了TfR2在鐵體內(nèi)穩(wěn)態(tài)中的重要作用(Philpott，C.C.(2002)Hepatology 35，993-1001；Camasehella等，(2000)Nat.Genet.25，14-15；Fleming等，(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99，10653-10658)。TfR2主要是在肝臟中表達的(Fleming等，(2000)Proc.Natl.Acadi.Sci.USA 97，2214-2219；Subramaniam等，(2002)Cell Biochem.Biophys.36，235-239)，不過，確切的細胞定位尚不清楚。
存在能夠增強在缺鐵個體體內(nèi)的鐵吸收的反饋機制，而在鐵過量的人體內(nèi)鐵的吸收減弱(Pietrangelo，A.(2002)Am J PhysiolGastrointest Liver Physiol 282，G403-414；Philpott，C.C.(2002)Hepatology 35，993-1001；Anderson和Powell(2002)Int J Hematol 76，203-203)。不過，在遺傳性血色素沉著病(HH)中，這種調(diào)節(jié)機制似乎受到了破壞；盡管鐵過量，仍然會從飲食中吸收提高量的鐵，并且導(dǎo)致過量的鐵在內(nèi)臟器官中積累，導(dǎo)致器官功能異常和衰竭。對腸對身體鐵需求改變的反應(yīng)的分子機制的理解還很少。在這種背景下，海帕西啶(hepcidin)，即最近鑒定的哺乳動物肽(Krause等(2000)FEBS Lett 489，147-150；Park等(2001)J Biol Chem 276，7806-7810)被推測為調(diào)節(jié)鐵體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵信號傳導(dǎo)成分(Philpott C.C.(2002)Hepatology 35，993-1001；Nicolas等(2003)proc Natl Acad Sci USA 99，4596-4601)。
海帕西啶是富含半胱氨酸的小肽，主要是在肝臟中產(chǎn)生的。該分子能調(diào)節(jié)腸中的鐵吸收，并且抑制鐵從巨噬細胞中釋放。海帕西啶最初是從人血漿和尿中分離的具有抗微生物活性的25個氨基酸(aa)的肽(Krause等(2000)FEBS Lett 489，147-150；Park等(2001)J Biol Chem 276，7806-7810)。隨后搜索通過鐵調(diào)節(jié)的肝臟特異性基因鑒定海帕西啶cDNA，其在小鼠中編碼83aa的前體，并且在大鼠和人體內(nèi)編碼84aa的前體，包括推測的24aa的信號肽(Pigeon等(2001)J Biol Chem 276，7811-7819)。人海帕西啶的cDNA結(jié)構(gòu)暗示了它是作為84個氨基酸的前肽原翻譯的，對它進行氨基末端加工成為60個氨基酸殘基的海帕西啶原(prohepcidin)肽，將它進一步加工成25個氨基酸的海帕西啶肽(Park等(2001))。
在表現(xiàn)出鐵過量的小鼠體內(nèi)海帕西啶的表達受到破壞，這是由于定向破壞了上游刺激因子2(Usf2)基因，與hfe-/-小鼠體內(nèi)存在的相同表型類似(Nicolas G，等(2001)Proc Natl Acad Sci USA 98，8780-8785)，導(dǎo)致得出了這種肽在鐵代謝中發(fā)揮關(guān)鍵作用的結(jié)論。相反，海帕西啶的超表達顯示導(dǎo)致了轉(zhuǎn)基因小鼠的嚴重的缺鐵性貧血(Nicolas等(2002)Proc Natl Acad Sci USA 99，4596-4601)，表明海帕西啶是鐵體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)節(jié)劑。另外，最近的研究業(yè)已顯示在hfe剔除的小鼠體內(nèi)肝臟海帕西啶表達的降低(Ahmad等(2002)Blood Cells Mol Dis 29，361-366)，并且在海帕西啶肽中的突變與嚴重的青少年血色素沉著病相關(guān)(Roetto等(2003)Nat Genet 33，21-22)，并且開啟了理解鐵過量的分子病理的新的前景。不過，海帕西啶在生理學(xué)和病理學(xué)狀況下平衡體內(nèi)鐵儲存和飲食鐵吸收的機制仍然有待確定。
在這一方面，這種肽的細胞定位以及它在各種鐵的狀態(tài)下的調(diào)節(jié)作用在海帕西啶功能的研究中十分重要。盡管對各種器官中的人和小鼠海帕西啶mRNA水平進行的RNA印跡分析發(fā)現(xiàn)海帕西啶主要是在肝臟中表達的(Krause等(2000)FEBS Lett 489，147-150；Park等(2001)J Biol Chem 276，7806-7810；Nicolas等(2002)Proc NatlAcad Sci USA 99，4596-4601)，但還沒有這種肽的細胞定位的數(shù)據(jù)。
發(fā)明概述本發(fā)明涉及海帕西啶對哺乳動物細胞吸收鐵的調(diào)節(jié)，以及海帕西啶和/或海帕西啶特異性抗體在診斷與鐵代謝紊亂相關(guān)的疾病中的用途。本發(fā)明的診斷檢測試劑盒特別適用于篩選人或動物的全部的群體，并且鑒定患有所述疾病的受試者。
本發(fā)明的一個方面是用于診斷以非生理學(xué)水平的海帕西啶為特征的疾病狀況的方法，包括從受試者體內(nèi)獲得組織或流體樣品；讓所述樣品與能特異性地結(jié)合來自海帕西啶的中間部分(20-50位氨基酸)或C-末端(65-84位氨基酸)的多肽結(jié)合的抗體或它的片段接觸，并且利用基于所述抗體和所述多肽結(jié)合的測定對海帕西啶的水平進行定量；其中，所述非生理學(xué)水平的海帕西啶是所述疾病狀況的指示。在本發(fā)明的一個方面，確立了靈敏的診斷方法和試劑盒，使得能夠檢測人血漿中的海帕西啶原。本發(fā)明具有廣泛的治療前景，其中，可以將海帕西啶抗體和診斷方法和試劑盒用于測定海帕西啶，作為在治療期間和之后上述疾病的發(fā)展的參數(shù)。
本發(fā)明的一種實施方案涉及包括海帕西啶原和它的片段在內(nèi)的海帕西啶蛋白的生成和純化。本發(fā)明的另一種實施方案涉及海帕西啶特異性抗體，或它的片段或變體，后者反過來又可用于免疫測定，以便檢測受懷疑的人或動物體內(nèi)的包括海帕西啶原在內(nèi)的海帕西啶蛋白。
在本發(fā)明的另一個方面，所述海帕西啶診斷方法和試劑盒可用于遺傳技術(shù)方法，如用于超表達或下調(diào)海帕西啶。
在本發(fā)明的另一個方面，海帕西啶可用于上述疾病的治療性處理，包括用海帕西啶，和海帕西啶的激動劑或拮抗劑治療受試者。可以通過改變海帕西啶的濃度，抑制海帕西啶與鐵或與TfR2受體的結(jié)合調(diào)節(jié)細胞中的鐵吸收。因此，海帕西啶，以及海帕西啶的激動劑或拮抗劑可用于治療存在鐵代謝紊亂的狀況。例如，所述物質(zhì)可用于治療上述疾病。
通過閱讀以下附圖和詳述能更好地理解本發(fā)明的上述和其他方面。
附圖簡述

圖1表示人海帕西啶前體蛋白的氨基酸序列，包括位于N-末端的標(biāo)準的24aa的信號肽(24和25位氨基酸之間的線條表示推測的信號序列切割位點)，35aa的前體區(qū)，以及C-末端20-，22-和25-aa的海帕西啶肽，它們的差別僅在于N-末端的截短，正如通過箭標(biāo)表示的。在從海帕西啶前體上切割信號肽之后，產(chǎn)生了由60aa組成的海帕西啶原分子。在海帕西啶25中的推測的二硫鍵連接是1-8，2-7，3-6和4-5，正如通過虛線示出的(引自Hunter等，20)。正如通過抗體符號所表示的，產(chǎn)生了抗海帕西啶前體aa 28-47的抗血清EG(1和2)-Hep N，產(chǎn)生了抗aa 70-84的抗血清EG(1)-Hep C。
圖2表示以下部分(A)人肝臟(泳道2和3)和HepG2細胞(泳道4和5)的RT-PCR分析，表示海帕西啶的基因表達。示出了bpDNA梯(泳道1和7)。泳道6表示負對照。(B-D)在豚鼠(泳道1)和人肝臟(泳道2)以及HepG2細胞(泳道3)，人血清(泳道4)和豚鼠骨骼肌(泳道5，對照)的提取物中用抗體EG(1)-HepN(B)，EG(2)-HepN(C)和EG(1)-HepC(D)進行的海帕西啶的蛋白印跡分析。注意，用所有抗體獲得的位于10和20kDa的免疫反應(yīng)性帶能識別海帕西啶前體上的不同的表位。(所使用的分子量標(biāo)記為磷酸化酶B，105kDa；谷氨酸脫氫酶，53kDa；碳酸酐酶，34kDa；肌紅蛋白-藍(myoglobin-blue)，23kDa；肌紅蛋白-紅(myoglobin-red)，17kDa；溶菌酶，13kDa；抑酶肽，7kDa；胰島素，3kDa)。
圖3表示通過免疫熒光顯微鏡術(shù)檢測HepG2細胞中的海帕西啶，使用了抗體EG(1)-HepN(A)，EG(2)-HepN(B)和EG(1)-HepC(C)(比例線8μm)。
圖4表示海帕西啶在豚鼠(A-F)和人(G-I)肝臟中的細胞定位。用區(qū)域特異性抗體EG(1)-HepN(A，D，G)，EG(2)-HepN(B，E，H)和EG(1)-HepC(C，F(xiàn)，I)對石蠟切片進行的免疫染色顯示在肝細胞的基底外側(cè)膜區(qū)域出現(xiàn)了不同的免疫反應(yīng)性(箭標(biāo))。(放大倍數(shù)A-C，X 180；D-I，X 540)。
圖5表示豚鼠肝臟的免疫組織化學(xué)切片A，抗體EG(1)-HepN；B，抗體EG(2)-HepNC，抗體EG(1)-HepC，表現(xiàn)出海帕西啶在肝小葉內(nèi)的明確的帶狀分布，免疫反應(yīng)性沿門管周區(qū)域(星號)到中央靜脈(箭頭)減弱。注意，在中央靜脈周圍的肝細胞中沒有出現(xiàn)免疫反應(yīng)性(B中的箭標(biāo)表示門管三聯(lián)體(portal triad))(A-C，X 180)。
圖6表示循環(huán)的人海帕西啶原的ELISA結(jié)果。示出了以ng/ml為單位的海帕西啶-(28-47)濃度和在450nm波長下ELISA溶液的消光值的代表性標(biāo)準曲線。注意，高的分辨率在4-400ng/ml海帕西啶-(28-47)范圍內(nèi)。
圖7表示26位健康志愿者(對照)，40位患有慢性慢性腎機能不全的患者，19位患有慢性腎機能不全和腎貧血的患者，以及35位患有遺傳性血色素沉著病的患者的靜脈血清海帕西啶原濃度值的框狀圖。方框內(nèi)的線條表示中位數(shù)，圓圈表示平均值。所述方框的下部和上部邊緣表示第一和第三四分位(quartile)，觸須線(whisker)表示最小和最大值。虛線表示循環(huán)免疫反應(yīng)性海帕西啶原的對照組的平均水平(106.16ng/ml)。
圖8表示在處理過的和未處理過的HH患者樣品中的海帕西啶原和鐵(A)，鐵蛋白(B)和運鐵蛋白飽和(C)之間的相關(guān)性。注意在我們的樣品沒有發(fā)現(xiàn)明顯的相關(guān)性。
圖9表示分別由GenBank數(shù)據(jù)庫編號NM021175和AAH20612復(fù)制的一種形式的海帕西啶的完整的核苷酸(SEQ ID NO1)和氨基酸序列(SEQ ID NO2)。
圖10表示以下部分(A)人(泳道2)，小鼠(泳道3)和大鼠(泳道4)腎的RT-PCR分析，表示海帕西啶的基因表達。示出了bpDNA梯(泳道1和5)。(B，C)用抗體EG(2)-HepN(B)和EG(1)-HepC(C)對人(泳道1)，大鼠(泳道2)和小鼠(泳道3)腎臟，以及人尿(泳道4)的提取物中的海帕西啶進行的蛋白印跡分析。注意，用這兩種抗體獲得的9.5kDa的免疫反應(yīng)性帶能識別海帕西啶前體上的不同的表位。(所使用的分子量標(biāo)記為磷酸化酶B，105kDa；谷氨酸脫氫酶，53kDa；碳酸酐酶，34kDa；肌紅蛋白-藍，23kDa；肌紅蛋白-紅，17kDa；溶菌酶，13kDa；抑酶肽，7kDa；胰島素，3kDa)。
圖11表示海帕西啶在大鼠腎皮質(zhì)中的細胞定位。用區(qū)域特異性抗體EG(1)-HepC(A)，EG(2)-HepC(B)，EG(1)-HepN(C)和EG(2)-HepN(D)對石蠟切片進行的免疫染色顯示在腎皮質(zhì)遠端小管中的不同的免疫反應(yīng)性。在某些小管中，免疫反應(yīng)性分布在上皮細胞的細胞質(zhì)內(nèi)(箭標(biāo))，但是在其他部位，所述免疫反應(yīng)性位于各個細胞的頂極(apical pole)上(D，箭頭)。注意腎小球(星號)缺乏任何海帕西啶免疫反應(yīng)性。(放大倍數(shù)A，X 90；B-D，X 180)。
圖12表示海帕西啶在大鼠(A和C)和小鼠(B和D)腎臟中的組織分布。用抗體EG(2)-HepN進行的免疫組織化學(xué)分析顯示外部髓質(zhì)(outer medulla)(A和B)具有顯著減弱的海帕西啶免疫反應(yīng)性，介于外側(cè)條(outer stripe)(os)和內(nèi)側(cè)條(inner stripe)(is)之間，它是通過黑色虛弧線表示的。C和D表示在內(nèi)部髓質(zhì)(m)缺乏海帕西啶免疫反應(yīng)性。強的免疫反應(yīng)性出現(xiàn)在皮質(zhì)(c)中。(放大倍數(shù)A，B，和D，X 90；C，X 180)。
圖13表示用抗體EG(1)-HepN(A)，EG(2)-HepN(B和D)和EG(1)-HepC(C)進行的海帕西啶在大鼠腎臟中的亞細胞定位。在某些遠端小管中，海帕西啶免疫反應(yīng)性分布在上皮細胞的細胞質(zhì)中(箭標(biāo))，但是在其他部位，所述免疫反應(yīng)性主要集中在朝向各個細胞的頂極部位(黑色箭頭)。注意腎小球(星號)和近端小管(透明箭頭)缺少任何海帕西啶免疫反應(yīng)性。(放大倍數(shù)A-D，X 360)。
圖14表示海帕西啶在人腎臟中的細胞定位?？贵wEG(1)-HepN(A)，EG(2)-HepN(B和D)和EG(1)-HepC(C)在腎皮質(zhì)遠端小管中表現(xiàn)出不同的免疫反應(yīng)性(箭標(biāo))。在相同的小管中，存在海帕西啶免疫反應(yīng)性的細胞間差異，顯示有細胞質(zhì)染色的強的(黑色箭頭)和微弱的免疫反應(yīng)性的(透明箭頭)上皮細胞。在腎小球中沒有發(fā)現(xiàn)免疫反應(yīng)性(星號)(放大倍數(shù)A-C，X180；D，X 360)。
圖15表示用抗體EG(1)-HepN(A)，EG(2)-HepN(B和D)和EG(2)-Hep C(C)在人腎臟的遠端小管細胞的頂極檢測海帕西啶免疫反應(yīng)性。注意在分泌性上皮細胞頂極出現(xiàn)的強的免疫染色(黑色箭頭)，某些細胞缺少海帕西啶免疫反應(yīng)性(透明箭頭)。星號表示腎小球(放大倍數(shù)A-C，X 180；D，X 360)。
圖16表示22位健康志愿者(對照)和22位患有慢性腎機能不全的患者的靜脈血清和尿海帕西啶原濃度值的框狀圖。方框內(nèi)的線條表示中位數(shù)，而圓圈表示平均值。方框的下部和上部邊緣表示第一和第三四分位，觸須線表示最小和最大值。虛線表示循環(huán)的免疫反應(yīng)性的海帕西啶原對照組的平均水平(104.2ng/ml)。
實施本發(fā)明的最佳方式本發(fā)明描述了海帕西啶能調(diào)節(jié)哺乳動物細胞對鐵的吸收，并且海帕西啶的非生理學(xué)表達導(dǎo)致了與鐵代謝紊亂相關(guān)的疾病。本文所使用的術(shù)語海帕西啶表示海帕西啶原，海帕西啶或其片段。血液中生理學(xué)濃度的海帕西啶在大約50-大約150ng/ml范圍內(nèi)。非生理學(xué)濃度低于或高于這一范圍。非生理學(xué)量的海帕西啶蛋白或其片段與鐵代謝紊亂相關(guān)，導(dǎo)致了鐵的缺乏或過量，如缺鐵性貧血；遺傳性和非遺傳性鐵過量疾病，如含鐵血黃素沉著癥和血色素沉著病或繼發(fā)性血色素沉著病，aceruloplasminemia，hypotransferrinemia，無轉(zhuǎn)鐵蛋白血病；未確定起因的鐵過量疾病，例如，膽囊系統(tǒng)疾病，肝病，特別是酒精性肝病，非酒精性脂肪性肝炎(steatohepatitis)，和慢性乙型肝炎和丙型肝炎感染；鐵利用疾病，例如鐵粒幼紅細胞貧血，地中海貧血；血液學(xué)疾病，如白血病，polyglobulie，大紅細胞性貧血，小紅細胞性貧血或正常紅細胞性貧血，伴隨網(wǎng)狀細胞增多的貧血，溶血性貧血；由于感染和疾病造成的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)紊亂；炎癥和感染，包括膿毒??；免疫學(xué)疾病和腫瘤，如癌，肉瘤，淋巴瘤，這些疾病會導(dǎo)致非生理學(xué)海帕西啶濃度；神經(jīng)變性病，如阿爾茨海默病和Wilson氏病。這一發(fā)現(xiàn)使得能夠開發(fā)對海帕西啶蛋白和它的片段的測定，以及隨后的純化，所述純化保留了它們的天然構(gòu)型和生理學(xué)活性。本發(fā)明部分基于以下發(fā)現(xiàn)在患有某些疾病的患者中，海帕西啶蛋白存在于人或動物的組織，血液和體液中。
本發(fā)明第一次提供了如下證明，即在患有上述疾病的受試者體內(nèi)，包括海帕西啶原在內(nèi)的海帕西啶蛋白，存在于人或動物組織，血液和體液中，其濃度遠遠超過不是所述疾病的受試者的正常的人或動物體內(nèi)存在的濃度。這是通過檢查來自患者的組織，血液或體液樣品，并且檢測海帕西啶蛋白和/或海帕西啶原的存在和量而實現(xiàn)的。根據(jù)本發(fā)明在組織，血液或體液中對包括海帕西啶原或其片段在內(nèi)的任何海帕西啶蛋白的檢測和定量測量可用于在受影響的患者以及在隨后的病程中證實上述疾病的臨床診斷。本發(fā)明還可用于在用試劑治療期間和之后監(jiān)控所述疾病，其中檢驗所述試劑穩(wěn)定，減弱或預(yù)防所述疾病發(fā)生的能力。
僅僅是出于說明目的，本發(fā)明將通過以下方式說明(a)生成包括海帕西啶原或其片段在內(nèi)的海帕西啶蛋白；(b)生成能特異性地結(jié)合包括海帕西啶原或其片段在內(nèi)的海帕西啶蛋白的抗體；(c)用于診斷所述疾病的亞型或監(jiān)測所述疾病的診斷測定和試劑盒；(d)用于超表達或下調(diào)海帕西啶或海帕西啶原的方法；和(e)所述疾病的治療性處理。
在本發(fā)明的一個方面，申請人提供了用于確定海帕西啶在生理學(xué)條件和在相關(guān)疾病中的作用的方法。在本發(fā)明的另一個方面，申請人提供了抗海帕西啶前體分子的中間部分和C末端的特異性抗體。在本發(fā)明的這一方面，所述抗體被用于確定海帕西啶在人和豚鼠肝臟中的細胞定位。確立了敏感的ELISA方法，它能檢測患有HH，慢性腎機能不全(CRI)和腎貧血(RA)的患者的人血清中的海帕西啶原。申請人業(yè)已描述，海帕西啶原是通過肝細胞基底外側(cè)膜釋放到血液中的，并且受到了腎清除。由于海帕西啶的血清水平在HH和慢性RA中被顯著下調(diào)，所以海帕西啶在受所述疾病的病理生理學(xué)過程中必然發(fā)揮作用。
海帕西啶蛋白的生產(chǎn)從血液和體液中分離海帕西啶蛋白對于本發(fā)明來說，術(shù)語海帕西啶蛋白被定義為與由Pigeon和他的同事公開的推測的氨基酸序列共有大約80％氨基酸序列同一性的任何哺乳動物海帕西啶多肽((2001)J.Biol.Chem.276，7811-7819)。本發(fā)明所提供的海帕西啶蛋白包括海帕西啶原，海帕西啶和它的片段。本發(fā)明所提供的海帕西啶蛋白還包括具有以下特征的蛋白氨基酸序列類似于純化的海帕西啶蛋白的氨基酸序列，不過在它上面天然提供了或人為工程化產(chǎn)生了修飾。例如，海帕西啶肽或DNA序列上的修飾可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員采用已知技術(shù)產(chǎn)生。海帕西啶蛋白序列上的目標(biāo)修飾可以包括在編碼序列上所選氨基酸殘基的改變，取代，置換，插入或缺失。例如，可以缺失一個或多個半胱氨酸殘基或用另一個氨基酸取代，以便改變該分子的構(gòu)象。用于所述改變，取代，置換，插入或缺失的技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知(參見，例如，美國專利號4,518,584)。所述改變，取代，置換，插入或缺失優(yōu)選保留了所述蛋白的需要的活性。對蛋白功能重要的海帕西啶蛋白的區(qū)域是通過本領(lǐng)域公知的各種方法確定的，包括丙氨酸掃描方法，它包括用丙氨酸系統(tǒng)地取代一個或一串氨基酸，然后檢測所得到的包括丙氨酸的變體的生物學(xué)活性。這種類型的分析確定了被取代的氨基酸在生物學(xué)活性上的重要性。
海帕西啶蛋白的生產(chǎn)可以通過如下方法實現(xiàn)，即采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的標(biāo)準技術(shù)，通過從患有血色素沉著病，缺鐵性貧血，含鐵血黃素沉著癥，肝硬化和本文所描述的其他此類疾病的人或動物的組織，血液或體液中分離海帕西啶蛋白。在本發(fā)明中所包括的所述技術(shù)還涉及用于生產(chǎn)海帕西啶蛋白的方法，包括在合適的培養(yǎng)基中生長宿主細胞培養(yǎng)物，并且從所述細胞或生長所述細胞的培養(yǎng)物中純化海帕西啶蛋白。
可以將本領(lǐng)域公知的多種方法用于獲得本發(fā)明的任意一種分離的海帕西啶蛋白。例如，海帕西啶蛋白還可以通過海帕西啶蛋白的氨基酸序列的化學(xué)合成產(chǎn)生(Pigeon等，(2001)J.Biol.Chem.276，7811-7819)，所述氨基酸序列是根據(jù)編碼海帕西啶蛋白的cDNA的克隆和測序推測的。可以將該海帕西啶蛋白序列信息用于預(yù)測要化學(xué)合成的海帕西啶蛋白的片段的合適的氨基酸序列，所述化學(xué)合成采用本領(lǐng)域公知的肽合成方法。所述方法包括由R.Bruce Merrifield設(shè)計的固相方法(Erickson和Merrifield，“Solid-Phase PeptideSynthesis”，in The Proteins，Volume 2，H.Neurath & R.Hill(Eds.)Academic Press，Inc.，New York pp.255-257；Merrifield，(1986)“Solid Phase synthesis”，Science，242341-347)。在上述固相方法中，將氨基酸逐步添加到與諸如聚苯乙烯珠的不溶性基質(zhì)連接的生長中的肽鏈上。這種方法的主要優(yōu)點是，在每一個階段需要的產(chǎn)物都結(jié)合在能夠快速過濾和洗滌的珠上，因此消除了對純化中間產(chǎn)物的需要。所有反應(yīng)都是在一個容器中進行的，由此消除了由于重復(fù)的轉(zhuǎn)移產(chǎn)物所導(dǎo)致的損失。這種化學(xué)肽合成的固相方法可方便地自動化，使得它能夠以良好的產(chǎn)量和純度常規(guī)地合成包括大約50個殘基的肽(Stewart和Young，(1984)Solid Phase PeptideSynthesis，2nded.，Pierce Chemical Co.；Tam等，(1983)J.Am.Chem.Soc.，1056442)。例如，可以合成相當(dāng)于圖9中示出的氨基酸殘基1-50或34-84的海帕西啶蛋白片段。在最簡單的水平上，可通過商業(yè)渠道獲得的肽合成儀特別適合用于生產(chǎn)海帕西啶蛋白的小的肽和片段。例如，片段可用于生成抗天然海帕西啶蛋白的抗體。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可方便地采用用于分離蛋白的已知方法，以便獲得本發(fā)明的分離的海帕西啶蛋白/肽之一。這些方法包括，但不局限于，免疫層析，HPLC，大小排阻層析，離子交換層析，和免疫親和層析。參見，例如，Scopes，Protein PurificationPrinciples andPractice，Springer-Verlag(1994)；Sambrook，等，in MolecularCloningA Laboratory Manual；Ausubel等，Current Protocolsin Molecular Biology。
最后，采用一個或多個反相高效液相層析(RP-HPLC)步驟進一步純化海帕西啶蛋白，所述步驟利用疏水性RP-HPLC介質(zhì)，例如，具有甲基或其他脂族基團的側(cè)基的硅膠。還可以將以各種方式組合的上述某些或所有純化步驟用于提供基本上均一的分離的重組海帕西啶蛋白。由此純化的海帕西啶蛋白基本上不含其他哺乳動物蛋白，并且按照本發(fā)明被定義為分離的蛋白。
海帕西啶蛋白的序列可以利用蛋白測序的Edman降解方法鑒定。該方法每次從肽的氨基末端去掉一個氨基酸殘基，用于隨后通過層析方法進行序列鑒定。參見，例如，描述于以下文獻中的技術(shù)Konigsberg和Steinman，(1977)Strategy and Methods of SequenceAnalysis，in Neurath and Hill(eds.)，The Proteins(3rded.)Yol.3，pp.1-178，Academic Press。另外，按照描述的技術(shù)，通過使用自動化液相氨基酸測序儀可以加快對海帕西啶蛋白的序列分析(Hewick等，(1981)J.Biol.Chem.，2567990-7997；Stein和Undefriend，(1984)Analy.Chem.，1367-23)，以便可以對皮摩爾量的海帕西啶蛋白進行分析。
可以將所述純化的海帕西啶蛋白用于為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的體外結(jié)合測定，以便鑒定能結(jié)合海帕西啶蛋白的分子。所述分子包括，但不局限于，例如，小分子，來自組合文庫的分子，抗體或其他蛋白。然后檢測在所述結(jié)合測定中鑒定的分子在本領(lǐng)域所熟知的體內(nèi)組織培養(yǎng)物或動物模型中的激動劑或拮抗劑活性。簡單地講，將所述分子滴定到多種細胞培養(yǎng)物或動物中，然后檢測細胞/動物死亡或動物/細胞延長的存活。
另外，所述結(jié)合分子可以與毒素，例如，篦麻毒蛋白或霍亂毒素，或與對細胞有毒的其他化合物復(fù)合。然后通過所述結(jié)合分子對海帕西啶蛋白的特異性將所述毒素結(jié)合的分子復(fù)合物導(dǎo)向腫瘤或其他細胞。
重組海帕西啶蛋白的克隆和表達在其他實施方案中，海帕西啶蛋白的生產(chǎn)可以通過重組DNA技術(shù)完成。例如，可以合成合適的海帕西啶核苷酸編碼序列，將其克隆并且在合適的宿主細胞中表達。由于編碼海帕西啶蛋白的DNA序列是已知的(Pigeon等，(2001)J.Biol.Chem.276，7811-7819)，所以可以通過本領(lǐng)域公知的多種方法合成DNA探針，以便篩選用來自患有血色素沉著病，缺鐵性貧血，含鐵血黃素沉著癥，肝硬化和本文所描述的其他疾病的人或動物受試者的肝組織制備的cDNA文庫，以尋找特異性海帕西啶蛋白cDNA。還可采用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法將所述DNA探針用于從所述cDNA文庫中分離整個海帕西啶蛋白基因家族。參見，例如，描述于以下文獻中的技術(shù)Maniatis等，(1982)Molecular Cloning A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，N.Y.，Chapter 7。
通過使用標(biāo)記過的混合的合成的寡核苷酸探針，將雜交方法用于篩選重組克隆，其中，每一種探針都是雜交樣品中特定DNA序列的潛在的完整互補體，所述樣品包括變性的雙鏈DNA異質(zhì)的混合物。為了進行所述篩選，雜交優(yōu)選在單鏈DNA或變性的雙鏈DNA上進行。通過使用用于避免非特異性結(jié)合的嚴格雜交條件，可能，例如，通過讓所述靶DNA與所述混合物中的作為它的完全互補體的單一探針雜交使得特定的DNA克隆能夠進行放射自顯影顯現(xiàn)(Wallace，等，(1981)Nucleic Acids Research，9879)。
另外，可以使用所述蛋白的抗體間接篩選表達文庫，以便尋找具有至少一個表位的海帕西啶蛋白。所述抗體可以是以多克隆或單克隆方式產(chǎn)生的，并且用于檢測指示海帕西啶蛋白存在的表達產(chǎn)物。一般，按照描述于以下文獻中的方法構(gòu)建λgt11文庫，并且進行免疫學(xué)篩選Huynh，等，(1985)(參見DNA CloningA Practical Approach，D.M.Glover，ed.，149)。
編碼海帕西啶蛋白的特定DNA序列的開發(fā)還可以通過以下方法獲得(1)從基因組DNA中分離雙鏈DNA序列，和(2)化學(xué)生產(chǎn)DNA序列，以便提供目標(biāo)蛋白的必需密碼子。
可以利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)擴增海帕西啶家族的單個成員，以便隨后克隆并且表達海帕西啶蛋白cDNA(例如，參見美國專利號4,683,202；4,683,195；4,889,818；Gyllensten等，(1988)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA，857652-7656；Ochman等，(1988)Genetics，120621-623；Triglia等，(1988)Nucl.Acids.Res.，168156；Frohman等，(1988)Proc.Nat’l Acad.Sci.USA，858998-9002；Loh等，(1989)Science，243217-220)。
可以將本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的方法用于構(gòu)建表達載體，該載體包括海帕西啶蛋白或其片段的編碼序列，以及合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號。所述方法包括，體外重組DNA技術(shù)，合成技術(shù)和體內(nèi)重組/遺傳重組。參見，例如，描述于以下文獻中的技術(shù)Maniatis等，1982，Molecular Cloning A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，N.Y.，Chapter 12。
有多種宿主-表達載體系統(tǒng)可用于表達海帕西啶蛋白或其片段。其中包括，但不局限于用包括海帕西啶蛋白或其片段的編碼序列的重組噬菌體DNA，質(zhì)粒DNA或粘粒DNA表達載體轉(zhuǎn)化過的微生物，如細菌；用包括海帕西啶蛋白或其片段的編碼序列的重組酵母表達載體轉(zhuǎn)化過的酵母；用包括海帕西啶蛋白或其片段的編碼序列的重組病毒表達載體(例如，桿狀病毒)感染的昆蟲細胞系統(tǒng)；或用包括海帕西啶蛋白或其片段的編碼序列的重組病毒表達載體(例如，腺病毒，痘苗病毒)感染過的動物細胞系統(tǒng)。
上述表達載體的表達元件的強度和特異性有所不同。依賴于所使用的宿主/載體系統(tǒng)，多種合適的轉(zhuǎn)錄和翻譯元件中的任意一種，包括組成型和誘導(dǎo)型啟動子，都可用于所述表達載體中。例如，當(dāng)在細菌系統(tǒng)中克隆時，可以使用誘導(dǎo)型啟動子，如噬菌體λ的pL，plac，ptrp，ptac(ptrp-lac雜合啟動子)等；當(dāng)在昆蟲細胞系統(tǒng)中克隆時，可以使用諸如桿狀病毒多角體蛋白啟動子的啟動子；當(dāng)在哺乳動物細胞系統(tǒng)中克隆時，可以使用諸如腺病毒晚期啟動子或痘苗病毒7.5K啟動子的啟動子。還可以將通過重組DNA或合成技術(shù)生產(chǎn)的啟動子用于提供插入的海帕西啶蛋白或其片段的編碼序列的轉(zhuǎn)錄。
在酵母中，有多種包括組成型或誘導(dǎo)型啟動子的載體可供使用。有關(guān)綜述可以參見，Current Protocols in Molecular Biology，Vol.2，(1988)Ed.Ausubel等，Greene Publish.Assoc. & WileyInterscience Ch.13；Grant等，(1987)Expression and SecretionVectors for Yeast，in Methods in Enzymology，Eds.Wu & Grossman，(1987)Acad.Press，N.Y.，Vol.153，pp.516-544；Glover，(1986)DNA Cloning，Vol.II，IRL Press，Wash.，D.C.Ch.3；和Bitter，(1987)Heterologous Gene Expression in Yeast，Methodsin Enzymology，Eds.Berger & Kimmel，Acad.Press，N.Y.，Vol.152，pp.673-684；和The Molecular Biology of the YeastSaccharomyces，(1982)Eds.Strathern等，Cold Spring HarborPress，Vols.I and II。為了在酵母中進行互補測定，可以將海帕西啶蛋白或其片段的cDNA克隆到酵母附加體質(zhì)粒(YEp)上，由于酵母2μ環(huán)(mu circle)的存在，所以所述質(zhì)粒能夠在酵母中自主地復(fù)制?？梢詫⒑Ｅ廖鬣さ鞍谆蚱淦涡蛄锌寺〉降闹T如ADH或LEU2的組成型酵母啟動子或諸如GAL的誘導(dǎo)型啟動子的后面(Cloning inYeast，Ch.3，R.Rothstein(1986)In DNA Cloning Vol.11，APractical Approach，Ed.DM Glover，IRL Press，Wash.，D.C.)。構(gòu)建體可以包括同源海帕西啶蛋白mRNA的或相當(dāng)于酵母基因的5’和3’非翻譯區(qū)。YEp質(zhì)粒能夠以高效率轉(zhuǎn)化，并且所述質(zhì)粒是極其穩(wěn)定的?？梢允褂闷渌d體，這些載體能夠促進外源DNA序列整合到酵母染色體上。
可用于表達海帕西啶蛋白或其片段的一種特別好的表達系統(tǒng)是昆蟲系統(tǒng)。在一種這樣的系統(tǒng)中，將苜蓿丫紋夜蛾(Autographacslifornica)核型多角體病毒(AcNPV)用作表達外源基因的載體。所述病毒能在草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)細胞中生長?？梢詫⒑Ｅ廖鬣さ鞍谆蚱淦蔚木幋a序列克隆到所述病毒的非必需區(qū)(例如，多角體蛋白基因)并且置于AcNPV啟動子(例如，多角體蛋白啟動子)的控制之下。多角體蛋白基因的成功的插入，導(dǎo)致了非封閉型重組病毒的生產(chǎn)(即，缺少由多角體蛋白基因編碼的蛋白外殼的病毒)。然后將所述重組病毒用于感染草地夜蛾細胞，在所述細胞中表達插入的基因(例如，參見Smith等，(1983)J.Biol.，46586；Smith，美國專利號4,215,051)。另外，用于桿狀病毒/昆蟲細胞表達系統(tǒng)的材料和方法能夠以試劑盒形式通過商業(yè)渠道獲得，例如，從Invitrogen，San Diego，Calif.，美國獲得(the MaxBatTM試劑盒)，并且所述方法為本領(lǐng)域所熟知，正如Summers和Smith所描述的，Texas Agricultural Experiment Station Bulletin No.1555(1987)，該文獻被收作本文參考。在本文中，能夠表達本發(fā)明的海帕西啶多核苷酸的昆蟲細胞是轉(zhuǎn)化過的。
在將腺病毒用作表達載體的情況下，海帕西啶蛋白或其片段的編碼序列可以與腺病毒轉(zhuǎn)錄/翻譯控制復(fù)合物連接，例如，晚期啟動子和三聯(lián)前導(dǎo)序列。然后通過體內(nèi)或體外重組將該嵌合基因插入腺病毒基因組中。插入所述病毒基因組的非必需區(qū)(例如，E1或E3區(qū))，能得到活的并且能夠在受感染的宿主中表達海帕西啶蛋白或其片段的重組病毒(例如，參見Logan & Shenk，(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.，(USA)813655-3659)。另外，可以使用痘苗病毒7.5K啟動子(例如，參見Mackett等，(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.，(USA)797415-7419；Mackett等，(1984)J.Virol.，49857-864；Panicali等(1982)Proc.Natl.Acad.Sci.，794927-4931)。
為了有效翻譯插入的海帕西啶蛋白或其片段的編碼序列，可能還需要特殊的起始信號。所述信號包括ATG起始密碼子和相鄰的序列。在將包括它自身的起始密碼子和相鄰的序列在內(nèi)的完整的海帕西啶蛋白基因組插入合適的表達載體的情況下，不再需要額外的翻譯控制信號。不過，在只插入了一部分海帕西啶蛋白編碼序列的情況下，必須提供包括ATG起始密碼子在內(nèi)的外源翻譯控制信號。另外，所述起始密碼子必須與海帕西啶蛋白或其片段的編碼序列的讀框同相，以便確保整個插入片段的翻譯。所述外源翻譯控制信號和起始密碼子可以具有各種來源，都可以是天然和合成的。通過包含合適的轉(zhuǎn)錄增強子元件，轉(zhuǎn)錄終止子等可以增強表達效率(參見Bitter等，(1987)Methodsin Enzymol.，153516-544)。
另外，可以選擇宿主細胞系，它能調(diào)節(jié)插入序列的表述，或以所需的特定方式修飾并且加工所述基因產(chǎn)物。在存在某些誘導(dǎo)物的情況下，可以加強由某些啟動子驅(qū)動的表達(例如，對于金屬硫蛋白啟動子來說是鋅和鎘離子)。因此，可以控制遺傳工程改造過的海帕西啶蛋白或其片段的表達。如果克隆的外源基因的蛋白產(chǎn)物對宿主細胞來說是致死的話，這樣做是重要的。另外，蛋白產(chǎn)物的修飾(例如，糖基化)和加工(例如，切割)對于該蛋白的功能來說可能是重要的。不同的宿主細胞具有用于蛋白翻譯后加工和修飾的特征性的和特異性的機制?？梢赃x擇合適的細胞系和宿主系統(tǒng)，以便確保所表達的外源蛋白的正確的修飾和加工。
包括海帕西啶蛋白或其片段的編碼序列并且能表達生物學(xué)活性的海帕西啶蛋白或其片段的基因產(chǎn)物的宿主細胞可以通過至少四種普通方法鑒定(a)DNA-DNA雜交；(b)“標(biāo)記”基因功能的存在或不存在；(c)評估轉(zhuǎn)錄水平，如通過海帕西啶蛋白mRNA轉(zhuǎn)錄物在宿主細胞中的表達所測量的；和(d)檢測海帕西啶蛋白基因產(chǎn)物，如通過免疫測定和通過它的生物學(xué)活性所測量的。
在上述第一種方法中，可以通過DNA-DNA雜交檢測插入所述表達載體的海帕西啶蛋白或其片段的編碼序列的存在，其中使用包括與海帕西啶蛋白的編碼序列或其特定部分同源的核苷酸序列的探針，基本上如最近所描述的(Pigeon等，(2001)J.Biol.Chem.276，7811-7819)。
在第二種方法中，可以根據(jù)特定“標(biāo)記”基因功能(例如，胸苷激酶活性，對抗生素的抗性，對氨甲蝶呤的抗性，轉(zhuǎn)化表型，包含體在桿狀病毒中的形成等)的存在或不存在來鑒定并且選擇重組表達載體/宿主系統(tǒng)。例如，如果海帕西啶蛋白或其片段的編碼序列被插入載體的標(biāo)記基因序列上，可以通過所述標(biāo)記基因功能的不存在來鑒定包括海帕西啶蛋白或其片段的編碼序列的重組體。另外，標(biāo)記基因可以與海帕西啶蛋白或其片段的編碼序列串聯(lián)，其處于用于控制海帕西啶的編碼序列表達的相同或不同啟動子的控制之下。所述標(biāo)記針對誘導(dǎo)或選擇的表達表明了海帕西啶蛋白的編碼序列的表達。
在第三種方法中，可以通過雜交測定評估海帕西啶蛋白或其片段的編碼區(qū)的轉(zhuǎn)錄活性。例如，可以分離RNA，并且通過RNA印跡進行分析，其中使用與海帕西啶蛋白或其片段的編碼序列或其特定部分同源的探針，基本上如文獻中所描述的(Pigeon等，(2001)J.Biol.Chem.276，7811-7819)。另外，可以提取宿主細胞的總的核酸，并且測定其與所述探針的雜交。
在第四種方法中，可以通過免疫學(xué)方法評估海帕西啶蛋白或其片段產(chǎn)物的表達，例如，通過蛋白印跡，免疫測定，如放射免疫沉淀和酶聯(lián)免疫測定等。
一旦鑒定了能表達海帕西啶蛋白或其片段的重組體，就應(yīng)當(dāng)分析所述基因產(chǎn)物。這可以通過基于所述產(chǎn)物的物理學(xué)，免疫學(xué)或功能特性的測定來實現(xiàn)。例如，本發(fā)明的方法包括用于生產(chǎn)海帕西啶蛋白的方法，其中，在能夠表達所編碼的海帕西啶蛋白的條件下培養(yǎng)含有合適的表達載體的宿主細胞，所述載體包括本發(fā)明的海帕西啶多肽?？梢詮乃雠囵B(yǎng)物中回收海帕西啶蛋白，方便地為從培養(yǎng)基中回收，或者從用所述宿主細胞制備的裂解液中回收，并且進一步純化。優(yōu)選的實施方案包括這樣的實施方案其中，通過所述方法生產(chǎn)的蛋白是全長或成熟形式的蛋白。
本發(fā)明還提供了由本發(fā)明的核酸片段或由本發(fā)明的核酸片段的簡并變體編碼的分離的海帕西啶蛋白?！昂啿⒆凅w”表示核苷酸序列與本發(fā)明的核酸片段(例如，ORF)不同的核苷酸片段，不過，由于遺傳密碼的簡并性，它能編碼相同的蛋白序列。本發(fā)明的優(yōu)選核酸片段是能編碼蛋白的Orbs。
還可以從業(yè)已改變成能表達海帕西啶蛋白的細胞中純化本發(fā)明的海帕西啶蛋白。在本文中，當(dāng)通過遺傳操作使細胞能生產(chǎn)海帕西啶蛋白時，該細胞就被改變成能表達需要的多肽或蛋白，所述細胞正常情況下不能產(chǎn)生所述蛋白或者所述細胞正常情況下只能以較低水平產(chǎn)生所述蛋白。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以方便地改進方法，以便將重組或合成序列導(dǎo)入真核或原核細胞并且表達重組或合成序列，以便生成能產(chǎn)生本發(fā)明的海帕西啶蛋白的細胞。
本發(fā)明的海帕西啶蛋白還可以作為轉(zhuǎn)基因動物的產(chǎn)物表達，例如，作為轉(zhuǎn)基因母牛，山羊，豬或綿羊的乳成分，這些動物以包括編碼海帕西啶蛋白的核苷酸序列的體細胞或生殖細胞為特征。
海帕西啶蛋白還可以通過已知的常規(guī)化學(xué)合成生產(chǎn)。通過合成方法構(gòu)建本發(fā)明的海帕西啶蛋白的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。所述合成構(gòu)建的海帕西啶蛋白序列，由于共有天然海帕西啶蛋白的一級，二級或三級結(jié)構(gòu)或構(gòu)象特征，所以可能具有共同的生物學(xué)特性，包括蛋白活性。因此，可將其用作天然的，純化的海帕西啶蛋白的生物學(xué)活性或免疫學(xué)替代物，用于篩選治療性化合物，并且用于開發(fā)抗體的免疫學(xué)方法中。
本發(fā)明的海帕西啶蛋白可以通過在適合表達所述重組蛋白的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化過的宿主細胞來制備。然后可以利用已知的純化方法從所述培養(yǎng)物(即從培養(yǎng)基或細胞提取物中)中純化所得到的表達的海帕西啶蛋白，所述方法如凝膠過濾和離子交換層析。海帕西啶蛋白的純化還可以包括裝有能結(jié)合所述蛋白的試劑的親和柱；在所述親和樹脂上的一個或多個柱步驟，如伴刀豆球蛋白A-瓊脂糖，肝素-toyopearlTM或Cibacrom blue 3GA SepharoseTM；涉及疏水相互作用層析的一個或多個步驟，其中使用諸如二苯醚，丁基醚或丙基醚的樹脂；或免疫親和層析。
另外，本發(fā)明的海帕西啶蛋白還能夠以便于純化的形式表達。例如，它可以作為融合蛋白表達，如麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)，谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)或硫氧還蛋白(TRX)的融合蛋白，或作為His標(biāo)記。用于表達和純化所述融合蛋白的試劑盒可以通過商業(yè)渠道分別從NewEngland BioLab(Beverly，Mass.)，Pharmacia(Piscataway，N.J.)和Invitrogen購買。還可以用表位標(biāo)記海帕西啶蛋白，并且隨后通過使用針對所述表位的特異性抗體進行純化。一種這樣的表位(“FLAG”)可以從Kodak公司(New Haven，Conn.)購買。
預(yù)計保留了完整的或部分蛋白活性(例如，與TfR2受體結(jié)合，與海帕西啶特異性抗體結(jié)合等)并且可用于篩選或其他免疫學(xué)方法的海帕西啶蛋白/肽序列的其他片段和衍生物還可以根據(jù)本發(fā)明由本領(lǐng)域技術(shù)人員容易地制備。本發(fā)明包括這樣的修飾。
無論它是由于完整的基因序列，所述基因序列的一部分的表達所產(chǎn)生的，還是由于為了生產(chǎn)嵌合蛋白而連接在一起的兩個或兩個以上的基因序列而產(chǎn)生的，海帕西啶蛋白或其片段都應(yīng)當(dāng)是免疫反應(yīng)性的。該免疫反應(yīng)性可以通過標(biāo)準免疫學(xué)技術(shù)證實，如放射免疫沉淀，放射免疫競爭或免疫印跡。
能確定海帕西啶蛋白或其片段的抗體的生成可以將本領(lǐng)域所公知的各種方法用于生產(chǎn)針對海帕西啶蛋白的中間部分(20-50位氨基酸)或C-末端表位(65-84位氨基酸)的抗體。海帕西啶特異性抗體能結(jié)合這樣的表位，而不結(jié)合其他已知的序列。所述抗體包括，但不局限于多克隆抗體，單克隆抗體，嵌合抗體，單鏈抗體，F(xiàn)ab片段以及Fab表達文庫。為了生產(chǎn)抗體，可以通過用特定的海帕西啶蛋白，或合成的海帕西啶蛋白注射來對各種宿主動物進行免疫，所述動物包括，但不局限于兔，小鼠，大鼠等?？梢詫⒏鞣N佐劑用于根據(jù)宿主物種增強免疫學(xué)反應(yīng)，包括，但不局限于弗氏(完全和不完全)佐劑，礦物凝膠，如氫氧化鋁，表面活性物質(zhì)，如溶血卵磷脂，pluronic多元醇，聚陰離子，肽，油性乳劑，匙孔血藍蛋白，二硝基苯酚，和潛在有用的人佐劑，如BCG(卡介苗)和小棒桿菌(Corynebacterium parvm)。
本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以用多種溫血動物容易地制備多克隆抗體，如馬，牛，各種家禽，兔，小鼠或大鼠。簡單地講，將海帕西啶蛋白用于通過腹膜內(nèi)，肌內(nèi)，眼內(nèi)或皮下注射對所述動物進行免疫，同時使用諸如弗氏完全或不完全佐劑的佐劑。在經(jīng)過若干次加強免疫之后，收集血清樣品，并且檢測與海帕西啶的反應(yīng)性。特別優(yōu)選的多克隆抗血清能夠在所述測定之一上產(chǎn)生信號，該信號至少比背景強三倍。一旦所述動物的效價達到了對海帕西啶的反應(yīng)性的平臺期，就可以通過每周放血，或通過給所述動物放血方便地獲得較大量的抗血清。
抗海帕西啶的肽的單克隆抗體可以通過使用任何技術(shù)制備，這些技術(shù)可以通過培養(yǎng)物中的連續(xù)的細胞系生產(chǎn)抗體分子。所述技術(shù)包括，但不局限于最初由Kohler和Milstein描述的雜交瘤技術(shù)(Nature，(1975)256495-497)，更近一些的人B-細胞雜交瘤技術(shù)(Kosbor等，(1983)Immunology Today，472)，以及EBV-雜交瘤技術(shù)(Cole等，(1985)Monoclonal Antibody and CancerTherapy，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96)。在本發(fā)明的其他實施方案中，對海帕西啶蛋白/肽特異性的單克隆抗體可以利用最新的技術(shù)在無菌動物體內(nèi)生產(chǎn)(PCT/US90/02545)。根據(jù)本發(fā)明，可以使用人抗體，并且可以通過使用人雜交瘤獲得人抗體(Cote等，(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.，802026-2030)或通過用EBV病毒體外轉(zhuǎn)化人B細胞獲得人抗體(Cole等，(1985)in，Monoclonal Antibody andCancer Therapy，Alan R.Liss，pp.77-96)。實際上，根據(jù)本發(fā)明，可以使用為了生產(chǎn)“嵌合抗體”而開發(fā)的技術(shù)(Morrison等，(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.，816851-6855；Neuberger等，(1984)Nature，312604-608；Takeda等，(1985)Nature，314452-454)，所述技術(shù)將來自具有合適的抗原特異性的小鼠抗體分子的基因與來自具有合適的生物學(xué)活性的人抗體分子的基因剪接在一起；這樣的抗體應(yīng)當(dāng)屬于本發(fā)明。
根據(jù)本發(fā)明，可以對所描述的用于生產(chǎn)單鏈抗體的技術(shù)(美國專利號4,946,778)進行修改，以便生產(chǎn)海帕西啶蛋白特異性單鏈抗體。
本發(fā)明的另一種實施方案采用了所描述的用于構(gòu)建Fab表達文庫的技術(shù)(Huse等，(1989)Science，2461275-1281)，以便能快速并且容易地鑒定具有對海帕西啶蛋白/肽的理想的特異性的單克隆Fab片段。
包括對海帕西啶蛋白的特異性結(jié)合位點的抗體片段可以通過已知技術(shù)生成。例如，所述片段包括，但不局限于F(ab’)2片段，它可以通過用胃蛋白酶消化所述抗體分子生產(chǎn)，以及可以通過還原F(ab’)2片段的二硫鍵產(chǎn)生的Fab片段。
診斷測定和試劑盒本發(fā)明的另一種目的是提供用于診斷測定的試劑，以用于檢測來自患有血色素沉著病，缺鐵性貧血，含鐵血黃素沉著癥，肝硬化和本文所描述的其他此類疾病的個體的海帕西啶蛋白。
在本實施方案的一種模式中，本發(fā)明的海帕西啶蛋白可以用作免疫測定的抗原，以用于檢測患有血色素沉著病，缺鐵性貧血，含鐵血黃素沉著癥，肝硬化和本文所描述的其他此類疾病的個體。本發(fā)明的海帕西啶蛋白，多肽和/或肽可用于本領(lǐng)域已知的任何免疫測定系統(tǒng)中，包括，但不局限于放射性免疫測定，酶聯(lián)免疫吸附測定，“夾心”測定，沉淀素反應(yīng)，凝膠擴散免疫擴散測定，聚集測定，熒光免疫測定，A蛋白免疫測定和免疫電泳測定等。美國專利號4,629,783和它里面所引用的專利也描述了合適的測定方法。
根據(jù)本發(fā)明，針對各種形式的海帕西啶蛋白生產(chǎn)的單克隆抗體或多克隆抗體可用于血液，脊髓液或其他體液的樣品的免疫測定，以便診斷患有血色素沉著病，缺鐵性貧血，含鐵血黃素沉著癥，肝硬化和本文所描述的其他疾病的受試者。
在本發(fā)明的一種實施方案中，通過靜脈切開放血術(shù)從患者體內(nèi)取出血液樣品，并且使該樣品與諸如EDTA的抗凝劑接觸，混合，以600g的速度離心10分鐘，并且排出血漿，正如本領(lǐng)域所公知的，或者通過腰椎穿刺從患者體內(nèi)取出脊髓液樣品。
本文所描述的抗體可以用作多種不同免疫測定的基礎(chǔ)試劑，以便測定海帕西啶蛋白在組織，血液或體液樣品中的存在。一般來說，所述抗體可用于任何類型的免疫測定，無論是定性還是定量測定。其中包括非競爭型的雙位點(two-site)夾心測定和單位點(single site)免疫測定，以及傳統(tǒng)的競爭性結(jié)合測定。
為了便于檢測，以及它的定量性質(zhì)，特別優(yōu)選的是夾心或雙抗體測定，其中存在多種變化形式，所有形式都被認為包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
例如，在標(biāo)準的正向夾心測定中，將未標(biāo)記過的抗體固定在固體基質(zhì)上，例如，微量滴定板孔，并且使要檢測的樣品與所述結(jié)合的分子接觸。在溫育合適的時間段之后，這段時間足以形成抗體-抗原二元復(fù)合物，然后添加用能夠誘導(dǎo)可檢測信號的受體分子標(biāo)記過的第二抗體，并且繼續(xù)溫育足夠時間，以便與位于不同位點的抗原結(jié)合，并且形成抗體-抗原-標(biāo)記的抗體的三元復(fù)合物。將未反應(yīng)的材料洗掉，并且通過觀察信號確定所述抗原的存在，可以通過與含有已知量的抗原的對照樣品比較來對所述信號進行定量。正向夾心測定的變化形式包括同時測定，其中，將樣品和抗體同時添加到所述結(jié)合的抗體中，或包括反向夾心測定，其中，首先組合標(biāo)記過的抗體和要檢測的樣品，溫育，并且添加到未標(biāo)記過的表面結(jié)合抗體上。這些技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，并且進行小的改變的可能性是顯而易見的。在本文中，“夾心測定”意在包括基于所述基本的雙位點技術(shù)的所有變化形式。
對于本發(fā)明的夾心測定來說，唯一的限制因素是兩種抗體對海帕西啶蛋白具有不同的結(jié)合特異性。因此，多種可能的組合是可行的。
作為更具體的例子，在標(biāo)準的正向夾心測定中，第一抗體與固體支持物共價或被動結(jié)合。所述固體表面通常是玻璃或聚合物，最常用的聚合物是纖維素，聚丙烯酰胺，尼龍，聚苯乙烯，聚氯乙烯或聚丙烯。所述固體支持物可以是管，珠，盤或小平板形式的，或其他任何適合進行免疫測定的表面。所述結(jié)合方法為本領(lǐng)域所熟知。在結(jié)合之后，在測試樣品的制劑中洗滌固相-抗體復(fù)合物。然后將一等分試樣含有要檢測的海帕西啶蛋白的體液添加到所述固相基質(zhì)中，并且在25℃下溫育一段時間，所述時間段足以讓所存在的任何海帕西啶蛋白與對海帕西啶蛋白特異性的抗體結(jié)合。然后將第二抗體添加到所述固相復(fù)合物上，并且在25℃下再溫育一段時間，這段時間足以讓所述第二抗體結(jié)合在所述第一抗體-抗原固相復(fù)合物上。所述第二抗體與報道分子連接，它的可視信號被用于指示第二抗體與樣品中任何抗原的結(jié)合。本說明書中所說的“報道分子”表示這樣的分子，由于它的化學(xué)性質(zhì)，所述分子可提供可以分析檢測的信號，這使得能夠檢測抗原-結(jié)合的抗體。檢測必須至少是相對可定量的，以便能夠測定所述樣品中抗原的量，該量可以絕對量形式計算，或者可以通過與含有已知正常水平的抗原的標(biāo)準物(或一系列標(biāo)準物)比較來進行。
在這種類型的測定中最常用的報道分子是酶或熒光團。對于酶免疫測定來說，酶與所述第二抗體綴合，通常是通過戊二醛或高碘酸鹽綴合。不過，很好理解的是，存在多種不同的綴合技術(shù)，這些技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。常用的酶包括辣根過氧物酶，葡萄糖氧化酶，β-半乳糖苷酶和堿性磷酸酶等。與所述特定酶一起使用的底物通常是經(jīng)過選擇的，以便在通過相應(yīng)的酶水解時能產(chǎn)生可檢測的顏色變化。例如，磷酸對硝基苯酯適合用于堿性磷酸酶綴合物；對于過氧化物酶綴合物來說，通常使用1，2-苯二胺或甲苯胺。還可能使用熒光底物，它能產(chǎn)生熒光產(chǎn)物，而不是使用上述顯色底物。在所有場合下，將酶-標(biāo)記過的抗體添加到第一種抗體-海帕西啶蛋白復(fù)合物中，并且讓它與所述復(fù)合物結(jié)合，然后將多余的試劑洗掉。然后將含有所述合適底物的溶液添加到抗體-抗原-標(biāo)記的抗體的三元復(fù)合物中。所述底物與和所述第二抗體連接的酶起反應(yīng)，產(chǎn)生定性的可視信號，可以對該信號進一步地定量，通常通過分光光度測定法進行，以便提供對存在于所述血清樣品中的抗原的量的評估。
另外，可以將諸如熒光素或羅丹明的熒光化合物用化學(xué)方法偶聯(lián)在抗體上，而又不改變它們的結(jié)合能力。在通過用特定波長的光線照射激活時，所述熒光染料-標(biāo)記的抗體能吸收所述光能，誘導(dǎo)所述分子的激發(fā)性狀態(tài)，然后發(fā)射出特有的較長波長的光線。所述發(fā)射似乎是可以用光學(xué)顯微鏡可檢測的特有顏色。對于酶免疫測定(EIA)來說，讓熒光標(biāo)記的抗體與所述第一種抗體-海帕西啶蛋白復(fù)合物結(jié)合。在洗滌未結(jié)合的試劑之后，讓剩余的三元復(fù)合物暴露于具有合適波長的光線，并且觀察到的熒光表示存在所述抗原。免疫熒光和EIA技術(shù)在本領(lǐng)域中都是十分完善的，并且對于本發(fā)明的方法來說是特別優(yōu)選的。不過，還可以使用其他報道分子，如放射性同位素，化學(xué)發(fā)光或生物發(fā)光分子。技術(shù)人員容易理解如何改變所述方法，以便適應(yīng)需要的用途。
另外，所述要檢測的樣品是含有海帕西啶蛋白的人血液或脊髓液，可將其用于單位點免疫測定，其中，它共價或非共價附著在固體基質(zhì)上。讓未標(biāo)記過的抗-海帕西啶蛋白抗體與結(jié)合在所述固體基質(zhì)上的樣品接觸。在溫育適當(dāng)時間之后，該時間足以形成抗體-抗原二元復(fù)合物，然后添加用能夠誘導(dǎo)可檢測信號的報道分子標(biāo)記過的第二抗體，并且繼續(xù)溫育足夠的時間，以便形成抗原-抗體-標(biāo)記過的抗體的三元復(fù)合物。對于單位點免疫測定來說，所述第二抗體可以是普通抗體(即針對免疫球蛋白的異種(zenogeneic)抗體，特別是與報道分子結(jié)合的抗-(IgM和IgG))，它能夠結(jié)合對目標(biāo)海帕西啶蛋白特異的抗體。
可以將海帕西啶基因(突變的或正常的)用于鐵代謝的測定中。所述基因是在來自人或動物受試者、健康受試者的細胞系或原代細胞，或來自其他生物(如嚙齒類動物，昆蟲，細菌，兩棲動物等)的細胞中表達的，有或沒有任何伴隨的分子。例如，可通過使用放射性同位素測量所述細胞對鐵的吸收。另外，還可以測量鐵與海帕西啶基因產(chǎn)物的結(jié)合。所述實驗有助于評估海帕西啶基因和海帕西啶基因產(chǎn)物在由細胞和細胞內(nèi)對鐵的吸收、結(jié)合和轉(zhuǎn)運方面的作用。
治療性處理在本發(fā)明的一個方面，所述海帕西啶診斷方法和試劑盒可用于遺傳學(xué)技術(shù)方法，如用于超表達或下調(diào)海帕西啶。在某些治療用途中，需要下調(diào)海帕西啶基因，突變型海帕西啶基因，海帕西啶蛋白或突變型海帕西啶蛋白的表達和/或功能。例如，在體內(nèi)鐵積累不足的情況下，例如在某些貧血(即，地中海貧血，溶血性貧血，輸血的情況下)中，需要下調(diào)正常海帕西啶基因或正常海帕西啶蛋白。另一方面，在鐵在體內(nèi)超量積累的情況下，需要下調(diào)突變型海帕西啶基因或海帕西啶蛋白。
正如上文所討論的，可以制備對正?；蛲蛔兊暮Ｅ廖鬣さ鞍滋禺惖目贵w。可以將所述抗體用于治療本文所描述的疾病。例如，用于阻斷突變型或正常海帕西啶基因的作用，如果與突變型蛋白相關(guān)的功能是對正常海帕西啶蛋白功能的上調(diào)并且導(dǎo)致鐵在體內(nèi)超量積累的話。類似的，可以將抗體治療性地用于阻斷導(dǎo)致鐵在體內(nèi)積累不足的海帕西啶蛋白的作用。
通過類似方式，正?；蛲蛔冃问降暮Ｅ廖鬣せ蚰軌蛲ㄟ^使用針對所述基因或它的轉(zhuǎn)錄物的反義寡核苷酸來下調(diào)。類似的策略可以按照上文所述與抗體結(jié)合使用。有關(guān)反義寡核苷酸的設(shè)計考慮和用途的特別有價值的綜述，參見Uhlmann等，(1990)Chemical Reviews 90543-584，該文獻的內(nèi)容被收作本文參考。本發(fā)明的反義寡核苷酸可以通過任何公知的化學(xué)寡核苷酸合成方法合成。例如，所述方法一般描述于以下文獻中Winnacker Chirurg(1992)63145。反義寡核苷酸最有利地是通過使用任何可通過商業(yè)渠道獲得的自動化核酸合成儀制備的。一種這樣的裝置——Applied Biosystems 380B DNA合成儀，采用了β-氰乙基亞磷酰胺化學(xué)方法。
由于互補于海帕西啶基因的DNA的完全核苷酸合成是已知的，所以所述cDNA序列的mRNA轉(zhuǎn)錄物也是已知的。因此，可以通過本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的寡核苷酸合成方法制備能夠與所述轉(zhuǎn)錄物的任何部分雜交的反義寡核苷酸。盡管任何長度的寡核苷酸都可用于本發(fā)明中，但短于12個堿基的序列可能在與目標(biāo)mRNA雜交時特異性較低，可能更容易被酶促消化破壞，并且可以通過酶促消化而去穩(wěn)定化。因此，優(yōu)選具有12個或更多個核苷酸的寡核苷酸。長的序列，特別是長度超過大約40個核苷酸的序列在抑制翻譯方面可能不夠有效，這是因為靶細胞對其的吸收降低。因此，優(yōu)選具有12-40個核苷酸的寡聚體，更優(yōu)選15-30個核苷酸，最優(yōu)選18-26個核苷酸。具有18-24個核苷酸的序列是最特別優(yōu)選的。
在本發(fā)明的另一個方面，可以將海帕西啶用于治療本文所描述的疾病，包括用海帕西啶，以及海帕西啶的激動劑或拮抗劑治療受試者。通過改變海帕西啶的濃度和/或抑制海帕西啶與鐵或與運鐵蛋白受體結(jié)合，可以調(diào)節(jié)細胞對鐵的吸收。因此，海帕西啶，以及海帕西啶的激動劑或拮抗劑可用于治療存在鐵代謝紊亂的狀況。例如，所述物質(zhì)可用于治療以下狀況，如血色素沉著病，神經(jīng)變性病，缺血性組織損傷，包括缺血性中風(fēng)或創(chuàng)傷，心臟病和腫瘤，特別是皮膚癌和本文所描述的其他此類疾病。
本發(fā)明還預(yù)期用海帕西啶調(diào)節(jié)鐵代謝的方法。具體地講，本發(fā)明涉及用于治療與鐵代謝紊亂相關(guān)的狀況的方法，包括施用鐵調(diào)節(jié)量的海帕西啶，或海帕西啶的刺激劑，激動劑或拮抗劑。舉例來說，可以用本發(fā)明的方法治療的與鐵代謝相關(guān)的狀況包括血色素沉著病，神經(jīng)變性病，缺血性組織損傷，包括缺血性中風(fēng)或創(chuàng)傷，心臟病和腫瘤，特別是皮膚癌和本文所描述的其他此類疾病。作為海帕西啶的激動劑或拮抗劑的物質(zhì)可以通過以下方法鑒定，即測定所述物質(zhì)對海帕西啶和鐵，或海帕西啶和運鐵蛋白受體TfR1或TfR2的結(jié)合活性的影響，或所述物質(zhì)對海帕西啶在能夠表達海帕西啶的細胞中的表達的影響，所述細胞包括通過遺傳工程改造成能在它們的表面上表達海帕西啶的細胞。
因此，本發(fā)明的一個方面涉及鑒定海帕西啶的激動劑或拮抗劑的方法，包括讓被懷疑是海帕西啶的激動劑或拮抗劑的物質(zhì)與海帕西啶和鐵在海帕西啶能夠與鐵結(jié)合的條件下起反應(yīng)；測量與鐵結(jié)合的海帕西啶的量；并且通過將與鐵結(jié)合的海帕西啶的量與用對照測定的量進行比較來測定所述物質(zhì)的作用。本發(fā)明還涉及鑒定海帕西啶的激動劑或拮抗劑的方法，包括讓被懷疑是海帕西啶的激動劑或拮抗劑的物質(zhì)與海帕西啶和運鐵蛋白受體在海帕西啶能夠與所述運鐵蛋白受體結(jié)合的條件下起反應(yīng)；測量與運鐵蛋白受體結(jié)合的海帕西啶的量；并且通過將與運鐵蛋白受體結(jié)合的海帕西啶的量與用對照測定的量進行比較來測定所述物質(zhì)的作用。
本發(fā)明還涉及鑒定海帕西啶的激動劑或拮抗劑的方法，包括讓被懷疑是海帕西啶的激動劑或拮抗劑的物質(zhì)與能產(chǎn)生海帕西啶的細胞起反應(yīng)，測量由所述細胞表達的海帕西啶的量，并且通過將海帕西啶的表達量與測定的對照的量進行比較來測定所述物質(zhì)的作用。本發(fā)明還涉及用于鑒定由海帕西啶的激動劑或拮抗劑-介導(dǎo)的鐵吸收的方法，包括在存在鐵和不存在運鐵蛋白的情況下溫育能在它表面上表達海帕西啶的細胞和被懷疑是海帕西啶的激動劑或拮抗劑的物質(zhì)，測量吸收到所述細胞中的鐵的量，并且通過將所述細胞的鐵吸收量與在不存在所述底物的條件下來自對照溫育的細胞中的鐵吸收量進行比較來鑒定由海帕西啶的激動劑或拮抗劑介導(dǎo)的鐵吸收。
在本發(fā)明的某些實施方案中，提供了用于治療具有主要為鐵過量疾病或綜合征的癥狀的受試者的海帕西啶肽，所述疾病或綜合征如血色素沉著病或由于次要原因，如反復(fù)輸血導(dǎo)致的其他鐵過量狀況。海帕西啶肽可以是全長的海帕西啶或海帕西啶的某些片段。海帕西啶肽優(yōu)選包括海帕西啶的28-47或70-80位氨基酸殘基。在以下文獻中提供了海帕西啶的推測的氨基酸序列以及基因組和cDNA序列(Krause等，(2000)FEBS Lett.480，147-150；Pigeon等，(2001)J.Biol.Chem.276，7811-7819)，所述文獻被以它們的全文形式收作本文參考。海帕西啶蛋白或其片段可以與β-2-微球蛋白一起施用，如以復(fù)合物形式施用。在某些實施方案中，超過大約20個氨基酸的海帕西啶蛋白是以與β-2-微球蛋白的復(fù)合物形式施用的。
在本發(fā)明的某些實施方案中，提供了海帕西啶蛋白或運鐵蛋白受體的激動劑或拮抗劑。例如，海帕西啶多肽的激動劑和/或運鐵蛋白受體的拮抗劑可用于治療原發(fā)性或繼發(fā)性鐵過量疾病或綜合征，而海帕西啶多肽的拮抗劑，或運鐵蛋白受體的激動劑可用于治療，例如，缺鐵狀況，如貧血。在其他實施方案中，提供了突變型海帕西啶蛋白/肽，它起著野生型海帕西啶蛋白的拮抗劑的作用。拮抗劑或激動劑還可以是針對運鐵蛋白受體或海帕西啶蛋白的中間部分(20-50位氨基酸)或C-末端區(qū)(65-84位氨基酸)的抗體。在本發(fā)明的某些實施方案中，海帕西啶多肽可以作為運鐵蛋白受體的拮抗劑。在本發(fā)明的其他實施方案中，可以利用本領(lǐng)域所熟知的技術(shù)將肽模擬物(peptidomimetic)設(shè)計成海帕西啶蛋白和/或運鐵蛋白受體的拮抗劑或激動劑。
運鐵蛋白受體的配體，無論是拮抗劑還是激動劑，都可利用本文所描述的技術(shù)篩選與運鐵蛋白受體結(jié)合的能力。另外，與海帕西啶結(jié)合運鐵蛋白受體的競爭可以用本領(lǐng)域所熟知的技術(shù)實現(xiàn)。使用本文所描述的技術(shù)，可以篩選海帕西啶蛋白的配體的，或更常見地它的結(jié)合配偶體的，例如，抑制海帕西啶蛋白多肽與β-2微球蛋白復(fù)合的能力，。
在本發(fā)明的某些實施方案中，運鐵蛋白的激動劑或拮抗劑類似地被用于增加或降低轉(zhuǎn)運到細胞中的鐵的量，如轉(zhuǎn)運到患者的肝細胞或淋巴細胞中。例如，藥物效力，治療劑，激動劑或拮抗劑可以通過篩選程序鑒定，其中，在體外細胞系統(tǒng)中監(jiān)控調(diào)節(jié)作用。能表達各種突變型海帕西啶蛋白/肽的宿主細胞系統(tǒng)適合用作第一篩選系統(tǒng)。可以通過以下方法評估候選藥物，即與所述細胞一起溫育，并且測定依賴于海帕西啶基因的細胞功能或測量正確的海帕西啶蛋白折疊或加工。所述測定還需要測量受體樣活性，鐵轉(zhuǎn)運和代謝，基因轉(zhuǎn)錄或其他上游或下游生物學(xué)功能，正如通過研究海帕西啶基因功能所證實的。
另外，可以使用無細胞系統(tǒng)?？梢詫⒓兓暮Ｅ廖鬣さ鞍字亟ǔ扇斯つせ蛐∨荩⑶以跓o細胞系統(tǒng)中進行藥物篩選。所述系統(tǒng)通常更方便，并且本身更適合高通量的篩選和自動化。
用于確定海帕西啶蛋白純度的標(biāo)準包括蛋白化學(xué)領(lǐng)域的標(biāo)準。其中包括N-末端氨基酸測定，單向和雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳和銀染色。純化的蛋白適合用于與確定二級和三級結(jié)構(gòu)相關(guān)的研究中，如輔助藥物設(shè)計，并且用于所述分子的生物學(xué)功能的體外研究中。
在本發(fā)明的某些實施方案中，可以根據(jù)對已知海帕西啶蛋白的結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)性的了解設(shè)計藥物來調(diào)節(jié)海帕西啶基因和海帕西啶蛋白的活性。為此，通過利用X-射線晶體學(xué)，計算機輔助的分子建模(CAMM)，定量或定性結(jié)構(gòu)活性關(guān)系(QSAR)，和類似技術(shù)進行的合理的藥物設(shè)計還可以集中在藥物發(fā)現(xiàn)方面。合理化設(shè)計使得能夠預(yù)測能與海帕西啶蛋白相互作用并且修飾海帕西啶蛋白活性的蛋白或合成結(jié)構(gòu)。所述結(jié)構(gòu)可以是在生物學(xué)系統(tǒng)中化學(xué)合成或表達的。該方法業(yè)已在以下文獻中進行過綜述Capsey等，Genetically EngineeredHuman Therapeutic Drugs，Stockton Press，New York(1988)。另外，可以設(shè)計，合成組合文庫，并且用于篩選程序。
為了施用基于或源于本發(fā)明的治療劑，可以理解的是，可以將合適的載體，賦形劑和其他試劑摻入所述制劑中，以便提供改善了的轉(zhuǎn)移，送遞，耐受性等。
在所有藥物學(xué)化學(xué)家所普通公知的配方集中可以找到多種合適的制劑Remington’s Pharmaceutical Sciences，(15th Edition，Mack Publishing Company，Easton，Pa.(1975))，特別是其中的第87章，作者Blaug，Seymour。例如，所述制劑包括粉末，糊劑，軟膏，膠凍，蠟，油，脂類，無水吸收基質(zhì)，水包油或油包水乳劑，乳劑聚乙二醇(carbowax)(具有各種分子量的聚乙二醇)，半固體凝膠和含有聚乙二醇的半固體混合物。
上述任何制劑都可能適用于本發(fā)明的處理和治療，前提是所述制劑中的活性劑不會被所述制劑滅活并且所述制劑是生理學(xué)上相客的。
本發(fā)明并不局限于本文所描述的實施方案，并且可以在不超出本發(fā)明范圍的前提下進行修飾或改變。
實施例實施例1海帕西啶在人肝臟中的表達。
組織和組織制備用于本研究的人肝臟樣品(n＝7)是在對患有肝臟轉(zhuǎn)移的成年受試者進行半肝切除術(shù)之后獲得的。健康組織在4％多聚甲醛中固定，以便用于免疫組織化學(xué)，或者馬上在液氮中冷凍，以便用于RT PCR，蛋白印跡和免疫熒光分析。
對豚鼠(n＝7)和小鼠(n＝5)進行麻醉，隨后通過頸脫位法處死。切除來自肝臟，骨骼肌和心臟的組織樣品，并且馬上在液氮中冷凍，以便進行蛋白印跡分析或在多聚甲醛中固定。
肽合成，免疫步驟和抗體。
根據(jù)公開的海帕西啶原序列(Krause等，(2000)FEBS Lett.480，147-150；Pigeon等，(2001)J.Biol.Chem.276，7811-7819)，采用標(biāo)準Fmoc方法合成了作為C末端酰胺的肽海帕西啶-(28-47)和海帕西啶-(70-84)(Cetin等，(1994)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，2935-2939)。使用間馬來酰亞胺基苯甲酰-N-羥基琥珀酰亞胺酯將肽偶聯(lián)在匙孔血藍蛋白上，并且用每一種肽綴合物(Eurogentec，Seraing，比利時)對兩只SPF兔(Charles River IffaCredo)進行免疫。在通過ELISA檢測效價之后，將三種抗血清[抗海帕西啶(70-84)的EG(1)-HepC以及各自抗海帕西啶(28-47)的和EG(1)-HepN和EG(2)-HepN]用于本研究(圖1)(海帕西啶28-47PQQ TGQ LAE LQP QDR AGA RA SEQ(SEQ ID NO3)，海帕西啶70-84CGC CHR SKC GMC CKT(SEQ ID NO4))。正如通過BLAST P2檢索所證實的，用于生成所述抗血清的肽表位與任何迄今為止所報道過的蛋白都沒有同源性。
抗小鼠TfR2的BT-TFR21 S抗體(BioTrend，Cologne，德國)是針對小鼠TfR2-α(TfR2)的細胞質(zhì)N-末端產(chǎn)生的，其可變剪接成α和β同種型，參見Fleming等，(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA97，2214-2219)，它與人TfR2-α的相應(yīng)的區(qū)域具有68％的序列同源性。所述抗體是在兔體內(nèi)產(chǎn)生的，并且進行親和純化。
在人肝臟中進行表達分析。
用Qiagen RNA easy試劑盒進行RNA分離，包括DNA消化。按以前描述的方法進行逆轉(zhuǎn)錄(RT)-PCR分析(Kulaksiz等，(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99，6796-6801；Kulaksiz等，(2002)Am.J.Pathol.161，655-664)，使用沿5’→3’方向提供的以下引物和說明人海帕西啶(GenBank數(shù)據(jù)編號.NM0211175)，5’-CTG CAACCC CAG GAC AGA G-3’(SEQ ID NO 5)和5，GGA ATA AAT AAG GAAGGG AGG GG-3’，(SEQ ID NO 6)，相當(dāng)于147-165和338-316號核苷酸位置。人TfR2(#AF067864)，5’-GAT TCA GGG TCA GGG AGG TG-3’(SEQ ID NO 7)和5’-(GAA GGG GCT GTG ATT GAA GG-3’(SEQ IDNO 8)；相當(dāng)于2496-2515和2694-2675號核苷酸位置。在94℃下進行4分鐘的最初的變性之后，對反應(yīng)物進行35輪以下熱程序94℃進行30秒，60℃進行30秒和72℃進行30秒；在該程序之后在72℃下進行最后5分鐘的延伸步驟。擴增產(chǎn)物在溴化乙錠-染色的1.8％的89mM Tris/89mM硼酸/2mM EDTA(pH 8.3)瓊脂糖凝膠上電泳。通過合適的對照排除了顯著水平的基因組DNA的擴增。
在HepG2細胞中進行表達分析人肝細胞瘤HepG2細胞是從德國微生物和細胞培養(yǎng)物保藏所(German Collection of Microorganisms and Cell Culture)(Braunschweig，德國)獲得的，并且在37℃下，在5％CO2中，在RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco，Karlsruhe，德國)中生長，該培養(yǎng)基補充了10％(體積/體積)熱滅活的FBS，青霉素(100單位/ml)和鏈霉素(100mg/ml)。通過RTPCR分析細胞，其中使用上面所提到的引物說明。為了進行免疫熒光顯微鏡術(shù)，讓HepG2細胞在玻璃載玻片上生長，在甲醇中固定4分鐘，并且通過在PBS中制備的0.5％TritonX-100進行透化。在與海帕西啶(1∶2000)和TfR2抗體(1∶1000)一起溫育60分鐘之后，與Cy-3-綴合的抗-兔抗體(Dianova，Hamburg，德國)一起溫育，在0lympus AX70顯微鏡下，使用合適的濾色片進行免疫染色研究。
從血清，組織和HEPG2細胞中提取海帕西啶和TfR2。
申請人使用從患有慢性腎衰竭的患者體內(nèi)收集的血清作為更大的海帕西啶來源。為了提取海帕西啶，用0.01N HCl以1∶1的比例稀釋20ml的血清樣品，并且用濃鹽酸將pH調(diào)整到3.0。將冷凍組織和HepG2細胞在0.5M乙酸中混合，并且按描述的方法煮沸8分鐘(Cetin等(1994)Proc Natl Acad Sci USA 91，2935-2939；Cetin等(1995)Proc Natl Acad Sci USA 92，5925-5929)。使用Ultra-Turrax勻漿器(Janke & Kunkel，Staufen，德國)進行勻漿之后，在4℃下以20,000Xg的速度對所述樣品進行20分鐘離心，并且通過0.45-μm孔徑大小的濾器對上清液進行過濾。為了富集蛋白，將血清樣品，細胞和總的組織提取物加樣到十八烷甲硅烷基(C18)的Sep-Pak柱體(cartridge)(Waters，Massachusetts)上。用0.01M HCl洗滌該柱，并且用30％(體積/體積)2-丙醇/30％(體積/體積)甲醇/0.01M HCl進行洗脫(Cetin等(1994)Proc Natl Acad Sci USA 91，2935-2939)。對蛋白級分進行冷凍干燥，并且在-80℃下保存待用。為了進行TfR2分析，在含有100mM NaCl，50mM Tris-HCl，pH 7.4，10％甘油，1％Triton X-100，2mg/ml亮抑酶肽，2mg/ml胃酶抑制劑和1mM苯基甲基磺酰氟的Tris-HCl緩沖液中對組織和細胞進行勻漿，并且在4℃下以100,000g的速度離心30分鐘。
免疫印跡分析。
為了進行蛋白印跡分析，在94℃下，在樣品緩沖液中溫育蛋白提取物7分鐘，該緩沖液含有4％(重量/體積)SDS(Merck，Darmstadt，德國)，50mM Tris-HCl(pH 8.15)，1mM EDTA，3.24mM二硫蘇糖醇(Roth，Karlsruhe，德國)，12.5％(重量/體積)甘油(Merck)和0.002％溴酚藍(Merck)。為了檢測海帕西啶，按照公開的方法使用16.5％ N-[2-羥-1，1-二羥甲基乙基]甘氨酸(tricine)-SDS-聚丙烯酰胺凝膠(Cetin等，(1994)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，2935-2939；Kulaksiz等，(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99，6796-6801；Kulaksiz等，(2002)Am.J.Pathol.161，655-664；Cetin等，(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92，5925-5929)。用8％SDS-聚丙烯酰胺凝膠進行TfR2免疫吸印。在電泳之后，通過半干印跡將蛋白轉(zhuǎn)移到基于疏水性聚偏1，1-二氟乙烯的膜(Pall，Portsmouth，England)上。所述膜與上述稀釋比例的海帕西啶或TfR2抗體溫育過夜。在含有10mM Tris-HCl(pH 8.0)，150mM NaCl和0.05％Tween 20的Tris緩沖的鹽溶液中洗滌之后，在與堿性磷酸酶綴合的山羊抗-兔抗體(稀釋比例為1∶50,000；Sigma)一起溫育之后顯現(xiàn)各自的免疫反應(yīng)性蛋白，其中使用氮藍四唑和5-溴-4氯-3-吲哚磷酸作色原(Sigma)。在使相應(yīng)的肽免疫原與所述抗體進行預(yù)溫育之后，對蛋白印跡上的免疫反應(yīng)進行了特異性阻斷。通過合適的對照排除了與第二山羊抗-兔抗體的交叉反應(yīng)性(Cetin等(1994)Proc NatlAcad Sci USA 91，2935-2939；Kulaksiz等(2002)Proc Natl AcadSci USA 99，6796-6801；Kulaksiz等(2002)Am J Pathol 161，655-664；Cetin等(1995)Proc Natl Acad Sci USA 92，5925-5929)。
免疫組織化學(xué)和免疫熒光。
在4℃下在4％多聚甲醛中將組織固定18小時。在分級乙醇系列中脫水之后，將樣品包埋在石蠟中。通過抗生物素蛋白-生物素-過氧化物酶復(fù)合物(ABC)技術(shù)和前述溫育序列對石蠟切片(5μm)進行海帕西啶(抗體EG(1)-HepN，EG(2)-HepN和EG(1)-HepC，分別以1∶2000的比例稀釋)或TfR2(抗體BT-TFR21-S，以1∶1000的比例稀釋)的免疫染色(Kulaksiz等，(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99，6796-6801；Kulaksiz等，(2002)Am.J.Pathol.161，655-664)。所述切片在4℃下與各自的抗體一起溫育24小時，然后與生物素化的抗-兔IgG(Jackson Immunoresearch，West Grove，PA，美國)一起溫育30分鐘，稀釋比例為1∶200。所述切片隨后用預(yù)先形成的生物素-過氧化物酶/鏈霉抗生物素蛋白的復(fù)合物(JacksonImmunoresearch)溫育30分鐘，它是在PBS中稀釋的(終濃度為生物素-過氧化物酶，0.7μg/ml；鏈霉抗生物素蛋白，5μg/ml)。通過在用0.05M Tris-HCl pH 7.6制備的07mM二氨基聯(lián)苯胺鹽酸鹽/0.002％H2O2中溫育所述切片，來顯現(xiàn)抗原-抗體結(jié)合位點。
為了進行免疫熒光顯微鏡術(shù)，用冷凍切片機(cryotome)(FrigoCut2800E；Leica，Nussloch，德國)制備了來自人肝臟的組織切片(2-4μm)，風(fēng)干2小時，并且在冷丙酮(-20℃)中固定10分鐘。按以前描述的方法進行雙重免疫熒光標(biāo)記(Rost等，(1999)Hepatology 29，814-821)，其中使用特異性海帕西啶抗體(以1∶1000的比例稀釋)和針對小管P-糖蛋白(Centocor，Malvern，PA)的單克隆抗體C219(同前)，稀釋比例1∶30。在與各自的抗血清一起溫育之后，通過與Cy2-(1∶200)和Cy3-(1∶600)標(biāo)記的針對小鼠和兔IgG的標(biāo)記的抗體(Dianova，Hamburg，德國)一起溫育進行染色。用裝有數(shù)碼相機(color view 12，軟件成像系統(tǒng)SIS，Munster，德國)和分析軟件(SIS，Munster，德國)的Olympus AX70顯微鏡拍攝顯微照片。
特異性對照。
通過按公開方法進行的對照排除了依賴于方法的非特異性(Cetin等，(1994)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91，2935-2939；Cetin等，(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92，5925-5929)。通過利用同種和異種抗原性肽預(yù)吸收所述抗體檢測抗體特異性(6.25-100μg/ml的抗血清)(Kulaksiz等，(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99，6796-6801；Kulaksiz等，(2002)Am.J.Pathol.161，655-664)。用濃度低到6.25μg/ml的同種抗原進行的抗體預(yù)吸收能完全阻斷肝臟組織和細胞中的免疫染色，而用濃度最高為100μg/ml的異種抗原進行的抗體預(yù)吸收，對免疫染色沒有作用。
海帕西啶ELISA競爭結(jié)合測定。
血清樣品是從26位健康個體(13位女性，13位男性，年齡為26-64歲，平均年齡為43歲)，從35位在HFE上具有純合的C282Y突變的HH患者(14位女性，21位男性，年齡為23步-82歲，平均年齡為54歲)(進行(15位患者)和不進行(20位患者)放血療法)，并且從患有腎機能不全進行長期血液透析的59位患者(33位女性，26位男性，年齡為26-96歲，平均年齡為57歲)體內(nèi)獲得的。在樣品收集期間，要注意患者沒有感染?；加心I機能不全的19位患者的組患有以血紅蛋白最大值為11g/dl為特征的腎貧血。所有患有慢性腎機能不全的患者每周用3,000IE重組人促紅細胞生成素(EPO)治療2-3次。將10ml血液樣品抽入冰冷的血清試管中，并且在4℃下以2500×g的速度離心10分鐘。用96孔微量滴定板重復(fù)進行測定，所述微量滴定板用200μl/孔的兔抗-海帕西啶抗體EG(2)-HepN進行涂覆，所述抗體以1∶4000的比例稀釋在含有40mM Tris-HCl(pH 7.3)，100mM NaCl的Tris緩沖的鹽溶液(TBS)中。將50μl含有各種量的合成肽(0，20，100，500和1000ng/ml)的標(biāo)準物或人血清樣品和150μl N-末端生物素化的海帕西啶-(28-47)(Peptide SpecialtyLaboratories GmbH，Heidelberg，德國)(2ng/孔)添加到每一個孔中，并且在室溫下溫育1小時。在用TBST(含有0.05％Tween 20的TBS)洗滌之后，通過鏈霉抗生物素蛋白-過氧化物酶(Dako，Hamburg，德國)檢測生物素化的抗原-抗體復(fù)合物，其中使用底物四甲聯(lián)苯胺(DRG Instruments GmbH，Marburg，德國)；用1M H2SO4終止顯色反應(yīng)，并且在450/630nm的波長下讀出該溶液的消光值。
將四個目標(biāo)組測量的海帕西啶值輸入EXCEL電子制表軟件，并且用SAS WIN Version 8.2進行評估。通過對診斷組進行以下概括統(tǒng)計歸納所述測量值觀察的數(shù)目，算術(shù)平均，標(biāo)準差，最小值，中間值和最大值。通過成對的Wilcoxon U-檢驗分析各組之間可能的差異。將顯著性水平α設(shè)定為5％(0.05)。通過斯皮爾曼等級相關(guān)(Spearmanrank correlation)分析海帕西啶原和鐵，鐵蛋白或運鐵蛋白之間的相關(guān)性。
在肝臟和HepG2細胞中表達海帕西啶和TfR2。
RT-PCR分析證實，海帕西啶是在人肝臟中表達的(Gehrke等(2003)Blood MS#2002-11-3610.R2)。類似地，在HepG2細胞中檢測到了192-bp的預(yù)期的PCR產(chǎn)物(對照)，業(yè)已證實它能表達海帕西啶(Pigeon C等(2001)J Biol Chem 276，7811-7819；Gehrke等(2003(圖2，A)。另外，RT-PCR分析明確揭示了TfR2是在人肝臟和HepG2細胞中表達的(數(shù)據(jù)未顯示)。
蛋白印跡分析中，所有海帕西啶抗體[EG(1)-HepN，EG(2)-HepN和EG(1)-HepC]都一致地在人和豚鼠肝臟的提取物中鑒定到大約10kDa的免疫反應(yīng)性帶。這種肝臟肽與由海帕西啶抗體在HepG2細胞的勻漿物中識別的免疫反應(yīng)性帶共遷移(圖2，B-D)。所有抗體還在用人和豚鼠肝臟提取物和HepG2細胞提取物加樣的所有泳道中鑒定了大約20kDa的免疫反應(yīng)性蛋白。對骨骼肌提取物(對照)進行的蛋白印跡分析證實了既沒有10kDa的免疫反應(yīng)性帶也沒有20kDa的免疫反應(yīng)性帶(圖2，B-D)。用TfR2抗體BT-TFR21-S進行的蛋白印跡分析導(dǎo)致了預(yù)期的小鼠肝臟提取物中大約105kDa蛋白的染色(Fleming等，(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97，2214-2219)。在人肝臟和HepG2細胞的提取物中，通過相同的抗體識別了大約95kDa的免疫反應(yīng)性TfR2和在較低程度上識別了大約105kda的免疫反應(yīng)性蛋白(數(shù)據(jù)未顯示)。在心臟中未檢測到免疫反應(yīng)性(對照組織)。
在HepG2細胞中進行的免疫熒光。
使用表位特異性抗-海帕西啶抗體，通過免疫熒光分析研究了海帕西啶肽在HepG2細胞中的表達。所有抗體都能類似地鑒定HepG2細胞中的海帕西啶，導(dǎo)致了強免疫反應(yīng)性(圖3)。與海帕西啶的細胞定位吻合，TfR2抗體檢測到了相同細胞中的TfR2(數(shù)據(jù)未顯示)。
海帕西啶和TFR2的細胞和亞細胞定位。
用各種區(qū)域特異性抗體進行的免疫組織化學(xué)研究，都一致地將海帕西啶定位于人肝臟的肝細胞中(圖4)。肝巨噬細胞，內(nèi)皮細胞，膽管和血管系統(tǒng)完全缺乏海帕西啶免疫反應(yīng)性。相同的抗體還在豚鼠肝臟中檢測到了強的海帕西啶-免疫反應(yīng)性(圖4)。肝小葉在海帕西啶免疫反應(yīng)性方面是非均一的在肝小葉內(nèi)，海帕西啶免疫反應(yīng)性細胞主要位于門管周區(qū)域，并且海帕西啶陽性細胞的頻率從門管三聯(lián)體向中央靜脈連續(xù)降低(圖5)。顯然，在海帕西啶陽性細胞之間存在顯著的細胞間差異盡管大部分肝細胞對海帕西啶是呈強陽性的，但其他細胞只表現(xiàn)出微弱的染色或?qū)Ｅ廖鬣ね耆珱]有反應(yīng)(圖5)。在亞細胞水平上，通過免疫組織化學(xué)證實海帕西啶免疫反應(yīng)性局限于肝細胞的基底外側(cè)(＝竇狀)膜區(qū)域；在各個細胞的頂膜區(qū)域上沒有發(fā)現(xiàn)免疫反應(yīng)性(圖2)。類似的，免疫熒光分析證實了在基底外側(cè)膜區(qū)域?qū)Ｅ廖鬣さ膹姷拿庖叻磻?yīng)性；通過用抗小管P-糖蛋白的C219抗體進行的雙重染色發(fā)現(xiàn)在頂膜區(qū)域無免疫反應(yīng)性(Rost等(1999)Hepatology29，814-821)(數(shù)據(jù)未顯示)。
與海帕西啶的定位相應(yīng)，蛋白-特異性抗體BT-TFR21-S在人和小鼠肝臟中檢測到了TfR2。在細胞水平上，TfR2存在于肝細胞的基底外側(cè)膜上，它揭示了與免疫反應(yīng)性強度相關(guān)的顯著細胞間差別(數(shù)據(jù)未顯示)。還在肝小葉中觀察到了不均一性，免疫反應(yīng)性沿中央靜脈到門管三聯(lián)體增強。
檢測人血漿中的海帕西啶前肽。
用所述特異性N-末端海帕西啶抗體EG(2)-HepN開發(fā)了高可再現(xiàn)性的和靈敏度的穩(wěn)定的海帕西啶原ELISA測定(DRG InstrumentsGmbH，Marburg，德國)。如圖6所示，ELISA發(fā)現(xiàn)了在4-400ng/ml范圍內(nèi)的最高的分辨率，在該范圍內(nèi)，確定了人血清中海帕西啶原的濃度定。作為特異性對照，用異種肽進行了在ELISA中的溫育。在使用異種肽時沒有觀察到交叉反應(yīng)性。
通過蛋白印跡分析證實了海帕西啶原在血液中的存在。所有海帕西啶抗體都能鑒定人血清提取物中的分子量為大約10kDa的單個海帕西啶免疫反應(yīng)性帶，該帶與肝臟組織和HepG2細胞提取物中的免疫反應(yīng)性海帕西啶共遷移(圖2，B-D)。
ELISA特征。
該測定的靈敏度為3.95ng/ml。與最低標(biāo)準物(20ng/ml)之間不存在重疊。溶解在零標(biāo)準物中的人海帕西啶原的系列稀釋液與海帕西啶原ELISA的標(biāo)準曲線平行分布，回收范圍在90.6-111.6％之間。回收率表達為根據(jù)預(yù)期的濃度觀察到的百分比，其值為91.8-105.7％。在該測定范圍內(nèi)檢測的三種海帕西啶原的濃度下，證實了很好的精確度(總CV＜10％)。
在遺傳性血色素沉著病，慢性腎機能不全和腎貧血中海帕西啶原的水平。
采用靈敏的海帕西啶ELISA，在26位志愿者的健康對照組中檢測到了在51.6-153.4ng/ml血清范圍內(nèi)的海帕西啶原(平均值±SE；106.2±32.1ng/ml)(圖7，表1)。在患有HH的患者體內(nèi)，海帕西啶原的濃度為12.1-153.9ng/ml血清(平均值±SE；70.2±38.1ng/ml)。與對照受試者相比上述濃度明顯較低(P＜0.05)(圖7，表1)。在患有CRI的患者血清中海帕西啶原濃度在31.1-471.3ng/ml范圍內(nèi)變化(平均值±SE；1481±88.0ng/ml)，并且與對照受試者(P＜0.01)和HH受試者(P＜0.001)相比，明顯增加了。相反，與患有CRI的患者相比，在患有RA的血液透析患者體內(nèi)的海帕西啶原顯著降低了(115.0±53.1ng/ml；范圍，20.5-252.4ng/ml)(P＝0.05)(圖7，表1)。
在我們的樣品中(來自HH，CRI和RA的血清)，沒有發(fā)現(xiàn)海帕西啶原和鐵，鐵蛋白或運鐵蛋白飽和之間的顯著相關(guān)性(圖8)。對與零的差別的檢測證實無顯著性。
表1成對的U-檢驗的結(jié)果(P-值)

討論用特定引物進行的RT-PCR分析顯示海帕西啶是在HepG2細胞(對照)中高度表達的，這種細胞是充分分化的肝細胞癌細胞系(Aden等(1979)Nature 282，615-616)，它在很多方面都表現(xiàn)出正常肝細胞的生理學(xué)。使用成功地應(yīng)用于HepG2細胞中的合適的引物說明和組合，RT-PCR研究證實了海帕西啶在人肝臟中的表達。三種能識別海帕西啶前體分子上的不同表位的不同的抗體(圖1)不僅在HepG2細胞中，而且還在兩個物種人和豚鼠的肝臟提取物中一致地通過蛋白印跡分析鑒定了大約10kDa的免疫反應(yīng)性肽。這種免疫反應(yīng)性肽的表觀分子量與根據(jù)cDNA序列推測的海帕西啶激素原的推測的分子量吻合(Pigeon C等(2001)J Biol Chem 276，7811-7819)(圖1)。有趣的是，通過所有海帕西啶抗體在HepG2細胞以及人和豚鼠肝臟的提取物中都檢測到大約20kDa的第二個免疫反應(yīng)性帶，但是在對照組織中缺乏該帶。這種免疫反應(yīng)性蛋白可能反映了二聚體類型的海帕西啶。實際上，在以前的研究中，描述了海帕西啶-25而不是海帕西啶-20的聚集特性和形成多聚體的可能性(Hunter等(2002)J Biol Chem277，37597-37603)。
用區(qū)域-和分子結(jié)構(gòu)域-特異性海帕西啶抗體進行的免疫細胞化學(xué)研究發(fā)現(xiàn)了在HepG2細胞中存在強的免疫反應(yīng)性，證實了海帕西啶在所述細胞中的表達，正如通過分子生物學(xué)技術(shù)業(yè)已證實的(Gehrke等(2003)Blood MS#2002-11-3610.R2)。用上述不同的海帕西啶抗體進行的免疫組織化學(xué)和免疫熒光研究顯示，在人和豚鼠肝臟中，海帕西啶特異性地定位于主要位于門管三聯(lián)體周圍的肝細胞中。通過不僅存在于人和豚鼠肝臟而且還存在于HepG2細胞中的不同的區(qū)域-特異性抗體進行的一致性的染色，表明了肝細胞是海帕西啶的來源。海帕西啶免疫反應(yīng)性沿門管周區(qū)域到中央靜脈減弱。在門管小葉中的這種帶狀分布可能具有功能重要性，因為門管周肝細胞具有通向門靜脈的第一個通道，將富含鐵的血液從腸帶走。特別是，在海帕西啶陽性細胞之間存在海帕西啶免疫反應(yīng)性強度方面的明顯的細胞間差異，它有可能反映了海帕西啶表達或分泌方面的細胞間差異。
在亞細胞水平上，海帕西啶集中在肝細胞的基底外側(cè)膜區(qū)域。在頂膜區(qū)域不存在免疫反應(yīng)性。海帕西啶在亞細胞水平上的不連續(xù)的分布模式可能推測海帕西啶通過基底外側(cè)向肝竇狀隙中定向釋放。這種定向分泌途徑通過在人血清中檢測到海帕西啶激素原(圖1)得到了進一步的證實(參見下文)；因此，以上發(fā)現(xiàn)提供了肝細胞可能以內(nèi)分泌形式通過海帕西啶原的分泌調(diào)節(jié)鐵代謝的進一步的證據(jù)。
為了分析TfR2的表達和細胞分布，以及各自的目標(biāo)膜區(qū)域，在細胞水平上進行了RT-PCR，蛋白印跡和免疫組織化學(xué)研究。正如在以前的研究中所證實的，RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)TfR2是在人肝臟中高水平表達的(Fleming等，(2000)Proc.Natl.Acadi.Sci.USA 97，2214-2219)。這種蛋白的存在是通過蛋白印跡研究證實的，使用了對人和小鼠TfR2特異的BT-TFR21-S抗體。在小鼠肝臟提取物中檢測到大約105kDa的免疫反應(yīng)性蛋白；這種免疫反應(yīng)性的TfR2的分子量略大于預(yù)期的95kDa(Fleming等，(2000)Proc.Natl.Acadi.Sci.USA 97，2214-2219)，并且可能體現(xiàn)了以前所描述的某些翻譯后修飾(Kawabata等，(2000)J.Biol.Chem.275，16618-16625)。不過，在相同條件下，TfR2-抗體能鑒定預(yù)期的95kDa分子量的蛋白，而對人肝臟提取物中的105kDa的蛋白具有較低的親和力。人和小鼠肝臟的免疫印跡之間的所述差別，可能是由于物種間差異造成的。
免疫組織化學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，TfR2位于人和小鼠肝臟的肝細胞中；與海帕西啶的細胞分布吻合，所述蛋白-特異性抗體只能將TfR2定位在基底外側(cè)膜上。TfR2的這種膜-特異性結(jié)合的類型特別表明了TfR2的基底外側(cè)激活，它與鐵代謝相關(guān)，這通過結(jié)合雙鐵運鐵蛋白，并且介導(dǎo)運鐵蛋白-結(jié)合的鐵從血液到肝細胞中的吸收來實現(xiàn)(Philpott，C.C.(2002)Hepatology 35，993-1001；Subramaniam等，(2002)Cell Biochem.Biophys.36，235-239)。特別是，對于TfR2觀察到了與海帕西啶類似的小葉帶狀分布，其中免疫反應(yīng)性沿門管周區(qū)域到中央靜脈減弱。
由于在以前的研究中業(yè)已討論了在細胞水平上海帕西啶和TfR2之間的相互作用(Nicolas等，(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA98，8780-8785；Frazer等，(2002)Gastroenterology 123，835-844)，分析了海帕西啶和TfR2在HepG2細胞中的共同存在，該細胞是一種充分分化的肝細胞癌細胞系(Aden等，(1979)Nature 282，615-616)，在很多方面表明了正常肝細胞的生理學(xué)。使用成功地應(yīng)用于人的肝臟的合適的引物說明和組合進行的RT-PCR研究，鑒定了海帕西啶和TfR2在HepG2細胞中的表達。在翻譯水平上，通過蛋白印跡研究證實了海帕西啶和TfR2在HepG2細胞中的存在，該研究得到了具有正確分子量的免疫反應(yīng)性蛋白帶，其與來自肝臟組織的相應(yīng)的免疫反應(yīng)性帶共遷移。所述各個蛋白在HepG2細胞中的共定位得到了免疫細胞化學(xué)的特別的驗證，該方法使用了相應(yīng)的區(qū)域-和分子結(jié)構(gòu)域-特異性抗體。所有抗體證實了在HepG2細胞中的海帕西啶標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)了這些細胞中的顆粒狀免疫反應(yīng)性模式，這種模式推測所述肽定位于小的分泌小泡中，這點業(yè)已通過電子顯微鏡術(shù)在肝細胞中得到證實(Schwartz等，(1985)EMBO J.4，899-904)。TfR2是通過免疫細胞化學(xué)方法定位于HepG2細胞上的，具有特殊的分布模式。
根據(jù)在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上現(xiàn)有的數(shù)據(jù)，海帕西啶和TfR2是在肝臟中共表達的，并且共定位于肝細胞的基底外側(cè)膜區(qū)域中。除了TfR2和海帕西啶在細胞水平上的共同定位之外，還檢測了這些分子在肝小葉內(nèi)的類似的分布，其中免疫反應(yīng)性集中在門管周區(qū)域，并且在朝向中央靜脈的方向上具有減弱的染色。所述蛋白在共同的(基底外側(cè))膜區(qū)域中的協(xié)同表達以及它們類似的小葉帶狀分布，說明可能存在所述調(diào)節(jié)性肽激素海帕西啶和通過TfR2的運鐵蛋白-結(jié)合的鐵吸收之間的形態(tài)功能偶聯(lián)。實際上，不同的數(shù)據(jù)證實海帕西啶和TfR2之間的相互作用。首先，運鐵蛋白飽和的改變可能通過TfR2感測到，所述改變調(diào)節(jié)肝臟海帕西啶的表達(Philpott，C.C.(2002)Hepatology 35，993-1001)。其次，正如對人肝臟進行定量RT-PCR分析所證實的，TfR2的肝臟表達明顯與通過運鐵蛋白飽和調(diào)節(jié)的海帕西啶表達相關(guān)(S.G.Gehrke，H.Kulaksiz等，未發(fā)表的數(shù)據(jù))。第三，海帕西啶和TfR2共定位于共同的細胞膜區(qū)域，并且揭示了相同的小葉分布，其中在門管周區(qū)域具有強的免疫反應(yīng)性，如果在該位點發(fā)生了消除TfR2(Fleming等，(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99，10653-10658)以及海帕西啶(Nicolas等，(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98，8780-8785)的表達，還有海帕西啶(Zhou等，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，2492-2497；Levy等，(1999)Blood 94，9-11)和B2m(Santos等，(1996)J.Exp.Med.184，1975-1985)的表達的突變，就會發(fā)生肝臟鐵過量。第四，據(jù)報道發(fā)生在TfR2基因中的突變導(dǎo)致了血色素沉著病(Camasehella等，(2000)Nat.Genet.25，14-15)；這可能是由于減弱了的海帕西啶表達所導(dǎo)致的，后者反過來又導(dǎo)致了鐵吸收的增強(Nicolas等，(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98，8780-8785)。
海帕西啶和TfR2在HepG2細胞中的同時存在，以及它們在肝臟中共同的極化定位和小葉分布可能表明了海帕西啶是固有的肝臟肽，在形態(tài)功能上與TfR2偶聯(lián)，它是由運鐵蛋白飽和調(diào)節(jié)的，并且反過來又調(diào)節(jié)海帕西啶表達。因此，預(yù)計根據(jù)對海帕西啶的信號傳導(dǎo)途徑的研究能得到相關(guān)發(fā)現(xiàn)。
由于造血組織和鐵儲存位點，如肝臟，能向腸細胞傳遞表明身體對飲食鐵的需求的信號(Philpott C.C.(2002)Hepatology 35，993-1001)，所以海帕西啶是從肝細胞中分泌出來的候選信號傳導(dǎo)因子，并且調(diào)節(jié)腸的鐵吸收。不過，在本發(fā)明之前，對血液中存在某些分子形式的海帕西啶尚有爭論(Krause等(2000)FEBS Lett 489，147-150；Park等(2001)J Biol Chem 276，7806-7810；Hunter等(2002)J Biol Chem 277，37597-37603)。
為了分析海帕西啶的激素原是否分泌到血液中，并且評估在健康志愿者和患有不同疾病的患者的人血清中的海帕西啶原水平的范圍，通過采用針對海帕西啶激素原產(chǎn)生的N-末端抗體EG(2)-HepN開發(fā)了ELISA。盡管C-末端抗體EG(1)-HepC在斑點印跡，蛋白印跡，免疫組織化學(xué)和免疫熒光實驗(圖1-4)中發(fā)現(xiàn)了特異性結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)，但是在ELISA中沒有獲得免疫反應(yīng)性。海帕西啶的緊湊的折疊模式以及它在血液中的三級結(jié)構(gòu)，可能導(dǎo)致了EG(1)-HepC抗體不能鑒定循環(huán)中的海帕西啶。
用抗體EG(2)-HepN進行的ELISA的特征是高再現(xiàn)性，穩(wěn)定性和靈敏度，檢測極限為3.95ng/孔，以及在4-400ng/ml范圍的高分辨率；在該范圍中海帕西啶濃度可被確定。在來自健康個體(n＝26)的人血清中，測得海帕西啶原在51.6-153.4ng/ml范圍內(nèi)(平均值±SE；106.2±32.1ng/ml)，這一結(jié)果與已知調(diào)節(jié)性肽激素的濃度一致，并且比人尿中海帕西啶的濃度高大約11倍(Park等(2001)J BiolChem 276，7806-7810)。有趣的是，表現(xiàn)出寬范圍的海帕西啶原的測得的濃度表明所述肽可能受到了強的調(diào)節(jié)。
所述cDNA結(jié)構(gòu)提示，海帕西啶作為84aa的前肽原翻譯，對它進行N-末端加工，形成20-25個氨基酸的肽(Park等(2001)(圖1和9)。盡管信號序列切割位點的強的共有序列位于Gly24和Ser25之間，這會產(chǎn)生60個殘基的前肽，但以前的研究沒有從諸如肝臟組織和血液的天然來源中分離到較大的前肽(Park等(2001))。除了技術(shù)上的難度之外，前肽轉(zhuǎn)化酶(convertase)在肝臟中的大量存在，可能導(dǎo)致了對某些前肽分離的抑制。在這一方面，有兩個研究小組進行的最新的研究業(yè)已表明，在血液(Krause等(2000)FEBS Lett 489，147-150)和在尿(Park等(2001)J Biol Chem 276，7806-7810)中的人循環(huán)形式的海帕西啶由所述蛋白的C-末端20-25個氨基酸組成。不過，用針對海帕西啶前體的N-末端制備的特異性抗體進行的本發(fā)明的ELISA測定表明，除了20-25個氨基酸的加工形式之外，海帕西啶激素原是在人血液中分泌并且循環(huán)的。實際上，通過蛋白印跡分析證實了海帕西啶原向血液中的潛在釋放。所有海帕西啶抗體在人血清的提取物中都鑒定了大約10kDa的單個海帕西啶帶，它與肝臟和HepG2細胞的組織提取物中的免疫反應(yīng)性海帕西啶(陽性對照；圖1)是共遷移的。沒有檢測到小于10kDa的海帕西啶片段。海帕西啶原在人血清中的存在，表明肝細胞能分泌海帕西啶的激素原，這能通過內(nèi)分泌途徑減弱飲食鐵吸收。
為了分析海帕西啶在患有鐵過量患者體內(nèi)的作用，本發(fā)明提供了在HFE中的C282Y突變純合的35位HH患者血清中的海帕西啶濃度，在接受研究的所有HH患者中檢測到典型的鐵過量特征。在這些個體內(nèi)海帕西啶濃度沒有如以前所推想的那樣增加，以便減弱腸的鐵吸收(Fleming和Sly(2001)Proc Natl Acad Sci USA 98，8160-8162)。在HH患者血清中的海帕西啶原水平得到了意外的下調(diào)，這不僅發(fā)生在未治療過的患者中，而且還發(fā)生在每周一次進行放血療法的個體中。與健康志愿者相比，海帕西啶原濃度顯著降低，從106.2降低到70.2ng/ml血清。在治療過的和未治療過的HH患者之間沒有發(fā)現(xiàn)差異。上述發(fā)現(xiàn)與以前的HH研究一致，表明了肝臟海帕西啶表達在hfe剔除小鼠(Ahmad等(2002)Blood Cells Mol Dis 29，361-366；Muckenthaler等(2003)Nat Genet 34，102-107)和患有HFE-相關(guān)血色素沉著病的患者中明顯減弱。它們還與體外研究吻合，證實原代人肝細胞和HepG2細胞的鐵加載能下調(diào)海帕西啶mRNA(Gehrke等(2003)BloodMS#2002-11-3610.R2；Nemeth等(2003)Blood 101，2461-2463)。由于盡管鐵過量，鐵吸收在HH患者中也增強(Pietrangelo A.(2002)Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 282，G403-414；PhilpottC.C.(2002)Hepatology 35，993-1001；Anderson和Powe11(2002)Int J Hematol 76，203-207)，并且組成型海帕西啶表達抑制了血色素沉著病的小鼠模型中的鐵過量(Nicolas等(2003)Nat Genet 34，97-101)，所以推測海帕西啶調(diào)節(jié)作用在HH患者中受到破壞。海帕西啶的較低的濃度明顯不能充分抑制較高的腸的鐵吸收。另外，根據(jù)肝臟海帕西啶表達在hfe剔除小鼠(Ahmad等(2002)Blood Cells MolDis 29，361-366；Muckenthaler等(2003)Nat Genet 34，102-107)以及在HH患者(Bridle等(2003)Lancet 361，669-673)中的顯著減弱的發(fā)現(xiàn)，盡管鐵過量在HH患者中海帕西啶原上調(diào)仍然缺乏，表明了HFE可能參與了血清海帕西啶水平的調(diào)節(jié)。
盡管以前的研究業(yè)已證實了尿的海帕西啶排泄與血清鐵蛋白濃度密切相關(guān)(Nemeth等(2003)Blood 101，2461-2463)，但在本研究中，在HH或透析患者體內(nèi)沒有發(fā)現(xiàn)循環(huán)中的海帕西啶原和血清鐵和鐵蛋白水平之間的相關(guān)性，同樣，沒有檢測到海帕西啶原和運鐵蛋白飽和之間的相關(guān)性，有人認為這種飽和能調(diào)節(jié)肝臟海帕西啶的表達(Gehrke等(2003))，盡管接受研究的HH患者沒有受到貧血，缺氧或炎癥的影響，這體現(xiàn)了海帕西啶的影響參數(shù)。以上數(shù)據(jù)提示，通過鐵儲存調(diào)節(jié)血清中海帕西啶原的水平量，涉及到復(fù)雜的間接作用(Nemeth等(2003)Blood 101，2461-2463)。
由于海帕西啶還可從尿中分離，所以本發(fā)明提供了對海帕西啶在腎機能不全患者體內(nèi)的調(diào)節(jié)作用的評估。與HH患者和健康受試者不同，CRI患者血清中的免疫反應(yīng)性海帕西啶原的濃度顯著提高，從健康受試者體內(nèi)的106.2ng/ml提高到148.1ng/ml。透析患者體內(nèi)海帕西啶原水平的提高，提示腎臟可能參與了這種循環(huán)肽的代謝和/或消除。不過，目前尚不清楚尿中的海帕西啶僅僅是從血液中過濾的還是從腎臟中產(chǎn)生的。根據(jù)本發(fā)明，不能排除海帕西啶至少部分是從腎臟中釋放的可能性，因為它還出現(xiàn)在腎臟小管細胞中(Kulaksiz等(2003)數(shù)據(jù)未發(fā)表)。
本發(fā)明提供了對患有RA的透析患者的海帕西啶原血清水平的測定，這種病是人們公認的漸進性腎衰竭的并發(fā)癥，它以常色的正常紅細胞為特征。與健康受試者相比，在患有RA患者體內(nèi)的免疫反應(yīng)性海帕西啶原濃度沒有明顯更高(平均115.0ng/ml)。盡管在這些患者的末期腎機能不全導(dǎo)致了所述肽激素的積累，但是海帕西啶原水平明顯低于沒有貧血的透析患者的水平(平均148.1ng/ml)。根據(jù)本發(fā)明得出的結(jié)論是，海帕西啶在RA中的調(diào)節(jié)作用不同于在炎癥或肝腺瘤的貧血中的調(diào)節(jié)作用。海帕西啶原在RA中的下調(diào)作用，反映了所述肽的反應(yīng)性生理學(xué)調(diào)節(jié)作用，以便增強腸的鐵吸收和鐵從網(wǎng)狀內(nèi)皮巨噬細胞中的釋放。本發(fā)明提出，盡管進行了EPO治療，在患有CRI而沒有貧血的患者組中海帕西啶原增加了。因此，得出的結(jié)論是由于血液減少，在RA中的海帕西啶減少，這可能是海帕西啶下調(diào)的原因(Nicolas等(2002)J Clin Invest 110，1037-1044)。
本發(fā)明提供了用于測量人血清中海帕西啶原水平的ELISA。該測定方法是非侵入性的，并且便于實施，因此適合常規(guī)操作。進行海帕西啶原測定，是因為它的精確度，靈敏度，可再現(xiàn)性，以及對人血清樣品的海帕西啶-(28-47)的準確測定。采用本發(fā)明的ELISA，使得第一次能夠檢測并且確定患有幾種鐵代謝疾病的患者體內(nèi)的海帕西啶原。需要其他研究以便鑒定海帕西啶原在各種鐵狀態(tài)中的作用的確切分子機制。本發(fā)明還提出海帕西啶激動劑和拮抗劑應(yīng)當(dāng)是預(yù)防和治療鐵紊亂的潛在藥物。
為了理解海帕西啶的作用，對這種肽的細胞起源和信號傳導(dǎo)途徑的了解是必要的。在這一方面，本發(fā)明描述了在人和豚鼠肝臟中的海帕西啶免疫反應(yīng)性，其中，它定位于肝細胞的基底外側(cè)區(qū)域中。以前的研究業(yè)已推測了這些細胞和吸收性腸細胞(enterocyte)之間的可能的聯(lián)系(Hunter等，(2002)J.Biol.Chem.，M205305200；Anderson等，(2002)Biochem.Soc.Trans.30，724-726)。本發(fā)明描述了海帕西啶原在人血漿中的檢測，因此表明了肝細胞分泌海帕西啶激素原，這有可能通過內(nèi)分泌途徑減弱飲食鐵的吸收。另外，在HepG2細胞中檢測到海帕西啶，其中，還發(fā)現(xiàn)了新發(fā)現(xiàn)的2型運鐵蛋白受體(數(shù)據(jù)未顯示)。
用于對人或動物血清和其他體液中的海帕西啶進行定量測量的酶免疫測定。
在本發(fā)明的一種實施方案中，采用了海帕西啶酶免疫測定(“EIA”)。EIA是基于競爭原理的固相酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)。用抗海帕西啶-(28-47)的多克隆兔抗-海帕西啶抗體對96孔微量滴定板的微量滴定孔進行涂覆。存在于所述樣品中的未知量的海帕西啶原與固定量的與生物素分子綴合的海帕西啶-(28-47)競爭固定在所述孔上的海帕西啶抗體的結(jié)合位點。在溫育一個小時之后，洗滌所述微量滴定板，以便終止所述競爭反應(yīng)。在隨后的溫育中，用鏈霉抗生物素蛋白辣根過氧物酶檢測結(jié)合的生物素分子。在溫育半小時之后，再次洗滌所述平板。加入底物溶液，海帕西啶的濃度與測得的光密度成反比。
材料微量滴定孔用抗-海帕西啶抗體涂覆的孔(96孔)；試劑生物素綴合物(與生物素綴合的海帕西啶)7ml；參考標(biāo)準物組，各1.0ml；0，20，100，500，1000，2000ng/ml；海帕西啶原對照，低和高，2小瓶(冷凍干燥物)；試劑酶復(fù)合物(與辣根過氧物酶(“HRP”)綴合的鏈霉抗生物素蛋白)14ml；試劑底物溶液-HS-TMB，14ml；終止溶液，0.5M H2SO4，14ml；洗滌溶液，40X，30ml；微量滴定板讀出器(450±10nm)(例如，DRG Instruments MicrotiterplateReader)；具有50和100μl的一次性管尖的精確微量移液管；標(biāo)準電冰箱；吸水紙；去離子水。
盡管業(yè)已根據(jù)優(yōu)選材料對本實施方案進行了說明，但本發(fā)明領(lǐng)域的技術(shù)人員可以理解的是，可以將其他材料用于本發(fā)明。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠理解可以將除了生物素/鏈霉抗生物素蛋白之外的互補性結(jié)合部分，以及除了辣根過氧化物酶/過氧化物以外的酶/底物組合用于本發(fā)明。
保存條件。
當(dāng)在2-8℃下保存時，完整的試劑在有效期都能保持反應(yīng)性。不要使用超過有效期的試劑。微量滴定孔必須在2-8℃下保存。一旦箔袋破裂，就必須小心地再次將它嚴密地封閉。在破裂的，但是嚴密封閉的裝有干燥劑的塑料拉鏈小袋中的狀態(tài)下，所述涂覆的微量滴定孔的免疫反應(yīng)性能穩(wěn)定大約6周時間。
樣品收集和制備。
應(yīng)當(dāng)將人或動物血清或EDTA血漿用于本測定。沒有必要對所述生物學(xué)樣品進行特殊預(yù)處理。所述樣品可以在2-8℃下保存長達24小時，并且可以在-20℃或更低溫度下冷凍以保存更長時間。不要使用總體上發(fā)生溶血的或總體上脂血的(lipemic)樣品。對于其他樣品材料來說，可能必須采用特殊的提取方法。
所述測定的性能一般說明所有試劑和樣品在使用之前必須能夠回溫到室溫。所有試劑必須在不起泡的情況下混合。
一旦開始測定，所有步驟必須不間斷地完成。
將新的一次性塑料移液管管尖用于每一種試劑，標(biāo)準物或樣品，以便避免交叉污染。為了分配所述底物溶液和終止溶液，避免使用具有金屬部分的移液管。
將標(biāo)準物和樣品吸到所述孔的底部。為了轉(zhuǎn)移酶綴合物和終止溶液，推薦將移液管保持所述孔上方的垂直位置，并且將相應(yīng)的溶液分配到所述孔的中央，以便使酶綴合物與樣品或標(biāo)準物完全混合，并且使終止溶液與底物溶液完全混合。
在開始測定之前，建議準備好所有試劑，去掉蓋子，將所有需要的孔固定在固定器上等。這樣能確保每一個移液步驟具有相同的所用時間而又沒有中斷。
作為一般原則，酶促反應(yīng)與時間和溫度成線性比例。這樣使得插值法可能適用于固定的物理化學(xué)條件。如果在測定中零標(biāo)準物的吸光度低于1.0或高于微量滴定板分光光度計的性能上限，就可以將最終的顏色的酶促形成的溫育時間相應(yīng)地延長或縮短到30或10分鐘。由于在每一個處理中測定了校準器，所以吸光度變化不會影響結(jié)果。
所述底物溶液應(yīng)當(dāng)是無色的或淺藍色或淺綠色的。如果所述溶液是深藍色的，所述試劑就是不穩(wěn)定的，并且必須棄掉。
在與底物溶液溫育期間，避免陽光直接照射在微量滴定板上。
試劑制備。
參考標(biāo)準物和對照用1.0ml雙蒸水(bidistilled water)重建冷凍干燥的標(biāo)準物/對照小瓶的內(nèi)含物。注意重建的標(biāo)準物/對照在2-8℃下能穩(wěn)定6天時間。為了更長時間的保存，在-20℃下冷凍。洗滌溶液將去離子水添加到40x濃度的洗滌溶液(含量30ml)中，達到1200ml的終體積。稀釋過的洗滌溶液在室溫下能穩(wěn)定2周時間。
測定步驟。
將需要數(shù)目的涂覆的條固定在固定器上。
將50μl海帕西啶標(biāo)準物分配到合適的孔中。
將50μl樣品分配到選擇的孔中。
將50μl生物素綴合物分配到每一個孔中。
充分混合所述平板10秒鐘。重要的是確保在該步驟中的完全混合。
在室溫下溫育60分鐘。
用力抖出所述孔的內(nèi)含物。
用稀釋洗滌溶液(400μl/孔)漂洗所述孔3次。讓所述孔猛烈撞擊吸水紙，以便排除殘余的液滴。
將100μl鏈霉抗生物素蛋白HRP復(fù)合物添加到所有孔中。
在室溫下溫育30分鐘。
用力抖出所述孔的內(nèi)含物。
用稀釋洗滌溶液(400μl/孔)漂洗所述孔3次。讓所述孔猛烈撞擊吸水紙，以便排除殘余的液滴。
以定時的間隔將100μl的底物溶液添加到每一個孔中。
在室溫下溫育15分鐘。
通過向每一個孔中添加100μl的終止溶液終止酶促反應(yīng)，時間間隔與步驟10相同，并且測定每一個孔在450±10nm波長下的吸光度。
最終的反應(yīng)穩(wěn)定性。
推薦在步驟15之后30分鐘之內(nèi)對所述孔進行讀數(shù)。
結(jié)果的計算。
可以使用能夠在450±10nm波長下測定吸光度的所有微孔讀出器。通過以下方法獲得每一個樣品的睪酮值a.使用線性-線性或半對數(shù)坐標(biāo)紙，通過將每一種參考標(biāo)準物的平均吸光度(Y)對它相應(yīng)的以ng/ml為單位的濃度(X)作圖來制做標(biāo)準曲線。為了制做標(biāo)準曲線，推薦使用四參數(shù)對數(shù)(logistic)函數(shù)。
b.通過根據(jù)該標(biāo)準曲線進行簡單的插值法推算，利用每一種樣品的平均吸光度測定相應(yīng)的睪酮值，如果必要的話，乘以最初的樣品稀度。
DRG ELIZA MAT 3000和DRG回歸程序使得能夠讀出，并且利用四參數(shù)對數(shù)函數(shù)進行計算機輔助的解釋。
標(biāo)準曲線的例子。
以下數(shù)據(jù)只是用于說明的目的，并且不是要用于取代在測定時產(chǎn)生的數(shù)據(jù)。

性能特征靈敏度。
圖6表示用于循環(huán)的人海帕西啶原標(biāo)準曲線的代表性的ELISA，示出了以ng/ml為單位的海帕西啶-(28-47)的濃度，以及ELISA溶液在450nm波長下的消光值。
表2DRG HEPCIDIN ELISA試劑盒的方法流程圖

通過平均值減去零標(biāo)準物的21次重復(fù)(n＝21)分析的2SD(SD＝0.055)計算分析靈敏度。
所述測定的靈敏度為3.95ng/ml。通過用零標(biāo)準物稀釋具有不同海帕西啶水平的樣品(血清)，評估所述測定的線性。通過ELISA測定稀釋樣品中的海帕西啶含量。對每一種樣品進行三種稀釋，并且計算百分比回收率。

在血清樣品的三種不同的濃度下估計了海帕西啶的分析回收率。將逐漸加大量的未標(biāo)記過的海帕西啶(50ng/ml，250ng/ml，500ng/ml)添加到具有各種起始海帕西啶濃度的樣品中。測定每一種樣品(未加料(spiked)和加料的)。測量海帕西啶濃度，并且計算百分比回收率。

通過對具有不同海帕西啶含量的三種對照樣品進行重復(fù)測量(n＝12)，確定測定內(nèi)的精度(在處理內(nèi))的變動。
樣品1平均值＝426.7；SD＝20.2；CV(％)＝4.69樣品2平均值＝210.7；SD＝8.58；CV(％)＝4.07樣品3平均值＝110.7；SD＝4.74；CV(％)＝4.28通過對三種不同試劑盒批次中的三種不同的對照樣品進行重復(fù)(n＝23)測量(3x)，確定測定間精度(處理間)的變動。
樣品1平均值＝431.96；SD＝20.8；CV(％)＝4.82樣品2平均值＝216.17；SD＝14.44；CV(％)＝6.68樣品3平均值＝109.8；SD ＝10.72；CV(％)＝9.76.
實施例2海帕西啶在人腎臟中的表達海帕西啶是在遠端腎小管中表達的，并且釋放到尿中普遍相信的是，鐵體內(nèi)穩(wěn)態(tài)主要是通過對飲食鐵的吸收在胃腸道中控制的，不過，最近的研究顯示腎臟也參與了鐵代謝。由于鐵調(diào)節(jié)和抗微生物肽海帕西啶最初是從人尿中分離的，所以申請人研究了海帕西啶在哺乳動物腎臟中的細胞和亞細胞定位，并且開發(fā)了用于分析血清和尿中海帕西啶原濃度的ELISA測定。
通過RT-PCR，蛋白印跡和免疫細胞化學(xué)用海帕西啶特異性多克隆抗血清在人、小鼠和大鼠腎臟中證實了海帕西啶的表達和細胞定位。通過靈敏的ELISA測定了它的血清和尿濃度。
海帕西啶是在人，小鼠和大鼠腎臟中表達。用區(qū)域-特異性抗血清進行的蛋白印跡分析，鑒定了大約9.5kDa的肽，相當(dāng)于海帕西啶原的表觀分子量。定位研究發(fā)現(xiàn)了海帕西啶是在腎皮質(zhì)和腎外部髓質(zhì)遠端小管中表達的。在亞細胞水平上，海帕西啶定位于分泌型小管細胞的頂膜區(qū)域中，根據(jù)它在尿中的額外存在，很顯然它是從頂端釋放到尿中的。在患有CRI的患者體內(nèi)測定到了較高水平的海帕西啶原(156.8ng/ml，健康志愿者104.2ng/ml)，表明了腎臟可能代謝和/或消除循環(huán)激素。
根據(jù)海帕西啶在哺乳動物腎臟中的表達，申請人得出的結(jié)論是，鐵調(diào)節(jié)激素海帕西啶是固有的腎臟肽，它不僅是由腎臟消除/代謝的，而且還是在腎小管系統(tǒng)中合成的，并且通過管腔釋放到尿中。海帕西啶在腎臟中的定位，暗示了這種肽在腎小管系統(tǒng)中的調(diào)節(jié)作用。
前言最新的研究業(yè)已發(fā)現(xiàn)了異常的海帕西啶表達(Muckenthaler等，(2003)Nat Genet，34102-107)以及在HFE-相關(guān)的血色素沉著病中受到破壞的海帕西啶調(diào)節(jié)(Bridle等，(2003)Lancet，361669-673；和Kulaksiz等，(2003)Gut，待發(fā)表)以及海帕西啶突變與嚴重的青少年血色素沉著病的相關(guān)(Roetto等，(2003)NatGenet，3321-22)。根據(jù)以上發(fā)現(xiàn)，業(yè)已提出了海帕西啶是鐵體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵成分，它起著小腸中鐵吸收和鐵從巨噬細胞中釋放的負調(diào)節(jié)劑的作用(Nicolas等(2002)Proc Natl Acad Sci USA 99，4596-4601)。
盡管大部分研究集中在海帕西啶生產(chǎn)的主要位點肝臟中海帕西啶的調(diào)節(jié)和功能方面(Park等；Kulaksiz等，(2003)Gut，待發(fā)表)，但積累的證據(jù)表明，這種肽還可能在腎臟和尿道中起作用(同前，Wareing等，(2003)Am Physiol Renal Physiol，Epub ahead ofprint；和Ferguson等，(2003)Kidney Int，641755-1764)。人們普遍相信，鐵體內(nèi)穩(wěn)態(tài)主要是在胃腸道中在從飲食中吸收的水平上控制的。現(xiàn)有的見解是，在生物內(nèi)不存在鐵的排泄途徑。不過，最近的研究業(yè)已發(fā)現(xiàn)，腎臟在鐵體內(nèi)穩(wěn)態(tài)中起著重要作用(Wareing等，(2003)Am J Physiol Renal Physiol，Epub ahead of print；Ferguson等，(2003)Kidney Int，641755-1764；和Gunshin等，(1997)Nature，388482-488)；血清中顯著比例的鐵可用于由腎小球超濾，并且從腎小球中過濾的大部分鐵被再次吸收(Wareing等，(2000)JPhysiol，524.2581-586)。
因此，可以合理地分析海帕西啶是否還作為局部肽存在于腎臟中。因此，申請人業(yè)已制備了針對海帕西啶前體分子的各種表位的抗血清，并且在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上研究了三種哺乳動物物種。我們的發(fā)現(xiàn)表明，除了腎臟中血清海帕西啶的消除之外，所述肽還作為內(nèi)在激素在哺乳動物腎臟的遠端小管細胞中表達，并且通過管腔釋放到尿中，表明了海帕西啶在腎臟和/或尿道中的調(diào)節(jié)作用。
材料和方法組織和組織制備用于本研究的人腎臟樣品(n＝5)是在患有腎上腺樣瘤的成年患者體內(nèi)進行腎臟切除術(shù)之后獲得的。用于本研究的人肝臟樣品(n＝7)是在患有肝臟轉(zhuǎn)移的成年患者體內(nèi)進行半肝切除術(shù)之后獲得的(Kulaksiz等，(2003)Gut，待發(fā)表)。在4％多聚甲醛或在布安氏固定劑中固定健康組織，以便進行免疫組織化學(xué)分析，或馬上在液氮中冷凍以用于進行RT-PCR和蛋白印跡。對大鼠(n＝5)和小鼠(n-5)進行麻醉，隨后通過頸脫位法處死。將來自腎臟和肝臟的組織樣品切除，并且馬上在液氮中冷凍，以便進行RT-PCR或蛋白印跡分析，或者在多聚甲醛中固定。
肽合成，免疫步驟和抗體根據(jù)公開的海帕西啶原序列(Krause等，(2000)FEBS Lett，480147-150；Pigeon等，(2001)J BiolChem，2767811-7819)，使用標(biāo)準Fmoc方法合成了作為C末端酰胺的肽海帕西啶-(28-47)和海帕西啶-(70-84)(Kulaksiz等，(2002)Proc Natl Acad Sci USA，996796-6801；和Kulaksiz等，(2002)Am J Pathol，161655-664)。利用間馬來酰亞胺基苯甲酰-N-羥基琥珀酰亞胺酯將肽偶聯(lián)在匙孔血藍蛋白上，并且用每一種肽綴合物(Eurogentec，Seraing，比利時)對兩只SPF兔(CharlesRiver-Iffa Credo)進行免疫。業(yè)已生成、表征、并且使用了抗體EG(1)-HepC，EG(2)-HepC[分別針對海帕西啶原-(70-84)]，和EG(1)-HepN和EG(2)-HepN[分別針對海帕西啶原-(28-47)](Kulaksiz等，(2003)Gut，待發(fā)表)。
在腎臟中的表達分析根據(jù)GenBank cDNA序列，構(gòu)建并且使用了以下引物沿5’→3’方向提供的人海帕西啶(數(shù)據(jù)庫編號NM021175)，5’-CTG CAA CCC CAG GAC AGA G-3’和5’-GGA ATA AAT AAG GAA GGGAGG GG-3’；大鼠海帕西啶(#NM 053469)，5’-ACA GAA GGC AAG ATGGCA CT-3’和5’-GAA GTT GGT GTC TCG CTT CC-3’，小鼠海帕西啶-1(#NM 032541)，5’-CGA TAC CAA TGC AGA AGA GAA GG-3’和5’-TTCAAG GTC ATT GGT GGG GA-3’。所述引物與任何以前報道的序列都不具備同源性。
用Qiagen RNAeasy試劑盒進行RNA分離，包括DNA消化。按以前描述的方法進行逆轉(zhuǎn)錄(RT)-PCR分析(Kulaksiz等，(2002)Proc Natl Acad Sci USA，996796-6801；和Kulaksiz等，(2002)Am J Pathol，161655-664)。在94℃下進行最初的變性4分鐘之后，對反應(yīng)物進行30輪以下熱程序94℃進行30秒，60℃進行30秒和72℃進行30秒；在該循環(huán)之后在72℃下進行最后5分鐘的延伸。擴增產(chǎn)物在溴化乙錠染色的1.8％ 89mM Tris/89mM硼酸/2mM EDTA(pH 8.3)瓊脂糖凝膠上進行電泳。作為特異性對照，通過MWG-Biotech對擴增的PCR-產(chǎn)物進行測序。
免疫印跡分析在16.5％N-[2-羥-1，1-二羥甲基乙基]甘氨酸-SDS-聚丙烯酰胺凝膠上進行蛋白印跡實驗。來自人，小鼠和大鼠腎臟和肝臟的蛋白以及來自人尿的蛋白(每一個實驗50ml)是按照公開的方法提取的(Kulaksiz等，(2003)Gut，待發(fā)表；Kulaksiz等，(2002)Proc Natl Acad Sci USA，99；6796-6801；和Kulaksiz等，(2002)Am J Pathol，161655-664)。在電泳之后，通過半干印跡將蛋白轉(zhuǎn)移到基于疏水性聚偏1，1-二氟乙烯的膜上(Pall，Portsmouth，England)。所述膜與以1∶1000的比例稀釋的海帕西啶抗體一起溫育過夜。在用含有10mM Tris-HCl(pH 8.0)，150mMNaCl和0.05％ Tween 20的Tris-緩沖的鹽溶液洗滌之后，通過用氮藍四唑和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸作為色原(Sigma)與堿性磷酸酶-綴合的山羊抗-兔抗體(稀釋比為1∶50,000；Sigma)溫育之后顯現(xiàn)免疫反應(yīng)性蛋白。在使相應(yīng)的肽免疫原與所述抗體預(yù)溫育之后，對蛋白印跡上的免疫反應(yīng)進行了特異性的抑制。通過合適的對照排除了與第二山羊抗-兔抗體的交叉反應(yīng)性(Kulaksiz等，(2002)Proc Natl AcadSci USA，996796-6801；和Kulaksiz等，(2002)Am J Pathol，161655-664)。
免疫細胞化學(xué)方法在4℃下將組織在4％多聚甲醛或布安氏固定液中固定18小時，并且包埋在石蠟中。通過抗生物素蛋白-生物素-過氧化物酶復(fù)合物(ABC)技術(shù)對石蠟切片(4-5μm)進行海帕西啶(抗體EG(1)-HepN，EG(2)-HepN，EG(1)-HepC，和EG(2)-HepC，分別以1∶2000的比例稀釋)的免疫染色；溫育序列以及抗原-抗體結(jié)合位點的顯現(xiàn)是按詳細描述的方法進行的(Kulaksiz等，(2003)Gut，待發(fā)表；Kulaksiz等，(2002)Proc Natl Acad Sci USA，996796-6801；和Kulaksiz等，(2002)Am J Pathol，161655-664)。簡單地講，在4℃下將所述切片與各自的抗體一起溫育24小時，然后與以1∶200的比例稀釋的生物素化的抗-兔IgG(JacksonImmunoresearch，West Grove，Pa.，美國)一起溫育30分鐘。然后將所述切片與預(yù)先形成的生物素-過氧化物酶/鏈霉抗生物素蛋白混合物(Jackson Immunoresearch)一起溫育30分鐘，后者稀釋在PBS中(最終濃度生物素-過氧化物酶，0.7μg/ml；鏈霉抗生物素蛋白，5μg/ml)。通過在用0.05M Tris-HCl(pH 7.6)制備的0.7mM二氨基聯(lián)苯胺鹽酸鹽/0.002％H2O2中溫育所述切片檢測抗原-抗體結(jié)合位點。
特異性對照通過按公開方法進行的對照，排除了依賴于方法的非特異性(Kulaksiz等，(2003)Gut，待發(fā)表)。通過用同種和異種抗原性肽預(yù)吸收所述抗體，檢測抗體特異性(6.25-100μg/ml的抗血清)(Kulaksiz等，(2002)Proc Natl Acad Sci USA，996796-6801；和Kulaksiz等，(2002)Am J Pathol，161655-664)。用低到6.25μg/ml的濃度的同種抗原對所述抗體的預(yù)吸收完全阻斷了在腎臟中的免疫染色，而用濃度最高為100μg/ml的同種抗原對所述抗體進行預(yù)吸收對免疫染色沒有作用。
海帕西啶ELISA競爭結(jié)合測定血清和尿樣品是從22位個體(11位女性，11位男性，年齡在23-59歲之間，平均年齡為39歲)體內(nèi)獲得，并且從22位患有腎機能不全的進行長期血液透析的患者(11位女性，11位男性，年齡在25-77歲之間，平均年齡為48歲)體內(nèi)獲得血清樣品。所有患有慢性腎機能不全的患者每周用3,000IE重組人促紅細胞生成素(EPO)進行2-3次治療。在收集樣品期間，要注意健康志愿者和患者沒有感染，并且不流血。將10ml血液樣品抽入血清試管中，并且將10ml尿樣品收集到尿試管中，在4℃下以2,500×g的速度離心10分鐘。按上述方法用96孔微量滴定板進行重復(fù)測定(8)。簡單地講，用200μl/孔兔抗-海帕西啶抗體EG(2)-HepN對微量滴定板進行涂覆，所述抗體是以1∶4000的比例稀釋的。將50μl含有各種量的合成肽(0，20，100，500和1000ng/ml)的標(biāo)準物或人血清和尿樣品以及150μl N-末端生物素化的海帕西啶-(28-47)(Peptide Specialty Laboratories GmbH，Heidelberg，德國)(2ng/孔)添加到每一個孔中，并且在室溫下溫育1小時。在用TBST(含有0.05％ Tween 20的TBS)洗滌之后，通過鏈霉抗生物素蛋白-過氧化物酶(Dako，Hamburg，德國)使用底物四甲聯(lián)苯胺(DRG InstrumentsGmbH，Marburg，德國)檢測生物素化的抗原-抗體復(fù)合物；用1M H2SO4終止顯色反應(yīng)，并且在450/630nm波長下讀出該溶液的消光值。
統(tǒng)計學(xué)分析數(shù)據(jù)是以平均值±SEM形式表示的。通過斯氏t-檢驗評估了所述統(tǒng)計學(xué)分析。P＜0.05的差異被認為是顯著的。
結(jié)果海帕西啶在哺乳動物腎臟中的表達RT-PCR分析揭示了海帕西啶的明確表達不僅存在于肝臟中(正對照，參見Kulaksiz等，(2003)Gut，待發(fā)表)，而且還存在于人，大鼠和小鼠腎臟中(圖10)。在這些物種的肝臟(數(shù)據(jù)未顯示)和腎臟中檢測到了預(yù)期的人的192-bp的PCR產(chǎn)物，小鼠的193-bp產(chǎn)物，大鼠的201-bp的產(chǎn)物。序列分析發(fā)現(xiàn)所述PCR產(chǎn)生的產(chǎn)物與相應(yīng)的肽cDNA具有完全的同源性。
在翻譯水平上，通過用區(qū)域特異性抗體進行的蛋白印跡研究證實了海帕西啶的存在(圖10)。針對海帕西啶前體分子的C和N末端的抗血清一致地鑒定了在人，大鼠和小鼠腎臟提取物中存在大約9.5kDa的免疫反應(yīng)性帶。
海帕西啶的細胞定位用區(qū)域特異性海帕西啶抗血清進行的免疫組織化學(xué)研究一致地將海帕西啶定位于人，小鼠和大鼠腎臟的遠端小管系統(tǒng)中(圖11-15)。近端腎臟小管，集合小管和腎小球完全缺少海帕西啶免疫反應(yīng)性。免疫反應(yīng)性遠端小管局限于腎皮質(zhì)和外部腎髓質(zhì)，內(nèi)部腎髓質(zhì)沒有表現(xiàn)出海帕西啶的免疫染色(圖11，12)。值得注意的是，在海帕西啶陽性小管細胞之間存在明顯的細胞間差異盡管大部分小管細胞對海帕西啶是呈強陽性的，但其中的某一些只表現(xiàn)出微弱的免疫反應(yīng)性，或?qū)Ｅ廖鬣ね耆珶o反應(yīng)(圖14)。很顯然，在研究過的所有切片中，海帕西啶抗血清發(fā)現(xiàn)了在沿遠端小管排列的上皮細胞的細胞質(zhì)中顆粒狀的免疫反應(yīng)性模式(圖11，12)。在某些組織中，海帕西啶陽性細胞表現(xiàn)出強免疫反應(yīng)性，集中在分泌性細胞的頂極(圖13，15)，而在各個細胞的基底外側(cè)膜區(qū)域中沒有發(fā)現(xiàn)免疫反應(yīng)性。
檢測血清和尿中的海帕西啶前肽用特異性N-末端海帕西啶抗體EG(2)-HepN開發(fā)了高可再現(xiàn)性和高靈敏度的穩(wěn)定的海帕西啶ELISA測定(Kulaksiz等，(2003)Gut，待發(fā)表)。如圖16所示，ELISA發(fā)現(xiàn)了海帕西啶原存在于人血清中。在健康受試者血清中測得的海帕西啶原在68.5-139.2ng/ml范圍內(nèi)(平均值±SE；104.2±19.5ng/ml)。在患有慢性腎機能不全的患者血清中海帕西啶原濃度在63.9-327.3ng/ml范圍內(nèi)變動(平均值±SE；156.8±61.9ng/ml)，并且與對照組相比明顯提高了。
使用靈敏的海帕西啶ELISA測定的來自對照組的人尿中的海帕西啶原在13.9-456.0ng/ml范圍內(nèi)(平均值±SE；180.1±94.8ng/ml)。海帕西啶原在人尿中的存在還通過蛋白印跡分析得到了證實。海帕西啶抗血清在人尿提取物中鑒定到一個大約9.5kDa分子量的海帕西啶免疫反應(yīng)性帶，它與腎臟組織中的免疫反應(yīng)性海帕西啶共遷移(圖10)。
討論新的激素海帕西啶是抗微生物肽，并且是鐵體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑(Park等，(2001)J Biol Chem，2767806-7810；Krause等，(2000)FEBS Lett，480147-150；Pigeon 等，(2001)J Biol Chem，2767811-7819；Nicolas等，(2001)Proc Natl Acad Sci USA，988780-8785；和Nicolas等，(2002)Proc Natl Acad Sci USA，994596-4601)。在以前的研究中，業(yè)已顯示肝臟是海帕西啶的主要來源(Park等，CH(2001)J Biol Chem，2767806-7810；和Kulaksiz等，(2003)Gut，待發(fā)表)。盡管海帕西啶最初是從人尿(Park等，(2001)和hemofiltrate(Krause等，(2000))中分離的，但在腎臟中沒有檢測到這種調(diào)節(jié)肽的表達(Pigeon等，(2001)。
使用成功地應(yīng)用于肝臟中的合適的引物說明和組合(Kulaksiz等，(2003)Gut，待發(fā)表；和Gehrke等，(2003)Blood，102371-376)，本發(fā)明的RT-PCR分析明確地揭示了海帕西啶不僅是在肝臟中表達的，而且還在三種哺乳動物物種-人，大鼠和小鼠的腎臟中表達。測序分析揭示了所生成的PCR產(chǎn)物的特異性。
為了證實翻譯的海帕西啶肽在腎臟中的存在，申請人制備了針對海帕西啶的大量的區(qū)域特異性抗血清，并且將它們用于蛋白印跡分析和免疫組織化學(xué)分析。蛋白印跡分析證實了海帕西啶在腎臟中的表達。四個不同的抗血清能識別海帕西啶前體分子上的不同的表位，一致地鑒定了存在于三種不同物種的腎臟中的大約9.5kDa的免疫反應(yīng)性肽，它相當(dāng)于根據(jù)各自的cDNA序列推測的海帕西啶激素原的分子量(Pigeon等，(2001))。這種免疫反應(yīng)性肽的表觀分子量還與在肝臟中檢測的海帕西啶激素原的分子量一致(Kulaksiz等，(2003)Gut，待發(fā)表)。申請人的發(fā)現(xiàn)明確地證實了海帕西啶不是肝臟特異性的，因為它還存在于腎臟中。
用四種區(qū)域特異性海帕西啶抗血清進行的免疫細胞化學(xué)研究揭示在人，小鼠和大鼠腎臟中海帕西啶特異性地定位于腎皮質(zhì)和外部髓質(zhì)的小管系統(tǒng)中。這些免疫反應(yīng)性小管被鑒定為遠端腎小管，這些是根據(jù)在光學(xué)顯微鏡術(shù)中檢測到的它們的典型的形態(tài)學(xué)特征確定的。不同區(qū)域特異性抗體的一致性的染色不僅存在于人體中，而且還存在于小鼠和大鼠腎臟中，表明了遠端小管是腎臟海帕西啶的來源。在近端腎臟小管，集合小管和腎小球或腎臟內(nèi)部髓質(zhì)中沒有檢測到對海帕西啶的免疫反應(yīng)性。
在腎皮質(zhì)和外部髓質(zhì)中，海帕西啶免疫反應(yīng)性局限于遠端小管的上皮分泌細胞中。很顯然，所有海帕西啶抗血清產(chǎn)生了顆粒狀免疫反應(yīng)性模式，所述模式假定這種肽定位于各個細胞的小分泌性小泡或溶酶體中，這業(yè)已通過電子顯微鏡術(shù)在這些細胞中得到了鑒定(vanKatachalan MA，Kritz WPathology of the kidney.Edited byJC Jennette，JL Oldson，MM Schwarz，SG SilverPhiladelphia，Heptinstall’s，1998，pp 3-66)。應(yīng)當(dāng)指出的是，即使是在相同小管的上皮細胞之間也存在明顯的細胞間差異，這些差異表現(xiàn)在海帕西啶免疫反應(yīng)性強度方面，這可能反映了表達或分泌的細胞間差別。很顯然，在某些小管中，海帕西啶的免疫反應(yīng)性定位于上皮細胞的整個細胞質(zhì)中，而在其他小管中，強的海帕西啶免疫反應(yīng)性集中在分泌性細胞的頂極。海帕西啶在細胞水平上的這種奇特的分布模式，可能推測了海帕西啶的管腔定向釋放。申請人沒有在腎小管細胞的基底外側(cè)膜區(qū)域上檢測到海帕西啶表達。這表明了腎臟海帕西啶不是通過沿小管排列的分泌細胞釋放到血液中的。
普遍相信的是，身體的鐵體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的控制主要依賴于對在近端小腸中從飲食中攝取的鐵的嚴格調(diào)節(jié)。不過，最近的研究業(yè)已證實，腎臟在鐵體內(nèi)穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用(Wareing等，(2003)Am J PhysiolRenal Physiol，Epub ahead of print；Ferguson等，(2003)KidneyInt，641755-1764；和Gunshin等，(1997)Nature，388482-488)。Wareing及其同事能夠令人信服地證實代謝上顯著量的鐵是在腎小球上過濾的，并且只有0.8-1.5％的過濾的鐵實際上被排泄到尿中(Wareing等，(2000)J Physiol，524.2581-586)。因此，必然存在沿腎小管再吸收鐵的非常有效的途徑和嚴格的控制作用。實際上，F(xiàn)erguson和他的同事能夠?qū)⑺龆r金屬轉(zhuǎn)運蛋白1(DMT-1)定位于腎臟的小管系統(tǒng)中(Ferguson等，(2001)Am J Physiol RenalPhysiol，280P803-F814)。這種蛋白被認為是通過胃腸道吸收飲食鐵的主要途徑(Gunshin等，(1997))。應(yīng)當(dāng)指出的是，業(yè)已證實DMT-1表達在腎皮質(zhì)和外部髓質(zhì)小管細胞的頂膜區(qū)域中最強，在這里申請人還發(fā)現(xiàn)了海帕西啶。另外，最近的研究證實了改變了的飲食鐵吸收能有效調(diào)節(jié)腎臟DMT-1表達(Wareing等，(2003))。根據(jù)以上發(fā)現(xiàn)和數(shù)據(jù)，所述發(fā)現(xiàn)和數(shù)據(jù)證實了海帕西啶表達與十二指腸DMT-1的表達成反比例關(guān)系(Frazer等，(2002)Gastroenterology，123835-844)，申請人提出了海帕西啶在腎臟鐵轉(zhuǎn)運方面的調(diào)節(jié)作用。
通過蛋白印跡研究證實了海帕西啶可能釋放到尿中。區(qū)域特異性海帕西啶-抗血清一致地鑒定了具有正確分子量的高度標(biāo)記過的帶(Kulaksiz等，(2003)Gut，待發(fā)表)，它是與腎臟組織提取物中的免疫反應(yīng)性海帕西啶原精確共遷移的。以上發(fā)現(xiàn)明確地顯示海帕西啶原是通過分泌性遠端小管細胞合成的，并且通過管腔釋放到尿中，在這里，它顯然逃脫了小管的蛋白水解和再循環(huán)。為了測量人尿中的海帕西啶原濃度，開發(fā)了靈敏的ELISA，其檢測靈敏度為3.95ng/孔。用業(yè)已成功地應(yīng)用在ELISA實驗中的海帕西啶抗血清EG(2)-HepN進行的ELISA分析(Kulaksiz等，(2003)Gut，待發(fā)表)，發(fā)現(xiàn)了在健康受試者尿中13.9-456.0ng/ml(平均值±SE；180.1±94.8ng/ml)的高濃度的海帕西啶原。這種濃度顯著高于同一個人的循環(huán)中的海帕西啶原濃度(68.5-139.2ng/ml；平均值±SE，104.2±19.5ng/ml)。應(yīng)當(dāng)指出的是，沒有發(fā)現(xiàn)在循環(huán)的海帕西啶原和血清鐵或鐵蛋白水平之間的相關(guān)性(Kulaksiz等，(2003)Gut，待發(fā)表)。同樣，沒有檢測到尿海帕西啶原和血清鐵或鐵蛋白水平之間的相關(guān)性(數(shù)據(jù)未顯示)，所述鐵蛋白水平被推測能調(diào)節(jié)肝臟海帕西啶的表達(Pigeon等，(2001)J Biol Chem，2767811-7819；Nemeth等，(2002 Blood，1012461-2463；和Ganz T，(2003)Blood，102783-788)。因此，申請人提示腎臟/尿的海帕西啶原的調(diào)節(jié)作用不會受到血清鐵或鐵蛋白的直接影響。
對進行長期血液透析的腎機能不全患者進行的海帕西啶原作用的評估，發(fā)現(xiàn)了在這些患者血清中的海帕西啶原的濃度明顯提高了，從健康受試者的104.2ng/ml提高到156.8ng/ml。透析患者體內(nèi)提高了的海帕西啶原水平，表明腎臟不僅與海帕西啶的合成相關(guān)，而且可能還與所述循環(huán)肽的代謝和/或消除相關(guān)。有趣的是，在現(xiàn)在的研究中，業(yè)已顯示腎臟激素促紅細胞生成素能下調(diào)肝臟的海帕西啶基因表達(Nicolas(2002)Blood Cells，Molecules，and Diseases，29327-335)。因此，對在透析患者體內(nèi)提高了的海帕西啶原濃度的另一種解釋可能是促紅細胞生成素的相對缺乏，這種現(xiàn)象是在晚期腎機能不全中通常遇到的(Eckardt KU，(2000)Clin Nephrol，53S2-8；和Santoro A(2002)Rev Clin Exp Hematol，Suppl 112-20)。不過，申請人報道了在患有慢性腎機能不全患者體內(nèi)測得了高水平的海帕西啶原，盡管用海帕西啶抑制性激素促紅細胞生成素對這些患者進行了治療，這支持海帕西啶的腎臟過濾。本發(fā)明的一種實施方案提供了尿海帕西啶部分來源于腎臟，并且部分來源于肝臟；因此，必須指出的是，測得的尿海帕西啶原是釋放的腎臟肽和消除的循環(huán)肽的總和。
綜上所述，最近的研究證實了腎臟在鐵體內(nèi)穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重要作用(Wareing等，(2003)Am J Physiol Renal Physiol，Epub aheadof print；Ferguson等，(2003)Kidney Int，641755-1764；Gunshin等，(1997)Nature，388482-488；Wareing等，(2000)J Physiol，524.2581-586和Ferguson等，(2001)Am J PhysiolRenal Physiol，280F803-F814)，不過，不存在有關(guān)腎臟鐵轉(zhuǎn)運的調(diào)節(jié)機制的證據(jù)。在這一方面，申請人第一次將海帕西啶定位于三種哺乳動物物種的腎臟中。申請人的發(fā)現(xiàn)表明了海帕西啶不是肝臟特異性的。除了腎臟中血清海帕西啶的消除之外，所述肽還作為內(nèi)在的激素在腎臟的分泌性遠端小管細胞中產(chǎn)生，并且通過管腔釋放到尿中，這暗示了海帕西啶在腎臟和/或尿道中的調(diào)節(jié)作用。進一步的研究應(yīng)當(dāng)分析海帕西啶在腎臟小管系統(tǒng)中的調(diào)節(jié)機制。
實施例3海帕西啶在人胰腺中的表達用于本研究的胰腺組織是在對患有胰腺癌的患者實施惠普耳(Whipple)手術(shù)之后獲得的。使用成功地應(yīng)用在肝臟和腎臟中的合適的引物說明和組合，本發(fā)明的RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)了海帕西啶不僅是在肝臟和腎臟中表達的，而且還能在人胰腺中表達。測序分析發(fā)現(xiàn)了所產(chǎn)生的PCR-產(chǎn)物的特異性。
用特異性抗體進行的大部內(nèi)印跡分析在翻譯水平上證實了海帕西啶在胰腺中的表達。使用相同的抗體，通過免疫組織化學(xué)將海帕西啶定位于胰腺。石蠟切片發(fā)現(xiàn)海帕西啶免疫反應(yīng)性定位于內(nèi)分泌胰腺；在外分泌胰腺中沒有發(fā)現(xiàn)免疫反應(yīng)性。
工業(yè)應(yīng)用性本發(fā)明可應(yīng)用于診斷以非生理學(xué)水平的海帕西啶蛋白為特征的疾病狀況，所述海帕西啶蛋白包括海帕西啶原和它的片段。
盡管本發(fā)明業(yè)已結(jié)合具體實施方案進行了描述，但應(yīng)當(dāng)理解的是，這些實施方案僅僅是用于對本發(fā)明的原理和應(yīng)用進行說明的，因此，應(yīng)當(dāng)理解的是，可以對所述說明性的實施方案進行多種修飾，并且，在不超出由所附權(quán)利要求書所述的本發(fā)明的精神和范圍的前提下，可以設(shè)計出其他方案。
本說明書所引用的所有專利和非專利文獻可以作為本發(fā)明所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員技術(shù)水平的指示。上述所有文獻和專利申請被以相同的程度收作本文參考，就如同每一份文獻或?qū)＠暾埍痪唧w和分別指明收作本文參考一樣。
序列表<110>DRG INTERNATIONAL，INC.
<120>通過篩選人或動物組織、血液或體液中的海帕西啶來診斷疾病的方法，以及該方法的治療性用途<130>DRG 3.4-001 CIP CIP<140>
<141>
<150>10/441,089<151>2003-05-19<150>10/299,486<151>2002-11-19<160>8<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>391<212>DNA<213>智人<400>1tcaagaccca gcagtgggac agccagacag acggcacgat ggcactgagc tcccagatct 60gggccgcttg cctcctgctc ctcctcctcc tcgccagcct gaccagtggc tctgttttcc 120cacaacagac gggacaactt gcagagctgc aaccccagga cagagctgga gccagggcca 180gctggatgcc catgttccag aggcgaagga ggcgagacac ccacttcccc atctgcattt 240tctgctgcgg ctgctgtcat cgatcaaagt gtgggatgtg ctgcaagacg tagaacctac 300ctgccctgcc cccgtcccct cccttcctta tttattcctg ctgccccaga acataggtct 360tggaataaaa tggctggttc ttttgttttc c 391<210>2<211>84<212>PRT<213>智人<400>2
Met Ala Leu Ser Ser Gln Ile Trp Ala Ala Cys Leu Leu Leu Leu Leu1 5 10 15Leu Leu Ala Ser Leu Thr Ser Gly Ser Val Phe Pro Gln Gln Thr Gly20 25 30Gln Leu Ala Glu Leu Gln Pro Gln Asp Arg Ala Gly Ala Arg Ala Ser35 40 45Trp Met Pro Met Phe Gln Arg Arg Arg Arg Arg Asp Thr His Phe Pro50 55 60Ile Cys Ile Phe Cys Cys Gly Cys Cys His Arg Ser Lys Cys Gly Met65 70 75 80Cys Cys Lys Thr<210>3<211>20<212>PRT<213>智人<400>3Pro Gln Gln Thr Gly Gln Leu Ala Glu Leu Gln Pro Gln Asp Arg Ala1 5 10 15Gly Ala Arg Ala20<210>4<211>15<212>PRT<213>智人<400>4Cys Gly Cys Cys His Arg Ser Lys Cys Gly Met Cys Cys Lys Thr1 5 10 15<210>5<211>19
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>5ctgcaacccc aggacagag 19<210>6<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>6ggaataaata aggaagggag ggg23<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>7gattcagggt cagggaggtg20<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列描述引物<400>8gaaggggctg tgattgaagg20
權(quán)利要求
1.一種用于診斷以非生理學(xué)水平的海帕西啶為特征的疾病狀況的方法，包括從受試者體內(nèi)獲得組織或流體樣品；讓所述樣品與能特異性結(jié)合海帕西啶的中間部分或羧基末端表位中的一個或多個的抗體或它的片段接觸，并對所述樣品中的海帕西啶水平進行定量；其中，所述非生理學(xué)水平的海帕西啶是所述疾病狀況的指示。
2.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述抗體能特異性結(jié)合包括在海帕西啶的28-47位氨基酸中的中間部分表位。
3.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述抗體能特異性結(jié)合包括在海帕西啶的70-84位氨基酸中的羧基末端表位。
4.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述定量包括進行選自下列一組的測定放射免疫測定，酶聯(lián)免疫吸附測定，夾心測定，沉淀素反應(yīng)，凝膠免疫擴散測定，聚集測定，熒光免疫測定，A蛋白免疫測定和免疫電泳測定。
5.一種用于檢測以非生理學(xué)水平的海帕西啶為特征的疾病狀況的試劑盒，包括能特異性結(jié)合海帕西啶的中間部分或羧基末端表位中的一個或多個的抗-海帕西啶抗體或它的片段，以及能直接或間接結(jié)合所述抗體或它的片段的試劑。
6.如權(quán)利要求5的試劑盒，其中，所述抗-海帕西啶抗體或它的片段被固定在支持物上。
7.如權(quán)利要求5的試劑盒，其中，所述試劑包括與第一種結(jié)合分子復(fù)合的海帕西啶。
8.如權(quán)利要求7的試劑盒，其中，所述第一種結(jié)合分子是生物素。
9.如權(quán)利要求8的試劑盒，其中，所述試劑盒還包括與第二種結(jié)合分子復(fù)合的酶和所述酶的底物。
10.如權(quán)利要求9的試劑盒，其中，所述第二種結(jié)合分子是鏈霉抗生物素蛋白。
11.如權(quán)利要求9的試劑盒，其中，所述酶是辣根過氧化物酶，并且所述底物包括過氧化物。
12.抗體或它的片段，其能特異性結(jié)合海帕西啶的中間部分或羧基末端表位中的一個或多個。
13.如權(quán)利要求12的抗體，其中，所述中間部分表位包括在海帕西啶的28-47位氨基酸中。
14.如權(quán)利要求12的抗體，其中，所述羧基末端表位包括在海帕西啶的70-84位氨基酸中。
15.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述海帕西啶包括海帕西啶原，海帕西啶或其片段。
16.如權(quán)利要求1的方法，其中，所述海帕西啶包括海帕西啶原。
17.如權(quán)利要求5的試劑盒，其中，所述海帕西啶包括海帕西啶原或海帕西啶。
18.如權(quán)利要求5的試劑盒，其中，所述海帕西啶包括海帕西啶原。
19.如權(quán)利要求12的海帕西啶，其中，所述海帕西啶包括海帕西啶原或海帕西啶。
20.如權(quán)利要求12的海帕西啶，其中，所述海帕西啶包括海帕西啶原。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于診斷疫病狀況的方法和試劑盒，所述疫病狀況特征在于非生理學(xué)水平的海帕西啶，包括海帕西啶原和它的片段，該方法包括從受試者體內(nèi)獲得組織或流體樣品；讓所述樣品與能特異性地結(jié)合相當(dāng)于海帕西啶蛋白的中間部分或C末端的多肽的抗體或它的片段接觸，并且利用基于所述抗體和所述多肽的結(jié)合的測定來定量海帕西啶水平；其中，所述非生理學(xué)水平的海帕西啶是所述疾病狀況的指示。本發(fā)明還涉及用于遺傳技術(shù)方法中的診斷方法和試劑盒，如用于超表達或下調(diào)海帕西啶。本發(fā)明還涉及通過用海帕西啶和海帕西啶的激動劑或拮抗劑治療受試者對某些疾病進行的治療性處理。
文檔編號G01N33/543GK101076730SQ200380108964
公開日2007年11月21日 申請日期2003年11月19日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月19日
發(fā)明者H·庫拉克斯茨, C·E·吉欽托夫, A·珍茨科, W·施特雷梅爾 申請人:Drg國際有限公司