專利名稱：多通道trail受體檢測系統(tǒng)及其檢測方法
背景技術(shù)：
細(xì)胞凋亡是生物體最重要的生理和病理現(xiàn)象之一。TRAIL(TNF-relatedapoptosisindecingligand)是新的腫瘤壞死因子TNF(Tumomecrosisfactor)家族成員，其最大的生物學(xué)特點(diǎn)是選擇性細(xì)胞毒作用，即僅誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞、轉(zhuǎn)化細(xì)胞或病毒感染細(xì)胞的凋亡，而不引起正常的細(xì)胞凋亡。這一特點(diǎn)在腫瘤治療中具有潛在而廣泛的應(yīng)用前景。
現(xiàn)階段檢測TRAIL四種受體的方法有兩種。一是用流式細(xì)胞儀的方法在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測。每個病人的樣品需要進(jìn)行四種抗體的單獨(dú)標(biāo)記、單獨(dú)操作，操作過程復(fù)雜，容易造成試劑及消耗品的浪費(fèi)。流式細(xì)胞儀的方法僅適用于實(shí)驗(yàn)室少量標(biāo)本的研究而不利于臨床大量標(biāo)本的批量檢測。二是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)方法。這種方法雖然簡單易行，但僅適于液體介質(zhì)中可溶性成分的檢測，不適合檢測用于細(xì)胞表面的跨膜蛋白，TRAIL屬于II型跨導(dǎo)蛋白的一種，即ELISA方法不適于TRAIL四種受體的檢測。
迄今為止，對TRAIL的研究主要集中在其生物學(xué)特性方面的研究，尚未建立TRAIL高通量的快速檢測系統(tǒng)。生物與電子技術(shù)結(jié)合產(chǎn)生的生物傳感器，可以對蛋白質(zhì)等大分子進(jìn)行檢測，為解決現(xiàn)有檢測手段的困難提供了可能。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要目的在于提供一種多通道TRAIL受體檢測系統(tǒng)及其檢測方法，利用抗原抗體反應(yīng)原理研制出免疫場效應(yīng)型TRAIL生物傳感器，可實(shí)現(xiàn)對腫瘤細(xì)胞凋亡因子TRAIL四種受體的檢測。
本發(fā)明的目的還在于提供一種TRAIL抗體生物敏感膜，以及制造方法。
本發(fā)明的目的還在于提供一種免疫場效應(yīng)型TRAIL生物傳感器，以及檢測腫瘤細(xì)胞凋亡因子TRAIL四種受體的方法。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的一種TRAIL抗體生物敏感膜制備的制造方法，其特征在于，其步驟如下A、采用P型硅材料，用半導(dǎo)體制備工藝制成MOS型場效應(yīng)晶體管，該場效應(yīng)晶體管包括源極、漏極、非金屬的絕緣材料氮化硅柵極；B、氮化硅作為敏感柵，將其做硅烷化處理；C、用吸附方法將蛋白A固定在氮化硅表面，室溫干燥，牛血清蛋白(BSA)做封閉處理，磷酸緩沖溶液(PBS)清洗待干燥，由此形成氮化硅—蛋白A的復(fù)合敏感膜；D、將TRAIL受體的抗體用吸附方法固定在蛋白A上，待室溫干燥，磷酸緩沖溶液(PBS)清洗置干備用；至此制備成氮化硅—蛋白A-TRAIL受體的抗體這樣有疊型結(jié)構(gòu)的生物敏感膜。
本發(fā)明還提供一種TRAIL抗體生物敏感膜，其特征在于，包括一固定在氮化硅上的蛋白A，兩者共同組成氮化硅—蛋白A的復(fù)合敏感膜；還包括一層吸附在其上的TRAIL受體的抗體。
本發(fā)明還提供一種免疫場效應(yīng)型TRAIL生物傳感器，其特征在于，包括以下結(jié)構(gòu)一采用P型硅材料用半導(dǎo)體制備工藝制成MOS型場效應(yīng)晶體管；還包括一在該場效應(yīng)晶體管上制得的如上所述的TRAIL抗體生物敏感膜；該傳感器分別提供單參數(shù)TRAIL和多參數(shù)TRAIL腫瘤細(xì)胞的檢測。即單參數(shù)檢測TRAIL采用離子敏場效應(yīng)管、多參數(shù)檢測TRAIL采用光尋址電位傳感器LAPS。
本發(fā)明還提供一種檢測TRAIL受體的方法，其特征在于，步驟如下
a、將定量TRAIL抗體固定在離子敏場效應(yīng)管(ISFET)敏感柵氮化硅表面構(gòu)成如前所述的生物功能性TRAIL抗體生物敏感膜；b、抗體識別待測液中不同細(xì)胞上表達(dá)的TRAIL受體抗原量，形成穩(wěn)定的復(fù)合體，抗原抗體的結(jié)合產(chǎn)生的荷電狀態(tài)，引起離子敏場效應(yīng)管膜電位變化；c、測量膜電位的電壓變化值得到待檢TRAIL受體抗原量的數(shù)量，完成對腫瘤細(xì)胞凋亡因子TRAIL的檢測。
其中步驟a，細(xì)分為如下步驟a1、將敏感柵上的氮化硅做硅烷化處理；a2、用吸附方法將蛋白A固定在氮化硅表面，室溫干燥，牛血清蛋白(BSA)做封閉處理，磷酸緩沖溶液(PBS)清洗待干燥，由此形成氮化硅—蛋白A的復(fù)合敏感膜；a3、將TRAIL受體的抗體用吸附方法固定在蛋白A上，待室溫干燥，磷酸緩沖溶液(PBS)清洗置干備用；本發(fā)明還提供一種多通道TRAIL受體檢測系統(tǒng)，其特征在于，包括若干個如前所述的免疫場效應(yīng)型TRAIL生物傳感器，用于將待檢TRAIL受體抗原量轉(zhuǎn)換為膜電位的電壓值；多路開關(guān)，用于依次選通各傳感器通道，把參比電極上的控制電位VG輸入到模數(shù)轉(zhuǎn)換器；反饋前級電路，用于保持漏源電流Ids恒定，使得參比電極上的控制電位VG與待測物質(zhì)活度ai的對數(shù)呈線性關(guān)系；數(shù)模轉(zhuǎn)換器，用于將參比電極上的控制電位VG由模擬量轉(zhuǎn)換為數(shù)字量；單片機(jī)，用于控制采樣，換算，顯示，存儲，通訊和按鍵操作；存儲器，用于存儲采樣結(jié)果；顯示器，用于顯示參比電極上的控制電位VG；所述的單片機(jī)，控制多路開關(guān)，依次選通各通道，模數(shù)轉(zhuǎn)換器，將參比電極上的控制電位，由模擬量轉(zhuǎn)換為數(shù)字量，間隔定期進(jìn)行數(shù)據(jù)采樣，并且將采樣結(jié)果存入存儲器，優(yōu)選為電可擦寫存儲器，采樣的結(jié)果由顯示器，優(yōu)選為液晶顯示器。
上述多通道TRAIL受體檢測系統(tǒng)，還包括PC機(jī)，與單片機(jī)連接，用于處理采樣數(shù)據(jù)。
由上可見，本發(fā)明采用微電子技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)傳感器芯片的陣列化，使腫瘤細(xì)胞凋亡因子TRAIL的大批量臨床檢測成為可能。傳感器方法檢測腫瘤細(xì)胞凋亡因子TRAIL四種受體，其特點(diǎn)是簡單、快速、成本低、價格低廉、特異性好、無需標(biāo)記、所需樣本量少，微升量級、可同時對多人多批次進(jìn)行檢測。利用多通道TRAIL受體快速檢測系統(tǒng)對腫瘤病人進(jìn)行檢測，可以為醫(yī)生提供半定量的數(shù)據(jù)信息。避免盲目用藥給病人造成的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。
免疫場效應(yīng)型TRAIL生物傳感器及其多通道快速檢測系統(tǒng)可以完成對腫瘤細(xì)胞凋亡因子TRAIL四種受體的定量或半定量檢測。比如用固定量的抗體檢測等量的不同腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的TRAIL受體抗原的量，通過電壓數(shù)據(jù)變化表明之間有差別。
TRAIL多通道快速檢測系統(tǒng)可與普通PC機(jī)相兼容，通過與PC機(jī)的通訊實(shí)現(xiàn)復(fù)雜的數(shù)據(jù)分析與管理。這一點(diǎn)與現(xiàn)有的用流式細(xì)胞儀檢測腫瘤細(xì)胞凋亡因子TRAIL四種受體的方法完全不同。流式細(xì)胞儀是檢測用熒光素標(biāo)記后細(xì)胞的專用儀器，能分別對標(biāo)記的四種熒光素細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，主要的檢測與分析軟件名為″Cellquest″，能用各種圖形進(jìn)行分析，并讀取數(shù)值，但其主機(jī)只能與蘋果機(jī)兼容，只能用蘋果機(jī)讀取和分析數(shù)據(jù)。


圖1是有疊型結(jié)構(gòu)生物敏感膜場效應(yīng)型傳感器示意圖；圖2是場效應(yīng)型生物傳感器用于檢測TRAIL受體的示意圖；圖3是本發(fā)明實(shí)施例TRAIL多通道快速檢測系統(tǒng)結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施例方式
如圖1所示為有疊型結(jié)構(gòu)生物敏感膜場效應(yīng)型傳感器示意圖。采用P型硅材料3，用半導(dǎo)體制備工藝制成MOS型場效應(yīng)晶體管。該場效應(yīng)晶體管包括源極1、漏極2、非金屬的絕緣材料氮化硅4柵極。將敏感柵氮化硅4做硅烷化處理，用吸附方法將蛋白A5固定在氮化硅4表面，室溫干燥，牛血清蛋白(BSA)做封閉處理，磷酸緩沖溶液(PBS)清洗待干燥，由此形成氮化硅—蛋白A的復(fù)合敏感膜。再將TRAIL受體的抗體6用吸附方法固定在蛋白A5上，待室溫干燥，磷酸緩沖溶液(PBS)清洗置干備用。至此制備成氮化硅—蛋白A-TRAIL受體的抗體這樣有疊型結(jié)構(gòu)的生物敏感膜。
場效應(yīng)型生物傳感器用于檢測TRAIL受體的實(shí)施方式如圖2所示。
免疫場效應(yīng)型TRAIL生物傳感器是利用抗原和抗體免疫反應(yīng)的特異性結(jié)合構(gòu)成的，具有高度專一性。定量TRAIL抗體2被固定在離子敏場效應(yīng)管(ISFET)敏感柵氮化硅表面構(gòu)成生物功能性敏感膜1，抗體識別待測液中不同腫瘤細(xì)胞4上表達(dá)的TRAIL受體3抗原量，形成穩(wěn)定的復(fù)合體?？乖贵w的結(jié)合產(chǎn)生的荷電狀態(tài)，會引起離子敏場效應(yīng)管膜電位變化，其膜電位改變和待測溶液中的離子活度遵循Nernst原理。將傳感器與多通道快速檢測系統(tǒng)連接，測量膜電位的電壓變化值即能得到待檢TRAIL受體3抗原量的多少。利用這種現(xiàn)象可以實(shí)現(xiàn)生物信號與電子信號的轉(zhuǎn)換，即用微結(jié)構(gòu)場效應(yīng)型生物傳感器的方法完成對細(xì)胞凋亡因子TRAIL四種受體的檢測。
便攜式多通道快速檢測系統(tǒng)的實(shí)施方式如圖3框圖所示。
多通道快速檢測系統(tǒng)是基于MOS器件基本原理設(shè)計(jì)完成的，可以用來檢測因待測物質(zhì)濃度變化而引起的膜電位變化。多通道快速檢測系統(tǒng)采用ATMEL公司的89c52單片機(jī)，通過它來控制采樣，換算，顯示，存儲，通訊和按鍵操作。通過應(yīng)用89c52單片機(jī)，有效的減少了外圍電路，增加了儀器的靈活性和可靠性。可以根據(jù)用戶的要求，通過改變儀器或者上位機(jī)的軟件，為該檢測系統(tǒng)擴(kuò)展一系列新功能。
圖3中，根據(jù)離子敏場效應(yīng)管ISFET原理，采用運(yùn)算放大器Lm258構(gòu)成反饋補(bǔ)償前級電路33，保持漏源電流Ids恒定，則參比電極上的控制電位VG與待測物質(zhì)活度ai的對數(shù)呈線性關(guān)系。單片機(jī)35，型號為AT89c52；控制多路開關(guān)32，型號為AD7501；依次選通各通道，模數(shù)轉(zhuǎn)換器34，型號為Max187；將參比電極上的控制電位VG由模擬量轉(zhuǎn)換為數(shù)字量，以4秒(S)的間隔通過傳感器采樣31，數(shù)量為1～n，進(jìn)行數(shù)據(jù)采樣，并且將采樣結(jié)果存入電可擦寫存儲器36，型號為x25043。采樣的結(jié)果由液晶驅(qū)動電路Icm7211驅(qū)動4位液晶顯示器顯示38。采樣數(shù)據(jù)量較大時，可通過連接電纜連接到計(jì)算機(jī)37，使用配套的軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析與管理。
多通道快速檢測系統(tǒng)特點(diǎn)可以與PC機(jī)進(jìn)行數(shù)據(jù)通訊，實(shí)現(xiàn)復(fù)雜的數(shù)據(jù)分析與管理。
軟件界面友好，操作簡單，無需專業(yè)人員。
用途廣泛，可以測量多種參數(shù)，易于實(shí)現(xiàn)功能擴(kuò)展。
檢測速度快，響應(yīng)時間小于4S。
檢測量大，有多個通道，可同時檢測多個樣品。
儀器使用9V直流電源，可在室內(nèi)、野外使用。
LED數(shù)字顯示。
體積小、重量輕、便于攜帶、穩(wěn)定可靠。
多通道快速檢測儀表技術(shù)參數(shù)最大樣品數(shù)量n(1～35)個檢測范圍0～1000mV標(biāo)準(zhǔn)溫度 25℃標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)時間 4S工作電源 9V直流電源使用環(huán)境 室內(nèi)/室外使用環(huán)境溫度 0～40℃使用濕度 ＜90％(40℃時)密封性不易滲水、腐蝕顯示電壓精度 1mV儀器尺寸 134×70×20mm儀器重量約 100g
權(quán)利要求
1.一種TRAIL抗體生物敏感膜制備的制造方法，其特征在于，其步驟如下A、采用P型硅材料，用半導(dǎo)體制備工藝制成MOS型場效應(yīng)晶體管，該場效應(yīng)晶體管包括源極、漏極、非金屬的絕緣材料氮化硅柵極；B、氮化硅作為敏感柵，將其做硅烷化處理；C、用吸附方法將蛋白A固定在氮化硅表面，室溫干燥，牛血清蛋白做封閉處理，磷酸緩沖溶液清洗待干燥，由此形成氮化硅—蛋白A的復(fù)合敏感膜；D、將TRAIL受體的抗體用吸附方法固定在蛋白A上，待室溫干燥，磷酸緩沖溶液清洗置干備用；至此制備成氮化硅—蛋白A-TRAIL受體的抗體這樣有疊型結(jié)構(gòu)的生物敏感膜。
2.一種TRAIL抗體生物敏感膜，其特征在于，包括一固定在氮化硅上的蛋白A，兩者共同組成氮化硅—蛋白A的復(fù)合敏感膜；還包括一層吸附在其上的TAIL受體的抗體。
3.一種免疫場效應(yīng)型TRAIL生物傳感器，其特征在于，包括以下結(jié)構(gòu)一采用P型硅材料用半導(dǎo)體制備工藝制成MOS型場效應(yīng)晶體管；還包括一在該場效應(yīng)晶體管上制得的如權(quán)利要求2所述的TRAIL抗體生物敏感膜；該傳感器分別提供單參數(shù)TRAIL和多參數(shù)TRAIL腫瘤細(xì)胞的檢測，該單參數(shù)檢測TRAIL采用離子敏場效應(yīng)管、多參數(shù)檢測TRAIL采用光尋址電位傳感器LAPS。
4.一種檢測腫瘤細(xì)胞凋亡因子TRAIL四種受體的方法，其特征在于，步驟如下a、將定量TRAIL抗體被固定在離子敏場效應(yīng)管敏感柵氮化硅表面構(gòu)成如權(quán)利要求2所述的生物功能性TRAIL抗體敏感膜；b、抗體識別待測液中不同細(xì)胞上表達(dá)的TRAIL受體抗原量，形成穩(wěn)定的復(fù)合體，抗原抗體的結(jié)合產(chǎn)生的荷電狀態(tài)，引起離子敏場效應(yīng)管膜電位變化；c、測量膜電位的電壓變化值得到待檢TRAIL受體抗原量的數(shù)量，完成對腫瘤細(xì)胞凋亡因子TRAIL的檢測。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測腫瘤細(xì)胞凋亡因子TRAIL四種受體的方法，其特征在于，其中步驟a，細(xì)分為如下步驟a1、將敏感柵上的氮化硅做硅烷化處理；a2、用吸附方法將蛋白A固定在氮化硅表面，室溫干燥，牛血清蛋白做封閉處理，磷酸緩沖溶液清洗待干燥，由此形成氮化硅—蛋白A的復(fù)合敏感膜；a3、將TRAIL受體的抗體用吸附方法固定在蛋白A上，待室溫干燥，磷酸緩沖溶液清洗置干備用；
6.一種多通道TRAIL受體檢測系統(tǒng)，其特征在于，包括若干個如權(quán)利要求3所述的免疫場效應(yīng)型TRAIL生物傳感器，用于將待檢TRAIL受體抗原量轉(zhuǎn)換為膜電位的電壓值；多路開關(guān)，用于依次選通各傳感器通道，把參比電極上的控制電位VG輸入到模數(shù)轉(zhuǎn)換器；反饋前級電路，用于保持漏源電流Ids恒定，使得參比電極上的控制電位VG與待測物質(zhì)活度ai的對數(shù)呈線性關(guān)系；數(shù)模轉(zhuǎn)換器，用于將參比電極上的控制電位VG由模擬量轉(zhuǎn)換為數(shù)字量；單片機(jī)，用于控制采樣，換算，顯示，存儲，通訊和按鍵操作；存儲器，用于存儲采樣結(jié)果；顯示器，用于顯示參比電極上的控制電位VG；所述的單片機(jī)，控制多路開關(guān)，依次選通各通道，模數(shù)轉(zhuǎn)換器，將參比電極上的控制電位，由模擬量轉(zhuǎn)換為數(shù)字量，間隔定期進(jìn)行數(shù)據(jù)采樣，并且將采樣結(jié)果存入存儲器，采樣的結(jié)果由顯示器顯示。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的多通道TRAIL受體檢測系統(tǒng)，其特征在于，還包括PC機(jī)，與單片機(jī)連接，用于處理采樣數(shù)據(jù)。
全文摘要
本發(fā)明公開一種TRAIL抗體生物敏感膜制備的制造方法，其步驟如下A.采用P型硅材料，用半導(dǎo)體制備工藝制成MOS型場效應(yīng)晶體管，該場效應(yīng)晶體管包括源極、漏極、非金屬的絕緣材料氮化硅柵極；B.氮化硅作為敏感柵，將其做硅烷化處理；C.用吸附方法將蛋白A固定在氮化硅表面，室溫干燥，牛血清蛋白做封閉處理，磷酸緩沖溶液清洗待干燥，由此形成氮化硅－蛋白A的復(fù)合敏感膜；D.將TRAIL受體的抗體用吸附方法固定在蛋白A上，待室溫干燥，磷酸緩沖溶液清洗置干備用；至此制備成氮化硅－蛋白A－TRAIL受體的抗體這樣有疊型結(jié)構(gòu)的生物敏感膜。本發(fā)明還涉及應(yīng)用上述TRAIL抗體生物敏感膜的多通道TRAIL受體檢測系統(tǒng)及檢測腫瘤細(xì)胞凋亡因子TRAIL四種受體方法。
文檔編號G01N27/30GK1782709SQ20041000993
公開日2006年6月7日 申請日期2004年12月2日 優(yōu)先權(quán)日2004年12月2日
發(fā)明者張虹, 鞏祥鵬, 韓涇鴻, 黃俊琪 申請人:中國科學(xué)院電子學(xué)研究所, 中山大學(xué)