專利名稱：海洋水產(chǎn)動物及人類病原菌－創(chuàng)傷弧菌基因診斷試劑盒及檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及海洋水生經(jīng)濟(jì)動物和人類病原菌的診斷試劑盒及檢測方法，主要是針對創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus)基因診斷的試劑盒及檢測方法。
背景技術(shù)：
創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus)是一種廣布于世界各地的靠海河道、海灣和海岸線區(qū)域以及海產(chǎn)品中的嗜鹽菌。此菌是一種條件致病菌，在一定條件下可暴發(fā)流行。近年來，隨著養(yǎng)殖環(huán)境的日益惡化，我國沿海地區(qū)因創(chuàng)傷弧菌引起海產(chǎn)品發(fā)病或大面積死亡以及人類食物中毒的報道日益增多。目前已知創(chuàng)傷弧菌可感染澳大利亞的尖吻鱸、歐洲鰻鱺、日本鰻鱺、羅非魚、中國對蝦、鰻鱺、石斑魚、牡蠣和皺紋盤鮑等多類水產(chǎn)品；另外該菌可通過受污染的海產(chǎn)品和皮膚破損等外傷感染人類，引發(fā)人類急性敗血癥，在1-3天內(nèi)即可致人死亡。因此，可以說創(chuàng)傷弧菌是海洋水生經(jīng)濟(jì)動物弧菌病主要病原菌，也是弧菌屬眾多弧菌中對人類健康安全危害最大的一種。創(chuàng)傷弧菌病具有暴發(fā)快、流行廣、死亡率高等特點(diǎn)，由于細(xì)菌極易對抗生素產(chǎn)生抗藥性，因此目前對創(chuàng)傷弧菌病還未有特效的治療方法，推行海洋水產(chǎn)品的健康養(yǎng)殖是最有效的預(yù)防措施，而這主要依賴于早期的快速檢測。目前對弧菌的檢測技術(shù)主要包括傳統(tǒng)的TCBS培養(yǎng)及進(jìn)一步的形態(tài)及生理生化鑒定法、免疫學(xué)方法(主要有單克隆抗體技術(shù)、酶聯(lián)免疫檢測法(ELISA))、免疫電鏡技術(shù)、分子生物學(xué)方法(主要有分子雜交技術(shù)、限制性內(nèi)切酶長度多態(tài)(RELP))等。這些檢測方法有些對技術(shù)條件要求高，檢測時間長。有些所需的材料制備麻煩，費(fèi)用高，有些方法靈敏度不高，特異性不強(qiáng)，因此廣大水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)主和醫(yī)生掌握的技術(shù)難度很大，很難推廣，限制了這些技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展。
早期快速診斷海洋水產(chǎn)動物和人類病原菌-創(chuàng)傷弧菌是目前海洋經(jīng)濟(jì)動物養(yǎng)殖的主要措施和減少損失的有效途徑，因此，簡便快速、特異性好又靈敏度高的診斷試劑盒及其檢測方法是廣大水產(chǎn)養(yǎng)殖者急切盼望的。
多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，簡稱PCR技術(shù))，是上世紀(jì)80年代發(fā)展起來的一種體外擴(kuò)增特異DNA片斷的技術(shù)，由于具有快速、敏感、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，所以這種方法建立后，很快就被應(yīng)用于實(shí)踐中。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是利用創(chuàng)傷弧菌基因保守序列設(shè)計的一對引物，建立創(chuàng)傷弧菌PCR反應(yīng)體系，在此基礎(chǔ)上優(yōu)化和設(shè)計，提供海洋水產(chǎn)動物和人類病原菌-創(chuàng)傷弧菌的基因診斷試劑盒及檢測方法。該試劑盒可批量生產(chǎn)，操作簡單，簡便快速，特異性好，靈敏度高；可用于海洋水產(chǎn)動物各時期養(yǎng)殖過程中的細(xì)菌跟蹤檢測，也可用于人類急性敗血癥的臨床檢測，還可以用于環(huán)境監(jiān)測，避免病菌傳播流行，具有很高的實(shí)用價值。
本發(fā)明的海洋水產(chǎn)動物和人類病原菌-創(chuàng)傷弧菌的基因診斷試劑盒包括下列部件1).樣品稀釋液A液，1管，內(nèi)裝1×PBS，pH7.4；2).PCR反應(yīng)液B液，1管，內(nèi)裝PCR擴(kuò)增反應(yīng)液，包括ddH2O、含Mg2+的10×Buffer、dNTP、引物VvF、引物VvR和TaqE；3).陽性對照液C液，1管，內(nèi)裝創(chuàng)傷弧菌的總DNA，作為陽性模板；4).盒子；5).一塊泡沫板，其大小與盒子的底面相同，裝于盒子中；泡沫板上有不少于上述小管數(shù)量的小孔，上述各小管分別對應(yīng)放置于這些小孔中。
上述海洋水產(chǎn)動物和人類病原菌-創(chuàng)傷弧菌的基因診斷試劑盒中所述的一對引物VvF和VvR是根據(jù)創(chuàng)傷弧菌基因保守區(qū)序列設(shè)計的，其DNA序列分別如下VvF5’-TAC GAT GAT TAT TGC G-3’；VvR5’-TAA AAG TGA CAT TCC C-3’用本發(fā)明上述試劑盒檢測海洋水產(chǎn)動物和人類病原菌-創(chuàng)傷弧菌的方法，按下列步驟進(jìn)行1).取新鮮待檢樣品，加入樣品稀釋液A液稀釋10～20倍，于無菌勻漿器中冰浴勻漿；待檢樣品可以是直接取自待檢動物的任何部位組織，最好是消化道或肌肉組織；對于人，可取糞便或傷口膿液作為待檢樣品。
2).6000～8000r/min離心5～10min；3).取上清200μl，煮沸15min，立刻放于冰上5～10min；4).6000～8000r/min離心10min，上清作PCR模板；5).分別取模板和C液，加入到PCR反應(yīng)液B液中，混勻后離心數(shù)秒(通常為500～1000r/min離心5～10sec)，置于PCR儀上；6).按下列條件擴(kuò)增95℃ 3min預(yù)變性→94℃ 1min 34個循環(huán)→72℃ 10min→4℃保存49℃ 45sec72℃ 1min7).反應(yīng)結(jié)束后取5～10μl加2μl溴酚藍(lán)混勻，經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳20～30分鐘后于紫外儀上觀察，若在402bp處出現(xiàn)明亮的反應(yīng)條帶，則為創(chuàng)傷弧菌陽性；若無反應(yīng)條帶顯示，則為陰性。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明的海洋水產(chǎn)動物和人類病原菌-創(chuàng)傷弧菌的基因診斷試劑盒及檢測方法，是以根據(jù)創(chuàng)傷弧菌基因保守區(qū)序列設(shè)計的一對引物為主體而設(shè)計的。利用該對引物，可以特異性地擴(kuò)增攜帶創(chuàng)傷弧菌的待測樣品的有關(guān)基因片斷，所建立的優(yōu)化的PCR體系保證檢測結(jié)果的快速性、準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。因此，使用本發(fā)明的試劑盒及檢測方法，可以簡便、快速、靈敏而特異的地檢測感染創(chuàng)傷弧菌的海洋水產(chǎn)動物，大大高于傳統(tǒng)和常規(guī)的生物學(xué)方法，可運(yùn)用于海洋水產(chǎn)動物各時期養(yǎng)殖過程細(xì)菌中的細(xì)菌跟蹤檢測，也可用于人類急性敗血癥的臨床檢測，還可以用于環(huán)境監(jiān)測，避免病菌傳播流行，具有很高的實(shí)用價值。


圖1是感染創(chuàng)傷弧菌的雜色鮑肝臟組織樣品的PCR擴(kuò)增結(jié)果。其中MDNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1創(chuàng)傷弧菌陽性對照；2創(chuàng)傷弧菌陰性對照；3檢測樣品；具體實(shí)施方式
以下通過具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
實(shí)施例1創(chuàng)傷弧菌的基因診斷試劑盒該試劑盒由下列部分構(gòu)成(10樣份)1).樣品稀釋液(A液)，1管，5ml/管，內(nèi)裝1×PBS，pH7.4。
2).PCR反應(yīng)液(B液)，1管，250μl/管，內(nèi)裝PCR擴(kuò)增反應(yīng)液(25μl體系)，包括ddH2O、含Mg2+的10×Buffer、dNTP、引物VvF、引物VvR和TaqE。
3).陽性對照液(C液)，1管，20μl/管，內(nèi)裝創(chuàng)傷弧菌總DNA，作為陽性模板；4).長方體盒子，8.5×5.8×6.2cm3。
5).一塊泡沫板，其大小與盒子的底面相同，高2.2cm，有四排孔，第一排四個孔，孔徑1.3cm，第二排五個孔，孔徑1.0cm，第三、四排分別六個孔，孔徑0.6cm。上述各小管分別對應(yīng)放置于這些小孔中，裝于長方體盒子中。
該試劑盒中的一對引物的DNA序列如下VvF5’-TAC GAT GAT TAT TGC G-3’；VvR5’-TAA AAG TGA CAT TCC C-3’PCR擴(kuò)增反應(yīng)液體系(25μl體系)如下ddH2O 21μl10×Buffer 1.8μldNTP 0.4μl引物VvF0.3μl引物VvR0.3μlTaqE 0.2μl
實(shí)施例2海洋水產(chǎn)動物和人類病原菌-創(chuàng)傷弧菌的檢測方法使用實(shí)施例1的試劑盒，按下列步驟進(jìn)行1).用無菌操作方法，取新鮮雜色鮑肝臟組織0.05g，加入樣品稀釋液(A液)500μl稀釋10倍，于無菌勻漿器中冰浴勻漿；2).6000r/min離心5min；3).取上清100μl，煮沸15min，立刻放于冰上5min；4).6000r/min離心10min，上清作為PCR模板；5).分別取模板和C液1μl，加入到PCR反應(yīng)液(B液)中，混勻后，1000r/min離心10sec，置于PCR儀上；6).按下列條件擴(kuò)增95℃ 3min預(yù)變性→94℃ 1min 34個循環(huán)→72℃ 10min→4℃保存49℃ 45sec72℃ 1min7).反應(yīng)結(jié)束后取5～10μl加2μl溴酚藍(lán)混勻，經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳20～30分鐘(5V/cm)后于紫外儀上觀察，若在402bp處出現(xiàn)一明亮的反應(yīng)條帶(與陽性對照在同一位置)，則為創(chuàng)傷弧菌陽性，說明檢測樣品中攜帶創(chuàng)傷弧菌；若無反應(yīng)條帶顯示，則為陰性，表明檢測樣品中不含創(chuàng)傷弧菌(見圖1)。
權(quán)利要求
1.海洋水產(chǎn)動物及人類病原菌-創(chuàng)傷弧菌的基因診斷試劑盒，其特征是該試劑盒包括下列部件1).樣品稀釋液A液，1管，內(nèi)裝1×PBS，pH7.4；2).PCR反應(yīng)液B液，1管，內(nèi)裝PCR擴(kuò)增反應(yīng)液，包括ddH2O、含Mg2+的10×Buffer、dNTP、引物VvF、引物VvR和TaqE；VvF為5’-TAC GAT GAT TAT TGC G-3’，VvR為5’-TAA AAG TGA CAT TCC C-3’；3).陽性對照液C液，1管，內(nèi)裝創(chuàng)傷弧菌的總DNA；4).盒子；5).一塊泡沫板，其大小與盒子的底面相同，裝于盒子中；泡沫板上有不少于上述小管數(shù)量的小孔，上述各小管分別對應(yīng)放置于這些小孔中。
2.一種檢測海洋水產(chǎn)動物及人類病原菌-創(chuàng)傷弧菌的方法，其特征是使用權(quán)利要求1所述試劑盒，按下列步驟進(jìn)行1).取新鮮待檢樣品，加入樣品稀釋液A液稀釋10～20倍，于無菌勻漿器中冰浴勻漿；2).6000～8000r/min離心5～10min；3).取上清200μl，煮沸15min，立刻放于冰上5～10min；4).6000～8000r/min離心10min，上清作PCR模板；5).分別取模板和C液，加入到PCR反應(yīng)液B液中，混勻后離心數(shù)秒，置于PCR儀上；6).按下列條件擴(kuò)增95℃ 3min預(yù)變性→94℃ 1min 34個循環(huán)→72℃ 10min→4℃保存49℃ 45sec72℃ 1min7).反應(yīng)結(jié)束后取5～10μl加2μl溴酚藍(lán)混勻，經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳20～30分鐘后于紫外儀上觀察，若在402bp處出現(xiàn)明亮的反應(yīng)條帶，則為創(chuàng)傷弧菌陽性；若無反應(yīng)條帶顯示則為陰性。
全文摘要
本發(fā)明提供一種海洋水產(chǎn)動物(如鰻鱺、石斑魚，鮑和對蝦等)及人類病原菌—創(chuàng)傷弧菌(Vibrio vulnificus)的基因診斷試劑盒及檢測方法。該試劑盒及檢測方法是以創(chuàng)傷弧菌基因保守區(qū)序列設(shè)計的一對引物為主體而設(shè)計的。本發(fā)明采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)，對海洋水產(chǎn)動物(如鰻鱺、石斑魚，鮑和對蝦等)及人類的病原菌—創(chuàng)傷弧菌的特異性DNA片斷進(jìn)行定性檢測，簡便快速，特異性好，靈敏度高；可用于海洋水產(chǎn)動物各時期養(yǎng)殖過程中的細(xì)菌跟蹤檢測，也可用于人類敗血癥和軟組織感染的臨床檢測，還可以用于環(huán)境監(jiān)測，避免病菌傳播流行，具有很高的實(shí)用價值。
文檔編號G01N21/31GK1560604SQ20041001546
公開日2005年1月5日 申請日期2004年2月26日 優(yōu)先權(quán)日2004年2月26日
發(fā)明者鄧先余, 何建國, 王智學(xué), 黃志堅, 翁少萍 申請人:中山大學(xué), 珠海福德隆生物技術(shù)有限公司