專利名稱：高低密度脂蛋白膽固醇聯(lián)合測定方法及試劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高低密度脂蛋白膽固醇聯(lián)合測定方法及試劑。
背景技術(shù)：
眾多流行病學(xué)與臨床研究證實(shí)，動脈粥樣硬化(AS)、冠心病(CHD)的發(fā)生與血清中高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平呈負(fù)相關(guān)，而與低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平呈正相關(guān)，臨床上常用高密度脂蛋白膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇的比值來表示冠心病的發(fā)病傾向，稱為冠心病指數(shù)，因此，HDL-C、LDL-C是當(dāng)前臨床實(shí)驗(yàn)室血脂測定中最有價(jià)值的心腦血管疾病的危險(xiǎn)因素指標(biāo)。
目前盡管HDL-C、LDL-C的測定方法很多，超速離心法、色譜法、電泳法及沉淀法等，但因特殊儀器、技術(shù)操作、環(huán)境等諸多因素的限制，使得上述方法均不屬于臨床實(shí)驗(yàn)室的最佳方法。超速離心法為美國疾病與預(yù)防中心(CDC)定為測定HDL-C、LDL-C的參考方法，也為NCEP所推薦，但因需用特殊儀器及對操作技術(shù)要求高，一般臨床實(shí)驗(yàn)室難以開展。雖然沉淀法因其操作簡單，準(zhǔn)確，在國內(nèi)臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用較廣，但需要進(jìn)行血清分離，且標(biāo)本分離過程中易受溫度、時間、轉(zhuǎn)速等因素的影響，而造成測定結(jié)果偏差較大。色譜法及電泳法也因儀器、操作要求高等種種原因使得臨床實(shí)驗(yàn)室也較少應(yīng)用，多用于脂蛋白的研究。此外，上述方法的共同局限性就是都不能進(jìn)行自動化分析。如今，實(shí)驗(yàn)室儀器設(shè)備自動化已逐漸成為臨床實(shí)驗(yàn)室的發(fā)展趨勢，這樣毋需對標(biāo)本進(jìn)行分離的直接檢測方法就應(yīng)運(yùn)而生。從目前國內(nèi)的直接法檢測試劑來看，尚存在技術(shù)不成熟問題，例如，中國專利公開號CN-1281981A公開的測定試劑，因其成份中一些金屬離子濃度過高，易和一些聚陰離子形成絮狀物而影響測定結(jié)果。又如中國專利公開號CN-1379234A的測定試劑，其成份中Mg2+較高，不僅可抑制試劑中各種酶的活性，且在pH值呈堿性的緩沖體系中，易形成Mg(OH)2沉淀而影響測定。由于上述技術(shù)問題的存在，使得國產(chǎn)直接法測定高低密度脂蛋白試劑無法很好地被廣泛應(yīng)用。進(jìn)口試劑技術(shù)上已經(jīng)較成熟，但價(jià)格較高，在國內(nèi)有些基層醫(yī)院也無法開展。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種操作簡便快捷、準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好、抗干擾能力強(qiáng)的高低密度脂蛋白膽固醇聯(lián)合測定方法。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)解決方案是利用脂蛋白與表面活性劑的親和性差異，加入試劑1或試劑2，在聚離子表面活性劑的作用下，血清中的CM、VLDL及LDL-C或HDL-C形成可溶性復(fù)合物，它們表面的游離膽固醇在膽固醇酯酶(CHER)、膽固醇氧化酶(CHO)的催化下反應(yīng)生成H2O2，在過氧化物酶(POD)的作用下，H2O2被清除，加入試劑3，在一種特殊的選擇性表面活性劑作用下，只有HDL-C或LDL-C顆?？扇?，利用Trinder反應(yīng)測定HDL-C或LDL-C的含量。
本發(fā)明的另一目的是提供上述高低密度脂蛋白膽固醇聯(lián)合測定方法中使用的試劑。
本發(fā)明試劑由試劑1、試劑2、試劑3組成，它們的組成分別是試劑1HEPES-NaoH緩沖液20~80mmol/L聚陰離子表面活性劑 1~6g/L膽固醇酯酶 0.5~6KU/L膽固醇氧化酶0.3~2KU/L
過氧化物酶 0.5~12KU/L膽酸鈉 0.5~1.8mmol/L亞鐵氰化鉀 0.001~0.005mmol/L抗壞血酸氧化酶 0.5~2KU/L聚乙二醇8000 20~50g/LTOOS 2~5mmol/L穩(wěn)定劑 0.2~2g/L防腐劑 0.1~2.5g/L試劑2HEPES-NaoH緩沖液20~80mmol/L聚陰離子表面活性劑 1~5g/L膽固醇酯酶 0.5~6KU/L膽固醇氧化酶0.3~2KU/L過氧化物酶 0.5~12KU/L亞鐵氰化鉀 0.001~0.005mmol/L抗壞血酸氧化酶 0.5~2KU/LTOOS2~5mmol/L膽酸鈉 0.5~3mmol/L皂苷0.1~0.4mmol/LBrij-35 2~4g/L試劑3HEPES-NaoH緩沖液20~80mmol/L4-安基安替比林 0.05~0.2g/L
防腐劑0.1~2.5g/L膽酸鈉0.5~1.8mmol/LGenapolx-080 2~4g/L穩(wěn)定劑0.2~2g/L為了提高測定準(zhǔn)確度，本發(fā)明試劑盒選擇了特異性強(qiáng)的表面活性劑，在第一步反應(yīng)中試劑1或試劑2中的表面活性劑能改變HDL-C或LDL-C以外的脂蛋白結(jié)構(gòu)并解離，所釋放出來的微?；懝檀寂c膽固醇酶試劑反應(yīng)，產(chǎn)生的H2O2在缺乏偶聯(lián)劑時被消耗而不顯色，此時HDL-C或LDL-C顆粒均是完整的，加試劑3使HDL-C或LDL-C迅速解離釋放膽固醇參與Trinder反應(yīng)而顯色。在試劑1和試劑2中聚陰離子表面活性劑可選聚氧乙烯亞烷基苯基醚、毛地黃皂苷、Thesit等，其中以聚氧乙烯亞烷基苯基醚最佳。防腐劑可選用柳酸汞、ProClin400進(jìn)行防腐，以ProClin400為最佳，其不但具有良好的防腐作用，且對酶活性無抑制。中國專利公開號CN-1379234A的試劑中，選用疊氮鈉作防腐劑，大量試驗(yàn)證實(shí)，疊氮鈉在防腐的同時對試劑中各種酶的活性抑制較大，易造成測定結(jié)果的不準(zhǔn)確及反應(yīng)在規(guī)定時間內(nèi)達(dá)不到平衡，另外疊氮鈉對長期使用人員的皮膚接觸中會有致癌的危險(xiǎn)。穩(wěn)定劑可選用海澡糖、牛血清白蛋白、庶糖、α-環(huán)糊精。本發(fā)明試劑盒具有較穩(wěn)定的緩沖體系和反應(yīng)體系，各組份的最佳組合保證了規(guī)定效期內(nèi)的穩(wěn)定性。為了增加抗干擾的能力，本發(fā)明試劑1、試劑2中加入了抗壞血酸氧化酶，亞鐵氰化鉀等成份，可減少黃疸、溶血時測定標(biāo)本的干擾。為了提高測定靈敏度，本發(fā)明試劑顯色劑篩選TOOS，使反應(yīng)的靈敏度可達(dá)到0.08mmol/L，且呈色穩(wěn)定。
由于本發(fā)明高低密度脂蛋白膽固醇聯(lián)合測定方法無需對標(biāo)本進(jìn)行沉淀、離心等前處理，因此操作簡便快捷；由于本發(fā)明可以聯(lián)合檢測血清中的HDL-C、LDL-C，因而大大降低了成本，使得在國內(nèi)基層實(shí)驗(yàn)室也有能力開展HDL-C、LDL-C直接法測定項(xiàng)目；本發(fā)明測定試劑中不含Mg2+，不會影響血清Mg2+的測定，也不會與自動生化分析儀中可能殘留的OH-結(jié)合生成沉淀而堵塞管道，因而特別適合于自動生化分析儀使用下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式
對本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。


圖1是實(shí)施例1中高密度脂蛋白膽固醇直接法(即本發(fā)明方法)與沉淀法的相關(guān)性圖。
圖2是實(shí)施例1中低密度脂蛋白膽固醇直接法(即本發(fā)明方法)與沉淀法的相關(guān)性圖。
圖3是實(shí)施例2中高密度脂蛋白膽固醇直接法(即本發(fā)明方法)與沉淀法的相關(guān)性圖。
圖4是實(shí)施例2中低密度脂蛋白膽固醇直接法(即本發(fā)明方法)與沉淀法的相關(guān)性圖。
圖5是實(shí)施例3中高密度脂蛋白膽固醇直接法(即本發(fā)明方法)與沉淀法的相關(guān)性圖。
圖6是實(shí)施例3中低密度脂蛋白膽固醇直接法(即本發(fā)明方法)與沉淀法的相關(guān)性圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1試劑1pH值7.5HEPES-NaoH緩沖液50mmol/L
聚氧乙烯亞烷基苯基醚 4g/L膽固醇酯酶 4KU/L膽固醇氧化酶 2KU/L過氧化物酶 8KU/L抗壞血酸氧化酶 1KU/L聚乙二醇8000 30g/LTOOS 4mmol/L亞鐵氰化鉀 0.002mmol/L膽酸鈉 1mmol/L牛血清白蛋白 2mmol/LProClin400 0.5g/L試劑2pH值7.5HEPES-NaoH緩沖液50mmol/L聚氧乙烯亞烷基苯基醚 4g/L膽固醇酯酶 4KU/L膽固醇氧化酶 2KU/L過氧化物酶 8KU/L抗壞血酸氧化酶 1KU/L皂苷 0.2mmol/LTOOS 4mmol/L亞鐵氰化鉀 0.002mmol/L膽酸鈉 1mmol/LBrij-353g/L
試劑3pH值7.5HEPES-NaoH緩沖液 50mmol/L4-氨基安替比林 0.10g/L牛血清白蛋白2mmol/L膽酸鈉 1.2mmol/LGenapolx-0803g/LProClin400 0.5g/L本實(shí)施例描述的高低密度脂蛋白膽固醇聯(lián)合檢測試劑，使用采用具有雙試劑功能的自動生化分析儀，以日立7170為例，其操作如下高密度脂蛋白膽固醇操作

低密度脂蛋白膽固醇操作


結(jié)果計(jì)算(樣本中高、低密度脂蛋白膽固醇濃度計(jì)算相同)血清高、低密度脂蛋白膽固醇濃度(mmol/L)＝ΔA樣品/ΔA校準(zhǔn)×校準(zhǔn)液濃度用本實(shí)施例介紹的測定試劑與沉淀法同時測定了30例臨床標(biāo)本HDL-C、LDL-C含量，結(jié)果如表1和圖1、圖2所示。
表1


由以上結(jié)果可見，與實(shí)施例1相比膽固醇酯酶、膽固醇氧化酶減少1/2的時候也可以獲得大致相同的結(jié)果。
實(shí)施例3本實(shí)施例使用的高低密度脂蛋白膽固醇聯(lián)合檢測試劑，是將實(shí)施例1中的pH值為7.5的HEPES-NaoH緩沖液由50mmol/L改為20mmol/L，進(jìn)行實(shí)施例1同樣的測定，結(jié)果如表3和圖5、圖6所示。
表3


從表3和圖5、圖6可以看出，與實(shí)施例1相比pH值為7.5的HEPES-NaoH緩沖液減少1/2的時候也可以獲得大致相同的結(jié)果，因此可以降低測定成本。
權(quán)利要求
1.一種高低密度脂蛋白膽固醇聯(lián)合測定方法，其特征在于利用脂蛋白與表面活性劑的親和性差異，加入試劑1或試劑2，在聚離子表面活性劑的作用下，血清中的CM、VLDL及LDL-C或HDL-C形成可溶性復(fù)合物，它們表面的游離膽固醇在膽固醇酯酶(CHER)、膽固醇氧化酶(CHO)的催化下反應(yīng)生成H2O2，在過氧化物酶(POD)的作用下，H2O2被清除，加入試劑3，在一種特殊的選擇性表面活性劑作用下，只有HDL-C或LDL-C顆?？扇埽肨rinder反應(yīng)測定HDL-C或LDL-C的含量。
2.一種權(quán)利要求1所述方法中使用的試劑，其特征在于由試劑1、試劑2、試劑3組成，它們的組成分別是試劑1HEPES-NaoH緩沖液 20~80mmol/L聚陰離子表面活性劑1~6g/L膽固醇酯酶0.5~6KU/L膽固醇氧化酶 0.3~2KU/L過氧化物酶0.5~12KU/L膽酸鈉0.5~1.8mmol/L亞鐵氰化鉀0.001~0.005mmol/L抗壞血酸氧化酶0.5~2KU/L聚乙二醇8000 20~50g/LTOOS 2~5mmol/L穩(wěn)定劑0.2~2g/L防腐劑0.1~2.5g/L試劑2HEPES-NaoH緩沖液 20~80mmol/L聚陰離子表面活性劑 1~5g/L膽固醇酯酶 0.5~6KU/L膽固醇氧化酶 0.3~2KU/L過氧化物酶 0.5~12KU/L亞鐵氰化鉀 0.001~0.005mmol/L抗壞血酸氧化酶 0.5~2KU/LTOOS 2~5mmol/L膽酸鈉 0.5~3mmol/L皂苷 0.1~0.4mmol/LBrij-352~4g/L試劑3HEPES-NaoH緩沖液 20~80mmol/L4-安基安替比林 0.05~0.2g/L防腐劑 0.1~2.5g/L膽酸鈉 0.5~1.8mmol/LGenapolx-080 2~4g/L穩(wěn)定劑 0.2~2g/L
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑，其特征在于其中聚陰離子表面活性劑選用聚氧乙烯亞烷基苯基醚。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的試劑，其特征在于其中防腐劑選用ProClin400。
5.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的試劑，其特征在于其中穩(wěn)定劑選用牛血清白蛋白。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑，其特征在于其中穩(wěn)定劑選用牛血清白蛋白。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種高低密度脂蛋白膽固醇聯(lián)合測定方法及試劑，它是利用脂蛋白與表面活性劑的親和性差異，加入試劑1或試劑2，在聚離子表面活性劑的作用下，血清中的CM、VLDL及LDL－C或HDL－C形成可溶性復(fù)合物，它們表面的游離膽固醇在膽固醇酯酶(CHER)、膽固醇氧化酶(CHO)的催化下反應(yīng)生成H
文檔編號G01N33/92GK1570648SQ200410018129
公開日2005年1月26日 申請日期2004年4月30日 優(yōu)先權(quán)日2004年4月30日
發(fā)明者王賢俊 申請人:王賢俊